JPH078240B2 - 遺伝的変異を検出する方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、個体の２本鎖DNAを１種または２種以上の制
限酵素により切断し、えられたフラグメントを電気泳動
により二次元に分離し、えられた分離パターンをメンブ
ランフィルターに移し、その上でDNA変性条件下に標識
されたDNAまたはRNAプローブでハイブリダイズし、つい
で標識を視覚化することにより遺伝的変異を検出する方
法に関する。

［従来の技術および発明が解決しようとする課題］ かかる方法、いわゆるDNA診断用薬の分野におけるも
の、すなわち罹患しているあるいは発癌物質にさらされ
ているなどの指標でありうる遺伝的変異を示すための分
析方法の使用であって、個体の同定として役立ちうる。
遺伝的変異は、DNAの塩基配列についていうと一般に個
体差を意味している。遺伝的変異は、制限酵素での消化
によってえられたDNAフラグメントを電気泳動で分離し
たのちにハイブリダイゼーション分析を行なうことによ
って検出することができる［サザン・ブロット・ハイブ
リダイゼーション・アナリシス（Southern Blot hybrid
ization analysis）；サザン（Southern）、1975年参
照］。特定の放射性標識の付されたDNAフラグメント
（プローブ）でのハイブリダイゼーションは、オートラ
ジオグラフィー後、１またはそれ以上のセレクトバンド
として現われる。各バンドは使用プローブでハイブリダ
イズされたDNAフラグメントを表わしている。バンドの
位置は問題のフラグメントの大きさの尺度である。も
し、１つの特定プローブに対し、バンド位置が使用した
制限酵素に対する認識部位の削除／挿入および／または
有無の結果として個体間で変化するならば、これは遺伝
的多型（genetic polymorphism）または制限フラグメン
ト長多型（restriction fragment length polymorphis
m）と呼ばれる。ゲノムにおけるいくつかの領域が他の
領域よりもより多型現象を示すことが経験的にわかって
いる。

かかる多型性領域に対するプローブが非常に有用である
のは、遺伝性疾患が発生しているファミリー内で、問題
の多型DNA配列の変異体と共にこの疾患の遺伝形質（inh
eritance）は、欠陥遺伝子がそれに近接していることを
示しているからである（グェゼラ、1986年）⁽⁷⁾。これ
は疾患遺伝子（disease gene）の「遺伝地図作製（gene
tic mapping）」と呼ばれている。もちろん、多型マー
カー配列が互いに相関して（relatively to each othe
r）かつ特定染色体のどこに存在するかを正確に知るこ
とはついで非常に重要である。究極的に全ゲノムについ
て、この方法で多数の（いわばこれらを結合している）
多型マーカーの相対位置を決定することにより地図を作
成することができる（ボットスタインら、1984）⁽³⁾。
最近、何百程の多型マーカーにもとづいてヒトゲノムの
部分の仮連鎖地図（provisional linkage maps）が作成
された（ドニス‐ケラーら、1987年およびナカムラら、
1988年）^(5)(14)。ヒトゲノムのかかる遺伝地図によっ
て、原則として各遺伝性疾患をゲノムの特定遺伝子座と
結びつけることができる。位置確認の正確さに依存して
（したがって連鎖地図の情報性（informativeness）に
依存して）、疾患遺伝子自身が究極的に単離されるう
る。

しかしながら、従来の連鎖地図は多数の欠点を有してい
る。まず第１に、すべてのマーカーが等しく情報的（in
formative）でなく、すなわち多型であることである。
このことは、研究したいと望む遺伝性疾患を有するファ
ミリーにおいて、各個体がマーカーの同一変異体を有し
ているチャンスが大きいことを意味している。したがっ
て、そのばあい、正常（healthy）と欠陥の対立遺伝子
の分離は見ることができない。しかも、すべてのマーカ
ーはゲノム全体に均一に分配されない。

連鎖地図を作成するための可能性のある別の方法は、VN
TR［バリアブル・ナンバー・オブ・タンデム・リピート
（Variable Number of Tandem Repeat）］とも称される
いわゆる高多型性ミニサテライト（hyperpolymorphic m
inisatellites）の使用である。ミニサテライト配列
（ジェフリーズ、1985年）⁽⁸⁾はいわゆる縦列反復配列
である。反復単位数における個体間の変異（variatio
n）はそれらを非常に多型にする（第１図参照）。多く
のミニサテライトは非常に情報的（高多型）であり、す
べての染色体で生じる（第２図参照）。実際、大規模で
遺伝子座‐特定ミニサテライトプローブを単離し、これ
らを（非常に情報的な）遺伝子連鎖地図のマーカーとし
て使用することが提案されている（ナカムラら、1987
年）⁽¹³⁾。

ゲノム全体に釣合いをとって分配された１組の高多型性
マーカーが入手できるとすぐに、いずれの遺伝性疾患も
原則としてマッピングすることができる。しかしなが
ら、地図を完成するためには、用いる分離法の比較的抵
い分解能の結果、多大の実験が要求される。事実、遺伝
子座‐特定ミニサテライトを使用するときは、１個体当
りりたった２つの対立遺伝子（１つの座）がスコアされ
うるだけである。ミニサテライトコア配列（minisatell
ite core sequence）を用いる実験において、原則とし
て、すべてではないが非常に多くのミニサテライトを視
覚化することは可能であるが、サザン法による連鎖分析
にとってはこれは終りのない作業である。第３図は、DN
Aプローブとしてミニサテライトコア配列を使用したば
あい非常にたくさんのフラグメントが検出されることを
示している。しかしながら、もっとも大きいバンドのわ
ずか15個程度が互いに分離して観察することができるだ
けである。各バンドは１つの対立遺伝子を示す（用いら
れる制限酵素がミニサテライトを切断しないことを仮定
すれば）。えられるバンディングは各個体によっ異な
り、同定のために使用することができる。（ジェフリー
ズ、1985年およびEP-A-0186271）⁽⁹⁾⁽¹⁾。しかしなが
ら、わずかな遺伝子座しか同時に分析することができ
ず、また与えられた遺伝子座の両対立遺伝子（父系母系
両対立遺伝子）を同時に示しうことを決して保証できな
いので、連鎖分析へのこのシステムの使用ははばまれて
いる。

いわゆる連鎖地図を作成するために、すなわちヒトゲノ
ムをマッピングするために、ミニサテライトプローブを
使用する提案（ナカムラら、1987年）⁽¹³⁾は、遺伝子座
に関して特異的なプローブの使用に限定されており、し
たがってそれらの反復特性を利用できない。連鎖分析の
ために、そのファミリーに属する座を含むすべてのミニ
サテライトの総計を示すコア配列は使用できないが、プ
ローブとしてのクローン化された対立遺伝子によって各
座は別々に分析されなければならない。反復配列は、た
とえそれらが多型であるとしても、一次元サザン分析法
では分解能が低くて反復配列ファミリーの全対立遺伝子
を互いに分離してオートラジオグラム上に視覚化できな
いので、一般には連鎖分析には不適切である。

