JPH0789912B2 - サイクロデキストリン グルカノトランスフェラーゼの製造法 - Google Patents
サイクロデキストリン グルカノトランスフェラーゼの製造法Info
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- JPH0789912B2 JPH0789912B2 JP60189852A JP18985285A JPH0789912B2 JP H0789912 B2 JPH0789912 B2 JP H0789912B2 JP 60189852 A JP60189852 A JP 60189852A JP 18985285 A JP18985285 A JP 18985285A JP H0789912 B2 JPH0789912 B2 JP H0789912B2
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- phage
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
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Description
【発明の詳細な説明】 一般にサイクロデキストリン グルカノトランスフェラ
ーゼ生産菌として、バチルス（Bacillus）属やクレブシ
ラ（Klebsiella）属の細菌などが用いられてきた。しか
し、その生産は微量で、かつ不安定であり、また培地中
に含まれるきょう雑物が多く、サイクロデキストリン
グルカノトランスフェラーゼの分離精製が困難であっ
た。例えば第７回日本分子生物学会プログラム・講演要
旨集（昭59−11−16）に記載の場合のサイクロデキスト
リン グルカノトランスフェラーゼの生産量は0.8U/1ml
培養液である。本発明者らは、バチルス・マセランス
（Bacillus macerans）のサイクロデキストリン グル
カノトランスフェラーゼ構造遺伝子をエシェリヒア・コ
リ（Escherichia coli）内でクローン化することに成
功し、この変異株を培養したところ、安定に短時間でサ
イクロデキストリン グルカノトランスフェラーゼを高
収率で生産させることができたものである。本発明は、
サイクロデキストリン グルカノトランスフェラーゼを
生産するエシェリヒア・コリ（C600−pEDS1（FERM BP−
774）を培養し、培養物からサイクロデキストリン グ
ルカノトランスフェラーゼを採取することを特徴とする
サイクロデキストリン グルカノトランスフェラーゼの
製造法である。
ーゼ生産菌として、バチルス（Bacillus）属やクレブシ
ラ（Klebsiella）属の細菌などが用いられてきた。しか
し、その生産は微量で、かつ不安定であり、また培地中
に含まれるきょう雑物が多く、サイクロデキストリン
グルカノトランスフェラーゼの分離精製が困難であっ
た。例えば第７回日本分子生物学会プログラム・講演要
旨集（昭59−11−16）に記載の場合のサイクロデキスト
リン グルカノトランスフェラーゼの生産量は0.8U/1ml
培養液である。本発明者らは、バチルス・マセランス
（Bacillus macerans）のサイクロデキストリン グル
カノトランスフェラーゼ構造遺伝子をエシェリヒア・コ
リ（Escherichia coli）内でクローン化することに成
功し、この変異株を培養したところ、安定に短時間でサ
イクロデキストリン グルカノトランスフェラーゼを高
収率で生産させることができたものである。本発明は、
サイクロデキストリン グルカノトランスフェラーゼを
生産するエシェリヒア・コリ（C600−pEDS1（FERM BP−
774）を培養し、培養物からサイクロデキストリン グ
ルカノトランスフェラーゼを採取することを特徴とする
サイクロデキストリン グルカノトランスフェラーゼの
製造法である。
本発明に用いるサイクロデキストリン グルカノトラン
スフェラーゼを生産するエシェリヒア・コリ（C600−pE
DS1（FERM BP−774）は次のようにして創製することが
できる。
スフェラーゼを生産するエシェリヒア・コリ（C600−pE
DS1（FERM BP−774）は次のようにして創製することが
できる。
サイクロデキストリン グルカノトランスフェラーゼ遺
伝子の調製は次のようにする。
伝子の調製は次のようにする。
