JPH079426B2 - フイコビリタンパク質による螢光エネルギ−転位 - Google Patents

フイコビリタンパク質による螢光エネルギ−転位

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JPH079426B2
JPH079426B2 JP60177764A JP17776485A JPH079426B2 JP H079426 B2 JPH079426 B2 JP H079426B2 JP 60177764 A JP60177764 A JP 60177764A JP 17776485 A JP17776485 A JP 17776485A JP H079426 B2 JPH079426 B2 JP H079426B2
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
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    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は一般に、可溶性物質又はアナライト（analyte
s）、たとえば抗原を検出するためのイムノアツセイ法
に有用な検出可能な標識に関し、更に特定的には、エネ
ルギー転位に基づき且つフイコビリタンパク質（phycob
iliproteins）を使用する蛍光標識（fluorescent label
s）に関する。
たとえば、血液、痰（sputum）、尿等の如き体液中の特
異抗原（specified antigens）（動物に導入するとそれ
と特異的に反応することができる抗体の生産を刺激する
物質として定義された）、ハプテン（動物に導入する前
に追加の補助物質を必要とする物質であつてそれに対し
て特異的な抗体の生産を刺激する物質）、アナライト及
び同様な物質（以後総括してリガンドと呼ぶ）の検出は
研究及び臨床環境において極度に重要になつてきた。リ
ガンド、特に抗原及びそれに対する特異的抗体の検出は
しばしば種々の病状に関連しており、従つて、診断及び
病気の発生に関する基本的理解を得ること及びその治療
の効果を監視することにおいて非常に有用である。
結果として、水性試料中のリガンドを検出するための改
良された方法は絶えず探索されている。本発明の目的
は、一般に、かかるイムノアツセイ法と共に使用するた
めの改良されそして新規な検出可能な標識を提供するこ
とによつてかかるイムノアツセイ法を改良することであ
る。
イムノアツセイは、一般に、タンパク質、たとえば抗
体、抗体フラグメント（antibodyfrag-ments）又は人工
的に発生したペプチド〔以後集約的にリガンド結合パー
トナー（ligand bind-ing partners）と呼ぶ〕と一般に
リガンドと本明細書中では呼んでいる、それらに対して
特異的な物質との間の免疫反応に基づいている。免疫反
応は一般にそれらの高い特異性によつて特徴づけられ、
従つてこの特性を利用するために多くの案が開発され
た。典型的には、かかる案は測定されるべきリガンドと
競合する精製されたリガンド並びに標識されそして固定
化抗体又はリガンド結合パートナー、又はそれら自身と
リガンドとの間で反応性である多重の固定化されそして
標識されたリガンド結合パートナーを必要とする。これ
らの方法はすべて一様に関連した標識の検出性に頼つて
いる。
検出の感度は使用される標識の種類並びにそれを検出す
るのに利用できる装置の品質及び種類に関係している。
たとえば同位体は、現在の工学的能力が単一同位体原子
の検出を許容するので高い水準の感度を与えるものと従
来から認識されてたが、それにもかかわらず放射性同位
体により課される固有の健康上の危険により非常に不評
である。更に、注意深い取扱い及び同位体試薬の廃棄に
より必要とされる操作上の困難はより良い標識の研究を
刺激した。
この理由で、２つの種類の標識、即ち蛍光分子及び酵素
が近年非常に好評を得るに到つた。酵素は、酵素の連続
的な又は持続性の化学的活性特性による生物学的増幅系
（biological amplifi-cation system）を有利に提供
し、それにより基質は検出可能な生成物に転換される。
かくして酵素は、実際には間接的標識である。何故なら
ば、検出されるのは酵素活性の生成物であつて、酵素そ
れ自体ではないからである。しかしながら、かかる酵素
又は酵素結合免疫吸着剤アツセイ（enzyme linked immu
nosorbant assays）（いわゆるFLISA系）は、得られる
生成物への転化及び得られる生成物の検出のために好適
な条件下の基質を提供するために、余分の工程及び試薬
を必要とする点で不利である。
蛍光分子（Fluorescent molecules）は、酵素の増幅の
利点を提供しないけれども、一般に、それらの検出及び
関連した方法に必要な装置が簡単であることにより好都