前記のごとく、遺伝的変異は従来より実質的にかつもっ
ばらよく知られているサザンブロットハイブリダイゼー
ション分析（サザン、1975年）⁽¹⁶⁾によって示されてき
た。これによって、多数の変異点が検出されていて、そ
れらのいくつかは直接的医療重要性を有しており、たと
えばいくつかの疾患の原因となっているグロビンの遺伝
子におけるある変異（variations）（グェゼラ、1986
年）⁽⁷⁾があげられる。その他のものはそうでなくと
も、同一性試験を行なうために使用できるので興味ある
ものであり、たとえば前記ミニサテライト（ジェフリー
ズ、1985年およびEP-A-0186271）⁽⁹⁾⁽¹⁾があげられる。

1970年代終りまでにDNAフラグメントの融解挙動（melti
ng-out behaviour）に基づく別の分離法が開発されてい
る（フィッシャーおよびラーマン、1979年）⁽⁶⁾。長さ
は等しいが塩基対組成の異なる２つのDNAフラグメント
が、変性剤（たとえば尿素／ホルムアミド）勾配または
温度勾配（ポーら、1987年）⁽¹⁵⁾が与えられているポリ
アクリルアミドゲルを通して電界の影響下に移動すると
すれば、それらは特定のポイントで融解するであろう。
勾配におけるこのポイントは、もし２つのフラグメント
が１部位のみで異なるならこのことがすでに融解挙動の
差異となって現われるほど高度に配列依存（sequence-d
ependent）している。融解は変性剤の所定濃度で突然起
こり、移動における大きな遅れをもたらす。DNAフラグ
メントの塩基対配列にもとづくこの分離は、フラグメン
トサイズとは独立したものである。

前記文献においては（フィシャーおよびラーマン、1979
年）⁽⁶⁾、この分離基準は、２次元パターンをうるため
にサイズ分離と組合わされている。２つの異なる分離基
準のために他の２次元DNA分離システムとは異なるこの
システムは、制限酵素EcoRIによる消化によってえられ
るフラグメントを分離するために細菌エシェリシア・コ
リ（Escherichia coli）のDNAと使用されている。電気
泳動分離後、DNAフラグメントはエチジウムブロマイド
で染色することによって視覚化された。約３×10⁹個の
塩基対を含有するヒトゲノムと比べると、エシェリシア
・コリは非常に簡単なDNAを有する生物であり、制限酵
素で消化したのちちにかかる２次元ゲル上で完全に分解
することができる。これまで前記原則にしたがって２次
元ゲルはヒトゲノムの分析には用いられていなかった。
当然、ヒトゲノムの大きな複雑性はエチジウムブロマイ
ドでの染色にもとづく全ゲノム（total genomic）DNAの
２次元分析の妨害となっており、予想されるフラグメン
ト数（EcoRIでの消化液で百万）は全くあまりも大きす
ぎる。

もし公知のサザンブロットハイブリダイゼーション分析
と同様に分離パターンをたとえばニトロセルロース紙に
移すことができて、ついで１種以上の適当なプローブに
よるハイブリダイゼーションを行なえるなら、この問題
は多分克服することができる。

しかしながら、これまでの実施によれば、DNA分離パタ
ーンのポリアクリルアミドゲルからの移転（transfer）
には問題があり、今までのところこれに対する満足な解
決法は見出されていない。1984年に発行された文献にお
いて（シャーチおよびギルバート、1984年）⁽⁴⁾、ナイ
ロンメンブランフィルターへのかかる移転のためのプロ
トコールが、ゲノムDNAにおける遺伝子のヌクレオチド
配列を直接決定する方法の構成内で記載されているが、
実際には該プロトコールをうまく実施するには非常に困
難であることが判明した。。有効な移転を実現する困難
性はとくに変性勾配分析（denaturing gradient analys
is）で感じられる。変性勾配分析においては、アガロー
スはあまりにも大きな孔（低分離）を有しておりまた電
気泳動を行なう温度（60℃）で液体であるので使用でき
ない。推測するに、それはポリアクリルアミドが非常に
微細なメッシュ構造でありかつ正規網状構造（the regu
lar network structure）であって、これらがDNA、とく
に２本鎖DNAの移転を非常に困難にしている。

本発明者らは、変性勾配分離パターンをメンブランフィ
ルターへ移す多くの試みを行った。まず電気泳動移転
（エレクトロブロッティング（electroblotting））を
使用しているシャーチおよびギルバートのプロトコール
から開始した。このプロトコールは、変性勾配分離パタ
ーンに対してはうまくいかないことが判ったが、最終的
に本発明者らは有用で再現性のあるプロトコールをもた
らすような変形を行なうのに成攻した。えられた経験
は、それが、役割をはたす移転の効率みならずDNAが最
終的にフィルター上に到達する条件でもあること（たと
えばフラグメントが１本鎖であるか２本鎖であるかどう
か）を示した。ひいては、これが使用プローブに依存し
た最終実験結果となるハイブリダイゼーション効率を決
定する。本発明者らは、ポリアクリルアミドゲルに含ま
れる部分融解DNAを、もしDNAがたとえば紫外線（302n
m）の照射によりさらに切断されて、ついでたとえば水
中で煮沸することにより変性されるなら、効率的に移す
ことができることを見出した。

一方、２番目の適切なプロトコールが、明らかに、より
手間や時間のかかるものではあるが、他人によって開発
された（ボレッセンら、1988年）⁽²⁾。これにおいて
は、電気泳動分離をアガロースとポリアクリルアミドの
混合物中で行なっている。ポリアクリルアミドの存在は
変性勾配分析を可能にする。しかしながら、アクリルア
ミド長鎖を架橋するためにビス‐アクリルアミドを用い
ている通常のポリアクリルアミドゲルとは異なり、ここ
ではいわゆる可逆性架橋剤、すなわちジアリル酒石酸ジ
アミドを使用している。これは、電気泳動分析後、架橋
が過ヨウ素酸処理によって切断されうることを意味して
いる。これはアガロースに影響しないので、該処理を行
ない幾度かの洗浄後、純粋なアガロースゲルが残ること
を意味している。移転は今や通常の操作（サザン、1975
年）⁽¹⁶⁾にしたがったキャピラリーブロッティング（ca
pillary blotting）によって行なうことができる。

