JPH0798834B2 - 螢光性ポリヌクレオチド - Google Patents
螢光性ポリヌクレオチドInfo
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- JPH0798834B2 JPH0798834B2 JP3144090A JP14409091A JPH0798834B2 JP H0798834 B2 JPH0798834 B2 JP H0798834B2 JP 3144090 A JP3144090 A JP 3144090A JP 14409091 A JP14409091 A JP 14409091A JP H0798834 B2 JPH0798834 B2 JP H0798834B2
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- JP
- Japan
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- fluorescent
- chloroform
- added
- chemical
- nucleotide
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
Landscapes
- Saccharide Compounds (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、螢光を発するヌクレオ
シド又はヌクレオチドを分子中又は分子末端に含むポリ
ヌクレオチドに関する。
シド又はヌクレオチドを分子中又は分子末端に含むポリ
ヌクレオチドに関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】生体高
分子、特に蛋白質や核酸における構造と機能の相関を明
らかにするために、螢光プローブを利用した研究が広く
行なわれている。そして核酸の研究においては、核酸中
に存在する螢光性の微量塩基をプローブとして用いる方
法や、核酸へ螢光分子を化学的に導入してこれをプロー
ブとして用いる方法がある。螢光性塩基を有するヌクレ
オシドの例としては、アデノシン類やシチジン類をクロ
ルアセトアルデヒドで化学修飾して得られる、下記式で
示されるような螢光性のエテノ誘導体がある。
分子、特に蛋白質や核酸における構造と機能の相関を明
らかにするために、螢光プローブを利用した研究が広く
行なわれている。そして核酸の研究においては、核酸中
に存在する螢光性の微量塩基をプローブとして用いる方
法や、核酸へ螢光分子を化学的に導入してこれをプロー
ブとして用いる方法がある。螢光性塩基を有するヌクレ
オシドの例としては、アデノシン類やシチジン類をクロ
ルアセトアルデヒドで化学修飾して得られる、下記式で
示されるような螢光性のエテノ誘導体がある。
【０００３】
【化３】
【０００４】
【化４】 特に、エテノアデノシン類は、中性で強く螢光を発する
ことから、これをプローブとして用いて種々の研究が行
なわれてきた。しかし、これらは塩基対形成能を有しな
い。
ことから、これをプローブとして用いて種々の研究が行
なわれてきた。しかし、これらは塩基対形成能を有しな
い。
【０００５】本発明者らは、螢光性を有しグアニンある
いはアデニンとの塩基対形成が可能な、螢光プローブと
して用いることのできるポリヌクレオチドを得るべく鋭
意研究を行ない、本発明に到達した。
いはアデニンとの塩基対形成が可能な、螢光プローブと
して用いることのできるポリヌクレオチドを得るべく鋭
意研究を行ない、本発明に到達した。
【０００６】
【課題を解決するための具体的な手段】即ち、本発明
は、分子中又は分子末端に、一般式（Ｉ）
は、分子中又は分子末端に、一般式（Ｉ）
【０００７】
【化５】 で表わされる螢光性ヌクレオチドを、少なくとも１個含
有するポリヌクレオチドである。
有するポリヌクレオチドである。
【０００８】一般式（Ｉ）において特に好ましいのは、
Ｘ2 が
Ｘ2 が
【０００９】
【化６】 であり、Ｙ2 が−Ｏ−でＷ2 がＨ−である、ポリヌクレ
オチドである。
オチドである。
【００１０】本発明においてポリヌクレオチドとは、重
合度２〜１０，０００以上のヌクレオチドをいい、比較
的重合度が低い重合度２〜５０のヌクレオチドを含むも
のをいう。かかるポリヌクレオチドのなかでも、重合度
１０〜１，０００のオリゴ又はポリヌクレオチドが、比
較的容易に調製でき、しかも選択性の高いＤＮＡプロー
ブとなりうるという点で好ましい。
合度２〜１０，０００以上のヌクレオチドをいい、比較
的重合度が低い重合度２〜５０のヌクレオチドを含むも
のをいう。かかるポリヌクレオチドのなかでも、重合度
１０〜１，０００のオリゴ又はポリヌクレオチドが、比
較的容易に調製でき、しかも選択性の高いＤＮＡプロー
ブとなりうるという点で好ましい。
【００１１】前記一般式（Ｉ）で表わされるポリヌクレ
オチドは、下記一般式（II）、
オチドは、下記一般式（II）、
【００１２】
【化７】 で表わされる螢光性ヌクレオシド又はヌクレオチドを、
その３' 位又は５' 位に後述の如き方法でリン酸基を導
入することによって、ヌクレオチドとすることができ
る。