バチルス・マセランスIAM1243株はサイクロデキストリ
ン グルカノトランスフェラーゼを菌体外に分泌する細
菌として知られている。本菌体からSaito,Miura法（Sai
to.H.and Miura,K..Biochim.Biophys.Acta,72,619,（19
64））により染色体DNAを調製する。これを制限酵素Sau
3AIで部分分解し、分解物からショ糖密度勾配超遠心法
により約2kb以上の染色体DNA断片を分離する。
ン グルカノトランスフェラーゼを菌体外に分泌する細
菌として知られている。本菌体からSaito,Miura法（Sai
to.H.and Miura,K..Biochim.Biophys.Acta,72,619,（19
64））により染色体DNAを調製する。これを制限酵素Sau
3AIで部分分解し、分解物からショ糖密度勾配超遠心法
により約2kb以上の染色体DNA断片を分離する。
別に、ファージλL47DNAを制限酵素Bam HIで切段し、こ
れに先の染色体DNA断片を混合し、更にT4DNAリガーゼを
添加して、連結処理をする。この処理液を用いてイン
ビトロ パッケイジング法（Horn,B.,Methods in Enzym
ology,68,299,（1979））によりλファージ粒子を形成
し、このλファージ粒子をエシェリヒア・コリWL95の培
養菌懸濁液に添加して、サイクロデキストリン グルカ
ノトランスフェラーゼ生産能を保有する特殊形質導入フ
ァージを得る。得られた特殊形質導入ファージ粒子よ
り、サイクロデキストリン グルカノトランスフェラー
ゼ遺伝子を含むλファージDNAを調製する。このDNAを制
限酵素Sau 3AIで部分分解し、プラスミドpBR322の制限
酵素Bam HI切断部分にT4リガーゼを用いて結合し、ハイ
ブリッド プラスミド混合物を得る。この混合物を用い
てエシェリヒア・コリへLederberg,Cohen法（Lederber
g,E.M.and Cohen,S.N..J.Bacteriol.,119,1072,（197
4））により形質転換する。形質転換株の中からアンピ
シリン耐性（50μg/ml）かつサイクロデキストリン グ
ルカノトランスフェラーゼ活性のある株を選択する。こ
の菌株を培養し、培養菌体からプラスミドpEDS1を得
た。
れに先の染色体DNA断片を混合し、更にT4DNAリガーゼを
添加して、連結処理をする。この処理液を用いてイン
ビトロ パッケイジング法（Horn,B.,Methods in Enzym
ology,68,299,（1979））によりλファージ粒子を形成
し、このλファージ粒子をエシェリヒア・コリWL95の培
養菌懸濁液に添加して、サイクロデキストリン グルカ
ノトランスフェラーゼ生産能を保有する特殊形質導入フ
ァージを得る。得られた特殊形質導入ファージ粒子よ
り、サイクロデキストリン グルカノトランスフェラー
ゼ遺伝子を含むλファージDNAを調製する。このDNAを制
限酵素Sau 3AIで部分分解し、プラスミドpBR322の制限
酵素Bam HI切断部分にT4リガーゼを用いて結合し、ハイ
ブリッド プラスミド混合物を得る。この混合物を用い
てエシェリヒア・コリへLederberg,Cohen法（Lederber
g,E.M.and Cohen,S.N..J.Bacteriol.,119,1072,（197
4））により形質転換する。形質転換株の中からアンピ
シリン耐性（50μg/ml）かつサイクロデキストリン グ
ルカノトランスフェラーゼ活性のある株を選択する。こ
の菌株を培養し、培養菌体からプラスミドpEDS1を得
た。
プラスミドpEDS1のフィジカルマップ（制限酵素切断地
図）は第４図に示した通りであり、白ぬきの部分はベク
ターpBR322由来、黒塗りの部分は染色体断片部分で、こ
のクローン化された断片の大きさは約4.4kbである。こ
こに得られる形質転換体はサイクロデキストリン グル
カノトランスフェラーゼを安定によく生産する優れた変
異エシェリヒア・コリである。本菌はエシェリヒア・コ
リC600−pEDS1（FERM BP−774）として微工研に寄託さ
れている。
図）は第４図に示した通りであり、白ぬきの部分はベク
ターpBR322由来、黒塗りの部分は染色体断片部分で、こ
のクローン化された断片の大きさは約4.4kbである。こ
こに得られる形質転換体はサイクロデキストリン グル