合であることが見出された。蛍光分子は適当な周波数で
照明されることのみが必要であり、そして得られる発光
スペクトルは適当な発光スペクトル領域における感度を
有する光検出器又は同様なものにより検出される。
実際には、たとえばオルトスペクトルIII（Or-tho Spec
trum III）（本発明の譲受人から入手可能である）を含
む多数の機器は蛍光性に標識された抗体を使用して、照
明ゾーンを通つてシングルフアイル（single file）を
通過するように流体力学的に集中されている（focuse
d）セル上の抗原性マーカ（antigenic markers）の存在
を検出する。スペクトル的に特異的な照明は適当な位置
に配列された光検出器により検出されるレーザ及び蛍光
発光により有利に与えられる。事実、種々の波長の蛍光
発光を提供する多数の蛍光染料が見出されておりそして
商業的に入手可能である。
非常に多数の蛍光染料が入手可能であるにもかかわら
ず、長波長、即ち、赤色スペクトルにおいて励起されそ
して発光される分子が相対的に欠如している。このよう
な特性は、これらの波長が他の生物学的分子からの天然
の蛍光を排除してより容易に検出することができる故に
望ましい。かかる天然の蛍光は他の場合には、蛍光性標
識からの所望の信号をしばしばマスクするバツクグラウ
ンド信号を生じ、それにより感度を低下させる。
更に、大抵の蛍光分子は典型的には、紫外線領域に近い
発光スペクトルを有しており、それによつてアルゴンレ
ーザ等の如き相対的に高価な光源を必要とする。容易に
認められ得る通り、計測操業（instrumentation）の追
加される複雑性及び価格は、特にDRG規制〔診断関連群
（Diag-nosis Related Group）規制〕等により課される
最近の財政上の圧迫に鑑みると、臨床検査室及び病院の
それらの入手可能性を減少させる。
かくして本発明の目的は、ヘリウムネオンレーザの如き
相対的に安価な光源により励起され得る蛍光標識を提供
することである。
オイ（Oi）等は、ザジヤーナルオブセルバイオロジー
（The Journal of Cell Biology）、93:981-986（198
2）において“細胞及び分子の分析のための蛍光性フイ
コビリタンパク質コンジユゲイト”（“Fluorescent Ph
yco-biliprotein Conjugates For Analysis of Cell an
d Molecules"）と題する論文において、橙赤色スペクト
ル領域において蛍光発光を有する新らしい種類の染料の
合成を記載している。これらの蛍光性分子又はフイコビ
リタンパク質は様様な種の藻類から導かれる。かかるフ
イコビリタンパク質は所望の波長の付近の波長において
比較的高い効率を有利に示す。オイにより述べられた染
料試薬は、両方共フイコビリタンパク質である２種類の
異なる蛍光性分子間のエネルギー転位に基づいており、
不利に大きい分子をもたらす。
蛍光エネルギー転位（fluorescence energytransfer）
は、その１つが供与体であるとみなされそして他が一般
に受容体と呼ばれる２種類の分子間で時々起こるプロセ
スである。典型的には、供与体分子は１つの波長（実際
には好ましくは入手可能な照明スペクトルのピークにあ
るように選ばれたピーク又は最適波長を有する波長のベ
ル形状スペクトル）のエネルルギーにより励起され、そ
して典型的な発蛍光団の蛍光エネルギー発光曲線とよく
似た蛍光エネルギー発光曲線を示す。受容体分子は、好
ましくは、その励起スペクトルの重要な部分が供与体分
子の発光波長スペクトル内に入るように、好ましくは適
当な励起波長を有するように選ばれる。最適条件下で
は、供与体ピーク発光波長は受容体ピーク励起波長にほ
ぼ等しいであろう。供与体分子からのエネルギー転位機
構による受容体分子によるエネルギーの受入れは供与体
分子の見かけの減少した蛍光をもたらす。受容体分子は
発色団、即ち、固有の蛍光を示さない分子であることが
できるが、好ましくは、エネルギー転位と共に増加する
それ自身の特性的蛍光発光スペクトルを有する蛍光分子
である。
真の蛍光エネルギー転位対におけるエネルギー転位は、
双極子−双極子エネルギー転位プロセスにより起こり、
その効率は供与体分子と受容体分子との間の距離の逆６
乗（inverse 6th pow-er）と共に変わる。かくして、蛍
光エネルギー発光における変化は、受容体分子及び供与
体分子又はそれらが結合している分子間の近接関係（pr
oximity relation ships）を決定するのに使用すること
ができる。更に、フオースターの理論（Forster′s the
ory）に従う、双極子−双極子エネルギー転位プロセス
は転位効率に影響する配向成分（orientation componen
ts）も有する。これらの及び他の蛍光エネルギー転位考
察は、アニユアルズ レビユー バイオケム （Annual