その３' 位又は５' 位に後述の如き方法でリン酸基を導
入することによって、ヌクレオチドとすることができ
る。
【００１３】一般式（II）において特に好ましいのは、
Ｘ1 とＹ1 が共にＨＯ−で、Ｚ1 がＨ−又はＨＯ−で、
Ｗ1 がＨ−の化合物、あるいはＸ1 及び／又はＹ1 が
Ｘ1 とＹ1 が共にＨＯ−で、Ｚ1 がＨ−又はＨＯ−で、
Ｗ1 がＨ−の化合物、あるいはＸ1 及び／又はＹ1 が
【００１４】
【化８】 （ｎは１，２又は３の整数を示す）で、Ｚ1 がＨ−又は
ＨＯ−で、Ｗ1 がＨ−である。水酸基が公知の適当な保
護基で保護されているものも、本発明の範囲に含まれ
る。
ＨＯ−で、Ｗ1 がＨ−である。水酸基が公知の適当な保
護基で保護されているものも、本発明の範囲に含まれ
る。
【００１５】一般式（II）の化合物の製造法を、Ｘ1 と
Ｙ1 が共にＨＯ−で、Ｚ1 とＷ1 が共にＨ−の場合を例
にとって説明する。
Ｙ1 が共にＨＯ−で、Ｚ1 とＷ1 が共にＨ−の場合を例
にとって説明する。
【００１６】一つの方法は、糖部の水酸基を保護した５
−ヨードデオキシシチジンにＯ−ヨードベンゾイルクロ
ライドを作用させ、得られた化合物をＤＭＦ中で、２価
のＰｄの存在下に加熱処理し、次いで保護基を除去する
方法である。
−ヨードデオキシシチジンにＯ−ヨードベンゾイルクロ
ライドを作用させ、得られた化合物をＤＭＦ中で、２価
のＰｄの存在下に加熱処理し、次いで保護基を除去する
方法である。
【００１７】他の方法は、デオキシシチジンから容易に
得られるＮ4 −ベンゾイルデオキシシチジン誘導体を、
メタノール中でヨウ素の存在下で光照射し、次いで常法
により脱保護を行なう方法である。
得られるＮ4 −ベンゾイルデオキシシチジン誘導体を、
メタノール中でヨウ素の存在下で光照射し、次いで常法
により脱保護を行なう方法である。
【００１８】かくして得られた一般式（II）の化合物
は、螢光性でありかつ核酸塩基のグアニンあるいはアデ
ニンと塩基対を形成する能力があるので、これを分子中
又は分子末端に有する本願発明のポリヌクレオチドは、
螢光プローブとして利用できる。あるいは、これらの化
合物は、ＤＮＡ二重らせん中に組み入れた際に、塩基部
分は空間的に適合しており、塩基間の水素結合形成能力
やスタッキング作用を増強する可能性も考えられる。
は、螢光性でありかつ核酸塩基のグアニンあるいはアデ
ニンと塩基対を形成する能力があるので、これを分子中
又は分子末端に有する本願発明のポリヌクレオチドは、
螢光プローブとして利用できる。あるいは、これらの化
合物は、ＤＮＡ二重らせん中に組み入れた際に、塩基部
分は空間的に適合しており、塩基間の水素結合形成能力
やスタッキング作用を増強する可能性も考えられる。
【００１９】螢光性ヌクレオシド又はヌクレオチドをＤ
ＮＡオリゴマーあるいはポリマーへ導入するには、有機
化学的に合成する方法と、酸素化学的に導入する２通り
の方法がとられる。
ＮＡオリゴマーあるいはポリマーへ導入するには、有機
化学的に合成する方法と、酸素化学的に導入する２通り
の方法がとられる。
【００２０】有機化学的に合成する方法は、螢光性ヌク
レオシド（以下、Ｆと略する）を含むオリゴヌクレオチ
ドを直接合成する方法である。I. Takura らが開発し
た、固相リン酸トリエステル法を用いて、図１に示すサ
イクルに従って合成を行なった。
レオシド（以下、Ｆと略する）を含むオリゴヌクレオチ
ドを直接合成する方法である。I. Takura らが開発し
た、固相リン酸トリエステル法を用いて、図１に示すサ
イクルに従って合成を行なった。
【００２１】すなわちステップ１として、ベンゼンスル
ホン酸（ＢＳＡ）で、５' −水酸基のジメトキシトリチ
ル基（ＤＭＴｒ基）を除去し、ステップ２で、ダイマー
ブロックをメシチレンスルホン酸ニトロトリアゾール
（ＭＳＮＴ）で縮合し、固相（図１においてローマ字Ｓ
を丸で囲んだもの）に担持されＦ含有オリゴマーの鎖を
伸長した。また、目的と異なる配列のオリゴマー生成を
防ぐために、縮合反応において未反応の５' −水酸基
は、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）存在下無
水酢酸（Ａｃ2 Ｏ）でキャッピングを行なった。
ホン酸（ＢＳＡ）で、５' −水酸基のジメトキシトリチ
ル基（ＤＭＴｒ基）を除去し、ステップ２で、ダイマー
ブロックをメシチレンスルホン酸ニトロトリアゾール
（ＭＳＮＴ）で縮合し、固相（図１においてローマ字Ｓ
を丸で囲んだもの）に担持されＦ含有オリゴマーの鎖を
伸長した。また、目的と異なる配列のオリゴマー生成を
防ぐために、縮合反応において未反応の５' −水酸基
は、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）存在下無
水酢酸（Ａｃ2 Ｏ）でキャッピングを行なった。
【００２２】このサイクルをくり返すことによって、目
的とするオリゴマーを合成した。オリゴマーヌクレオチ
ドのポリマー支持体からの切り出しとリン酸の保護基の
除去は、室温でアンモニア水で処理することにより行な
った。
的とするオリゴマーを合成した。オリゴマーヌクレオチ
ドのポリマー支持体からの切り出しとリン酸の保護基の
