JPH0787960A

JPH0787960A - 海洋性微細藻類の培養方法

Info

Publication number: JPH0787960A
Application number: JP5234826A
Authority: JP
Inventors: Kenichi Uehara; 原健一上; Tokio Iizuka; 塚時男飯; Daizo Takeuchi; 内大造武
Original assignee: Kawasaki Steel Corp
Current assignee: JFE Steel Corp
Priority date: 1993-09-21
Filing date: 1993-09-21
Publication date: 1995-04-04

Abstract

(57)【要約】【目的】海洋性微細藻類の藻体を高濃度で安定して生産
する海洋性微細藻類の培養方法の提供。【構成】海洋性微細藻類に属し、かつ、ドコサヘキサエ
ン酸を産生する能力を有する藻類を培養して増殖させた
藻体よりドコサヘキサエン酸を製造するに際し、α−ア
ミノ酸類として、酸性アミノ酸その塩、塩基性アミノ酸
またはその塩、それらのアミド類、またはイミノ酸を存
在させた培地で培養する海洋性微細藻類の培養方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ドコサヘキサエン酸を
産生する能力のある海洋性微細藻類を良好に増殖させド
コサヘキサエン酸の生産性を高めるための培養方法に関
するものである。ドコサヘキサエン酸は、近年、コレス
テロール低下作用、抗血液凝固作用、学習機能向上作用
など多彩な生理作用が報告されている高度不飽和脂肪酸
である。

【０００２】

【従来の技術】多彩な生理作用が報告されている高度不
飽和脂肪酸であるドコサヘキサエン酸について、魚油以
外に起源を求め、微生物などに選択的に産生させること
が、検討されてきた。中でも、海洋性微細藻類に属する
クリプテコディニウム・コーニーを増殖させることによ
り、ドコサヘキサエン酸を産生させることが、従来から
検討されてきた。

【０００３】クリプテコディニウム・コーニーなどの海
洋性微細藻類の培地は、採取する場所により、生理性質
が異なったり、滅菌によって沈澱を形成する海水を基本
としてこれに欠乏し易い栄養物質を添加した天然培地よ
りも、高圧滅菌によっても、沈澱を形成せず実験の再現
性も保証される合成培地が好まれている。

【０００４】クリプテコディニウム・コーニーの培養に
ついて扱ったものを幾つか挙げて示すと、アール・ジェ
ームス・ヘンダーソンらによる検討では、合成培地であ
るＡＸＭ培地を用いて、クリプテコディニウム・コーニ
ーによる¹⁴Ｃラベル化ドコサヘキサエン酸の生合成につ
いて報告がされている（Phytochemistry, 27(6),1679-1
683(1988) 参照）が、トリグリセライド画分やリン脂質
画分に占めるドコサヘキサエン酸の割合が示されている
のみであり、実際のドコサヘキサエン酸の収量等につい
ては触れられていない。

【０００５】また、アール・シー・タットュルらによる
検討では、藻体の増殖速度の最適化を目的とし、合成培
地であるＭＬＨ培地を基本として、その成分量の最適化
をはかり、世代時間への効果が報告されている（Phycol
ogia, 14(1),1-8(1975) 参照）が、各々のドコサヘキサ
エン酸など脂肪酸組成・含量への影響・効果については
触れられていない。

【０００６】さらに、マーテック社による検討では、ド
コサヘキサエン酸の収量の増大を目的として、天然海水
または人工海水を基本とし、グルコースと酵母エキスを
加えた培地による培養が報告されている（WO91/1191
8）。しかし、合成培地の個々の成分が藻体増殖やドコ
サヘキサエン酸蓄積に及ぼす効果については触れられて
いない。

【０００７】一方、本発明者らは、特願平０４−３４４
２７９号で、特定の糖類、有機窒素源、無機塩類および
重金属元素を含有する成分を必須成分とする培地を用い
て、海洋性微細藻類の藻体の安定した増殖とドコサヘキ
サエン酸の高い生産性を示した。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、海洋
性微細藻類に属し、かつ、ドコサヘキサエン酸を産生す
る能力を有する藻類を安定に増殖させ、その藻類の藻体
から抽出することにより、脂質中のドコサヘキサエン酸
の含量を高めるための簡便でかつ有効な組成の培地を提
供するものである。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明では、これらの問
題点を解決するために鋭意検討した結果、海洋性微細藻
類に属し、かつ、ドコサヘキサエン酸を産生する能力を
有する藻類を、α−アミノ酸類として、酸性アミノ酸、
その塩またはそのアミド、塩基性アミノ酸またはその
塩、またはイミノ酸を存在させた培地で培養することに
より、藻体の安定した増殖と脂質中のドコサヘキサエン
酸の含量が顕著に上昇することを見いだし、本発明をな
すに至った。

