JPH0782167A - 血清ｃｓｆ活性誘導剤及びその製造方法 - Google Patents
血清ｃｓｆ活性誘導剤及びその製造方法Info
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- JPH0782167A JPH0782167A JP5184404A JP18440493A JPH0782167A JP H0782167 A JPH0782167 A JP H0782167A JP 5184404 A JP5184404 A JP 5184404A JP 18440493 A JP18440493 A JP 18440493A JP H0782167 A JPH0782167 A JP H0782167A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 副作用が少なく、造血機能を著しく促進する
作用を有する血清CSF 活性誘導剤及びその製造方法の提
供。 【構成】 酸化型グルタチオンまたはその薬理上許容さ
れる塩、または薬用ニンジン水抽出物から分離された酸
化型グルタチオンを含む画分を有効成分とする血清CSF
活性誘導剤、及び薬用ニンジン水抽出物から分配、陽イ
オン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグ
ラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー及び逆相HPLCの
少なくとも１つ以上を用いて分離して、酸化型グルタチ
オンを含む画分を得ることからなる血清CSF 活性誘導剤
の製造方法。
作用を有する血清CSF 活性誘導剤及びその製造方法の提
供。 【構成】 酸化型グルタチオンまたはその薬理上許容さ
れる塩、または薬用ニンジン水抽出物から分離された酸
化型グルタチオンを含む画分を有効成分とする血清CSF
活性誘導剤、及び薬用ニンジン水抽出物から分配、陽イ
オン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグ
ラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー及び逆相HPLCの
少なくとも１つ以上を用いて分離して、酸化型グルタチ
オンを含む画分を得ることからなる血清CSF 活性誘導剤
の製造方法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、酸化型グルタチオンお
よび酸化型グルタチオンを含む薬用ニンジンの分離画分
またはそれらの薬理上許容される塩を有効成分とする血
清ＣＳＦ活性誘導剤及びその製造方法に関する。血清Ｃ
ＳＦ活性誘導剤は、生体内の造血因子であるコロニー刺
激因子（以下、ＣＳＦという。特許請求の範囲の記載も
同じである）の活性を誘導し、このＣＳＦの作用に基づ
く癌化学療法、放射線療法の副作用軽減、感染防御、生
体防御機能促進等に有用である。
よび酸化型グルタチオンを含む薬用ニンジンの分離画分
またはそれらの薬理上許容される塩を有効成分とする血
清ＣＳＦ活性誘導剤及びその製造方法に関する。血清Ｃ
ＳＦ活性誘導剤は、生体内の造血因子であるコロニー刺
激因子（以下、ＣＳＦという。特許請求の範囲の記載も
同じである）の活性を誘導し、このＣＳＦの作用に基づ
く癌化学療法、放射線療法の副作用軽減、感染防御、生
体防御機能促進等に有用である。
【０００２】
【従来の技術】一般に、癌の化学療法あるいは放射線療
法を行なうと血球細胞の分化増殖の阻害を含む造血機能
の抑制が生じ、免疫能が低下するので、これらの治療法
の効果を認めるのに必要な投与スケジュールに制限を受
けることがある。これらの治療法では生体内で細胞障害
性の強いフリーラジカルが産生されることが知られてお
り、古くから還元型グルタチオンなどのチオール類がそ
のスカベンジング作用を利用した副作用軽減剤として開
発されている。近年では、この副作用軽減剤または造血
機能促進剤として、糖蛋白の造血因子を利用する方法が
開発され、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF)やエリスロ
ポエチン（EPO)が医薬品として臨床に用いられている。
さらに、造血因子としては、これらの他にサイトカイン
と称される種々の糖蛋白質が発見されており、癌化学療
法や放射線療法の副作用軽減、感染防御作用や生体防御
機能促進作用を有する物質であることが知られている
が、これらには、発熱など副作用の激しいものが多く、
実際に臨床に用いることが困難な状況にある。
法を行なうと血球細胞の分化増殖の阻害を含む造血機能
の抑制が生じ、免疫能が低下するので、これらの治療法
の効果を認めるのに必要な投与スケジュールに制限を受
けることがある。これらの治療法では生体内で細胞障害
性の強いフリーラジカルが産生されることが知られてお
り、古くから還元型グルタチオンなどのチオール類がそ
のスカベンジング作用を利用した副作用軽減剤として開
発されている。近年では、この副作用軽減剤または造血