除去は、室温でアンモニア水で処理することにより行な
った。
【００２３】更にアンモニア水で加熱処理することによ
り、塩基部のアシル基を除去した。次いで逆層のシリカ
ゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、必要なフラク
ションを分取し、５' −末端のＤＭＴｒ基を除去し、更
に高速液体クロマトグラフィーで精製した。
り、塩基部のアシル基を除去した。次いで逆層のシリカ
ゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、必要なフラク
ションを分取し、５' −末端のＤＭＴｒ基を除去し、更
に高速液体クロマトグラフィーで精製した。
【００２４】螢光性ヌクレオシド又はヌクレオチドをＤ
ＮＡオリゴマーあるいはポリマーに酵素化学的に導入す
る方法としては、例えば、 （ｉ）ＤＮＡポリメラーゼを用いるニックトランスレー
ション（Rigby, P.W. ら、J.Mol. Biol., １１３，２３
７（１９７７）参照） （ii）末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼを
用いる３' −末端付加反応（F.J. Bollum, The Enzyme
s, (P.D. Boyer, ed.), 3rd Ed. Vol. １０，ｐｐ．１
４５−１７１，Academic Press, New York, N.Y.（１９
７４）参照） の２つが、通常用いられる。
ＮＡオリゴマーあるいはポリマーに酵素化学的に導入す
る方法としては、例えば、 （ｉ）ＤＮＡポリメラーゼを用いるニックトランスレー
ション（Rigby, P.W. ら、J.Mol. Biol., １１３，２３
７（１９７７）参照） （ii）末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼを
用いる３' −末端付加反応（F.J. Bollum, The Enzyme
s, (P.D. Boyer, ed.), 3rd Ed. Vol. １０，ｐｐ．１
４５−１７１，Academic Press, New York, N.Y.（１９
７４）参照） の２つが、通常用いられる。
【００２５】いずれの酵素を用いる場合にも、基質とし
ては、好ましくは、ヌクレオシド５' −トリリン酸が用
いられる。螢光性ヌクレオシドの５' −モノリン酸の合
成は、Yosyikawa ら（Tetrahedron Lett.,５０６５（１
９６７））の方法に従って合成できる。また、５' −モ
ノリン酸をイミダゾリドとした後ジリン酸と反応させ
る、５' −トリリン酸の合成は、Ottoらの方法（J.Am.
Chem. Soc., ８７，１７８５−１７８８（１９６５））
に従って行なうことができる。
ては、好ましくは、ヌクレオシド５' −トリリン酸が用
いられる。螢光性ヌクレオシドの５' −モノリン酸の合
成は、Yosyikawa ら（Tetrahedron Lett.,５０６５（１
９６７））の方法に従って合成できる。また、５' −モ
ノリン酸をイミダゾリドとした後ジリン酸と反応させ
る、５' −トリリン酸の合成は、Ottoらの方法（J.Am.
Chem. Soc., ８７，１７８５−１７８８（１９６５））
に従って行なうことができる。
【００２６】次に合成した５' −トリリン酸を基質とし
て用い、ＤＮＡポリメラーゼを用いて、ニック・トラン
スレーションを行なうと、シチジンの代りに、螢光性ヌ
クレオチドが導入され螢光標識されたオリゴマーあるい
はポリマーを調製することができる。また、末端デオキ
シヌクレオチドトランスフェラーゼを用いると、３'−
末端に螢光性ヌクレオチドポリマーを付加することがで
きる。
て用い、ＤＮＡポリメラーゼを用いて、ニック・トラン
スレーションを行なうと、シチジンの代りに、螢光性ヌ
クレオチドが導入され螢光標識されたオリゴマーあるい
はポリマーを調製することができる。また、末端デオキ
シヌクレオチドトランスフェラーゼを用いると、３'−
末端に螢光性ヌクレオチドポリマーを付加することがで
きる。
【００２７】以下、実施例、参考例により本発明を詳述
する。
する。
【００２８】
【参考例１】
【００２９】
【化９】 （１）５−ヨードデオキシシチジン（ａ）５００mgを無
水ピリジン１０mlに、懸濁させ、これに１，１，３，３
−テトライソプロピル−１，３−ジクロルジシロキサン
０．５７ml（１．２当量）を氷冷下で加え、その後室温
で２時間反応させた。
水ピリジン１０mlに、懸濁させ、これに１，１，３，３
−テトライソプロピル−１，３−ジクロルジシロキサン
０．５７ml（１．２当量）を氷冷下で加え、その後室温
で２時間反応させた。
【００３０】氷冷下で、水２mlを加えて反応を停止し、
１０分間放置した後、溶媒を減圧下留去した。残渣を水
−クロロホルム系で抽出し、クロロホルム層を無水硫酸
ナトリウムで乾燥した。クロロホルムを留去した後、シ
リカゲルクロマトグラフィーにより精製し、メタノール
で再結晶して、３',５' −０−（１，１，３，３−テト
ライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−５−