s Review Biochem）.,47:819-846（1978）における、
“分光ルーラーとしての蛍光エネルギー転位”（“Fluo
rescence Energy Transfer as a Spectroscopic Rule
r"）と題するルバートストリアー（lube-rt Stryer）に
より書かれた普通の参考文献に記載された。
蛍光エネルギー転位のこの距離感受性の観点は米国特許
第4,199,559号、第3,996,345号、第4,174,384号及び第
4,261,968号においてウルマン（Ullman）等により標識
技術として使用された。ウルマンは、蛍光剤分子が特定
の波長の光により励起されそしてより長い波長の蛍光を
発するような分子の蛍光剤−消光剤対（fluorescer-que
ncher pair）の使用を教示している。しかしながら、蛍
光剤に極めて近接している非蛍光性消光剤分子の存在は
この蛍光の消光をもたらし、それにより測定可能な蛍光
の総合的減少に寄与する。従つて、ウルマンのアツセイ
は、検出されるべきリガンドとの特異的且つ同時的免疫
学的反応のための、蛍光剤分子又は消光剤分子で標識さ
れた２つの異なる抗体を使用する。これらの方法は、多
重抗体（multiple antibo-dies）の結合のための必要な
多重の結合部位（binding sites）を与えるために、性
質において多価であるリガンドを必要とする。これらの
方法は蛍光エネルギー対の２つのメンバーが別の試薬の
一部であることも必要とする。
これに替つて、一価リガンドの場合には、ウルマンはリ
ガンド類似体（ligand-analog）であつて、その実質的
部分は、リガンドと同じ空間的及び極性構成を有してい
て受容体又は抗体の結合部位に対してリガンドと競合す
ることができる１つ又はそれより多くの決定基又はエピ
トープ部位（epitopic sites）を規定するところのリガ
ンド類似体の使用を教示している。リガンド類似体は結
合部位における原子又は官能基の不存在又はリガンド中
に始めから存在している１つ又はそれより多くの原子の
代わりに導入されたリンキング基（linking group）を
有するという点でリガンドとは異なる。そうすると、典
型的には、このリガンド類似体は蛍光剤又は消光剤分子
の何れかで標識されそして蛍光剤−消光剤対の他の分子
で標識されている抗体上の結合部位に対して試料のリガ
ンドと競合する。この方式においては、リガンドの濃度
を増加させることは抗体結合部位に対してより有効に競
合し、それにより標識されたリガンド類似体を追い出し
そしてそうでなければそれらが寄与するであろう蛍光消
光の量を減少させることが期待され得る。
ウルマンのアツセイは、検出されるべきリガンド又はア
ナライトの多価性を必要とするのが不利であり、又はリ
ガンドと競合するのに精製された損傷のない（intact）
リガンド類似体の製造を必要とするのが不利である。経
験によれば、かかる物質の製造は一般に不利で、困難
で、時間を消費しそして費用のかかる提案であることが
証明された。いずれにせよ、蛍光剤−消光剤対の分子は
免疫学的反応の不存在下においては分かれている（sepa
rate）。
本発明の更に他の目的は、少なくとも２つの蛍光団であ
つて、その１つは励起すると、第２の蛍光団を励起する
ことができる発光スペクトルを示し、第２蛍光団は測定
により検出可能で且つ第１の発光スペクトルとは区別す
ることができる発光を示しそして該蛍光団の１つはフイ
コビリタンパク質である、少なくとも２つの蛍光団を使
用することである。
本発明の更に他の目的は、恒久的に相互に結合した（pe
rmaneutly coupled together）蛍光エネルギー転位対の
個々のメンバーを有する標識であつて該メンバーの１つ
はフイコビリタンパク質である標識を提供することによ
つて標識技術を簡単にすることである。
蛍光エネルギー転位対のスペクトル的に近接した励起及
び発光スペクトルと関連した問題を認識したので、検出
の感度を増加するために発光周波数と励起周波数との間
のスペクトル差又はストークスシフト（Stokes Shift）
を増加するのに追加の方法が探索された。バイオフイジ
ツクスジヤーナル（Biophysics Journal）43:383（198
3）においてグレーザー（Glazer）及びストリアー（Str
yer）は２つのフイコビリタンパク質、即ちフイコエリ
スリン（phycoery-thrin）及びアロフイコシアニン（al
lophyco-cyanine）間の蛍光エネルギー転位を達成する
ために該２つのフイコビリタンパク質の共有結合（cova
lent linkage）を述べている。かくして１つの周波数に
おける発光はエネルギー転位及びより大きい周波数にお
ける励起をもたらし、それにより有意なストークスシフ
トを得る。しかしながら、グレザー等の系は、上記コン