カノトランスフェラーゼを安定によく生産する優れた変
異エシェリヒア・コリである。本菌はエシェリヒア・コ
リC600−pEDS1（FERM BP−774）として微工研に寄託さ
れている。
この変異エシェリヒア・コリはサイクロデキストリン
グルカノトランスフェラーゼの生産性において全く新規
であり、サイクロデキストリン グルカノトランスフェ
ラーゼの工業生産上極めて有用である。
グルカノトランスフェラーゼの生産性において全く新規
であり、サイクロデキストリン グルカノトランスフェ
ラーゼの工業生産上極めて有用である。
本発明においては、上記変異エシェリヒア・コリが液体
培養される。培地としては、エシェリヒア・コリの培養
に用いられるものであればいずれでもよいが、炭素源と
しては澱粉、液化澱粉、グルコース、グリセリン、糖
蜜、廃糖蜜などがあり、窒素源としては各種蛋白分解
物、大豆粉、肉エキス、ペプトン、尿素、硝酸塩、アン
モニウム塩、酵母エキス、コーンスティープリカーなど
があり、その他ビオチンなどの栄養素や微量金属などが
適宜使用される。
培養される。培地としては、エシェリヒア・コリの培養
に用いられるものであればいずれでもよいが、炭素源と
しては澱粉、液化澱粉、グルコース、グリセリン、糖
蜜、廃糖蜜などがあり、窒素源としては各種蛋白分解
物、大豆粉、肉エキス、ペプトン、尿素、硝酸塩、アン
モニウム塩、酵母エキス、コーンスティープリカーなど
があり、その他ビオチンなどの栄養素や微量金属などが
適宜使用される。
培養は37℃で通気かくはんによって行われる。８〜10時
間の培養によってサイクロデキストリン グルカノトラ
ンスフェラーゼは最大蓄積量を示すので、培養液を遠心
分離して菌体を得、超音波破砕する。
間の培養によってサイクロデキストリン グルカノトラ
ンスフェラーゼは最大蓄積量を示すので、培養液を遠心
分離して菌体を得、超音波破砕する。
破砕菌体を遠心分離して除き、得られた上清から、塩
析、透析、イオン交換樹脂、アフィニティクロマトグラ
フ処理等一般的酵素精製法によりサイクロデキストリン
グルカノトランスフェラーゼを単離することができ
る。
析、透析、イオン交換樹脂、アフィニティクロマトグラ
フ処理等一般的酵素精製法によりサイクロデキストリン
グルカノトランスフェラーゼを単離することができ
る。
次に本発明を実施例及び試験例により詳しく説明する。
創製例 変異エシェリヒア・コリの創製 バチルス・マセランスIAM1243株をフスマ培地（６％フ
スマ抽出液,0.5％マルト エキストラクト,0.5％イース
ト エキストラクト,0.5％ポリペプトン,0.05％塩化カ
ルシウム）で48時間培養し、遠心分離にて集菌、洗浄
し、得られた菌体からSaito,Miuraの方法（Saito,H.and
Miura,K.,Biochim.Biophys.Acta,72,619,（1964））に
よって染色体DNAを分離し、これをトリス塩酸・EDTA緩
衝液に溶解し、制限酵素Sau 3AIを添加して、37℃で部
分分解した後、分解物からショ糖蜜度勾配超遠心法で約
2kb以上の染色体断片を分離、取得した。
スマ抽出液,0.5％マルト エキストラクト,0.5％イース
ト エキストラクト,0.5％ポリペプトン,0.05％塩化カ
ルシウム）で48時間培養し、遠心分離にて集菌、洗浄
し、得られた菌体からSaito,Miuraの方法（Saito,H.and
Miura,K.,Biochim.Biophys.Acta,72,619,（1964））に
よって染色体DNAを分離し、これをトリス塩酸・EDTA緩
衝液に溶解し、制限酵素Sau 3AIを添加して、37℃で部
分分解した後、分解物からショ糖蜜度勾配超遠心法で約
2kb以上の染色体断片を分離、取得した。
用いたファージベクターλL47のDNA概略開裂地図は第１
図に示した通りであり、このファージλL47DNAは40.6kb
で制限酵素Bam HIによって２箇所切断されるものであ
る。
図に示した通りであり、このファージλL47DNAは40.6kb
で制限酵素Bam HIによって２箇所切断されるものであ
る。
Bam HIで切断したλL47DNAと前記のバチルス・マセラン
スIAM1243株から得られた約2kb以上の染色体断片を混合
し、T4DNAリガーゼを添加して連結処理した（Weiss,B.,
Sablon,A.J.,Live,T.R.,Fareed,G.C.and Richardson,C.