ヨードデオキシシチジン（ｂ）７５０mgを得た。物性値
は次の通りであった。
１０分間放置した後、溶媒を減圧下留去した。残渣を水
−クロロホルム系で抽出し、クロロホルム層を無水硫酸
ナトリウムで乾燥した。クロロホルムを留去した後、シ
リカゲルクロマトグラフィーにより精製し、メタノール
で再結晶して、３',５' −０−（１，１，３，３−テト
ライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−５−
ヨードデオキシシチジン（ｂ）７５０mgを得た。物性値
は次の通りであった。
【００３１】ｍ．ｐ． ２１０−２１１℃ ＵＶ λｍａｘ（メタノール） ２９３nm Ｍａｓｓ ｍ／ｅ ５９５（Ｍ+ ），５５２（Ｍ−４
３）。
３）。
【００３２】（２）３',５' −０−（１，１，３，３−
テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−
５−ヨードデオキシシチジン（ｂ）７００mgを無水ピリ
ジン１０mlに溶かし、氷冷下で、２−ヨードベンゾイル
クロリド３４０mg（１．２当量）を加えて、５０分間反
応させた。氷冷下で水２mlを加えて反応を停止し、１０
分間放置した後、溶媒を減圧下留去した。残渣を水−ク
ロロホルム系で抽出し、クロロホルム層を無水硫酸ナト
リウムで乾燥した。クロロホルムを減圧下で留去した
後、シリカゲルクロマトグラフィーにより精製し（０．
５％メタノール／クロロホルム）、３',５' −Ｏ−
（１，１，３，３−テトライソプロピルジシロキサン−
１，３−ジイル）−Ｎ4 −（２−ヨードベンゾイル）−
５−ヨードデオキシシチジン（ｃ）８８０mgを得た。物
性値は次の通りであった。
テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−
５−ヨードデオキシシチジン（ｂ）７００mgを無水ピリ
ジン１０mlに溶かし、氷冷下で、２−ヨードベンゾイル
クロリド３４０mg（１．２当量）を加えて、５０分間反
応させた。氷冷下で水２mlを加えて反応を停止し、１０
分間放置した後、溶媒を減圧下留去した。残渣を水−ク
ロロホルム系で抽出し、クロロホルム層を無水硫酸ナト
リウムで乾燥した。クロロホルムを減圧下で留去した
後、シリカゲルクロマトグラフィーにより精製し（０．
５％メタノール／クロロホルム）、３',５' −Ｏ−
（１，１，３，３−テトライソプロピルジシロキサン−
１，３−ジイル）−Ｎ4 −（２−ヨードベンゾイル）−
５−ヨードデオキシシチジン（ｃ）８８０mgを得た。物
性値は次の通りであった。
【００３３】ＵＶ λｍａｘ（メタノール） ３４０nm Ｍａｓｓ ｍ／ｅ ８２５（Ｍ+ ），７８２（Ｍ−４
３）。
３）。
【００３４】（２）３',５' −０−（１，１，３，３−
テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−
Ｎ4 −（２−ヨードベンゾイル）−５−ヨードデオキシ
シチジン（ｃ）５００mgを無水ジメチルホルムアミド５
mlに溶かし、酢酸パラジウム１４mg、トリフェニルホス
フィン３０mg、トリエチルアミン０．３mlを加え、アル
ゴン気流下で、１６時間１００℃に加熱した。溶媒を留
去し、残渣を水−クロロホルム系で抽出し、クロロホル
ム層は無水硫酸ナトリウムで乾燥した。クロロホルムを
留去した後、シリカゲルクロマトグラフィーにより精製
し（３％メタノール／クロロホルム）、２−［３',５'
−Ｏ−（１，１，３，３−テトライソプロピルジシロキ
サン−１，３−ジイル）−β−Ｄ−デオキシリボフラノ
シル］−３，６−ジオキソピリミド［４，５−ｃ］イソ
キノリン（ｄ）１１５mgを得た。物性値は以下の通りで
あった。
テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−
Ｎ4 −（２−ヨードベンゾイル）−５−ヨードデオキシ
シチジン（ｃ）５００mgを無水ジメチルホルムアミド５
mlに溶かし、酢酸パラジウム１４mg、トリフェニルホス
フィン３０mg、トリエチルアミン０．３mlを加え、アル
ゴン気流下で、１６時間１００℃に加熱した。溶媒を留
去し、残渣を水−クロロホルム系で抽出し、クロロホル
ム層は無水硫酸ナトリウムで乾燥した。クロロホルムを
留去した後、シリカゲルクロマトグラフィーにより精製
し（３％メタノール／クロロホルム）、２−［３',５'
−Ｏ−（１，１，３，３−テトライソプロピルジシロキ
サン−１，３−ジイル）−β−Ｄ−デオキシリボフラノ
シル］−３，６−ジオキソピリミド［４，５−ｃ］イソ
キノリン（ｄ）１１５mgを得た。物性値は以下の通りで
あった。
【００３５】ＵＶ λｍａｘ（メタノール） ２５２，
３４３nm Ｍａｓｓ ｍ／ｅ ５７１（Ｍ+ ），５２８（Ｍ−４
３） ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ）δ＋９．０９（ｓ，Ｈ−１），
８．８９（ｂｒ ｓ，Ｎ−Ｈ）８．４〜７．５（Aromat
ic, ４Ｈ），６．１２（ｄ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，Ｈ−１'
）。
３４３nm Ｍａｓｓ ｍ／ｅ ５７１（Ｍ+ ），５２８（Ｍ−４
３） ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ）δ＋９．０９（ｓ，Ｈ−１），
８．８９（ｂｒ ｓ，Ｎ−Ｈ）８．４〜７．５（Aromat
ic, ４Ｈ），６．１２（ｄ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，Ｈ−１'
）。
【００３６】（４）上記（３）で得られた化合物（ｄ）
の１００mgをテトラヒドロフラン５mlに溶解し、１Ｍテ
トラブチルアンモニウムフルオリド０．２ml（テトラヒ
ドロフラン溶液）を加えて、室温で１時間攪拌し、溶媒
を留去後、シリカゲルクロマトグラフィー（１０％メタ
ノール／クロロホルム）により精製して２−β−Ｄ−デ
オキシリボフラノシル−３，６−ジオキソピリミド
［４，５−ｃ］イソキノリン（ｅ）４８mgを得た。物性
値は以下の通りであった。
の１００mgをテトラヒドロフラン５mlに溶解し、１Ｍテ
トラブチルアンモニウムフルオリド０．２ml（テトラヒ
ドロフラン溶液）を加えて、室温で１時間攪拌し、溶媒
を留去後、シリカゲルクロマトグラフィー（１０％メタ
ノール／クロロホルム）により精製して２−β−Ｄ−デ
オキシリボフラノシル−３，６−ジオキソピリミド
［４，５−ｃ］イソキノリン（ｅ）４８mgを得た。物性
値は以下の通りであった。
【００３７】ＵＶ λｍａｘ ２５２nm（ε＝３６５０
０） ３４３nm（ε＝１１７００） ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6 ）δ＋ １２．０２（ｂｒ ｓ，Ｎ−Ｈ），９．５９（ｓ，Ｈ−
１）８．２〜７．４（芳香族４Ｈ），６．１９（ｔ，Ｊ
＝５．５Ｈｚ，Ｈ−１' ） λｅｘ ３４３nm（螢光スペクトルの励起波長） λｅｍ ３８５nm（螢光スペクトルの発光波長）。
０） ３４３nm（ε＝１１７００） ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6 ）δ＋ １２．０２（ｂｒ ｓ，Ｎ−Ｈ），９．５９（ｓ，Ｈ−
１）８．２〜７．４（芳香族４Ｈ），６．１９（ｔ，Ｊ
＝５．５Ｈｚ，Ｈ−１' ） λｅｘ ３４３nm（螢光スペクトルの励起波長） λｅｍ ３８５nm（螢光スペクトルの発光波長）。
【００３８】なお、化合物（ｅ）の相対螢光強度は、ピ
リドピリミジンヌクレオシドの約７０％であった。
リドピリミジンヌクレオシドの約７０％であった。
【００３９】
【参考例２】
【００４０】
【化１０】 ３',５' −０−（１，１，３，３−テトライソプロピル
ジシロキサン−１，３−ジイル）−Ｎ4 −ベンゾイルデ
オキシシチジン（ａ）３００mgを、メタノール３００ml
に溶かして、これにヨウ素４０mgを加え、高圧水銀灯で
２４時間、光照射した。反応液を重曹水で中和し５０ml
まで減圧下濃縮した。これに、水１００mlを加えて、ク
ロロホルムで抽出し、クロロホルム層を無水硫酸ナトリ
ウムで乾燥した。クロロホルムを留去した後、シリカゲ
ルクロマトグラフィーにより精製し、（３％メタノール
／クロロホルム）、２−［３',５' −０−（１，１，
３，３−テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジ
イル）−β−Ｄ−デオキシリボフラノシル］−３，６−
ジオキソピリミド［４，５−ｃ］イソキノリン（ｂ）８
６mgを得た。
ジシロキサン−１，３−ジイル）−Ｎ4 −ベンゾイルデ
オキシシチジン（ａ）３００mgを、メタノール３００ml
に溶かして、これにヨウ素４０mgを加え、高圧水銀灯で
２４時間、光照射した。反応液を重曹水で中和し５０ml
まで減圧下濃縮した。これに、水１００mlを加えて、ク
ロロホルムで抽出し、クロロホルム層を無水硫酸ナトリ
ウムで乾燥した。クロロホルムを留去した後、シリカゲ
ルクロマトグラフィーにより精製し、（３％メタノール
／クロロホルム）、２−［３',５' −０−（１，１，
３，３−テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジ
イル）−β−Ｄ−デオキシリボフラノシル］−３，６−
ジオキソピリミド［４，５−ｃ］イソキノリン（ｂ）８
６mgを得た。
【００４１】物性値は、参考例１において合成したもの
と一致した。
と一致した。
【００４２】なお、糖水酸基の保護基をアセチル基にし
た場合にも、ほぼ同様の条件で目的物が得られた。
た場合にも、ほぼ同様の条件で目的物が得られた。
【００４３】
【参考例３】
【００４４】
【化１１】 実施例１で得られた２−β−Ｄ−デオキシリボフラノシ
ル−３，６−ジオキソピリミド［４，５−ｃ］イソキノ
リン（ｅ）６５５mgを、無水トリエチルホスフェート５
mlに溶かし、０℃に冷却して、これにオキシ塩化リン６
１３mgを加えて、６時間反応させた後、氷１ｇを加えて
加水分解した。減圧下濃縮した後、残渣を蒸留水１mlに
溶かして、ＤＥＡＥ−セファデックスＡ−２５（ＨＣＯ
3 −型）を用い、トリエチルアンモニウムビカーボネー
トの直線濃度勾配にて、精製し、２−（５' −０−ホス
ホリル−β−Ｄ−デオキシリボフラノシル）−３，６−
ジオキソピリミド［４，５−ｃ］イソキノリン（ｆ）６