ジユゲイト（conjugate）の約１対１のタンパク質対タ
ンパク質結合比（protein-to-protein coupling rati
o）をもたらし、それにより有用なストークスシフトを
伴なうが効率の増加を殆んど生じないか又は全然生じな
い。更に、フイコビリタンパク質は大きい分子（105ダ
ルトンのオーダー）である傾向があり、そして２つのこ
のような大きい分子を結合することによつて、種々のイ
ムノアツセイ用途に実際に使用するのが非常に困難であ
る過度に大きい分子が導かれる。得られる標識は犬を揺
する尾とでも比喩的に表現することができる、免疫学的
成分を完全に立体妨害する程に大きい。
結果として、本発明の更に他の目的は大きいストークス
シフトとカツプリングしたより大きい効率を有するが、
多重フイコビリタンパク質（multiple phycobiliprotei
ns）を使用しないフイコビリタンパク質をベースとする
標識を提供することである。
更に他の関連した目的は、蛍光エネルギー転位機構を使
用して、前記した効率増加及びストークスシフトを得る
が、１対１タンパク質対タンパク質結合比により生じる
グレイザー及びストクアーの欠点を回避することであ
る。
本発明の原理及び目的に従えば、フイコビリタンパク質
の蛍光発光効率を増加させるのに蛍光エネルギー転位機
構を使用するイムノアツセイ用途に有用な蛍光標識が提
供される。これは少なくとも１つの、最も好ましい態様
においては、複数の有機染料分子を、エネルギー転位機
構が作用することを可能とするような方法でフイコビリ
タンパク質に共有結合させる（covalently linking）こ
とによつて有利に達成される。
かくして、理想的には、有機染料分子スペクトル周波数
の励起周波数における標識の照明はエネルギー転位機構
を介してそのエネルギーの少なくともいくらかのフイコ
ビリタンパク質への転位をもたらし、それによりもとの
励起周波数とフイコビリタンパク質発光周波数との間の
ストークスシフトを達成する。複数の、好ましくは小さ
い分子量の有機染料分子の存在は、フイコビリタンパク
質それ自体と比較してフイコビリタンパク質の蛍光効率
を増加する。
本発明の最も好ましい態様においては、蛍光標識はアロ
フイコシアニンに共有結合した（cova-lently couple
d）複数のアズールＡ（Azure A）有機染料分子を含有し
て成る。
検出される蛍光信号における非特異的ノイズ成分を減少
するという所望に従つて、本発明は、非特異的蛍光ノイ
ズ成分が自然に減少するところの、遠赤外又は近赤外ス
ペクトル領域において発光するフイコビリタンパク質受
容体分子を使用する。感度を最適化しそして高めるため
に、本発明は、エネルギー転位機構を介して大きいスト
ークスシフトを達成するのに好適な補助分子と共にフイ
コビリタンパク質を含有して成る標識も提供する。かく
して、励起周波数と発光周波数との間の減少したスペク
トルオーバーラツプは、発光周波数の検出期間中スペク
トルフイルタにより励起周波数の便利なスペクトル排除
（spectral elimina-tion）を高める。
かかるストークスシフトはフイコビリタンパク質をオイ
又はグレーザー等刊行物における如く他のフイコビリタ
ンパク質とではなくて、好ましくは小さい低分子量の有
機分子と結合させることによつてフイコビリタンパク質
を用いて達成され得ることが本発明者により発見され
た。フイコビリタンパク質分子の相対的に大きい寸法の
ため、複数の小さい有機染料がそれに結合しているのが
好ましく、該有機染料の各々は蛍光エネルギー機構を介
してフイコビリタンパク質へのエネルギーに寄与し、そ
れにより蛍光効率を増加させることができる。予期され
る如く、より高い蛍光効率はより低い標識濃度での検
出、従つてより高い感度を可能とする。
小さい有機分子は、約100乃至1000ダルトンの範囲の分
子量を有し、それにより得られる標識の寸法又は重量を
不必要に増加することなくフイコビリタンパク質に多数
のこのような分子の結合を許容するのが好ましい。蛍光
エネルギー転位機構の効果を更に高めるために、好まし
い標識は、理想的には、前記分光ルーラの論文において
ストリアーにより記載された考案に従つて、有機染料分
子とフイコビリタンパク質との間の距離を注意深く調節
することによつてエネルギー転位を最適化するような方
法で、フイコビリタンパク質に共有結合した有機染料分
子を有するであろう。
得られる標識は、試験されるべき成分及び行なわれるべ
きアツセイの種類（競合的、非競合的等）に依存して所
望に応じてリガンド又はリガンド受容体の如き適当な試
薬に標識を結合する工程のみを残して、非常に多様な種
類のイムノアツセイに使用することができる。実際の結
合方法は、前記オイ等の論文に記載されており、又は他
の種類の普通の周知の結合方法を使用することができ
る。追加の指示は添付実施例を参照して得ることができ
る。
容易に認められる如く有機染料分子は、最も望ましい又
