JPH0811068B2 - プロテインａ様物質の遺伝子及び該遺伝子含有微生物 - Google Patents

プロテインａ様物質の遺伝子及び該遺伝子含有微生物

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JPH0811068B2
JPH0811068B2 JP58201871A JP20187183A JPH0811068B2 JP H0811068 B2 JPH0811068 B2 JP H0811068B2 JP 58201871 A JP58201871 A JP 58201871A JP 20187183 A JP20187183 A JP 20187183A JP H0811068 B2 JPH0811068 B2 JP H0811068B2
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明はプロテインＡ様物質のヌクレオチド配列（遺
伝子）、該遺伝子を含む微生物及び該微生物によるプロ
テインＡ様物質の製造に関するものである。
プロテインＡは細菌スタフイロコツカス・アウレウス
（Staphylococcus aureus）の細胞壁の構成成分であ
る。その一つの型につき42,000の分子量が報告されてお
り、細胞壁の主成分である（全細胞蛋白質の1.7％を占
める）〔ビヨルク（Biork）著、ユーロ．ジエイ．バイ
オケム．（Eur.J.Biochem.）、29:579（1972年）を参
照〕。プロテインＡの摩擦比（friction ratio）および
固有粘度を最も球状の蛋白質と比較測定すると、比較的
細長い形状であるらしい。その分子を調節的にトリプシ
ン分解すると４つの相同性（homologous）ペプチド領域
（Ｎ末端のものから順にＤ、Ａ、ＢおよびＣと名命す
る）を生じ、その各々はIgG1分子を核IgGのFc部分で結
合することができる〔シヨダール，ジエイ．（Sjodahl,
J.）著、ユーロ．ジエイ．バイオケム.,73:343（1977
年）およびシヨダール，ジエイ．著、ユーロ．ジエイ．
バイオケム.,78:471（1977年）参照〕。プロテインＡの
相対結合効率は、pH、菌種、IgGのクラスおよびサブク
ラス等を含む多くの因子に依存する。プロテインＡは免
疫グロブリン（IgG）の抗体に対する親和力（affinit
y）を大きく損なうことなくIgGに結合する能力を有する
ため、種々の診断および基礎研究の試験系における免疫
吸着体として広く使用されている（米国特許第4,322,27
4号明細書参照）。最近におけるプロテインＡの応用の
興味は、抗癌治療における臨床用途の可能性に集中しつ
つある。通常、腫瘍細胞に対して細胞毒性作用を有する
感作末稍血リンパ球は、特異抗原、抗体、抗グロブリン
および免疫複合体よりなると推定される血清阻止因子に
よつて上記作用が阻止されると推測されている（バーン
ズ，ビー．シー．（Barnes,B.C.）、キヤンサー・ブル
（Cancer Bull.）、33:278（1981年）参照〕。これらの
「阻止因子」はプロテインＡを含有するスタフイロコツ
カス・アウレウス、コワンＩ菌体（Staphylococcus aur
eus,Cowan I cells）に吸着させて腫瘍患者の血清から
分離し、かくしてリンパ球細胞の介在する腫瘍細胞毒性
を試験管実験系（in vitro test system）で進行させる
ことができる〔スチーレ，ジー．（Steele,G.）、アン
カースト，ジエイ（Ankerst,J.）、およびシオグレン，
エイチ．（Sjogren,H.）著、イント．ジエイ．キヤンサ
ー（Int.J.Cancer）、14:83（1974年）参照〕。プロテ
インＡはIgG結合活性とは独立に多クローン抗体合成を
活性化する働きも有する〔シヨダール，ジエイ（Sjodah
l,J.）およびモラー，ジー．（Moller,G）著、スカン