５２mgを得た。
ル−３，６−ジオキソピリミド［４，５−ｃ］イソキノ
リン（ｅ）６５５mgを、無水トリエチルホスフェート５
mlに溶かし、０℃に冷却して、これにオキシ塩化リン６
１３mgを加えて、６時間反応させた後、氷１ｇを加えて
加水分解した。減圧下濃縮した後、残渣を蒸留水１mlに
溶かして、ＤＥＡＥ−セファデックスＡ−２５（ＨＣＯ
3 −型）を用い、トリエチルアンモニウムビカーボネー
トの直線濃度勾配にて、精製し、２−（５' −０−ホス
ホリル−β−Ｄ−デオキシリボフラノシル）−３，６−
ジオキソピリミド［４，５−ｃ］イソキノリン（ｆ）６
５２mgを得た。
【００４５】
【参考例４】
【００４６】
【化１２】 実施例３で得られた２−（５' −０−ホスホリル−β−
Ｄ−デオキシリボフラノシル）−３，６−ジオキソピリ
ミド［４，５−ｃ］イソキノリン（ｆ）１００mgを、無
水ジメチルホルムアミド５mlに溶かし、カルボニルジイ
ミダゾール４００mgを加えて、室温で１時間反応させ
た。その後、反応液を、２０mlの１％ヨウ化ナトリウム
／アセトンに注ぎ、生成した沈澱は濾別して、アセトン
で洗浄し、減圧下で乾燥した。沈澱を無水ジメチルホル
ムアミド５mlに溶かし、モノ−トリ−ｎ−ブチルアンモ
ニウムホスフェート２ｇを加えて、室温で２４時間反応
させた。減圧下、濃縮した後、残渣を蒸留水３mlに溶か
して、ＤＥＡＥ−セファデックスＡ−２５（ＨＣＯ3 −
型）を用い、トリエチルアンモニウムビカーボネートの
直線濃度勾配にて精製し、２−（５' −０−ホスホリル
−β−Ｄ−デオキシリボフラノシル）−３，６−ジオキ
ソピリミド［４，５−ｃ］イソキノリン（ｇ）６０mgを
得た。
Ｄ−デオキシリボフラノシル）−３，６−ジオキソピリ
ミド［４，５−ｃ］イソキノリン（ｆ）１００mgを、無
水ジメチルホルムアミド５mlに溶かし、カルボニルジイ
ミダゾール４００mgを加えて、室温で１時間反応させ
た。その後、反応液を、２０mlの１％ヨウ化ナトリウム
／アセトンに注ぎ、生成した沈澱は濾別して、アセトン
で洗浄し、減圧下で乾燥した。沈澱を無水ジメチルホル
ムアミド５mlに溶かし、モノ−トリ−ｎ−ブチルアンモ
ニウムホスフェート２ｇを加えて、室温で２４時間反応
させた。減圧下、濃縮した後、残渣を蒸留水３mlに溶か
して、ＤＥＡＥ−セファデックスＡ−２５（ＨＣＯ3 −
型）を用い、トリエチルアンモニウムビカーボネートの
直線濃度勾配にて精製し、２−（５' −０−ホスホリル
−β−Ｄ−デオキシリボフラノシル）−３，６−ジオキ
ソピリミド［４，５−ｃ］イソキノリン（ｇ）６０mgを
得た。
【００４７】
【参考例５】
【００４８】
【化１３】 実施例４におけるモノ−トリ−ｎ−ブチルアンモニウム
ホスフェートの代りに、ジ−トリ−ｎ−ブチルアンモニ
ウムジホスフェートを用いて、同じ操作を行ない、２−
（５' −０−ホスホリル−β−Ｄ−デオキシリボフラノ
シル）−３，６−ジオキソピリミド［４，５−ｃ］イソ
キノリン（ｈ）６０mgを得た。
ホスフェートの代りに、ジ−トリ−ｎ−ブチルアンモニ
ウムジホスフェートを用いて、同じ操作を行ない、２−
（５' −０−ホスホリル−β−Ｄ−デオキシリボフラノ
シル）−３，６−ジオキソピリミド［４，５−ｃ］イソ
キノリン（ｈ）６０mgを得た。
【００４９】
【実施例１】本発明の螢光性ヌクレオシドを含むドデカ
マーの合成を、参考例５の（ｈ）を用いて、以下の如き
ホスホトリエステル固相合成法（図１参照）で行なっ
た。固相支持体は、１％架橋ポリスチレン樹脂を用い、
３' −末端となるシチジンは、３' −水酸基と樹脂とを
コハク酸エステルで結合し、担持した。合成は、図１に
示すサイクルに従って、ダイマーブロック縮合を行なっ
た。ステップ１ （脱トリチル化反応） ５μmol ヌクレオシド相当の樹脂を用いて、２％ベンゼ
ンスルホン酸（ＢＳＡ）クロロホルム溶液２mlで１分間
処理した（２回くり返した）。ステップ２ （縮合反応） ダイマー２０μmol を２００〜３００μｌのピリジンに
溶かし、縮合剤として、メシチレンスルホン酸ニトロト
リアゾール（ＭＳＮＴ）７０μmol を加えて、４０℃で
２０分間反応させた。ステップ３ （キャッピング反応）（未反応物の非反応化
反応） 無水酢酸（Ａｃ2 Ｏ）０．２mlを０．１Ｍ４−ジメチル
アミノピリジン（ＤＭＡＰ）のピリジン溶液１．８mlと
混合し（用時調製）、反応させた。
マーの合成を、参考例５の（ｈ）を用いて、以下の如き
ホスホトリエステル固相合成法（図１参照）で行なっ
た。固相支持体は、１％架橋ポリスチレン樹脂を用い、
３' −末端となるシチジンは、３' −水酸基と樹脂とを
コハク酸エステルで結合し、担持した。合成は、図１に
示すサイクルに従って、ダイマーブロック縮合を行なっ
た。ステップ１ （脱トリチル化反応） ５μmol ヌクレオシド相当の樹脂を用いて、２％ベンゼ
ンスルホン酸（ＢＳＡ）クロロホルム溶液２mlで１分間
処理した（２回くり返した）。ステップ２ （縮合反応） ダイマー２０μmol を２００〜３００μｌのピリジンに
溶かし、縮合剤として、メシチレンスルホン酸ニトロト
リアゾール（ＭＳＮＴ）７０μmol を加えて、４０℃で
２０分間反応させた。ステップ３ （キャッピング反応）（未反応物の非反応化