は入手可能な照明源に極めて適合する励起周波数スペク
トルを与えるように好ましくは選ばれる。更に、それら
の間のエネルギー転位を最大にするために、選ばれたフ
イコビリタンパク質の励起スペクトルに好ましくは極め
て近接して、即ち好ましくは5nmより少ない差で適合す
る発光スペクトルを考慮するようにも選択がなされなけ
ればならない。
多分最も信頼性があり且つ経済的な高強度照明源はヘリ
ウム−ネオン（He-Ne）レーザーである。従つて、本発
明の標識の最も好ましい態様は、フイコビリタンパク質
アロフイコシアニンに共有結合した小さい分子量の有機
染料、アズールＡ（Azure A）、を使用する。アズール
Ａは約632nmの励起周波数を有し、従つて約632.8nmで発
光するHe-Neレーザーのスペクトル発光にきわめて適合
する。更に、645nmにおけるアズールＡの発光ピーク
は、アロフイコシアニンの励起ピークに密接に対応して
いる。検出は、適当に波された光電子増倍管又は他の
感光性デバイスを介して655nmにピークを有するアロフ
イコシアニンの発光を検出することにより達成される。
かくして、もとの励起周波数と最終発光周波数との間に
約23nmの大きいストークスシフトがある。
例として与えられ、限定することを意図しない下記実施
例を参照して本発明の原理及び方法が更に理解される。
実施例１ アロフイコシアニン−アズールＡ標識の合成及び固相固
定化 アロフイコシアニン〔アプライドバイオシステムズ，シ
ーエイ（Applied Biosystems,CA）からの〕は約5mg/ml
の濃度で65％硫酸アンモニウム中懸濁液として得られ
た。この懸濁液0.5mg乃至5.0mgを暗所で４℃で一夜10mM
リン酸塩緩衝液（Aldrich）１に対して透析した。次
いで透析したアロフイコシアニンを、１−エチル−３−
（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド−HCl
塩（Sigma）1.0〜5.0mgを加えることにより活性化し、
そして室温で１時間混合した。次に、10mMリン酸塩緩衝
液10ul〜100ul中のアズールＡ（Aldrich Chemicals）10
ug〜100ugを活性化されたアロフイコシアニンに加え、
そして得られる混合物を暗所で４℃で一夜反応させた。
反応が終了すると、アロフイコシアニン−アズールＡ標
識はセントリコン（Centricon）濃縮装置（Ami-con）を
使用して繰返し濃縮及び再懸濁により精製された。次い
でアロフイコシアニン−アズールＡコンジユゲイテツド
（allophycocyanin-azure A conjugated dye）を、標準
カルボジイミド法によつて、カルボキシレイト デリビ
タイズド モノデイスパース（carboxylate derivitize
d monodisperse）1-6umラテツクスビーズ（Polyscience
s）にアロフイコシアニンアミノ基を介して結合させ
た。得られる染料結合ビーズを洗浄しそして保存剤とし
て0.1％ナトリウムアジド（Fisher）を加えて50mMホウ
酸塩緩衝液（Borate Saline Buffer）pH8.5中に貯蔵し
た。この固定化方法はアズールＡラテツクスビーズ及び
アロフイコシアニンラテツクスビーズの製造にも、適当
な且つ明らかな変更を伴なつて遂行された。
実施例２ 蛍光測定 標識されていないビーズ、アズールＡビーズ、アロフイ
コシアニンビーズ及びアズールＡ−アロフイコシアニン
で標識されたビーズの蛍光測定をスペクラムIIIフロー
サイトメーター（Spectrum III flow cytometer）（本
発明の譲受人から入手可能）を使つて行なつた。観測さ
れた結果は下記表に要約されている。試 料 平均蛍光 標識されていないビース 1.0 アズールＡビーズ 3.7 アロフイコシアニンビーズ 29.4 アズールA/アロフイコシアニンビーズ 439.8 容易に認められる通り、本発明の標識、即ち、アロフイ
コシアニンに共有結合されたアズールＡは、個々の成分
の何れに対しても蛍光信号の有意な増加を与える。本発
明の原理及び目的に従えば、これは主として下記の結果
と考えられる：標識の励起周波数とより大きいストーク
スシフトでカツプリングされている好ましいヘリウムネ
オンレーザー光源との優れた適合、それにより励起周波
数と発光周波数との間のフイルタ識別効率（filter dis
crimination efficiency）を増加すること、高いエネル
ギー転位効率及びより大きい染料対タンパク質結合比
（dye-to-protein coup-ling ratio）。更に、本発明の
原理は前記に限定されるものではなく、たとえば化学ル
ミネツセンス、リン光及び熱ルミネツセンスを含むイル
ミネツセンスエネルギー転位プロセス（illumine-scenc
e energy transfer process）に適用することができる