C.,J.Biol.Chem.,243,4543,（1968））。処理液を、イ
ン ビトロ パッケイジング キット（宝酒造社製品）
に添加して、イン ビトロ パッケイジング法（Horn,
B.,Methods in Enzymology,68,299,（1979））により当
該DNAをファージ粒子に導入した。このファージ粒子を
エシェリヒア・コリWL95の菌体懸濁液に添加し、１％可
溶性澱粉、1.2％の寒天を含むλ培地（バクトトリプト
ン10g,NaCl2.5gを水1lに溶解）に添加して、37℃で培養
し、出現したプラークにヨウ素液を噴霧して、ヨウ素反
応を起こさなかったファージをサイクロデキストリン
グルカノトランスフェラーゼ生産ファージとして分離す
ることができた。
スIAM1243株から得られた約2kb以上の染色体断片を混合
し、T4DNAリガーゼを添加して連結処理した（Weiss,B.,
Sablon,A.J.,Live,T.R.,Fareed,G.C.and Richardson,C.
C.,J.Biol.Chem.,243,4543,（1968））。処理液を、イ
ン ビトロ パッケイジング キット（宝酒造社製品）
に添加して、イン ビトロ パッケイジング法（Horn,
B.,Methods in Enzymology,68,299,（1979））により当
該DNAをファージ粒子に導入した。このファージ粒子を
エシェリヒア・コリWL95の菌体懸濁液に添加し、１％可
溶性澱粉、1.2％の寒天を含むλ培地（バクトトリプト
ン10g,NaCl2.5gを水1lに溶解）に添加して、37℃で培養
し、出現したプラークにヨウ素液を噴霧して、ヨウ素反
応を起こさなかったファージをサイクロデキストリン
グルカノトランスフェラーゼ生産ファージとして分離す
ることができた。
得られたサイクロデキストリン グルカノトランスフェ
ラーゼ生産ファージを単離し、これをエシェリヒア・コ
リWL66とともにλ培地で37℃で培養した。培養液を遠心
分離して宿主菌体を除き、ポリエチレングリコールを加
えてファージ粒子を凝集させたのち、遠心分離によって
ファージ粒子を集め、新規なファージを得た。このファ
ージをλCD2と名づけた。
ラーゼ生産ファージを単離し、これをエシェリヒア・コ
リWL66とともにλ培地で37℃で培養した。培養液を遠心
分離して宿主菌体を除き、ポリエチレングリコールを加
えてファージ粒子を凝集させたのち、遠心分離によって
ファージ粒子を集め、新規なファージを得た。このファ
ージをλCD2と名づけた。
このファージ粒子を、50％ホルムアミドを含むファージ
懸濁用緩衝液に対して透析し、λCD2ファージDNAを得
た。ファージλCD2DNAは45.0kbの大きさで、そのフィジ
カルマップ（制限酵素切断地図）を第２図に示す。ここ
で白ぬきの部分はベクターλL47由来で、黒塗りの部分
は染色体断片部分である。各略記号はすべて制限酵素で
ある。
懸濁用緩衝液に対して透析し、λCD2ファージDNAを得
た。ファージλCD2DNAは45.0kbの大きさで、そのフィジ
カルマップ（制限酵素切断地図）を第２図に示す。ここ
で白ぬきの部分はベクターλL47由来で、黒塗りの部分
は染色体断片部分である。各略記号はすべて制限酵素で
ある。
このファージλCD2DNAを32Pでラベルし、バチルス・マ
セランスIAM1243株染色体DNA、エシェリヒア・コリWL95
株染色体DNAおよびα−アミラーゼ高生産株バチルス・
ズブチリス（Bacillus subtilis）NA64染色体DNAのそれ
ぞれのEco RI分解物とサザンハイブリダイゼーション
（Sauthern,E.M.,J.Mol.Biol.,98,503,（1975））を行
ったところ、エシェリヒア・コリ、バチルス・ズブチリ