機能促進剤として、糖蛋白の造血因子を利用する方法が
開発され、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF)やエリスロ
ポエチン（EPO)が医薬品として臨床に用いられている。
さらに、造血因子としては、これらの他にサイトカイン
と称される種々の糖蛋白質が発見されており、癌化学療
法や放射線療法の副作用軽減、感染防御作用や生体防御
機能促進作用を有する物質であることが知られている
が、これらには、発熱など副作用の激しいものが多く、
実際に臨床に用いることが困難な状況にある。
【０００３】一方、天然物から造血因子製剤を開発する
目的で、造血機能を促進する物質を探索研究することが
行なわれた結果、レンチナン〔薬学雑誌 108 171 (198
8)〕、 MDP〔J. Immunol. 144 3789 (1990) 〕などの薬
剤が開発された。また、生薬の配合物である人参養栄湯
にも造血作用があることが報告されている〔Int. J,Imm
unopharmac. 11 (7) 771 (1989) 〕。人参養栄湯の成
分の１つである薬用ニンジンは古くから単独で、または
配合して幅広い薬理効果について利用されてきた。薬用
としての利用以外に、韓国では食用にも使われており、
その毒性は低いと考えられる。これまで薬用ニンジンか
ら薬理作用のある成分として、配糖体の一種であるサポ
ニン〔「薬用人参−その研究と進歩−」共立出版（198
1）〕や、高分子多糖〔「多糖の構造と生理活性」朝倉
出版（1990）〕等が報告されてきた。例えば、放射線障
害に対する延命率上昇あるいは血球細胞の回復促進に関
しては、非サポニン画分である水溶性画分に効果がある
ことが報告されている〔Proc. Symp. WAKAN-YAKU 12 4
4 (1979)〕。前記の薬剤や薬用ニンジン画分は、造血因
子を産生する細胞に直接にまたは間接に作用してサイト
カインの活性を上昇させることにより、造血機能を促進
する宿主介在的なものであると考えられ、サイトカイン
からなる蛋白質製剤とは、異なる薬理効果が期待でき
る。しかし、これらは一般に高分子の多糖あるいはその
混合物であるのでその有効成分の構造が明確にならず、
均一な薬剤を供給したり、吸収や薬理作用の改良を目的
として修飾が難しいなどの問題がある。
目的で、造血機能を促進する物質を探索研究することが
行なわれた結果、レンチナン〔薬学雑誌 108 171 (198
8)〕、 MDP〔J. Immunol. 144 3789 (1990) 〕などの薬
剤が開発された。また、生薬の配合物である人参養栄湯
にも造血作用があることが報告されている〔Int. J,Imm
unopharmac. 11 (7) 771 (1989) 〕。人参養栄湯の成
分の１つである薬用ニンジンは古くから単独で、または
配合して幅広い薬理効果について利用されてきた。薬用
としての利用以外に、韓国では食用にも使われており、
その毒性は低いと考えられる。これまで薬用ニンジンか
ら薬理作用のある成分として、配糖体の一種であるサポ
ニン〔「薬用人参−その研究と進歩−」共立出版（198
1）〕や、高分子多糖〔「多糖の構造と生理活性」朝倉
出版（1990）〕等が報告されてきた。例えば、放射線障
害に対する延命率上昇あるいは血球細胞の回復促進に関
しては、非サポニン画分である水溶性画分に効果がある
ことが報告されている〔Proc. Symp. WAKAN-YAKU 12 4
4 (1979)〕。前記の薬剤や薬用ニンジン画分は、造血因
子を産生する細胞に直接にまたは間接に作用してサイト
カインの活性を上昇させることにより、造血機能を促進
する宿主介在的なものであると考えられ、サイトカイン
からなる蛋白質製剤とは、異なる薬理効果が期待でき
る。しかし、これらは一般に高分子の多糖あるいはその
混合物であるのでその有効成分の構造が明確にならず、
均一な薬剤を供給したり、吸収や薬理作用の改良を目的
として修飾が難しいなどの問題がある。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、上記現
状に鑑み、造血機能を促進する副作用の少ない薬剤を薬
用ニンジンから見出すべく、鋭意研究を進めた。すなわ
ち、生体防御機構の１つであるサイトカインネットワー
クに作用して、必要な血球細胞の分化・増殖を促進し、
なおかつネットワークによるフィードバック機構によっ
て過度の反応が抑えられるような性質をもつ物質を探索
した結果、薬用ニンジンに含まれている酸化型グルタチ
オンが血清ＣＳＦ活性誘導作用を惹起する物質であるこ
とを見出した。本発明はかかる知見に基づきなされたも
ので、本発明の目的は、副作用が少なく、造血機能を著
しく促進する作用を有する血清ＣＳＦ活性誘導剤及びそ
の製造方法を提供することにある。
状に鑑み、造血機能を促進する副作用の少ない薬剤を薬
用ニンジンから見出すべく、鋭意研究を進めた。すなわ
ち、生体防御機構の１つであるサイトカインネットワー
クに作用して、必要な血球細胞の分化・増殖を促進し、