最近、本発明者らは、２次元ゲル電気泳動を行ない、つ
いでプローブとして反復DNA配列を用いるハイブリダイ
ゼーション分析を行なうことが、エージング（ageing）
でDNA中の転移（transpositions）を検出するのに好適
であることを提案した（ベイヒおよびウィッテルリンデ
ン、1987年）⁽¹⁹⁾。しかし、分離パターンの転移に適し
たプロトコールは該文献には与えられていない。しか
も、反復DNA配列は一般に遺伝子ファクターの連鎖の研
究においてプローブとして使用するのには適していると
は思われない。これに対し、かかる作業のためのプロー
ブの調整においては、反復配列は、サザンブロット分析
においてプローブとして使用すると、関連する（involv
ed）遺伝因子の分析を不可能にするほどの複雑なバンド
パターンを生ずるので、可能な限り避けるべきものとさ
れているものである。

同程度の複雑さが、全ヒトゲノムDNAの２次元分析後に
も見られる。これは、（すべての制限フラグメントを視
覚化する）エチジウムブロマイドでの染色後と反復DNA
配列のためにプローブを使用するハイブリダイゼーショ
ン後のいずれのばあいも、２次元ゲルのある領域に制限
フラグメントの明瞭な「クラスタリング（clusterin
g）」を与える。

［課題を解決するための手段］ 驚くべきことに、かかるクラスタリングはミニサテライ
ト‐コア配列をプローブとして使用するときには起らな
いこと、およ２次元パターンがついに非常に良好な分離
をもってえられ（第６図参照）、該パターンにおいて特
定フラグメント（スポット）の遺伝形質（inheritanc
e）（第９〜10図参照）もまた再現性よく観察されうる
ことが見出された。

遺伝子座に関して特異性のあるVNTRプローブでのHae II
I開裂ヒトゲノムDNAの２次元パターンの分析は（コアプ
ローブと遺伝子座に関して特異性のあるミニサテライト
プローブ間の差異については（第２図参照））、遺伝子
座の両対立遺伝子が変性勾配（denaturing gradient）
においてほぼ同位置に移動することを示した。これは、
隣接領域に対するミニサテライトの相対的GCリッチネス
（第7A図参図）によるものであると本発明者らは確信し
ている。本発明者らが創生した制限酵素フラグメントの
安定なGCに富んだミニサテライトは融解が遅いであろ
う。これは、相対的にATに富んだ隣接領域が勾配におけ
る制限フラグメントの電気泳動挙動を決定することを意
味している。ミニサテライトと異なり、これらの隣接領
域は実際に非多型であるので、ミニサテライト遺伝子座
の２つの対立遺伝子は勾配におい同一位置に移動するで
あろう。この移動挙動は、関係するフラグメントのサイ
ズ（800〜9500bp）とは独立であることが見出された
（第8a〜8b図参照）。このことは複合２次元スポットパ
ターンにおいて、与えられた遺伝子座の両対立遺伝子を
常に見ることができるという確かさを提供する。これに
おいて、２次元法（ジェフリーズら、1986年）⁽¹⁰⁾は、
ジェフリーズらによって提案されたごとき遺伝子連鎖研
究におけるミニサテライトコアプローブの使用とは本質
的に異なるものである。プローブとして他のGCに富む反
復配列（たとえばシンプルシークエンスモティーブ（si
mple sequence motivs）；タウツおよびレンツ、1984
年）⁽¹⁷⁾を使用するハイブリダイゼーション分析が匹敵
する高分解スポットパターンを示したので、反復配列が
GCに富むことがこのための条件であると推定することは
妥当である。事実、本発明者らによって、ATに富んだ領
域を有する反復配列では低分解パターンになることが示
されている（たとえば、ATに富んだ部分を含有すること
が知られている第５図におけるB1反復参照）。

したがって、本発明は、生ずるDNAフラグメントの電気
泳動分離を２つの独立した基準にもとづいて２次元で行
なうものであって、該フラグメントをそれらの長さに基
づいて一方の次元に分離し、それらの塩基対配列に基づ
いて他の次元に分離し、かつハイブリダイゼーション分
析におけるプローブとしてミニサテライト配列またはそ
の他GCに富む反復配列の１種または２種以上のコアを含
有する標識されたDNAまたはRNA分子を使用することを特
徴とする前記種類の方法を提供するものである。プロー
ブとしては³²Pなどの放射性同位体またはビオチンなど
の非放射性標識で標識されたプローブを用いることがで
きる。

かくして本発明の本質は、とくにメンブランへの移転お
よびハイブリダイゼーション分析が続く、個体のDNAの
制限フラグメントの２次元電気泳動分離によって個体
（ヒトのみならず、動物、とくに純血種の馬や犬などの
動物のゲノムに類似の多型配列を有する植物も含む）の
連鎖地図を作成するために、高多型性ミニサテライト
（または他のGCに富んだ反復配列）のコア配列を使用す
ることからなる。

［実施例］ 本発明は、 （１）GCに富む反復配列を含有するDNAフラグメントの
融解特性にもとづいて、２次元の個体特有の高分解分離
パターンをハイブリダイゼーション分析によってうるこ
とができること、 （２）前記原則にもとづいて、同一性試験の信頼性を大
きく向上することができること、 （３）前記原則にもとづいて、ファミリーにおけるそれ
らの伝達の間において多数のスポット（対立遺伝子）を
同時にフォロー（follow）することができること、 （４）前記原則およびゲノムにおいて研究されている対
立遺伝子の位置についての情報にもとづいて、いわゆる
連鎖地図を個体について構成することができること、 （５）かかる連鎖地図の正確さは、ゲノム中のマーカー
遺伝子座間のスペースに依存しており、したがって１つ
のゲル上で分離されうるスポット数に依存しているこ
と、 （６）どの遺伝子性疾患も多型マーカーと直接結びつく
ように前記システムを使用することができること、 （７）前記システムは、１種または２種以上のマーカー
との連鎖不平衡による遺伝的変異と有病率とを結びつけ
ることにも役立つこと、 （８）前記システムは、発癌性の疑いのある物質にさら
されたのちの危険度を評価するのに適していること、 （９）前記システムは、GCに富んだ配列を付けたDNAに
変換されたRNA分子の複合個体群を比較するのに適しい
ること、および （10）前記システムは、データファイルと組合わされた
アドバンスドイメージ分析によるコンピュータ化にすば
らしく適していること、 を意味している。

前記要約は、本発明が一般に核酸分子（DNAおよびRNA）
の複合個体群を分析するのに使用しうること、とくに同
一性試験（たとえばアクターシップ（actorship）、父
系および母系に対する証拠としての法医学において）、
疾患遺伝子のマッピングおよび関連を研究すること、お
よび突然変異誘導試験の遂行のために使用しうることを
示している。