ド．ジエイ．イムノル．（Scand.J.Immunol）、10:593
（1979年）参照〕。
プロテインＡの制癌剤としての大規模な試験は、材料
の高価なことおよびあるプロテインＡ製品中の不純物存
在のために不可能であつた。プロテインＡ製品の価格が
十分低下し、純度も向上するならば、プロテインＡの制
癌剤としで用途に関する一層の臨床試験は益々急速に進
展すると期待される。
本発明は、プロテインＡ様物質のアミノ酸配列をコー
ドする新規ヌクレオチド配列および公知のプラスミドベ
クターpBR322を含む組み変えプラスミドを開示するもの
である。この新規オリゴヌクレオチドの配列は下記に示
す。全配列はプラスミドpAC37中に含まれている。プラ
スミドpAC37-6も最後の209ヌクレオチド塩基を除く同一
の全配列を含有する。pAC37-6の最後の６ヌクレオチド
塩基はPst I認識配列、即ちCTGCAGをコードする。
下記に示す配列は、驚くべきことに、プロテインＡ様
物質のアミノ末端近傍の領域Ｅと命名されたさらに別の
IgG結合領域を新たに開示するものでもある。このよう
な領域の存在は、従来開示も示唆もされていなかつたも
のである。さらに、多クローン抗体合成の活性化に関与
する領域を形成していると考えられる予期に反する大き
なカルボキシ末端コード配列も発見された。
本発明により提供されたヌクレオチド配列およびその
サブフラグメントは、遺伝子工学分野に携わる者に対し
て、初めてプロテインＡ様物質およびプロテインＡ様物
質のサブフラグメントをコードするクローニングされた
ヌクレオチド配列を得ることを可能ならしめたものであ
る。
上記配列を知ることにより、遺伝子工学分野の技術者
にとつて、実質的に同じプロテインＡ様生物活性を有す
る分子をコードする他の同等ヌクレオチド配列の存在を
認識することは容易である。従つて、本発明の範囲には
上記特定のヌクレオチド配列のみならず、実質的にプロ
テインＡ様生物活性を有する分子をコードする全てのヌ
クレオチド配列も包含される。ここで「同等」の語は特
許用語として通常用いられる意味であり、実質的に同種
の宿主中において、上記ヌクレオチド配列と実質上同様
に、実質的に同じプロテインＡ様生物活性を有する分子
を製造するヌクレオチド配列を意味するものである。同
等ヌクレオチド配列の定義の中には、IgGのFc部分に結
合する能力を有するプロテインＡ様物質に相当するサブ
フラグメント、あるいは多クローン性Ｂ−細胞活性化作
用を有するものに相当するサブフラグメントも含まれ
る。本発明に係るプロテインＡ様物質およびそのサブフ
ラグメントは前記プロテインＡと同様の目的に使用可能
である。
プロテインＡ様物質をコードするDNA配列のクローニ
ングは、SACゲノム（S.aureus,Cowan I,SAC,ATCC 1259
8）のDNA配列を含む遺伝子の蓄積調製から開始した。こ
の調製は、基質としてHae III＋Alu I部分制限分解によ
り生じた平滑末端（blunt end）のSAC DNAフラグメント
を使用して、G-Cテーリングにより行なつた。50mMトリ
ス−塩酸;pH7.5;5mM MgCl;1mMジチオスレイトール（DT
T）400μｌ中でのHae III150単位およびAIu I200単位に
よるSAC DNA250μｇの分解（37℃、12分間）によつて、
広範な寸法範囲のフラグメント（2-10キロベース・ペア
ーズ〔kb〕）が得られた。報告されている分子量値42,0
00から、プロテインＡのコード配列は1.1-1.2kbのDNAよ
りなると推定された。プロテインＡをコードする配列お
よび隣接する調節配列の両者を含む組み変え挿入片（re
combinant insert）を得る可能性を最高に高めるため、
SAC遺伝子蓄積の調製には3-6kbの大きいフラグメントを
使用した。このDNAは調製用アガロースゲルから抽出
し、ターミナルトランスフエラーゼで15-20C残基のテー
ルを形成しそしてＧ−テールを形成したPst I−分解pBR