なおかつネットワークによるフィードバック機構によっ
て過度の反応が抑えられるような性質をもつ物質を探索
した結果、薬用ニンジンに含まれている酸化型グルタチ
オンが血清ＣＳＦ活性誘導作用を惹起する物質であるこ
とを見出した。本発明はかかる知見に基づきなされたも
ので、本発明の目的は、副作用が少なく、造血機能を著
しく促進する作用を有する血清ＣＳＦ活性誘導剤及びそ
の製造方法を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】すなわち、本発明は、酸
化型グルタチオンまたはその薬理上許容される塩を有効
成分とする血清ＣＳＦ活性誘導剤、さらに、薬用ニンジ
ン水抽出物から分離された酸化型グルタチオンを含む画
分を有効成分とする血清ＣＳＦ活性誘導剤、及び薬用ニ
ンジン水抽出物を分配、陽イオン交換クロマトグラフィ
ー、陰イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマ
トグラフィー及び逆相HPLCの少なくとも１つ以上を用い
て分離して、酸化型グルタチオンを含む画分を得ること
からなる血清ＣＳＦ活性誘導剤の製造方法である。尚、
本発明において血清ＣＳＦ活性誘導剤とは、これを投与
することにより、生体内で血清中のＣＳＦの活性を高
め、癌化学療法、放射線療法の副作用軽減作用、感染防
御作用、生体防御促進作用を有する薬剤をいう。
化型グルタチオンまたはその薬理上許容される塩を有効
成分とする血清ＣＳＦ活性誘導剤、さらに、薬用ニンジ
ン水抽出物から分離された酸化型グルタチオンを含む画
分を有効成分とする血清ＣＳＦ活性誘導剤、及び薬用ニ
ンジン水抽出物を分配、陽イオン交換クロマトグラフィ
ー、陰イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマ
トグラフィー及び逆相HPLCの少なくとも１つ以上を用い
て分離して、酸化型グルタチオンを含む画分を得ること
からなる血清ＣＳＦ活性誘導剤の製造方法である。尚、
本発明において血清ＣＳＦ活性誘導剤とは、これを投与
することにより、生体内で血清中のＣＳＦの活性を高
め、癌化学療法、放射線療法の副作用軽減作用、感染防
御作用、生体防御促進作用を有する薬剤をいう。
【０００６】本発明の酸化型グルタチオンは還元型グル
タチオンのチオール基がジスルフィド結合を生じてダイ
マーを形成したものである。還元型グルタチオンは酵母
から生産され、日本医薬局方外医薬品として収載されて
おり、一般に市販されている。この酸化型グルタチオン
も、一般に市販されており、本発明では、これをそのま
ま用いることができ、また還元型グルタチオンを酸化し
て、酸化型グルタチオンとし、これを用いることもでき
る。尚、還元型グルタチオンでは本発明の効果が得られ
ない。尚、この酸化型グルタチオンの薬理上許容される
塩としては、カルボキシル基の全て若しくは一部が、ナ
トリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、カルシウ
ム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩、或いは
非毒性のアミン塩となっているもの、またはアミノ基が
塩酸、硫酸等の非毒性の無機酸の塩、マレイン酸等の非
毒性の有機酸の塩になっているもの等を用いることがで
きる。
タチオンのチオール基がジスルフィド結合を生じてダイ
マーを形成したものである。還元型グルタチオンは酵母
から生産され、日本医薬局方外医薬品として収載されて
おり、一般に市販されている。この酸化型グルタチオン
も、一般に市販されており、本発明では、これをそのま
ま用いることができ、また還元型グルタチオンを酸化し
て、酸化型グルタチオンとし、これを用いることもでき
る。尚、還元型グルタチオンでは本発明の効果が得られ
ない。尚、この酸化型グルタチオンの薬理上許容される
塩としては、カルボキシル基の全て若しくは一部が、ナ
トリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、カルシウ
ム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩、或いは
非毒性のアミン塩となっているもの、またはアミノ基が
塩酸、硫酸等の非毒性の無機酸の塩、マレイン酸等の非
毒性の有機酸の塩になっているもの等を用いることがで
きる。
【０００７】また、この酸化型グルタチオンは薬用ニン
ジンからも得られ、薬用ニンジンからの酸化型グルタチ
オンを含む画分を用いることができる。例えば、ウコギ
科（Araliaceae）、パナックス属（Panax)に属する植物
で、オタネニンジン、チクセツニンジン、アメリカニン
ジン、三七ニンジン等の薬用ニンジンの主として根部を
乾燥して細切し、水で抽出する。このとき、薬用ニンジ
ンと水との割合を１：７程度の重量比とし室温で抽出
し、抽出液のヨーソ反応が消失するまで本操作をくり返
して行うことが望ましい。このようにして得られた抽出
液を集め、濾過し、濾液を濃縮する。濃縮は低温（室温