ことが理解されるであろう。
フロントページの続き (56)参考文献 欧州特許公開76695（ＥＰ，Ａ) Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒ ｙ，29（９），Ｐ．1582−1586，1983 Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．，43（３），Ｐ. 383−386，1983 Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐ ｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，766（２），Ｐ. 269−276，1984

Claims (2)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】アロフイコシアニンに共有結合した複数の
    アズールＡ分子を含有して成る蛍光標識であって、該ア
    ズールＡ分子を励起することにより該アロフイコシアニ
    ンにエネルギーの転移をもたらして該アロフイコシアニ
    ンによる検出可能な蛍光発光を生じる、標識。
  2. 【請求項２】リガンドとそれに対して特異的なリガンド
    結合性受容体との間の免疫学的反応を検出することによ
    るリガンドの検出方法において、該リガンド又はリガン
    ド結合性受容体成分の１つと関連した標識を検出するこ
    とにより該免疫学的反応を検出することを含み、該標識
    が相互にエネルギー転位を許容する条件下でアロフイコ
    シアニンに共有結合した複数のアズールＡ分子を含有し
    て成り、 該検出工程が、アズールＡ分子を励起することができる
    第１の周波数において該標識を照明すること及び第２の
    周波数における該アロフイコシアニンからの蛍光発光を
    検出することを更に含むことを特徴とする方法。
JP60177764A 1984-08-14 1985-08-14 フイコビリタンパク質による螢光エネルギ−転位 Expired - Lifetime JPH079426B2 (ja)

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Families Citing this family (50)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4857474A (en) * 1985-03-29 1989-08-15 Research Corporation Phycoerythrins useful in fluorescent conjugates
US4996143A (en) * 1985-12-23 1991-02-26 Syngene, Inc. Fluorescent stokes shift probes for polynucleotide hybridization
US4777128A (en) * 1986-05-27 1988-10-11 Ethigen Corporation Fluorescence immunoassay involving energy transfer between two fluorophores
JP2594925B2 (ja) * 1987-01-23 1997-03-26 株式会社日立製作所 電気泳動装置
IT1217993B (it) * 1988-02-01 1990-03-30 Boehringer Biochemia Srl Metodo analitico impiegante reagneti biospecifici marcati con macromolecole colorate
US6010867A (en) * 1989-04-19 2000-01-04 Ibiden Co., Ltd. Reagent for biomaterials assay, preparation method thereof, and assay method
WO1990013029A1 (fr) * 1989-04-19 1990-11-01 Ibiden Co., Ltd. Reactif de dosage de substances biologiquement actives, son procede de production, procede et appareil de dosage
US5401469A (en) * 1989-04-19 1995-03-28 Ibiden Co., Ltd. Plastic optical biomaterials assay device
ATE106566T1 (de) * 1989-11-21 1994-06-15 Bayer Ag Optischer biosensor.