ス染色体DNAとは全くハイブリダイズしなかったが、バ
チルス・マセランスIAM1243株の染色体DNAとは２箇所で
特異的にハイブリダイズしており、クローン化した遺伝
子はバチルス・マセランスIAM1243株由来であることが
確かめられた。
セランスIAM1243株染色体DNA、エシェリヒア・コリWL95
株染色体DNAおよびα−アミラーゼ高生産株バチルス・
ズブチリス（Bacillus subtilis）NA64染色体DNAのそれ
ぞれのEco RI分解物とサザンハイブリダイゼーション
（Sauthern,E.M.,J.Mol.Biol.,98,503,（1975））を行
ったところ、エシェリヒア・コリ、バチルス・ズブチリ
ス染色体DNAとは全くハイブリダイズしなかったが、バ
チルス・マセランスIAM1243株の染色体DNAとは２箇所で
特異的にハイブリダイズしており、クローン化した遺伝
子はバチルス・マセランスIAM1243株由来であることが
確かめられた。
ここに得られたλCD2ファージDNAをトリス塩酸・EDTA緩
衝液に溶解し、制限酵素Sau 3AIを添加し、37℃で部分
分解した。分解物からショ糖密度勾配超遠心法で約2kb
以上の染色体断片を分離、取得し、プラスミドpBR322を
用いて再クローン化を図った。
衝液に溶解し、制限酵素Sau 3AIを添加し、37℃で部分
分解した。分解物からショ糖密度勾配超遠心法で約2kb
以上の染色体断片を分離、取得し、プラスミドpBR322を
用いて再クローン化を図った。
再クローン化に用いたプラスミドpBR322の概略開裂地図
は第３図に示すが、このプラスミドpBR322は4.4kbでア
ンピシリン耐性（Apr）を有し、制限酵素Bam HIによっ
て１箇所切断されるものである。
は第３図に示すが、このプラスミドpBR322は4.4kbでア
ンピシリン耐性（Apr）を有し、制限酵素Bam HIによっ
て１箇所切断されるものである。
Bam HIで１箇所切断したpBR322と前記のλCD2ファージ
から得られた約2kb以上の染色体断片を混合し、T4DNAリ
ガーゼを添加して連結処理した。この処理液を用い、エ
シェリヒア・コリC600株を宿主として、Lederberg,Cohe
n法（Lederberg,E.M.and Cohen,S.N.,J.Bacteriol.,11
9,1072,（1974））により、当該プラスミドを導入し
た。
から得られた約2kb以上の染色体断片を混合し、T4DNAリ
ガーゼを添加して連結処理した。この処理液を用い、エ
シェリヒア・コリC600株を宿主として、Lederberg,Cohe
n法（Lederberg,E.M.and Cohen,S.N.,J.Bacteriol.,11
9,1072,（1974））により、当該プラスミドを導入し
た。
得られた形質転換処理菌体を選択培地である可溶性澱粉
１％、アンピシリン50μg/ml,寒天1.6％を含むＬ培地
（バクトトリプトン10g,酵母エキス5g,NaCl5gを1lの水
に溶解）にて37℃で培養し、アンピシリン耐性株を得
た。このアンピシリン耐性株をアンピシリン50μg/ml,
可溶性澱粉を含むＬ培地にて37℃で24時間培養し、培養
液中のサイクロデキストリンの有無をペーパークロマト
グラフィーおよび高速液体クロマトグラフィーによって
調べた。
１％、アンピシリン50μg/ml,寒天1.6％を含むＬ培地
（バクトトリプトン10g,酵母エキス5g,NaCl5gを1lの水
に溶解）にて37℃で培養し、アンピシリン耐性株を得
た。このアンピシリン耐性株をアンピシリン50μg/ml,
可溶性澱粉を含むＬ培地にて37℃で24時間培養し、培養
液中のサイクロデキストリンの有無をペーパークロマト