〜40℃前後）で減圧下に行うことが有効成分の破壊を防
止する意味で好ましい。得られる濃縮液を、撹拌したメ
タノールの中にゆっくり滴下して沈澱を生じさせる。こ
の沈澱を採取して、水で抽出する。この水は、蒸留水を
用いた後、水飽和ブタノールを用い水層を採取するのが
よい。この抽出液を限外濾過膜で濾過し、分子量10,000
ダルトン以上、好ましくは 2,400ダルトン以上の画分を
除き、濾液を酸性条件下で陽イオン交換樹脂を通し、非
吸着画分をアルカリ性条件下で陰イオン交換樹脂に吸着
させ、これを塩化ナトリウム等を含有する緩衝液でクラ
ジエント溶出させる。そして塩化ナトリウム50〜70mMで
溶出する画分を集め、酸化型グルタチオンを含んだ画分
（Fr-3画分）を得る。さらに限外濾過あるいはゲル濾過
クロマトグラフィー等を行って分子量 500以下の低分子
を除去し、さらにこの画分を逆相HPLCで分画する。以上
の分離・精製の手段を適宜組み合せ反復用いることによ
り、酸化型グルタチオンを含む画分を得ることができ
る。この画分は、さらに濃縮するかあるいは凍結乾燥等
を行って粉末の状態にすることもできる。この画分は、
動物試験の結果、血清中のＣＳＦ活性を誘導する作用の
あることが判明したので、癌化学療法、放射線療法の副
作用軽減、感染防御作用、生体防御機能促進作用を有す
る薬剤として有用である。
ジンからも得られ、薬用ニンジンからの酸化型グルタチ
オンを含む画分を用いることができる。例えば、ウコギ
科（Araliaceae）、パナックス属（Panax)に属する植物
で、オタネニンジン、チクセツニンジン、アメリカニン
ジン、三七ニンジン等の薬用ニンジンの主として根部を
乾燥して細切し、水で抽出する。このとき、薬用ニンジ
ンと水との割合を１：７程度の重量比とし室温で抽出
し、抽出液のヨーソ反応が消失するまで本操作をくり返
して行うことが望ましい。このようにして得られた抽出
液を集め、濾過し、濾液を濃縮する。濃縮は低温（室温
〜40℃前後）で減圧下に行うことが有効成分の破壊を防
止する意味で好ましい。得られる濃縮液を、撹拌したメ
タノールの中にゆっくり滴下して沈澱を生じさせる。こ
の沈澱を採取して、水で抽出する。この水は、蒸留水を
用いた後、水飽和ブタノールを用い水層を採取するのが
よい。この抽出液を限外濾過膜で濾過し、分子量10,000
ダルトン以上、好ましくは 2,400ダルトン以上の画分を
除き、濾液を酸性条件下で陽イオン交換樹脂を通し、非
吸着画分をアルカリ性条件下で陰イオン交換樹脂に吸着
させ、これを塩化ナトリウム等を含有する緩衝液でクラ
ジエント溶出させる。そして塩化ナトリウム50〜70mMで
溶出する画分を集め、酸化型グルタチオンを含んだ画分
（Fr-3画分）を得る。さらに限外濾過あるいはゲル濾過
クロマトグラフィー等を行って分子量 500以下の低分子
を除去し、さらにこの画分を逆相HPLCで分画する。以上
の分離・精製の手段を適宜組み合せ反復用いることによ
り、酸化型グルタチオンを含む画分を得ることができ
る。この画分は、さらに濃縮するかあるいは凍結乾燥等
を行って粉末の状態にすることもできる。この画分は、
動物試験の結果、血清中のＣＳＦ活性を誘導する作用の
あることが判明したので、癌化学療法、放射線療法の副
作用軽減、感染防御作用、生体防御機能促進作用を有す
る薬剤として有用である。
【０００８】酸化型グルタチオンまたは上記画分を薬剤
として用いるには、それ自体で、または製剤に用いられ
る慣用の賦型剤、結合剤、あるいは希釈剤等と適宜混合
して粉末、顆粒、錠剤、カプセル剤、シロップ剤、注射
剤、座剤等の形態で経口的あるいは非経口的に投与する
ことができる。また必要に応じ、他の造血因子あるいは
制癌剤等と併用することもできる。その使用量は、年
令、体重、症状、投与方法等によって異なるが、通常は
成人に対して１日当たり、 0.1〜1000mgを投与すること
ができる。本発明の物質は薬用ニンジン等に含有されて
いる物質であり、急性毒性はないと考えられる。
として用いるには、それ自体で、または製剤に用いられ
る慣用の賦型剤、結合剤、あるいは希釈剤等と適宜混合
して粉末、顆粒、錠剤、カプセル剤、シロップ剤、注射
剤、座剤等の形態で経口的あるいは非経口的に投与する
ことができる。また必要に応じ、他の造血因子あるいは
制癌剤等と併用することもできる。その使用量は、年
令、体重、症状、投与方法等によって異なるが、通常は
成人に対して１日当たり、 0.1〜1000mgを投与すること
ができる。本発明の物質は薬用ニンジン等に含有されて
いる物質であり、急性毒性はないと考えられる。
【０００９】次に、本発明の実施例を示して、本発明を
さらに具体的に証明する。
さらに具体的に証明する。
【実施例】薬用ニンジンの抽出物および分離画分につい
て、各々次に示した方法により評価して、有効成分の追
跡を行なった。血清ＣＳＦ活性の誘導作用の評価法 （１）血清ＣＳＦ活性の誘導 マウス血清中にＣＳＦ活性を誘導する方法は、Plunzuic
k らのＬＰＳ投与マウスの血清ＣＳＦ活性の実験系〔J.