【００１０】すなわち、本発明は、海洋性微細藻類に属
し、かつ、ドコサヘキサエン酸を産生する能力を有する
藻類を培養して増殖させた藻体よりドコサヘキサエン酸
を製造するに際し、α−アミノ酸類として、酸性アミノ
酸またはその塩、塩基性アミノ酸またはその塩、それら
のアミド類、またはイミノ酸を存在させた培地で培養す
る海洋性微細藻類の培養方法を提供する。また、α−ア
ミノ酸類が、アスパラギン酸ナトリウム、グルタミン酸
ナトリウム、アスパラギンまたはグルタミンであるのが
好ましい。そして、α−アミノ酸類が、リシン、アルギ
ニンまたはアルギニン塩酸塩であるのが好ましい。そし
て、α−アミノ酸類として、グルタミン酸ナトリウムを
２．０〜３０．０ｍＭの濃度で、アスパラギンを１．０
〜２０．０ｍＭの濃度で、またはアルギニン塩酸塩を
０．２５〜１０．０ｍＭの濃度で存在させるのが好まし
い。また、イミノ酸が、プロリンであるのが好ましい。
さらに、前記海洋性微細藻類が、クリプテコディニウム
・コーニーＡＴＣＣ３００２１であるのが好ましい。

【００１１】本発明の培養方法に用いる海洋性微細藻類
として、クリプテコディニウム・コーニーなどに属する
菌株を、α−アミノ酸類として、酸性アミノ酸、その塩
またはそのアミド、塩基性アミノ酸またはその塩、また
はイミノ酸を存在させた培地で培養させると、非常に良
好な藻体の増殖を示すばかりでなく、高度不飽和脂肪酸
としてドコサヘキサエン酸の脂質中の割合を高度に上昇
できると同時に、生産性を向上できる点で特筆すべきで
ある。

【００１２】以下に、本発明を詳細に説明する。本発明
に利用される藻類は、海洋性微細藻類に属し、かつ、ド
コサヘキサエン酸を産生するものであればいずれでもよ
く、例えば、クリプテコディニウム・コーニー（Crypth
ecodinium cohnii）等が挙げられる。

【００１３】これらはＡＴＣＣ（American Type Cultur
e Collection）などの各種保存機関から入手できる公知
のものも利用することが可能である。具体的には、クリ
プテコディニウム・コーニー(Crypthecodinium cohnii)
ATCC30021, 30543, 30556, 30571, 30572, 30775, 5005
1, 50053, 50055, 50056, 50058, 50060 等が挙げられ
る。中でも、Crypthecodinium cohnii ATCC 30021 であ
ると、ＤＨＡ含有量が高いので好ましい。このほか、該
微生物に、例えば、紫外線照射や、各種変異剤による処
理等の公知の変異処理を施した変異株の使用も、本発明
に包含されるものである。

【００１４】本発明の培養方法に用いる培地は、必須成
分として、α−アミノ酸を含有することが肝要である。
そして、α−アミノ酸として、酸性アミノ酸またはその
塩、塩基性アミノ酸またはその塩、それらのアミド類、
またはイミノ酸が挙げられる。

【００１５】酸性アミノ酸またはその塩としては、グル
タミン酸、グルタミン酸ナトリウム、アスパラギン酸、
アスパラギン酸ナトリウム、等が挙げられる。塩基性ア
ミノ酸またはその塩としては、リシン、リシン塩酸塩、
アルギニン、アルギニン塩酸塩、ヒスチジン等が挙げら
れる。それらのアミド類としては、グルタミン、アスパ
ラギン等が挙げられる。イミノ酸としては、プロリン等
が挙げられる。

【００１６】本発明の培養方法に用いる培地にこれらの
α−アミノ酸またはイミノ酸の内の一種を単独で存在さ
せてもよいし、また、２種以上を一緒に存在させてもよ
い。これらのα−アミノ酸またはイミノ酸の培地中の含
有量は、グルタミン酸ナトリウムである場合、２．０〜
３０．０ｍＭであるのが好ましい。２．０ｍＭ未満で
は、高い藻体収率を得ることができず、したがって、ド
コサヘキサエン酸を得ることが難しく、３０．０ｍＭ超
では、増殖が著しく遅くなったり、藻体の生産する脂質
の量が大きく減少したりして、ドコサヘキサエン酸の収
率が減少し好ましくない。また、高価なアミノ酸である
ので、経済的観点を考慮にいれて３０．０ｍＭ以下であ
るのが好ましい。