反応） 無水酢酸（Ａｃ2 Ｏ）０．２mlを０．１Ｍ４−ジメチル
アミノピリジン（ＤＭＡＰ）のピリジン溶液１．８mlと
混合し（用時調製）、反応させた。
【００５０】この操作（ステップ１〜３）を、５回くり
返し、ドデカマーを合成した。
返し、ドデカマーを合成した。
【００５１】合成したドデカマー（ｄＧＧＧＡＡＦＴＴ
ＴＣＣＣ……Ｆは螢光性ヌクレオシド）は、次の順序の
操作に従って、脱保護し精製した。 （ｉ）濃アンモニア水１６mlとピリジン４mlを加え、室
温で２４時間反応させた。 （ii）さらに、５０℃に加熱して４時間反応させた。 （iii ）逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｃ
１８カラム：ウォータース社製、３５〜１００μｍ）
で、精製した（アセトニトリルグラジエント：１０％−
３５％）。 （iv）８０％酢酸に溶かし、室温で２０分間処理して、
５' −末端のジメトキシトリチル基を除去した。 （ｖ）逆相高速液体クロマトグラフィーにて精製した
（東洋ソーダ：ＴＳＫ−４１０ＡＫ）。 （vi）イオン交換高速液体クロマトグラフィーにて精製
して、単一ピークを得た（東洋ソーダ：ＴＳＫgel ＩＥ
Ｘ５４０Ｋ）。
ＴＣＣＣ……Ｆは螢光性ヌクレオシド）は、次の順序の
操作に従って、脱保護し精製した。 （ｉ）濃アンモニア水１６mlとピリジン４mlを加え、室
温で２４時間反応させた。 （ii）さらに、５０℃に加熱して４時間反応させた。 （iii ）逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｃ
１８カラム：ウォータース社製、３５〜１００μｍ）
で、精製した（アセトニトリルグラジエント：１０％−
３５％）。 （iv）８０％酢酸に溶かし、室温で２０分間処理して、
５' −末端のジメトキシトリチル基を除去した。 （ｖ）逆相高速液体クロマトグラフィーにて精製した
（東洋ソーダ：ＴＳＫ−４１０ＡＫ）。 （vi）イオン交換高速液体クロマトグラフィーにて精製
して、単一ピークを得た（東洋ソーダ：ＴＳＫgel ＩＥ
Ｘ５４０Ｋ）。
【００５２】ドデカマーのＵＶスペクトルにおいて、３
４３nmの吸収により、螢光性ヌクレオシドの存在が確認
された。
４３nmの吸収により、螢光性ヌクレオシドの存在が確認
された。
【００５３】ドデカマー５' −末端を放射性標識
（32Ｐ）し、フィンガープリントを行なった結果、塩基
配列の正しいことを示していた。
（32Ｐ）し、フィンガープリントを行なった結果、塩基
配列の正しいことを示していた。
【００５４】
【実施例２】ニックトランスレーション法による方法 （ａ）用いた試薬 大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ（Boehringer - Mannheim
など、５unit／mlの５０％グリセロール溶液を原液のま
ま使用）；脾臓ＤＮase Ｉ［１mg／mlとなるように０．
０１Ｎ塩酸に溶かし、−２０℃で保存。使用時に希釈液
（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５ｍＭ
ＭｇＣｌ2 、１mg／mlウシ血清アルブミン）にて１０倍
に希釈し、０℃で２時間放置して活性化したあとさらに
終濃度０．１４mg／mlにして用いる］；ニックトランス
レーション緩衝液（１０倍量、５００ｍＭ Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５０ｍＭ ＭｇＣｌ2 、１０ｍＭ
２−メルカプトエタノール）；ｄＮＴＰ溶液（各０．１
ｍＭのｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰおよび参考例５の
（ｈ）で得たピリミドイソキノリンヌクレオシド−５'
−トリホスフェート（ｄＦＴＰ）溶液）；試料ＤＮＡ
（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０ｍＭ
ＫＣｌ、０．２ｍＭ ＥＤＴＡに１μｇ／μｌとなる
ようにλファージＨｉｎｄ IIIフラグメントＤＮＡを溶
かす）。
など、５unit／mlの５０％グリセロール溶液を原液のま
ま使用）；脾臓ＤＮase Ｉ［１mg／mlとなるように０．
０１Ｎ塩酸に溶かし、−２０℃で保存。使用時に希釈液
（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５ｍＭ
ＭｇＣｌ2 、１mg／mlウシ血清アルブミン）にて１０倍
に希釈し、０℃で２時間放置して活性化したあとさらに
終濃度０．１４mg／mlにして用いる］；ニックトランス
レーション緩衝液（１０倍量、５００ｍＭ Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５０ｍＭ ＭｇＣｌ2 、１０ｍＭ
２−メルカプトエタノール）；ｄＮＴＰ溶液（各０．１
ｍＭのｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰおよび参考例５の
（ｈ）で得たピリミドイソキノリンヌクレオシド−５'
−トリホスフェート（ｄＦＴＰ）溶液）；試料ＤＮＡ