Cell Physiol. 28 71 (1975) 〕を改良して行なった。
すなわち、一群４〜６匹の６〜９週齢の雄性 C3H/HeJ系
マウスに、各々の薬用ニンジン抽出物または分離画分を
150mMの塩化ナトリウム溶液で溶解し、必要に応じて水
酸化ナトリウム溶液でpHを６〜７に調整し、腹腔内に投
与した。尚、未処理群には生理食塩水を投与した。投与
６時間後のマウスを頸椎脱臼で屠殺し、全採血した。採
集した血液は個体ごとに４℃で一晩静置して翌日、6,00
0rpm で５分間遠心分離し、さらに上清を6,000rpmで３
分間遠心分離して血清を回収した。血清は次の活性試験
に供するまで−20℃または−80℃で保存した。
て、各々次に示した方法により評価して、有効成分の追
跡を行なった。血清ＣＳＦ活性の誘導作用の評価法 （１）血清ＣＳＦ活性の誘導 マウス血清中にＣＳＦ活性を誘導する方法は、Plunzuic
k らのＬＰＳ投与マウスの血清ＣＳＦ活性の実験系〔J.
Cell Physiol. 28 71 (1975) 〕を改良して行なった。
すなわち、一群４〜６匹の６〜９週齢の雄性 C3H/HeJ系
マウスに、各々の薬用ニンジン抽出物または分離画分を
150mMの塩化ナトリウム溶液で溶解し、必要に応じて水
酸化ナトリウム溶液でpHを６〜７に調整し、腹腔内に投
与した。尚、未処理群には生理食塩水を投与した。投与
６時間後のマウスを頸椎脱臼で屠殺し、全採血した。採
集した血液は個体ごとに４℃で一晩静置して翌日、6,00
0rpm で５分間遠心分離し、さらに上清を6,000rpmで３
分間遠心分離して血清を回収した。血清は次の活性試験
に供するまで−20℃または−80℃で保存した。
【００１０】（２）血清ＣＳＦ活性の試験 マウス血清中のＣＳＦ活性の測定は、骨髄細胞のin vit
ro colony assay 法によって行なった。先ず、正常マウ
スを頸椎脱臼で屠殺した後、無菌的に大腿骨を切除し、
同大腿骨をDMEM（−）（ＩＳ社製）で灌流することによ
って骨髄細胞をDMEM（−）中に回収した。次に、ピペッ
ティングや遠心分離により余分な結合組織や接着細胞を
取り除き、骨髄由来の血球細胞を得た。96穴のプレート
で、DMEM（−）を80％、メチルセルロース（東京化成
製）を0.41％（w/v)、 FBS（ＩＳ社製）を18％、100mM
β−メルカプトエタノール水溶液（ナカライテスク製）
を0.1 ％(v/v) 含む半流動培地 450μl に、105 個の骨
髄細胞を入れて、上記で得た血清を融解したものを個体
ごとに50μl(v/v)添加した。培養開始日を初日とし、37
℃、５％CO2 飽和湿度下で、６日間インキュベートし
て、６日目に 100倍の顕微鏡下で20細胞以上と認められ
る細胞集塊または細胞集団をコロニーとし、その数を計
測した。処理群、未処理群とも一群の平均値と実験誤差
を求め、活性の強さを比較した。
ro colony assay 法によって行なった。先ず、正常マウ
スを頸椎脱臼で屠殺した後、無菌的に大腿骨を切除し、
同大腿骨をDMEM（−）（ＩＳ社製）で灌流することによ
って骨髄細胞をDMEM（−）中に回収した。次に、ピペッ
ティングや遠心分離により余分な結合組織や接着細胞を
取り除き、骨髄由来の血球細胞を得た。96穴のプレート
で、DMEM（−）を80％、メチルセルロース（東京化成
製）を0.41％（w/v)、 FBS（ＩＳ社製）を18％、100mM
β−メルカプトエタノール水溶液（ナカライテスク製）
を0.1 ％(v/v) 含む半流動培地 450μl に、105 個の骨
髄細胞を入れて、上記で得た血清を融解したものを個体
ごとに50μl(v/v)添加した。培養開始日を初日とし、37
℃、５％CO2 飽和湿度下で、６日間インキュベートし
て、６日目に 100倍の顕微鏡下で20細胞以上と認められ
る細胞集塊または細胞集団をコロニーとし、その数を計
測した。処理群、未処理群とも一群の平均値と実験誤差
を求め、活性の強さを比較した。
【００１１】薬用ニンジン中の血清ＣＳＦ活性誘導物質の分離 （１）水溶性画分の調製（図１参照） 薬用ニンジン(Panax ginseng, C.A Meyer、長野県丸子
産）を刻み、その10kg（乾燥重量）を注射用蒸留水70リ
ットルで撹拌しながら室温で抽出し、ガーゼで濾過し、
濾液を回収した。濾液のヨーソ反応が陰性になるまで上
記の操作を繰り返し、濾液を合わせて抽出液とした。濾
紙で濾過することにより、残渣を除去して濾液を40±２
℃で減圧下、４リットルに濃縮した。10倍容量のメタノ
ールをスターラーで撹拌し、この中にこの濾液をゆっく
り滴下し、室温で１夜静置した後、濾紙で濾過後、沈澱
を注射用蒸留水２リットルで溶解する操作を３回繰り返
し、抽出液６リットルを得た。この濾液と等容量の水飽
和ｎ−ブタノールでブタノール可溶性画分を抽出する操
作を３回繰り返し、水相を回収した。水相を40±２℃で
減圧濃縮し、水溶性画分500gを得た。また、薄膜クロマ