322にアニールした。得られた組み変えDNA、Ｇ−テール
を形成したプラスミドDNAのみまたは未切断pBR322によ
る大腸菌（E.coli）MS371菌の形質転換により、夫々プ
ラスミドDNAのμｇ当り2.0×104、5.0×102および2.0×
106の形質転換効率を与えた。約7.0×103個の形質転換
菌を新鮮テトラサイクリンプレート上に採取してスクリ
ーニングした。
無作為に選別した10の形質転換菌のミニーライゼート
（Mini-lysate）プラスミドDNA標品をPst Iで消化し、
得られたDNAフラグメントの大きさをアガロースゲル電
気泳動で分析した。その結果、（１）形質転換菌10個中
７個は組み変えDNAプラスミドを有すること、（２）９
つの組み変えプラスミド中７つはG-Cテーリング操作で
再生した両Pst I制限部位を有すること、そして（３）
挿入されたDNAの平均は長さは約3kbであることが判明し
た。
本発明のクローニング・ベヒクルは、形質転換宿主の
レプリケーシヨンによりプロテインＡ様生物活性を有す
る分子をコードする遺伝子を、最初に入手可能としそし
て該遺伝子の供給を増大するために有用である。このよ
うに所望遺伝子を大量に供給することによつて、プロテ
インＡ様物質をより低価格で入手しうるに十分なプロテ
インＡ発現レベルに達しうると期待される。
次に最良の態様を含めて本発明を実施するための実施
例を記載する。しかしながら、本発明は実施例の範囲に
限定されるものではない。実施例中、特に記載しない限
り、パーセントは全て重量％で示し、溶媒混合物の混合
比率は容量で示す。
実施例１ 菌株の保存および増殖 スタフイロコツカス・アウレウス、コワンＩ（Staphy
lococcus aureus CowanI（SAC,ATCC 12598）およびW
oods46（SAW,ATCC 10832）株は、メリーランド州，ロ
ツクビルのアメリカン・タイプ・カルチユア・コレクシ
ヨン（American Type Culture Collection）から入手し
た。両株ともペンアツセイ（Penassay）メデイウム〔5m
g/mlカシトン（Casitone）、2.5mg/mlイーストエキスト
ラクト、2.5mg/mlβ−グリセロホスフエート、4mg/mlニ
アシン、2mg/mlチアミン−塩酸〕中で標準条件下に液体
培地または1.5％寒天プレート上で増殖させた。
大腸菌MS371はＬ−ブロス（5g/l NaCl、10g/lバクト
トリプシン、5g/lイーストエキストラクト）中で培養し
た。プラスミドDNAの調製のために、所望プラスミドを
有する細胞をM-9培地（49mM Na2HPO4、17mM KH2PO4、8.
6mM NaCl、18.7mM NH4Cl、0.1mM CaCl2、1mM MgSO4・7H2
O、0.4％グルコース、0.4％カザミノ酸、2mg/mlチアミ
ン）中で培養した。
実施例２ SACからのDNAの抽出 SACの一夜培養物をペンアツセイブロスで1:100に希釈
し、次いでOD600＝0.6まで増殖させた。この菌体を遠心
分離（ベツクマンJA10ローターにて、２℃において5,00
0rpm、10分）してペレツト化し、20倍のDNA抽出バツフ
アー（0.1M NaCl;50mM EDTA;10mMトリス−塩酸、pH8.
0）に再懸濁させ、そしてドライアイス−アセトン浴中
で凍結した。
凍結細胞懸濁物を37℃で解凍し、リゾスタフイン〔ly
sostaphin:ミズリー州，セントルイスのシグマ社（Sigm
a Chemical Co.）より入手〕を50mg/mlに添加し、そし
てこの懸濁液を37℃で15分インキユベートした。プロテ
アーゼＫ（40mg/ml）およびSDS（0.5％）を添加し、混
合物を37℃で１時間インキユベートした。この溶解菌体
を次いでDNA抽出バツフアーで飽和したフエノール／ク
ロロホルム（1:1）で抽出した。このSAC DNA溶液を（0.