（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０ｍＭ
ＫＣｌ、０．２ｍＭ ＥＤＴＡに１μｇ／μｌとなる
ようにλファージＨｉｎｄ IIIフラグメントＤＮＡを溶
かす）。
【００５５】（ｂ）方法 （１）６．５μｌのニックトランスレーション緩衝液、
１０μｌのｄＮＴＰ溶液、２μｌの試料ＤＮＡ（１μｇ
／μｌ）と水を加えて全量を６５μｌとし、よく攪拌し
た。
１０μｌのｄＮＴＰ溶液、２μｌの試料ＤＮＡ（１μｇ
／μｌ）と水を加えて全量を６５μｌとし、よく攪拌し
た。
【００５６】（２）活性化したＤＮase Ｉ溶液５μｌを
加えて室温に２分間放置してニックをいれた。ついで、
大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩを２μｌ加えて１４℃で１
時間反応させた。
加えて室温に２分間放置してニックをいれた。ついで、
大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩを２μｌ加えて１４℃で１
時間反応させた。
【００５７】（３）０．２５Ｍ ＥＤＴＡを３５μｌ加
えて６８℃で１０分間加温し、酵素反応を止めた。フェ
ノール抽出を２回、エタノール沈澱を２回繰り返した。
最後の沈澱を０．５mlの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐ
Ｈ７．５、１０ｍＭ ＫＣｌ、０．２ｍＭ ＥＤＴＡに
溶かして使用時まで−２０℃に保存した。
えて６８℃で１０分間加温し、酵素反応を止めた。フェ
ノール抽出を２回、エタノール沈澱を２回繰り返した。
最後の沈澱を０．５mlの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐ
Ｈ７．５、１０ｍＭ ＫＣｌ、０．２ｍＭ ＥＤＴＡに
溶かして使用時まで−２０℃に保存した。
【００５８】得られたポリヌクレオチドの重合度は約１
００〜１，０００であった。
００〜１，０００であった。
【図１】固相リン酸トリエステル法によるオリゴヌクレ
オチドの合成システムを示す。
オチドの合成システムを示す。
Claims (2)
- 【請求項１】 分子中又は分子末端に、一般式（Ｉ） 【化１】 で表わされる螢光性ヌクレオチド単位を、少なくとも１
個含有するポリヌクレオチド。 - 【請求項２】 一般式（Ｉ）において、Ｘ2 が 【化２】 であり、Ｙ2 が−Ｏ−でＷ2 がＨ−である、請求項１記
載のポリヌクレオチド。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3144090A JPH0798834B2 (ja) | 1985-09-09 | 1991-05-21 | 螢光性ポリヌクレオチド |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19769085A JPS6259293A (ja) | 1985-09-09 | 1985-09-09 | 螢光性ヌクレオシド又はヌクレオチド |
| JP3144090A JPH0798834B2 (ja) | 1985-09-09 | 1991-05-21 | 螢光性ポリヌクレオチド |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP19769085A Division JPS6259293A (ja) | 1985-09-09 | 1985-09-09 | 螢光性ヌクレオシド又はヌクレオチド |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06135991A JPH06135991A (ja) | 1994-05-17 |
| JPH0798834B2 true JPH0798834B2 (ja) | 1995-10-25 |
Family
ID=26475625
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3144090A Expired - Lifetime JPH0798834B2 (ja) | 1985-09-09 | 1991-05-21 | 螢光性ポリヌクレオチド |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0798834B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007223974A (ja) * | 2006-02-24 | 2007-09-06 | Japan Health Science Foundation | ポリ（ａｄｐ−リボース）グリコヒドロラーゼ分解耐性のポリ（エテノａｄｐ−リボース） |
-
1991
- 1991-05-21 JP JP3144090A patent/JPH0798834B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH06135991A (ja) | 1994-05-17 |
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