トグラフィーにより、本画分にサポニンが含まれていな
いことを確認した。
産）を刻み、その10kg（乾燥重量）を注射用蒸留水70リ
ットルで撹拌しながら室温で抽出し、ガーゼで濾過し、
濾液を回収した。濾液のヨーソ反応が陰性になるまで上
記の操作を繰り返し、濾液を合わせて抽出液とした。濾
紙で濾過することにより、残渣を除去して濾液を40±２
℃で減圧下、４リットルに濃縮した。10倍容量のメタノ
ールをスターラーで撹拌し、この中にこの濾液をゆっく
り滴下し、室温で１夜静置した後、濾紙で濾過後、沈澱
を注射用蒸留水２リットルで溶解する操作を３回繰り返
し、抽出液６リットルを得た。この濾液と等容量の水飽
和ｎ−ブタノールでブタノール可溶性画分を抽出する操
作を３回繰り返し、水相を回収した。水相を40±２℃で
減圧濃縮し、水溶性画分500gを得た。また、薄膜クロマ
トグラフィーにより、本画分にサポニンが含まれていな
いことを確認した。
【００１２】（２）抽出物の精製（図２参照） 上記水溶性画分を注射用蒸留水に溶解し、限外濾過膜(P
LGC OMPO4, MILLIPORE社製）を用いて分画し、分子量1
0,000ダルトン以下の画分を得た。この画分を40±２℃
で減圧濃縮した後、酢酸、トリエチルアミンを用いてpH
４に調整し、200mM酢酸−トリエチルアミン緩衝液（pH
４）で平衡化した陽イオン交換樹脂(Dowex50W-X1 、室
町化学製）によって分画し、同緩衝液による非吸着画分
を得た。10mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH７）で平衡化
した陰イオン交換樹脂(Q-SepharoseFF,Pharmacia 社
製）を充填したカラムに、40±２℃で減圧濃縮してリン
酸ナトリウム緩衝液でpH７に調整した前記非吸着画分を
流した。同緩衝液で十分に非吸着画分を溶出した後、終
濃度250mM 塩化ナトリウム−10mMリン酸ナトリウム緩衝
液（pH７）で吸着画分をグラジェント溶出した。図３に
溶出パターンを示した。塩化ナトリウム濃度50〜70mMで
溶出する画分を集め、ゲル濾過クロマトグラフィー（Se
phadex G-15, Pharmacia社製）で分子量 500以下の低分
子を除去した後、40±２℃で減圧濃縮して、 Fr3-A画分
を得た。次に逆相HPLC(C18μ Bondapack,3.9mm ×30c
m、ウォーターズ社製）で、0.15％ TFA/H2Oと0.15％ TF
A/acetonitrilのグラジェント溶出によって分画し、活
性画分C18-fr3 を分取した。図４にゲル濾過クロマトグ
ラフィーの、図５に逆相HPLCの溶出パターンを示した。
LGC OMPO4, MILLIPORE社製）を用いて分画し、分子量1
0,000ダルトン以下の画分を得た。この画分を40±２℃
で減圧濃縮した後、酢酸、トリエチルアミンを用いてpH
４に調整し、200mM酢酸−トリエチルアミン緩衝液（pH
４）で平衡化した陽イオン交換樹脂(Dowex50W-X1 、室
町化学製）によって分画し、同緩衝液による非吸着画分
を得た。10mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH７）で平衡化
した陰イオン交換樹脂(Q-SepharoseFF,Pharmacia 社
製）を充填したカラムに、40±２℃で減圧濃縮してリン
酸ナトリウム緩衝液でpH７に調整した前記非吸着画分を
流した。同緩衝液で十分に非吸着画分を溶出した後、終
濃度250mM 塩化ナトリウム−10mMリン酸ナトリウム緩衝
液（pH７）で吸着画分をグラジェント溶出した。図３に
溶出パターンを示した。塩化ナトリウム濃度50〜70mMで
溶出する画分を集め、ゲル濾過クロマトグラフィー（Se
phadex G-15, Pharmacia社製）で分子量 500以下の低分
子を除去した後、40±２℃で減圧濃縮して、 Fr3-A画分
を得た。次に逆相HPLC(C18μ Bondapack,3.9mm ×30c
m、ウォーターズ社製）で、0.15％ TFA/H2Oと0.15％ TF
A/acetonitrilのグラジェント溶出によって分画し、活
性画分C18-fr3 を分取した。図４にゲル濾過クロマトグ
ラフィーの、図５に逆相HPLCの溶出パターンを示した。
【００１３】（３）精製画分の分析 C18-fr3 画分は、逆相HPLC（C18 μ Bondapack 3.9mm×
30cm、ウォーターズ社製）及びゲル濾過HPLC(TSK gel G
2500PWXL,7.5mm×30cm、東ソー製）を用いた分離で、UV
吸収（215nm)の検出器を用いて分析した結果、単一ピー
クを示した（図６ａ：逆相HPLC、図６ｂ：ゲル濾過HPL
C）。本画分はアミノ酸分析により、 Glx:Cys:Gly＝1:
1:1 を含むものであること、90％（乾燥重量％）がアミ
ノ酸で構成されること、FAB-MS分析から分子量が 612で