同一性試験（Identity test） まず第１の有用性は、同一性試験の信頼性を高めるため
に本発明によるシステムを適用することである。もし、
10個の多型性対立遺伝子が１つのゲルに含まれている親
関係試験（parenthood test）において、子供の10父系
対立遺伝子を、その子供の父親でない個体が有するとい
うチャンスは百万分の１であるとすれば、第９図に示さ
れるごとき２次元システム（ここでは54個の父系対立遺
伝子が１回のパスで判明）によって、どのように確実性
を何倍も高めることができるかが容易にわかる。

疾患遺伝子のマッピング 疾患遺伝子のマッピングは連鎖分析によって行なわれ
る。連鎖分析は、疾患遺伝子とリンクされた多型性遺伝
マーカーの遺伝形質を決定することからなる。これは、
問題にしている疾患の伝達が正確に知られているファミ
リー内において、該ファミリーの各メンバーにおける多
型マーカー（対立遺伝子）の異なる変異体を決定するこ
とによって行なわれる。ついで所定の対立遺伝子が常に
疾患と共に遺伝しているか否かを決定する。もし遺伝し
ておれば、該疾患が問題の多型マーカーとリンクされて
いると言い、それに近接して存在しているはずである。
この方法で遺伝性疾患の地図を作成するために、わずか
約１千万個の塩基対の平均空間を有するゲノム中に分散
された多数の多型マーカーが、遺伝性疾患ががひそんで
いるファミリーのメンバーにおいて（サザンブロット分
析法によって）分析されるべきである。もし問題の疾患
遺伝子が存在する位置についてなんの表示もなければ、
ゲノム中に一様に分配された総300以上の多型マーカー
を考慮すべきである（トータルハプロイドゲノムは事実
3.10⁹の塩基対の長さがある）。男性、女性および一人
の子供からなる最も簡単なファミリーのばあい、これは
900回のの１次元サザン分析を意味している。若干大き
いファミリーにおいては、これは２万のサザンブロット
に相当しうる。たとえ数十のサンプルが１ブロットで分
析されたとしても、依然、2000ブロットである。これは
かなりの時間と材料を要することは明らかである。

本発明はこの問題を変性勾配ゲルにおいてGCに富んだ反
復配列のある特徴的性質を使用し、かつこれらを先に使
用した電気泳動サイズ分離に結びつけることによって解
決している。えられる２次元分離パターンは高分解性で
あるという特徴があり、この結果、非常にたくさんのVN
TRおよび類似の多型反復配列を分析することができる。
遺伝子欠陥および疾病素質の検出における本発明の適用
は基本的に２つのルートで行なうことができる。

（ａ）先に特徴づけられた遺伝子座に関して特異性のあ
るプローブの混合使用：この適用は、とくに疾患遺伝子
が局在している所定の染色体についての事前情報がある
ばあいにみられる。このようなばあい、限られたセット
のプローブ（limited set of probes）を用いることの
みが必要である。従来の方法より優れている大きな利点
は、１つ１つではなくてむしろ同時に非常にたくさんの
遺伝子座を分析することができるという事実によってう
ることのできる膨大な時間的利益である。

（ｂ）非常にたくさんの遺伝子座を同時に検出するコア
プローブの使用：この適用は、疾患にかかわる遺伝子の
位置および数についてまったく情報がない疾患にすばら
しく適している。それは、とくに複数個の遺伝子と環境
因子の両方が関係する多因子性疾患、たとえばリューマ
チ関節炎などであり、従来のやり方では関係する遺伝子
の位置および同定についての洞察をうることは全ったく
不可能である。事実、複数個の遺伝子座との連鎖（link
age）を表わすのに要するサザン分析回数は、複数個の
マーカーを多数のファミリーにおいて分析しなければな
らないので恐ろしく増大する。この種のばあい、ときに
は何百もの個体分析しなければならない。約300のマー
カーから出発し、これは10万に近いサザンブロットをも
たらす。

２次元分析により、ゲノムの大部分を同時に分析するこ
とが可能である。これを決定するものは、互いに分離し
ているとなお観察されうる対立遺伝子数である。

イメージ分析システムによるコンピュータ分析は、実験
的に実現された分離パターンが700以上のスポットを含
むことを示した。しかし、単に若干大きなゲルを使用す
るだけで（かつ当然複数個の異なるプローブの混合物を
使用することにより）、検出される対立遺伝子の総数を
著しく増大することができる。たとえば、もし1000スポ
ットが互いに分離していると見ることができ、これらの
反復多型対立遺伝子の600個が一定間隔でゲノム中に分
散しているならば、ヒト個体の全遺伝子地図は今や現実
のものとなる。イメージ分析により、コンピュータに公
知の多型マーカーの標準２次元パターンを保存すること
が可能であり、のちに分析した個体のパターンをこれら
と簡単な方法で比較することができる。もし疾患が所定
パターンにしたがって伝達されているファミリーのDNA
サンプルが入手できるなら、この方法で、原則として、
すべての遺伝子疾患に対する遺伝子を非常に迅速に検出
することができる。

個体の全連鎖地図は種々の理由で非常に興味あるもので
ある。１つの理由は、全ゲノムDNAにおける疾患遺伝子
の位置がそれによって非常に迅速に決定されうるという
ことである。これは、プローブとして（ゲノム中に比例
して分配されている）約300の多型マーカー配列の混合
物を用いて疾患ファミリーの各メンバーの２次元パター
ンをうることによって簡単に行なうことができる。つい
で、約600の多型対立遺伝子（スポット）のどれが疾患
と共に遺伝しているかを決定することができる。実際の
ところ、疾患を有するファミリーのメンバーは、影響を
受けていない該ファミリーの個体が持っていない一定ス
ポットを必ず示すことが予想される。問題のスポットは
ついでゲルから抜き取ってルーチン操作によってクロー
ン化することができる。この方法ですべての遺伝性疾患
についてマーカーをうることができる。これらのマーカ
ーから疾患遺伝子自身を追跡することができ、それによ
って生化学的欠陥の詳細な分析の遂行が可能となる。し
かし、該マーカーは診断目的にも使用できる。実際、疾
患のひそんでいるファミリー内で、影響を受けていない
各個体について彼または彼女が疾患のキャリアーかどう
か、またいずれかが病気にかかっておればどの子がキャ
リアーであるかを認定することができる。現在これらの
試験は、約10mlの血液からまたは羊水サンプリング（出
生前の診断のばあい）によって行なうのはむしろ簡単で
あり、これは最近導入されたポリメラーゼ連鎖反応にも
とづいて、もっと簡単になる状況にある。しかしなが
ら、各試験における十字形因子（crucial factor）は多
型マーカーである。もし、たとえば、テストキットが普
通の形態（familliar form）のアルツハイマー病用に市
販されるならば、該キットはそのテストに使用するいく
つかの試薬に加えてマーカー用のプローブを含むものと
なる。したがって、そのポイントは各疾患に対して最も
近接するマーカーを見つけ出すことである。それは、疾
患と結びつけられたマーカーの検出にほかならず、これ
によりここに記載した技術システムを非常に価値あるも
のにしている。