US5326692B1 (en) * 1992-05-13 1996-04-30 Molecular Probes Inc Fluorescent microparticles with controllable enhanced stokes shift
US5171846A (en) * 1990-05-21 1992-12-15 Coulter Corporation Method of preferential labelling of a phycobiliprotein with a second dye for use in a multiple color assay and product for such use
US5272257A (en) * 1990-05-21 1993-12-21 Coulter Corporation Method of preferential labelling of a phycobiliprotein with an amine-reactive dye for use in a multiple color assay and product for such use
US5783673A (en) * 1990-05-21 1998-07-21 Coulter Corporation Method of preferential labelling of a phycobiliprotein with an aminereactive dye for use in a multiple color assay and product for such use
US6359113B1 (en) 1990-12-31 2002-03-19 Rhodia Chimie Protective group, compound protected by said group and device for grafting the protective group on the compound to protect it
US5869605A (en) * 1992-10-30 1999-02-09 Rhone-Poulencchimie Protected compound comprising a protective group removably attached to a compound to be protected
US5237515A (en) * 1991-04-10 1993-08-17 University Of Utah Research Foundation Method of determining energy transfer efficiency of a donor-acceptor pair of fluorescent dyes
US5260004A (en) * 1991-12-02 1993-11-09 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Process of making Langmuir-Blodgett films having photo-electronic properties
JP3107649B2 (ja) * 1991-12-20 2000-11-13 イビデン株式会社 蛍光免疫測定装置
DE69330892T2 (de) * 1992-06-22 2002-04-11 Packard Instrument B.V., Groningen Plastischer Selbsklebender Szintillator
US5354574A (en) * 1992-06-23 1994-10-11 Ibiden Co., Ltd. Method for producing optical fiber having formyl groups on core surface thereof
ATE236403T1 (de) * 1992-09-03 2003-04-15 Coulter Int Corp Verfahren zur bevorzugten markierung von phycobiliprotein mittels aminreaktivem farbstoff zur verwendung in einem mehrfarbentest
US5674698A (en) * 1992-09-14 1997-10-07 Sri International Up-converting reporters for biological and other assays using laser excitation techniques
US6159686A (en) 1992-09-14 2000-12-12 Sri International Up-converting reporters for biological and other assays
US6399397B1 (en) 1992-09-14 2002-06-04 Sri International Up-converting reporters for biological and other assays using laser excitation techniques
US5698397A (en) * 1995-06-07 1997-12-16 Sri International Up-converting reporters for biological and other assays using laser excitation techniques
US5736410A (en) * 1992-09-14 1998-04-07 Sri International Up-converting reporters for biological and other assays using laser excitation techniques
NZ271658A (en) * 1993-08-23 1997-11-24 Unilever Plc Apparatus for customising facial foundation products at point of sale comprising a skin analyzer, a programmable device and a formulation machine formulating/dispensing apparatus
GB9319011D0 (en) * 1993-09-14 1993-10-27 Cambridge Veterinary Sciences Assaying biological samples
US5824799A (en) * 1993-09-24 1998-10-20 Biosite Diagnostics Incorporated Hybrid phthalocyanine derivatives and their uses
US7322927B2 (en) 1993-09-24 2008-01-29 Biosite, Inc. Hybrid phthalocyanine derivatives and their uses
US6251687B1 (en) 1993-09-24 2001-06-26 Biosite Diagnostics, Inc. Fluorescence energy transfer and intramolecular energy transfer in particles using novel compounds
US6238931B1 (en) * 1993-09-24 2001-05-29 Biosite Diagnostics, Inc. Fluorescence energy transfer in particles
US7083984B2 (en) 1993-09-24 2006-08-01 Biosite, Inc. Hybrid phthalocyanine derivatives and their uses
US5512753A (en) * 1994-06-08 1996-04-30 Packard Instrument, B.V. Scintillation counting system using scintillator capsules