あること、さらにはクロマトでの挙動が酸化型グルタチ
オンと一致し、その還元体のクロマトでの挙動が還元型
グルタチオンと一致し、ＮＭＲスペクトルも一致するこ
とを確認した。以上のことから、本画分は酸化型グルタ
チオンであると同定できた。
30cm、ウォーターズ社製）及びゲル濾過HPLC(TSK gel G
2500PWXL,7.5mm×30cm、東ソー製）を用いた分離で、UV
吸収（215nm)の検出器を用いて分析した結果、単一ピー
クを示した（図６ａ：逆相HPLC、図６ｂ：ゲル濾過HPL
C）。本画分はアミノ酸分析により、 Glx:Cys:Gly＝1:
1:1 を含むものであること、90％（乾燥重量％）がアミ
ノ酸で構成されること、FAB-MS分析から分子量が 612で
あること、さらにはクロマトでの挙動が酸化型グルタチ
オンと一致し、その還元体のクロマトでの挙動が還元型
グルタチオンと一致し、ＮＭＲスペクトルも一致するこ
とを確認した。以上のことから、本画分は酸化型グルタ
チオンであると同定できた。
【００１４】 （４）C18-fr3 の血清ＣＳＦ活性誘導作用の評価 上記で得られたC18-fr3 の画分及び（１）で得られた薬
用ニンジン水溶性画分（図中、K-CEで示す）について、
上記血清ＣＳＦ活性の誘導作用の評価法により測定した
結果を図７に示す。図中、生理食塩水は薬用ニンジン抽
出物または分離画分に代えて、生理食塩水を投与したも
ので、未処理群である。この結果から明らかなように、
酸化型グルタチオンを含有する薬用ニンジン分離画分は
血清ＣＳＦ活性誘導作用を有することが分かる。
用ニンジン水溶性画分（図中、K-CEで示す）について、
上記血清ＣＳＦ活性の誘導作用の評価法により測定した
結果を図７に示す。図中、生理食塩水は薬用ニンジン抽
出物または分離画分に代えて、生理食塩水を投与したも
ので、未処理群である。この結果から明らかなように、
酸化型グルタチオンを含有する薬用ニンジン分離画分は
血清ＣＳＦ活性誘導作用を有することが分かる。
【００１５】（５）市販のグルタチオンの血清ＣＳＦ活
性誘導作用の評価 市販の酸化型グルタチオン（G4501, Sigma社製、図中GS
SGと標記) 、及び還元型グルタチオン（G4251, Sigma社
製、図中GSH と標記）について、上記と同様の方法によ
り血清ＣＳＦ活性誘導作用の評価を行なった。この結果
を図８に示す。この結果から、酸化型グルタチオンには
血清ＣＳＦ活性誘導作用があり、還元型グルタチオンに
はこの活性が認められないことが明らかとなった。
性誘導作用の評価 市販の酸化型グルタチオン（G4501, Sigma社製、図中GS
SGと標記) 、及び還元型グルタチオン（G4251, Sigma社
製、図中GSH と標記）について、上記と同様の方法によ
り血清ＣＳＦ活性誘導作用の評価を行なった。この結果
を図８に示す。この結果から、酸化型グルタチオンには
血清ＣＳＦ活性誘導作用があり、還元型グルタチオンに
はこの活性が認められないことが明らかとなった。
【００１６】
【発明の効果】本発明の酸化型グルタチオンまたはそれ
を含む薬用ニンジンの精製画分を有効成分とする血清Ｃ
ＳＦ活性誘導剤は生体内で造血因子の活性を誘導するの
で、ＣＳＦ活性誘導を作用機序とする癌化学療法、放射
線療法の副作用軽減作用、感染防御作用、生体防御機能
促進作用を有する誘導剤として有用である。また、通常
生体内のグルタチオンは還元型で大部分が存在するが、
酸化型と還元型の変換経路及び代謝経路が生体内にそな
わっていることから生体内での副作用の起こる確率は低
いと考えられ、薬剤としての性質が秀れている。
を含む薬用ニンジンの精製画分を有効成分とする血清Ｃ
ＳＦ活性誘導剤は生体内で造血因子の活性を誘導するの
で、ＣＳＦ活性誘導を作用機序とする癌化学療法、放射
線療法の副作用軽減作用、感染防御作用、生体防御機能
促進作用を有する誘導剤として有用である。また、通常
生体内のグルタチオンは還元型で大部分が存在するが、
酸化型と還元型の変換経路及び代謝経路が生体内にそな
わっていることから生体内での副作用の起こる確率は低
いと考えられ、薬剤としての性質が秀れている。
【図１】薬用ニンジン刻みからの水溶性画分の抽出例を
示す。
示す。
【図２】水溶性画分を分離して、C18-fr3 を得るまでの
過程を示す。
過程を示す。
【図３】陰イオン交換クロマトグラフィーの溶出パター
ンを示す。
ンを示す。
【図４】ゲル濾過クロマトグラフィーの溶出パターンを
示す。
示す。
【図５】逆相HPLCの溶出パターンを示す。
【図６】(a) 逆相HPLC及び(b) ゲル濾過HPLCによる純度
検定のためのクロマトグラムを示す。
検定のためのクロマトグラムを示す。
【図７】C18-fr3 の血清ＣＳＦ活性誘導作用の評価結果
を示す。
を示す。
【図８】酸化型グルタチオン、還元型グルタチオンの血
清ＣＳＦ活性誘導作用の評価結果を示す。