突然変異誘導試験 発癌性物質の試験は、たえず新しく合成された薬剤が出
現する社会において非常に重要である。さらに、この試
験は、増大する癌危険性あるいは遺伝物質の永久的損傷
などの起こりうる永久的悪影響について試験されるべき
発癌物質（または、原子力発電所における災害をともな
うような放射線）にされされたかもしれない個体にとっ
て重要である。一方、種々の形態の癌と遺伝性欠陥の両
者がDNA中の変化によって起こることが明らかになって
いる。突然変異原（すなわちDNAの塩基配列を変える物
質）は実際、常に発癌物質である。したがって発癌性に
ついての多くの試験は、被験物質のDNA中に突然変異を
誘導する可能性にもとづいている。もっとも有名な試験
は、変異のためにバクテリアをスクリーニングするエイ
ムス試験である。バクテリアは人類ではないので、この
試験は100％信類できるわけではなく、現在価格的に匹
敵し、しかも結果の信頼できる方法が熱心に研究されて
いる。一般にヒト細胞による試験が好ましい。もし疑い
のある物質がヒト細胞のDNA中に何の異常も示さなけれ
ば、これはバクテリアにおける陰性結果よりもはるかに
信頼性がある。これは、非常に多くの遺伝子が同時に検
討されるばあいはなおさらのことである。

２次元分析によって、非常に多くの遺伝子を同時に研究
できるのみならず、とくに変異原に過敏であると推定さ
れうる遺伝子をも研究することができる。ミニサテライ
トは、個体間で大きく変わること、このことは高突然変
異頻度を示唆しているのであるが（ジェフリーズら、19
88年）⁽¹¹⁾、このことのみならず、たとえば腫瘍におい
ても変化を受けること（ゼインら、1987年）⁽¹⁸⁾も知ら
れている。もし突然変異誘導性（したがって発癌性）の
疑いのある物質がミニサテライトに変化をもたらさなけ
れば、それにさらされた人類の遺伝的完全性に対して該
物質は危険性を含まないと推定することができる。

同様に、ミニサテライトの２次元分析は、発癌物質にさ
らされた個体をスクーニングするために使用できる。単
に血液サンプルを取り、それに含まれるDNAの２次元分
析を行なうことにより、問題にしているヒトが受けてい
る遺伝子損傷を該個体から以前に取り出したサンプルと
比較して迅速に評価することができる。

つぎに本発明を実験例および図面によって説明するが、
本発明はもとよりこれらに限られるものではない。

第１図は、ある一つの染色体上でのミニサテライト遺伝
子座の可能な多数の変異体のうちの３つを示す図であ
る。変異体はミニサテライトの基本単位（basic unit
s）の数が異なることが示されている。

第２図は、ゲノム中の異なるミニサテライト遺伝子座の
構成を示す図である。遺伝子座間の差異は、ミニサテラ
イトの基本単位のいわゆる非コア部分（non-core porti
on）および隣接する配列に基づいている。

第３図は、５体の無関係の個体の死後脳組織から単離
し、制限酵素Hae IIIで開裂させてえた全ゲノムDNAのサ
ザンブロット分析のオートラジオグラムのスケッチ図で
ある。用いたプローブはミニサテライトコンセンサス配
列33.15であった。

第４図は、エチジウムブロマイドで染色したポリアクリ
ルアミドゲルのスケッチ図であり、該ゲルには制限酵素
Hae IIIで開裂させてえたヒトゲノムDNAが２つの次元に
分けられていた。第１の次元における大きさでの分離は
中性６％ポリアクリルアミドゲルで行なわれ、その後、
そのレーンを切り出し、幅方向（breadth-wisc）に変性
勾配を有するポリアクリルアミドゲルに適用し、第２の
次元で配列組成分離を行なった。この図は、制限酵素Ha
e IIIで哺乳類のゲノムを切断してえられたフラグメン
トの数（約100万）が多すぎ、各々を分別観察すること
ができないことを示している。第３図に提示されている
結果から引き出されるもう一つの重要な結論は、明らか
に２つの領域に密集しており、用いた分離基準が不充分
であることである。

個体（およびその変形）の全ゲノム構造に対する知見を
うるために、結局、いわゆる反復DNA配列をプローブと
して用いたハイブリダイゼーション分析を検討した。ハ
イブリダイゼーション分析は、通常、独自の遺伝子用の
プローブを用いるサザンハイブリダイゼーション（１次
元分離に基づく）によって行なわれる。なんとか、ゲノ
ムを通して規則正しく分布している反復DNA配列のファ
ミリー用のプローブを用いる２次元分離パターンのハイ
ブリダイゼーションがスポットの翻訳可能なパターンを
提供しえた。

しかしながら、全ゲノムDNAに見られる（第４図参照）
ものと同様の密集状態が、反復DNA配列ファミリーB1用
のプローブを用いナイロンフィルターへ移したゲルパタ
ーンのハイブリダイゼーションののちに観察された（第
５図参照）。このマウスのリピートファミリー（repeat
family）（ヒトの同種のものはAluと称されている）は
いわゆる分散型リピートカテゴリー（despersed repeat
category）（すなわち、ゲノムを通して規則的および
ランダムに分布している）に属することが知られている
ので、全ゲノムDNAを用いるばあいは、第２の次元での
不適正な分離によりその低い分離能となっているものと
最初に結論づけた。

第５図は、プローブとしてB1配列を用い、Hae IIIで切
断したラットゲノムDNAの２次元分離パターンのハイブ
リダイゼーション分析ののちにえられたオートラジオグ
ラムのスケッチ図である。プローブとしてB1配列を用い
ることにより、２次元パターンでゲノムを通して拡がっ
ているすべてのB1配列が検出できる。

しかしながら、それ以後の実験により観察された密集状
態は第２の次元の分離が不適当であったためではなく、
プローブの選択にあったことが証明された。

分散型リピートファミリーおよび縦列リピートサテライ
トに加えて、混合型、すなわち、いわゆる分散型リピー
トミニサテライトが存在する。この配列は、各々16〜64
個の塩基対の連続した反復単位からなり、ゲノムを通し
て拡散が生じている。それゆえ、たとえばcHa-rasプロ
ト腫瘍遺伝子の３′端にそうしたミニサテライトが存在
する。

そうしたミニサテライトの重要な点はその高多型性にあ
る。巨大な個人間の特性の差は、ある一つの遺伝子座中
の反復単位の数に関して、および異なる遺伝子座間に見
出されている。ミニサテライトは、いわゆるコア配列に
基づいて、それらの間では相同ではないファミリー内で
構成される。