US6342389B1 (en) 1995-04-10 2002-01-29 Roger S. Cubicciotti Modified phycobilisomes and uses therefore
US5695990A (en) * 1995-04-10 1997-12-09 Cubicciotti; Roger S. Phycobilisomes, derivatives, and uses therefor
FR2735238B1 (fr) * 1995-06-09 1997-09-05 Cis Bio Int Utilisation d'un complexe phycobiliproteine-peptide de liaison en tant que traceur fluorescent
US5714386A (en) * 1996-01-11 1998-02-03 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Cy7-allophycocyanin conjugates for use in multiplex fluorescence detection assays
JP2809228B2 (ja) * 1997-10-22 1998-10-08 株式会社日立製作所 電気泳動装置
ATE478090T1 (de) 1997-10-27 2010-09-15 Boston Probes Inc SICH AUF ßPNA MOLECULAR BEACONSß BEZIEHENDE VERFAHREN, TESTSÄTZE UND ZUSAMMENSETZUNGEN
US6485901B1 (en) 1997-10-27 2002-11-26 Boston Probes, Inc. Methods, kits and compositions pertaining to linear beacons
GB9727355D0 (en) * 1997-12-24 1998-02-25 Kalibrant Limited A composition for use in fluorescence assay systems
AU2679899A (en) 1998-02-18 1999-09-06 Dade Behring Inc. Chemiluminescent compositions for use in detection of multiple analytes
US6361942B1 (en) 1998-03-24 2002-03-26 Boston Probes, Inc. Method, kits and compositions pertaining to detection complexes
WO2000017650A1 (en) * 1998-09-23 2000-03-30 Molecular Probes, Inc. Energy transfer compositions comprising phycobiliproteins
CA2442282A1 (en) * 2001-03-29 2002-10-10 Cellect Technologies Corp. Methods devices and systems for sorting and separating particles
DE10214019A1 (de) * 2002-03-30 2003-10-16 Detlef Mueller-Schulte Lumineszierende, sphärische, nicht autofluoreszierende Silicagel-Partikel mit veränderbaren Emissionsintensitäten und -frequenzen
US6991372B2 (en) * 2003-03-13 2006-01-31 Illinois Tool Works Inc. Reclosable packages with front panel slider-zipper assembly
US8017104B2 (en) * 2007-02-28 2011-09-13 Carestream Health, Inc. Large stoke shift dye used for optical imaging
US8906354B2 (en) 2007-02-28 2014-12-09 Bruker Biospin Corporation Loaded latex optical molecular imaging probes containing lipophilic large stokes shift dyes

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4166105A (en) * 1973-07-30 1979-08-28 Block Engineering, Inc. Dye tagged reagent
US3996345A (en) * 1974-08-12 1976-12-07 Syva Company Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays
US4199559A (en) * 1974-08-12 1980-04-22 Syva Company Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays
US4174384A (en) * 1975-06-30 1979-11-13 Syva Company Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays
US4261968A (en) * 1979-05-10 1981-04-14 Syva Company Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays
IT1140209B (it) * 1981-09-25 1986-09-24 Anic Spa Reagenti per immunoluorescenza e metodo per la loro preparazione
EP0076695B1 (en) * 1981-10-06 1985-02-20 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Fluorescent conjugates for analysis of molecules and cells
US4542104A (en) * 1983-04-06 1985-09-17 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Jr. Univ. Phycobiliprotein fluorescent conjugates

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ＢｉｏｃｈｉｍｉｃａｅｔＢｉｏｐｈｙｓｉｃａＡｃｔａ，７６６（２），Ｐ．２６９−２７６，１９８４
Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．，４３（３），Ｐ．３８３−３８６，１９８３
ＣｌｉｎｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，２９（９），Ｐ．１５８２−１５８６，１９８３

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Publication number Publication date
JPS6188155A (ja) 1986-05-06
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US4666862A (en) 1987-05-19
CA1261741A (en) 1989-09-26
EP0174744B1 (en) 1989-12-20

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