【００１７】アスパラギンである場合、１．０〜２０．
０ｍＭであるのが好ましい。１．０ｍＭ未満では、高い
藻体収率を得ることができず、したがって、ドコサヘキ
サエン酸を得ることが難しく、２０．０ｍＭ超では、増
殖が著しく遅くなったり、藻体の生産する脂質の量が大
きく減少したりして、ドコサヘキサエン酸の収率が減少
し好ましくない。また、高価なアミノ酸であるので、経
済的観点を考慮にいれて３０．０ｍＭ以下であるのが好
ましい。

【００１８】アルギニン塩酸塩である場合、０．２５〜
１０．０ｍＭであるのが好ましい。０．２５ｍＭ未満で
は、高い藻体収率を得ることができず、したがって、ド
コサヘキサエン酸を得ることが難しく、１０．０ｍＭ超
では、増殖が著しく遅くなったり、藻体の生産する脂質
の量が大きく減少したりして、ドコサヘキサエン酸の収
率が減少し好ましくない。また、高価なアミノ酸である
ので、経済的観点を考慮にいれて３０．０ｍＭ以下であ
るのが好ましい。

【００１９】本発明の培養方法に用いられる培地は、さ
らに有機窒素源、糖質、無機塩類、重金属元素含有物質
等を含有し得る。

【００２０】本発明に用いられる有機窒素源としては、
酵母エキス、牛肉エキス、ペプトンなどの各種抽出物、
廃糖蜜、コーンスティープリカーなどの農産物残渣など
が挙げられ、さらにこれらを組み合わせることも可能で
ある。

【００２１】本発明に用いられる糖質としては、グルコ
ース、ガラクトースが挙げられ、さらにこれらを組み合
わせることも可能である。

【００２２】本発明に用いられる無機塩類としては、市
販の人工海水の濃縮物を用いることも可能であるが、例
えば、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム等を組合せて
用いることも可能である。

【００２３】本発明に用いられる重金属元素含有物質と
しては、鉄、マンガン、コバルト、亜鉛の各元素を含有
する物質が挙げられ、これらは単体であってもイオン、
塩、水和物等であってもよい。

【００２４】以上のほか、藻体の増殖やドコサヘキサエ
ン酸の収量へ直接影響を与えないが、重金属塩類の安定
化のために、ホウ酸やエチレンジアミン四酢酸の添加も
好ましい。さらに、消泡剤として、脂肪酸モノグリセリ
ド、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソ
ルビタン脂肪酸エステル等を添加してもよい。

【００２５】本発明に用いる培地のｐＨは、通常５〜
９、好ましくは６〜８である。このｐＨ安定化のため
に、トリスヒドロキシメチルアミノメタン、モルホリノ
エタンスルホン酸などの緩衝剤の添加も好ましい。

【００２６】本発明に用いる培養方法としては、静置培
養法を用いることも可能であるが、微細藻類の藻体生産
性と脂質中のドコサヘキサエン酸の含量を考えると、振
盪培養法または深部通気撹拌培養法による培養が好まし
い。振盪培養は、往復振盪であっても、回転振盪であっ
てもよい。振盪培養および深部通気攪拌培養の方法は、
例えば、特願平０４−０７７１８９号に記載の通りの方
法が用い得る。培養温度としては、通常１５〜３４℃で
藻体産生を行なうことが可能である。

【００２７】上述のように海洋性微細藻類を、本発明の
培養方法で培養すると、安定した増殖を示すばかりでな
く、高度不飽和脂肪酸としてドコサヘキサエン酸の脂質
中の割合が高度に高い海洋性微細藻類が得られる。培養
終了後、そのような粗脂質を得る方法としての培養液か
らの藻体の回収は、一般的な方法、例えば、１０℃、８
０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離法や、濾紙およびガ
ラスフィルターによる濾過法等により行なうことが可能
である。このようにして回収した藻体は、そのままか、
あるいは、凍結乾燥法、熱風乾燥法などにより乾燥藻体
とすることができる。得られた藻体またはその乾燥藻体
から、ドコサヘキサエン酸を高度に含有する粗脂質を抽
出することが可能である。