ジェフリーズ（Jeffreys）らは、プローブとしてコア配
列を用い、同時にサザン分析を用いて10〜15のミニサテ
ライト領域が区分けできたことを示している。彼らはこ
の知見を個体の同定に用いている。ミニサテライト領域
の高多型性は、それぞれがミニサテライト領域を表わす
サザンブロット上の異なるバンドの位置での個体差を保
証している。ジェフリーズによって用いられたサザン分
析は最長のミニサテライト含有制限フラグメントのわず
か10〜15の区分けを可能しているだけであることに注意
を要する（第３図参照）。

高多型ミニサテライト配列のもう一つの重要な用途は、
疾患遺伝子の遺伝子的連鎖分析におけるマーカーとして
のものである。それらの連鎖分析への適正さは、それら
の高多型性により、さらにコア配列と異なり、全体とし
て、ミニサテライトとはゲノムのどこにおいても他のミ
ニサテライト配列と交叉ハイブリダイゼーションを起さ
ないという事実によって決まっている。

前記のごとく、個体の同定におけるミニサテライトの初
期の使用ではその反復特性が重要な利点であったが、連
鎖分析ではその性質は望ましくないものである。連鎖分
析におけるコア配列の使用は、対立遺伝子のごく限られ
た部分が視覚化されているだけであり、しかも父系およ
び母系対立遺伝子が同時にかつ互いに分離されて観察さ
れることが保証されているわけでもないのであるから、
充分な情報を与えるものではない（たとえば父系または
母系の一つがゲルの底部の殆んど分離されていないスミ
アー中に位置しているかも知れない。たとえば第３図参
照）。

２次元分離パターンのハイブリダイゼーション分析にプ
ローブとしてミニサテライトコア配列を用いようと決め
た。驚くべきことに、まえに試したB1分散リピートファ
ミリーとは違い、最初の試みののちにすでに、このもの
は第２の次元において優れた分離を与えると共に、ゲル
全体を通して実質的に最も望ましく分布したスポットパ
ターンを与えた（第６図参照）。

第６図はプローブとしてミニサテライトコア配列33.6を
用い、Hae IIIで切断したヒトゲノムDNAの２次元分離パ
ターンのハイブリダイゼーション後にえられたオートラ
ジオグラムのスケッチ図である。

第7a図は本発明の構成内で合成されたいくつかのミニサ
テライトコア配列の地図（survey）である。加えて、GC
に富んだまたはGCに富んでいない他のコア配列、すなわ
ち、いわゆる単純配列（simple sequence）、（CAG）_ｎ
および（GT）_ｎがB1反復ファミリーのためのプローブと
共に用いられている。

第7b図は、本発明で用いられるVNTRコア配列の調製と放
射性物質による標識づけのフローを示す図である。

第7c図は、本発明者らによって合成されたVNTRコアプロ
ーブのポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示すス
ケッチ図である。このスケッチ図においてプローブは長
さが11〜約2500の塩基対からなるコア配列のポリマーよ
りなっている。

そのものがなぜ変性勾配において規則正しい分離パター
ンを与える真にこのファミリーであるかという指標は、
遺伝子座特異プローブによるVNTR遺伝子座の２次元分析
でえられる（第８図参照）。個体24から単離されたDNA
はHae IIIで切断され２つの次元に分離された。

第8a図は遺伝子座特異プローブｐλG3によるハイブリダ
イゼーション分析後にえられたオートラジオグラムのス
ケッチ図である。詳しくは、同じDNAの一次元的分離は
中性ポリアクリルアミドゲル（第１次元PAAGE）と変性
勾配ゲル（第２次元DGGE）において示されている。個体
24のパターンは、両対立遺伝子（7.5と0.8kb）が大きさ
で大きく異なるものの変性勾配でほぼ同じ位置まで移動
していることを明示している。他の個体のDNAについて
も同様のことが認められている。

第8b図は、34個の異なる個体からえられた切断DNAのア
ガロースゲル電気泳動および変性勾配ゲル電気泳動（一
次元）の結果を示すスケッチ図である。この同図は遺伝
子座特異VNTRプローブpYNH24を用いてのハイブリダイゼ
ーション後にえられたオートラジオグラムを示す。変性
勾配でのすべての対立遺伝子はゲル中（等温（the isot
herm））で一つの位置に移動するが、アガロースゲルで
の種々の対立遺伝子はそれらの長さに基づいて異なる位
置に移動する。えられた分離パターンがつづく対立遺伝
子の分離に充分な高い分離能をもっていたか否かを調べ
るために、２次元分析を父、母および息子よりなるファ
ミリーについて行なった。

第９図は、Hae IIIで切断したヒトゲノムDNAの２次元分
離パターンのミニサテライトコア配列33.6をプローブと
して用いたハイブリダイゼーション分析後にえられたオ
ートラジオグラムのスケッチ図である。父、母および彼
らの息子から採取した３つのDNAサンプルを一つのゲル
で電気泳動した。肉眼で約600個のスポットが各個体に
つき判別でき（のちのコンピュータ分析では幾分多かっ
た）、それらのうちの150個は多型（父と母で異なる）
であった。これらのうちの105個は分離しており（父系5
2個で母系53個）、45個は息子のパターンには認められ
ない。後者は、ミニサテライトなどのヘテロ接合遺伝子
座ではすべての対立遺伝子が１人の子供に継承されるこ
とがないために生ずる。

第10図は、第９図で（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）で表示
された領域の詳細なスケッチ図である。

第９図にその結果を示す実験の大きな重要性は、問題と
されているミニサテライトファミリーに属するすべての
対立遺伝子をさかのぼって見出しうることである。理論
的には、ある一つのスポットにおいて同じ大きさでかつ
同じ融解特性を有するもう１つのまったく異なるものが
存在しうるが、古典的なサザンブロット分析における状
況とは異なり、そのようなことは到底ありえないであろ
う。したがって、第９図に示す２次元スポツトパターン
は個体のゲノム地図とみなされうる。なお、この点につ
いて各個体のスポットの同定後までそれらのパターンは
連鎖地図としての価値がえられない。この同定は、独自
のミニサテライトプローブと古典的なサザンブロットハ
イブリダイゼーション分析により進められている。した
がって近い将来、一つのゲルで視覚化されたフラグメン
トがデータファイルを１回通すことにより同定できるで
あろう。そして、ヒトの個体の全遺伝子地図が完成する
であろう。