グラフィーおよび高速液体クロマトグラフィーによって
調べた。
ペーパークロマトグラフィーは培養液をｎ−ブタノール
/n−プロパノール／水（3/5/4）の溶媒系で60℃、２回
上昇展開を行ったのち、90％アセトンのヨウ素溶液にペ
ーパークロマトグラムを浸してサイクロデキストリンの
呈色を検索し、発色したものをサイクロデキストリン
グルカノトランスフェラーゼ分泌株として分離すること
ができた。
/n−プロパノール／水（3/5/4）の溶媒系で60℃、２回
上昇展開を行ったのち、90％アセトンのヨウ素溶液にペ
ーパークロマトグラムを浸してサイクロデキストリンの
呈色を検索し、発色したものをサイクロデキストリン
グルカノトランスフェラーゼ分泌株として分離すること
ができた。
得られたサイクロデキストリン グルカノトランスフェ
ラーゼ生産菌株を単離し、これをアンピシリン50μg/ml
を含むＬ培地にて37℃で培養し、培養液を遠心分離して
集菌し、洗浄後、分離菌体からアルカリ抽出法（Birnbo
im,H.C.and Doly,J.,Nucleic Asids Res.,７,1513,（19
79））によってプラスミドを分離、探索し、新規なプラ
スミドを得た。このプラスミドをプラスミドpEDS1と名
づけた。
ラーゼ生産菌株を単離し、これをアンピシリン50μg/ml
を含むＬ培地にて37℃で培養し、培養液を遠心分離して
集菌し、洗浄後、分離菌体からアルカリ抽出法（Birnbo
im,H.C.and Doly,J.,Nucleic Asids Res.,７,1513,（19
79））によってプラスミドを分離、探索し、新規なプラ
スミドを得た。このプラスミドをプラスミドpEDS1と名
づけた。
プラスミドpEDS1は8.8kbの大きさで、そのフィジカルマ
ップ（制限酵素切断地図）を第４図に示す。ここで白ぬ
きの部分はベクターpBR322由来で、黒塗りの部分は染色
体断片部分であり、各略記号はすべて制限酵素である。
ップ（制限酵素切断地図）を第４図に示す。ここで白ぬ
きの部分はベクターpBR322由来で、黒塗りの部分は染色
体断片部分であり、各略記号はすべて制限酵素である。
試験例１ サイクロデキストリン グルカノトランスフェラーゼの
生産 アンピシリン50μg/mlを含むＬ培地を、500ml容の坂口
フラスコに100ml分注し、エシェリヒア・コリC600−pED
S1（FERM BP−774）を37℃で20時間振とう培養した。そ
の間培養物を1mlずつ採取して、生産されるサイクロデ
キストリン グルカノトランスフェラーゼの活性を測定
した。
生産 アンピシリン50μg/mlを含むＬ培地を、500ml容の坂口
フラスコに100ml分注し、エシェリヒア・コリC600−pED
S1（FERM BP−774）を37℃で20時間振とう培養した。そ
の間培養物を1mlずつ採取して、生産されるサイクロデ
キストリン グルカノトランスフェラーゼの活性を測定
した。
第５図は、サイクロデキストリン グルカノトランスフ
ェラーゼ活性の経時的変化を示すものである。ここでＡ
はサイクロデキストリン グルカノトランスフェラーゼ
活性、Ｂは菌の生育を示している。
ェラーゼ活性の経時的変化を示すものである。ここでＡ
はサイクロデキストリン グルカノトランスフェラーゼ
活性、Ｂは菌の生育を示している。
第５図から明からなように、サイクロデキストリン グ
ルカノトランスフェラーゼ活性は培養後８時間で最高値
に達する。
ルカノトランスフェラーゼ活性は培養後８時間で最高値
に達する。
実施例 Ｌ培地の組成 バクトトリプトン 10g 酵母エキス 5g NaCl 5g 水 1l アンピシリン 50mg エシェリヒア・コリC600−pEDS1（FERM BP−774）を上
記培地100mlを入れた500ml容坂口フラスコ２本に接種