【００２８】藻体からドコサヘキサエン酸を高度に含有
する粗脂質を抽出する方法としては、通常の脂質の抽出
方法を用いることができ、特に、Folch 法やBligh-Dyer
法に代表されるクロロホルム／メタノール系等の有機溶
媒による一般的な抽出方法を用いることが可能である。

【００２９】粗脂質からのドコサヘキサエン酸の精製
は、常法に従って行なうことが可能である。例えば、粗
脂質をＮａＯＨなどでケン化した後、そのままか、ある
いは、酸またはアルカリ触媒によりアルコールエステル
とすることで、カラムクロマトグラフィーまたは分別、
蒸留、超臨界抽出などの方法によって容易に純品として
得ることが可能である。これは、藻体中にドコサヘキサ
エン酸と物性の非常に似通った高度不飽和脂肪酸が同時
に含まれていないことによるもので、従来の魚油などか
らの精製に比較して、非常に簡便で効率良くドコサヘキ
サエン酸を得ることが可能である。

【００３０】以上のように、本発明によれば、海洋性微
細藻類を培養させる際に、α−アミノ酸類として、酸性
アミノ酸、その塩またはそのアミド、塩基性アミノ酸ま
たはその塩、またはイミノ酸を存在させた培地で培養す
ることにより、藻体の安定した増殖と、他の高度不飽和
脂肪酸を含まず、ドコサヘキサエン酸の含量を上昇させ
ることが可能であるが、本発明の趣旨に従い通常行なわ
れる改変は本発明に含まれる。

【００３１】

【実施例】以下に、実施例により、本発明をさらに詳し
く説明するが、これらの実施例が本発明の範囲を限定す
るものではないことは言うまでもない。下記の実施例
中、海洋性微細藻類の藻体生産性は、培養後の藻体の乾
燥藻体重量で示し、また、ドコサヘキサエン酸の含有量
は、乾燥藻体からクロロホルム／メタノール（２：１）
で抽出される粗脂質を三フッ化ホウ素メタノール錯体で
脂肪酸メチルエステルとし、ヘプタデカン酸を内部標準
として産生したドコサヘキサエン酸をガスクロマトグラ
フィーにより定量することにより測定した。

【００３２】実施例１〜７、比較例１〜６で、下記表１
に記載の培地（Ｉ）を用いた。

【００３３】（実施例１および２）上記表１の培地
（Ｉ）に下記表２に示す各酸性アミノ酸を、２．６７ｍ
Ｍとなるように含有させた培地それぞれ１００ｍｌを、
３００ｍｌ容三角フラスコに入れて滅菌をした。冷却
後、これにグルコース１０ｇ／ｌ、酵母エキス（Ｄｉｆ
ｃｏ製）２ｇ／ｌを人工海水アクアマリン（八洲薬品株
式会社製）に溶解し、ｐＨ７．４に調整した培地で、予
め２８℃で７日間静置培養したクリプテコディニウム・
コーニーＡＴＣＣ３００２１の培養液を５ｍｌ接種し、
本培養として、２８℃で５日間回転振盪培養（１８０ｒ
ｐｍ）を行なった。培養藻体から得た乾燥藻体重量、粗
脂質収量とドコサヘキサエン酸収量は、表２に示す結果
を得た。

【００３４】（実施例３および４）上記表１に示す培地
（Ｉ）に、下記表２に示す酸性アミノ酸アミドを、２．
６７ｍＭの濃度になるように含有させた培地を用いる点
以外は、実施例１および２と同様に培養を行ない、表２
に示す結果を得た。

【００３５】（実施例５および６）上記表１に示す培地
（Ｉ）に、下記表２に示す塩基性アミノ酸を、２．６７
ｍＭの濃度になるように含有させた培地を用いる点以外
は、実施例１および２と同様に培養を行ない、表２に示
す結果を得た。

【００３６】（実施例７）上記表１に示す培地（Ｉ）
に、下記表２に示すイミノ酸を、２．６７ｍＭの濃度に
なるように含有させた培地を用いる点以外は、実施例１
および２と同様に培養を行ない、表２に示す結果を得
た。

【００３７】（比較例１〜６）上記表１に示す培地
（Ｉ）に、下記表２に示す脂肪族アミノ酸、ヒドロキシ
アミノ酸、含硫アミノ酸、芳香族アミノ酸、複素環式ア
ミノ酸を、２．６７ｍＭの濃度になるように含む培地を
用いる点以外は、実施例１および２と同様に培養を行な
い、表２に示す結果を得た。