これらの実験では、つぎの材料と方法を用いた。

［DNA単離と制限酵素消化］ 前記２次元パターンを作製するために、原則としてはDN
A源としてどのような組織でも使用できる。培養細胞も
適当である。一般的には、スタンダードなDNA単離手法
を用いることができる。前記の実験では、DNAは異なる
個体の脳組織から、および同じく異なる個体の血液から
単離した。脳組織由来のDNAの単離において、つぎの手
法を用いた。低温凍結死後小脳をフラグメント化し、ト
リス100mM、pH7.5、Na-EDTA250mM、１％ドデシル硫酸ナ
トリウム（SDS）およびプロテイナーゼＫ（BRL）100μg
/mlを含む溶液の２体積中で65℃にて一夜間培養した。
一体積の8M酢酸カリウムを混合したのち、溶液を氷上に
２時間置き、ついで１体積のクロロホルムで抽出した。
エタノール沈殿により水相からDNAがえられ、これを水
に溶解させた。血液由来のDNAは、常法で単離したもの
をＥ・バッカー（Bakker）博士（ライデン大学、人類遺
伝学部（Antropogenetics））より入手した。DNA（10μ
ｇ）を制限酵素エンドヌクレアーゼHae IIIまたはHinfI
（BRL）を用いて作製者記載の条件で切断した。

［電気泳動法による分離］ 10μgDNA制限フラグメントの２次元分離をポリアクリル
アミドゲル（アクリルアミド：ビスアクリルアミド＝3
7:1）で行なった。第１の次元の分離は、中性６％ゲル
で50℃、２時間、250Vにて１×TAE（40mMトリス、pH7.
4、20mM酢酸ナトリウム、1mM Na-EDTA）中で行なった。
１次元分離パターンは、エチジウムブロマイド（0.1μg
/ml）で10時間染色（暗中）し、ついで脱イオン水で少
なくとも30分間脱色することによって視覚化した。0.54
〜2.8kbの区域をレーンから切り出し、横方向の第２の
６％ポリアクリルアミドゲルに適用した。このゲルは変
性剤の10〜75％の直線状の濃度勾配（100％変性剤＝7.0
M尿素、40％ホルムアミド）を電気泳動方向に平行に有
していた。これらのゲルは直線状勾配作成機（linear g
radient former）中でペリスタティックポンプを用いて
バウンダリー（boundary）溶液を混合してキャストす
る。この第２の次元に対しては、20cm幅の標準器具に加
えて、隣り合わせで６レーンを収容する30cm幅のものも
しばしば使用した。12時間、225Vおよび60℃で電気泳動
を行なったのちゲルをエチジウムブロマイドで染色し、
ついで脱色して分離パターンを視覚化した。

［分離パターンのメンブランフィルターへの移転］ ２次元分離パターンをまず302nmの紫外線（UV）をゲル
に４分間照射することによって（これが最善である）フ
ラグメント化した。移すまえにゲルを５分間１×TBE（8
9MAトリス、89mMホウ酸、2mM Na-EDTA）中で沸騰させ、
ついで１×TBEに移した。ナイロンメンブラン（ナイロ
ン13N、シュライハー・アンド・シュエル・オア・ツェ
タビント（Schleicher and Schuell or Zetabind）、バ
イオラド（BioRad））への移転は、グラファイト板を用
いるエレクトロブロッティング装置中で400mA（12〜28
V）、15℃でエレクトロブロッティングすることにより
行なった。エレクトロブロッティングは、新たな１×TB
E（２回のエレクトロブロッティング期間のあいだで交
換した）中に浸したワットマン（Whattman）3MM紙で10
枚間で45分間の２つの期間で行なった。移転後、フィル
ターを２×SSC（１×SSC＝150mM Nacl、15mMクエン酸ナ
トリウム）中ですすぎ、空気中で乾燥し、炉（furnac
e）中で１時間80℃で加熱し、45秒間、302nmの紫外線を
照射した。

［プローブの作製と放射線標識付け］ プローブは２つの部分的に相補的なおよび重複的なオリ
ゴヌクレオチドをそれぞれ独立してリン酸化することに
より作製した。そのような対の一つが、ミニサテライト
コア配列である。用いた配列はコア配列33.6（５′‐AG
GGCTGGAGG-3′）であった。リン酸化後、２つのオリゴ
ヌクレオチドを混合し、57℃で１時間アニーリングし、
スタンダードな手法（マニアチィス（Maniatis）ら、19
82年）で結合（ligation）した。えられた合成プローブ
は塩基対500個以上の平均長さを有していた（第7c図参
照）。結合生成物50ngをランダムに活性化されたオリゴ
標識法（ベーリンガー（Boehringer））あるいは５分間
沸騰させて自己活性化させかつクレノウ（Klenow）酵素
の１単位の存在下２μＭのdNTP、50mMのトリス、pH7.
2、10mMのMgCl₂という条件下で再アニーリングをする方
法のいずれかによってα‐³²P-dCTPで標識付けした。３
〜８×10⁸c.p.m./μｇの比活性が達成された。

［ハイブリダイゼーション分析］ フィルターを５×SSC、20mMリン酸ナトリウム、pH7.2、
１％SDS、1mM Na-EDTA、50μg/mlヘパリン中で65℃にて
２時間プレハイブリダイズした。１×10⁶c.p.m./mlの濃
度の変性プローブを加えたのち、ハイブリダイゼーショ
ンを65℃にて12時間続けた。ついでフィルターを2.5×S
SC、0.1％SDS中で、室温にて５分間（３回）、65℃にて
20分間（３回）洗浄した。オートラジオグラフィーに
は、高強度スクリーン（コダック）間でコダックXAR-5
フィルムを用いて−80℃にて12〜48時間かけた。

［発明の効果］ 本発明によれば、GCに富む反復配列を含有するDNAフラ
グメントの融解特性にもとづいて、２次元の個体特有の
高分解分離パターンをハイブリダイゼーション分析によ
ってうることができ、遺伝子欠陥および疾病素質の検
出、同一性試験、突然変異誘導試験などに有用である。

（参考文献） （１） 欧州特許公開公報第0186271号明細書 （２） ボレッセン（Borresen）ら、ミューテーション
・リサーチ（Mutation Research）、202巻、77〜83頁、
1988年 （３） ボットスタイン（Botstein）ら、アム・ジェー
・フム・ゲンクト（Am.J.Hum.Genct.）、32巻、314〜33
1頁、1984年 （４） シャーチおよびギルバート（Church and Gilbe
rt）、プロック・ナトル・アカド・ソク・ユー・エス・
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rman）、セル（Cell）、16巻、191〜200頁、1979年 （７） グェゼラ（Gusella）、アン・レブ・バイオケ
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986年 （11） ジェフリーズ（Jeffreys）ら、ネーチャー（Na
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クローニング（Molecular Cloning）；ア・ラボラトリ
ー・マニュアル・コールド・スプリング・ハーバー・ラ
ボラトリー・プレス・ニュウ・ヨーク（A laboratory M
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e）、235巻、1616〜1622頁、1987年 （14） ナカムラ（Nakamura）ら、ゲノミックス（Geno
mics）、２巻、302〜309頁、1988年 （15） ポー（Po）ら、ヌクレイック・アシッズ・レス
（Nucleic Acids Res.）、15巻、5069〜5083頁、1987年 （16） サザン（Southern）、ジェー・モル・バイオル
（J.Mol.Biol.）、98、503〜517頁、1975年 （17） タウツおよびレンツ（Tautz and Renz）、ヌク
レイック・アシッズ・レス（Nucleic Acids Res.）、12
巻、4127〜4138頁、1984年 （18） ゼイン（Thein）ら、ブル・ジェー・キャンサ
ー（Br.J.Cancer）、55巻、353〜356頁、1987年 （19） ベイヒおよびウイッテルリンデン（Vijg and U
itterlinden）、メーク・エージング・デブ（Mech.Agei
ng Dev.）、41巻、47〜63頁、1987年