し、37℃で一夜振とう培養して、種培養液を得た。前記
と同じ組成の培地20lを入れたジャーファーメンターに
種培養液200mlを添加し、37℃で10時間通気かくはん培
養した。得られた培養液を遠心分離することにより菌体
を得、これを5lの2mM酢酸カルシウムを含む10mMトリス
塩酸緩衝液（pH7.5）に懸濁し、超音波破砕機によって
菌体を破砕した。
記培地100mlを入れた500ml容坂口フラスコ２本に接種
し、37℃で一夜振とう培養して、種培養液を得た。前記
と同じ組成の培地20lを入れたジャーファーメンターに
種培養液200mlを添加し、37℃で10時間通気かくはん培
養した。得られた培養液を遠心分離することにより菌体
を得、これを5lの2mM酢酸カルシウムを含む10mMトリス
塩酸緩衝液（pH7.5）に懸濁し、超音波破砕機によって
菌体を破砕した。
破砕菌体を遠心分離によって除き、上清に50gのトウモ
ロコシ澱粉を加え、５℃で一晩かくはんしてサイクロデ
キストリン グルカノトランスフェラーゼを吸着させ
た。澱粉を250mlの33％エタノールで洗浄し、ガラスフ
ィルターで減圧ろかしてエタノール溶液を除いた。
ロコシ澱粉を加え、５℃で一晩かくはんしてサイクロデ
キストリン グルカノトランスフェラーゼを吸着させ
た。澱粉を250mlの33％エタノールで洗浄し、ガラスフ
ィルターで減圧ろかしてエタノール溶液を除いた。
澱粉を250mlの蒸留水に懸濁し50℃で15分かくはんして
酵素の脱着を行った。
酵素の脱着を行った。
澱粉をろ別し、1mM塩化カルシウムを含む0.05M酢酸緩衝
液（pH6.0）で平衡化したDEAE−セルロースカラムを用
いてカラムクロマトグラフィーを行った。溶出は同緩衝
液を用い、０〜0.5M食塩の濃度勾配法にて行った。活性
の有る画分を集め、コロジオンバッグで1mM塩化カルシ
ウム溶液中にて透析し、蛋白濃度３〜４％にまで濃縮し
た。
液（pH6.0）で平衡化したDEAE−セルロースカラムを用
いてカラムクロマトグラフィーを行った。溶出は同緩衝
液を用い、０〜0.5M食塩の濃度勾配法にて行った。活性
の有る画分を集め、コロジオンバッグで1mM塩化カルシ
ウム溶液中にて透析し、蛋白濃度３〜４％にまで濃縮し
た。
この濃縮酵素液に1mM塩化カルシウムを含む飽和硫安溶
液を滴下した。約0.1飽和でわずかに白濁したので、少
量の1mM塩化カルシウム溶液を加えて透明にし、３〜５
℃で放置した。４週間後に結晶をガラスフィルター上に
取り出し、1mM塩化カルシウム溶液で洗浄した後、結晶
を集めて1mM塩化カルシウム溶液中に懸濁して凍結し、
精製酵素とした。
液を滴下した。約0.1飽和でわずかに白濁したので、少
量の1mM塩化カルシウム溶液を加えて透明にし、３〜５
℃で放置した。４週間後に結晶をガラスフィルター上に
取り出し、1mM塩化カルシウム溶液で洗浄した後、結晶
を集めて1mM塩化カルシウム溶液中に懸濁して凍結し、
精製酵素とした。
第１図はファージλL47のフィジカルマップ（制限酵素
切断地図）、第２図はファージλCD2のフィジカルマッ
プ、第３図はプラスミドpBR322のフィジカルマップ、第
４図はpEDS1のフィジカルマップをそれぞれ示してい
る。 第５図は試験例においてサイクロデキストリン グルカ
ノトランスフェラーゼ活性の経時変化および菌の生育を
示す図である。
切断地図）、第２図はファージλCD2のフィジカルマッ
プ、第３図はプラスミドpBR322のフィジカルマップ、第
４図はpEDS1のフィジカルマップをそれぞれ示してい
る。 第５図は試験例においてサイクロデキストリン グルカ
ノトランスフェラーゼ活性の経時変化および菌の生育を