【００３８】

【表１】

【００３９】注）コーンスティープリカー：和光純薬（株）製 −：含有しないことを示す。

【００４０】（実施例８〜１１）下記表３に示す濃度の
グルタミン酸ナトリウムを含む培地それぞれ１００ｍｌ
を、３００ｍｌ容三角フラスコに入れて滅菌をした。冷
却後、これにグルコース１０ｇ／ｌ、酵母エキス（Ｄｉ
ｆｃｏ製）２ｇ／ｌを人工海水アクアマリン（八洲薬品
株式会社製）に溶解し、ｐＨ７．４に調整した培地で、
予め２８℃で７日間静置培養したクリプテコディニウム
・コーニーＡＴＣＣ３００２１の培養液を５ｍｌ接種
し、本培養として、２８℃で５日間回転振盪培養（１８
０ｒｐｍ）を行なった。培養藻体から得た乾燥藻体重量
とドコサヘキサエン酸含量は、表３に示す結果を得た。

【００４１】（比較例７）下記表３に示すとおり、有機
窒素源として、グルタミン酸を含有しない組成の培地を
用いた点以外は、実施例８〜１１と同様に培養を行な
い、表３に示す結果を得た。なお、比較例７の結果は、
実施例１２〜１５、実施例１６〜１９との比較のため
に、表４および５にも記載した。

【００４２】（実施例１２〜１５）グルタミン酸ナトリ
ウムの代わりに、下記表４に示す濃度のアスパラギンを
含む培地を用いた以外は、実施例８〜１１と同様に培養
を行ない、表４に示す結果を得た。

【００４３】（実施例１６〜１９）グルタミン酸ナトリ
ウムの代わりに、下記表５に示す濃度のアルギニン塩酸
塩を含む培地を用いた以外は、実施例８〜１１と同様に
培養を行ない、表５に示す結果を得た。

【００４４】

【表２】

【００４５】

【表３】

【００４６】

【表４】

【００４７】

【発明の効果】本発明の海洋性微細藻類の培養方法で
は、ドコサヘキサエン酸を産生する能力を有する藻類
を、α−アミノ酸類として、酸性アミノ酸、その塩また
はそのアミド、塩基性アミノ酸またはその塩、またはイ
ミノ酸を存在させた培地で培養することにより、藻体の
安定した増殖と、エイコサペンタエン酸など他の高度不
飽和脂肪酸を含まず、ドコサヘキサエン酸の含量を顕著
に上昇させることができる。さらに、従来は原料の供給
が不安定で品質が一定せず、独特の臭気をもつ魚油から
の抽出と高度な分離精製技術により得ていたドコサヘキ
サエン酸を高濃度に安定して生産でき、かつ、非常に簡
便な分離精製技術により純度の高いものを供給できる点
で工業的に有効な効果を奏するものである。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｒ 1:89）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】海洋性微細藻類に属し、かつ、ドコサヘキ
サエン酸を産生する能力を有する藻類を培養して増殖さ
せた藻体よりドコサヘキサエン酸を製造するに際し、α
−アミノ酸類として、酸性アミノ酸またはその塩、塩基
性アミノ酸またはその塩、それらのアミド類、またはイ
ミノ酸を存在させた培地で培養することを特徴とする海
洋性微細藻類の培養方法。
【請求項２】前記α−アミノ酸類が、アスパラギン酸ナ
トリウム、グルタミン酸ナトリウム、アスパラギンまた
はグルタミンである請求項１に記載の海洋性微細藻類の
培養方法。
【請求項３】前記α−アミノ酸類が、リシン、アルギニ
ンまたはアルギニン塩酸塩である請求項１に記載の海洋
性微細藻類の培養方法。
【請求項４】前記イミノ酸が、プロリンである請求項１
に記載の海洋性微細藻類の培養方法。
【請求項５】前記α−アミノ酸類として、グルタミン酸
ナトリウムを２．０〜３０．０ｍＭの濃度で、アスパラ
ギンを１．０〜２０．０ｍＭの濃度で、またはアルギニ
ン塩酸塩を０．２５〜１０．０ｍＭの濃度で存在させる
請求項１〜３のいずれかに記載の海洋性微細藻類の培養
方法。
【請求項６】前記海洋性微細藻類が、クリプテコディニ
ウム・コーニーＡＴＣＣ３００２１である請求項１〜５
のいずれかに記載の海洋性微細藻類の培養方法。