【図面の簡単な説明】

第１図は、ある一つの染色体上でのミニサテライト座の
可能な多数の変異体のうちの３つを示す図である。 第２図は、ゲノム中の異なるミニサテライト遺伝子座の
構成を示す図である。 第３図は、制限酵素Hae IIIで開裂させてえた、５体の
無関係の個体の全ゲノムDNAのサザンブロット分析のオ
ートラジオグラムのスケッチ図である。 第４図は、ヒトゲノムDNAを用いて２次元電気泳動を行
なったのちに、エチジウムブロマイドで染色したポリア
クリルアミドゲルのスケッチ図である。 第５図は、プローブとしてB1配列を用いた、ラットゲノ
ムDNAの２次元分離パターンのハイブリダイゼーション
分析ののちにえられたオートラジオグラムのスケッチ図
である。 第６図はプローブとしてミニサテライトコア配列33.6を
用い、ヒトゲノムDNAの２次元分離パターンのハイブリ
ダイゼーション後にえられたオートラジオグラムのスケ
ッチ図である。 第7a図は本発明の構成内で合成されたいくつかのミニサ
テライトコア配列の地図である。 第7b図は、本発明で用いられるVNTRコア配列の調製と放
射性物質による標識づけのフローを示す図である。 第7c図は、VNTRコアプローブのポリアクリルアミドゲル
電気泳動の結果を示すスケッチ図である。 第8a図は遺伝子座特異プローブｐλG3によるハイブリダ
イゼーション分析後にえられたオートラジオグラムのス
ケッチ図である。 第8b図は、34個の異なる個体からえられた切断DNAのア
ガロースゲル電気泳動および変性勾配ゲル電気泳動（一
次元）の結果を示すスケッチ図である。 第９図は、ヒトゲノムDNAの２次元分離パターンのミニ
サテライトコア配列33.6をプローブとして用いたハイブ
リダイゼーション分析後にえられたオートラジオグラム
のスケッチ図である。 第10図は、第９図で（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）で表示
された領域の詳細なスケッチ図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 アンドレアス・ガラルズス・アィッテルリ ンデン オランダ王国、3012‐セーデー ロッテル ダム、マウリツプラーツ 74 (56)参考文献 Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ ｏｇｙ，68（1980）Ｐ．183−191 Ｎｅｔｕｒｅ，314（1985）Ｐ．67−73

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】下記のステップからなる遺伝的変異を検出
   する方法。 ａ）二本鎖DNAを１種または２種以上の制限酵素により
   断片化し、 ｂ）得られたフラグメントを、電気泳動により、フラグ
   メントの長さに基づく次元とフラグメントの塩基対配列
   に基づく次元という２の独立した基準に基づいて二次元
   的に分離し、 ｃ）得られた分離パターン中のフラグメントを照射によ
   りさらに断片化し、 ｄ）任意に、さらに上記の分離されたパターンを加熱に
   より変性し、 ｅ）得られたフラグメントまたは変性された分離パター
   ンまたはその両方をメンブランフィルターに移し、 ｆ）該メンブランフィルター上で、ミニサテライト配列
   またはその他のGCに富む反復配列の１種または２種以上
   のコアを含む標識されたDNAまたはRNA分子を、DNAまた
   はRNAプローブとして、DNA変性条件下でハイブリダイズ
   し、そして、 ｇ）該標識を視覚化する。
2. 【請求項２】得られたDNAフラグメントを、まずその長
   さに基づいて中性ポリアクリルアミドゲルにより分離
   し、次いで電気泳動の方向に平行にDNA変性剤の濃度勾
   配が増大するポリアクリルアミドゲルにおいて塩基対配
   列に基づく第２の次元により分離する、請求項１記載の
   方法。
3. 【請求項３】長さに基づく電気泳動による分離を45〜55
   ℃の間の温度で行い、塩基対配列に基づく電気泳動によ
   る分離を55〜65℃の間の温度で行う、請求項２に記載の
   方法。
4. 【請求項４】紫外線を使って断片化したあとで、２次元
   電気泳動の後に得られた分離パターンがエレクトロブロ
   ッティング法によりメンブランフィルターに移すことを
   特徴とする、請求項１ないし３のいずれかに記載の方
   法。
5. 【請求項５】メンブランフィルターとしてナイロンメン
   ブランまたはそれと同等の材料を用いる請求項１ないし
   ４のいずれかに記載の方法。
6. 【請求項６】ミニサテライト、単純な配列、または、遺
   伝子座に対して特異性のあるプローブの混合物といった
   反復配列用の１種または２種以上のGCに富むコアを含む
   DNA分子をプローブとして用いる、請求項１ないし５の
   いずれかに記載の方法。
7. 【請求項７】得られたDNAフラグメントが特別に構成さ
   れたcDNAライブラリーに由来するものであり、そして、
   器官、組織、または細胞からのトータルRNAといったコ
   ンプレックスRNAポピュレーションから調整されたcDNA
   分子に、GCに富む配列が付いている、請求項１ないし６
   のいずれかに記載の方法。
8. 【請求項８】³²Pといった放射性同位体またはビオチン
   などの非放射性標識で標識されているプローブを用いる
   請求項１ないし７のいずれかに記載の方法。
9. 【請求項９】ａ）DNA変性剤の濃度勾配をもつゲルを含
   み、該ゲルにはフラグメントを断片化するために各DNA
   フラグメントの分離の後に放射線を照射するものであっ
   て、塩基対配列に基づく一方向と、長さに基づくもう一
   つの方向にDNAフラグメントを分離するのに適する２次
   元電気泳動用の材料と、 ｂ）分離され、断片化されたDNAフラグメントが移され
   るメンブランと、 ｃ）ミニサテライト配列、または、その他のGCに富む反
   復の１種か２種以上のコアを含んだ標識されたプローブ
   と、 からなる請求項１ないし８のいずれかに記載の方法を実
   施するためのキット。