示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 小林 昭一 茨城県新治郡桜村竹園１丁目1410番地 803棟401号 (72)発明者 貝沼 圭二 茨城県新治郡桜村並木３丁目1211番地 619棟 (72)発明者 橋本 仁 神奈川県鎌倉市今泉台４丁目31―10 (72)発明者 桶本 尚 神奈川県横浜市鶴見区上の宮１−４―６ 塩糖第１寮 (56)参考文献 特開 昭61−135589（ＪＰ，Ａ) 第７回日本分子生物学会プログラム・講 演要旨集（昭59−11−16）Ｂ−78の要旨
Claims (1)
- 【請求項１】サイクロデキストリン グルカノトランス
フェラーゼを生産するエシェリヒア・コリC600−pEDS1
（FERM BP−774）を培養し、培養物からサイクロデキス
トリン グルカノトランスフェラーゼを採取することを
特徴とするサイクロデキストリン グルカノトランスフ
ェラーゼの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60189852A JPH0789912B2 (ja) | 1985-08-30 | 1985-08-30 | サイクロデキストリン グルカノトランスフェラーゼの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60189852A JPH0789912B2 (ja) | 1985-08-30 | 1985-08-30 | サイクロデキストリン グルカノトランスフェラーゼの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6251987A JPS6251987A (ja) | 1987-03-06 |
| JPH0789912B2 true JPH0789912B2 (ja) | 1995-10-04 |
Family
ID=16248262
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60189852A Expired - Lifetime JPH0789912B2 (ja) | 1985-08-30 | 1985-08-30 | サイクロデキストリン グルカノトランスフェラーゼの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0789912B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100637314B1 (ko) * | 2004-11-09 | 2006-10-23 | 재단법인서울대학교산학협력재단 | 초내열성 사이클로덱스트린 글루카노트렌스퍼레이즈 및이의 생산방법 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2612684B2 (ja) * | 1984-12-03 | 1997-05-21 | 株式会社 林原生物化学研究所 | シクロマルトデキストリングルカノトランスフエラーゼ遺伝子を含む組換えｄｎａを導入した形質転換微生物とその利用 |
-
1985
- 1985-08-30 JP JP60189852A patent/JPH0789912B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 第７回日本分子生物学会プログラム・講演要旨集（昭５９−１１−１６）Ｂ−７８の要旨 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6251987A (ja) | 1987-03-06 |
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