清ＣＳＦ活性誘導作用の評価結果を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 高田 正昭 長野県小県郡武石村大字鳥屋99−４
Claims (3)
- 【請求項１】 酸化型グルタチオンまたはその薬理上許
容される塩を有効成分とする血清ＣＳＦ活性誘導剤。 - 【請求項２】 薬用ニンジン水抽出物から分離された酸
化型グルタチオンを含む画分を有効成分とする血清ＣＳ
Ｆ活性誘導剤。 - 【請求項３】 薬用ニンジン水抽出物から分配、陽イオ
ン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラ
フィー、ゲル濾過クロマトグラフィー及び逆相HPLCの少
なくとも１つ以上を用いて分離して、酸化型グルタチオ
ンを含む画分を得ることを特徴とする血清ＣＳＦ活性誘
導剤の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5184404A JPH0782167A (ja) | 1993-06-29 | 1993-06-29 | 血清ｃｓｆ活性誘導剤及びその製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5184404A JPH0782167A (ja) | 1993-06-29 | 1993-06-29 | 血清ｃｓｆ活性誘導剤及びその製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0782167A true JPH0782167A (ja) | 1995-03-28 |
Family
ID=16152580
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5184404A Pending JPH0782167A (ja) | 1993-06-29 | 1993-06-29 | 血清ｃｓｆ活性誘導剤及びその製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0782167A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7186423B2 (en) * | 1997-12-12 | 2007-03-06 | Fx Life Sciences International Gmbh | Processes of making North American ginseng fractions, products containing them, and uses as immunomodulators |
| US7371411B2 (en) | 1998-11-23 | 2008-05-13 | Novelos Therapeutics, Inc. | Methods for production of the oxidized glutathione composite with CIS-diamminedichloroplatinum and pharmaceutical compositions based thereof regulating metabolism, proliferation, differentiation and apoptotic mechanisms for normal and transformed cells |
-
1993
- 1993-06-29 JP JP5184404A patent/JPH0782167A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7186423B2 (en) * | 1997-12-12 | 2007-03-06 | Fx Life Sciences International Gmbh | Processes of making North American ginseng fractions, products containing them, and uses as immunomodulators |
| US7371411B2 (en) | 1998-11-23 | 2008-05-13 | Novelos Therapeutics, Inc. | Methods for production of the oxidized glutathione composite with CIS-diamminedichloroplatinum and pharmaceutical compositions based thereof regulating metabolism, proliferation, differentiation and apoptotic mechanisms for normal and transformed cells |
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