95g/ml）CsClに調節し、遠心分離（ベツクマンTi60ロー
ターを用い23℃で44000rpm、48時間）により層別した。
次いでDNAをシリンジおよび21g針を用いて側部穿刺して
採取した。このDNAをTEバツフアー（10mMトリス−塩
酸、1mM EDTA、pH8.0）で透析し、前記同様フエノール
／クロロホルムで抽出し、２倍量のエタノールで２回沈
殿させた。SAC DNAの収量は、菌体湿重量1g当り700-800
mg DNAの範囲にあつた。
実施例３ 制限酵素による消化 全ての制限エンドヌクレアーゼは、メリーランド州，
ベセスダのベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（Beth
esda Research Laboratories）またはマサチユセツツ
州，ベバリーのニユー・イングランド・バイオラブス
（New England Biolabs）から入手した。特に記載しな
い限り、本明細書中の制限分解は、DNA濃度100-400μg/
ml、DNAμｇ当り2-4単位の酵素、2-3時間、37℃の条件
で、各市販会社が各酵素に対して推奨するバツフアー系
中にて行なつた。
実施例４ DNAフラグメントの電気泳動および抽出 アガロースゲル電気泳動は、ゲル中には2Xトリス−ア
セテートゲルバツフアー（80mMトリス−塩酸、pH8.0;40
mM NaC2H3O2:36mM NaCl;2mM Na2 EDTA）そして、泳動に
は1Xバツフアーを用いて行なつた。分析用ゲルは通常、
水平ゲルボツクス中にて「サブマリン・ゲル（submarin
e gel）」の状態で泳動した。調製用ゲルは通常、ECモ
デル470ゲルボツクス中にて泳動した。DNAバンドの検出
はエチジウム・ブロマイド（EtBr）による後染色法（1X
ゲルバツフアー中0.5mg/ml）およびカリフオルニア州，
サンガブリエルのウルトラバイオレツト・プロダクツ社
（Ultra-Violet Products,Inc.）製モデルTM-36U.V.ト
ランスイルミネーターを用いて行なつた。
調製用アガロースゲルからのDNAの抽出は、先ず、一
本のゲルレーンのEtBr染色バンドの位置の検出から始め
た。目的DNAフラグメントを含有するゲルのスライスを
手でさいの目に切り出し、1.5-2倍量のDNAゲル抽出バツ
フアー（0.5M NH4C2H3O2、10mM EDTA、10mM Mg(C2H3O2)
2、10％SDS）とともに20g針を通過させた。1mM NH4C2H3
O2および10mM EDTAで飽和したフエノールを等量加え、
エツペンドルフチユーブ中でロータリーシエーカーによ
る抽出を23℃で一夜行なつた。次いでチユーブを30分間
氷上に置き、次いでマイクロ遠心によつて水層を除い
た。飽和フエノール溶液による水層の抽出を3-4回繰返
し、その後クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行
なつた。15kbより小さいDNAフラグメントの日常回収率
は約40％であつた。
実施例５ プラスミドおよび挿入用DNAのテイル形成お
よびアニーリング（Annealing） 組み変えプラスミドの製造は、G-Cテイリング法〔シ
ユタイン，アイ．（Stein.I.）、カテラル，ジエイ．
（Catterall,J.）、ウー，エス．（Woo.S.）、ミーン
ズ，エイ．（Means.A.）、オマリー，ビー．（O'Malle
y,B.）著、バイオケミストリー（Biochemistry）17:576
3（1978年）参照〕により行なつた。Pst Iで消化し、ア
ガロースゲルで精製したpBR322DNAは、下記の条件下に1
00μｌの反応で約14G残基のテイルを形成させた:100μg
/ml DNA、20μM dGTP、200mM K/カコジレート、1mM CoC
l2、1mMβ−メルカプトエタノール（β−SH）、15単位
ターミナルデオキシヌクレオチジル・トランスフエラー
ゼ〔ウイスコンシン州，ミルウオーキーのピー．エル．
バイオケミカルス社（P.L.Biochemicals.Inc.）〕、37
℃、30分。２μｌの100mM EDTA、２μｌの5M NaCl、２
μｌの20％SDSを加えて反応を停止させ、そしてフエノ
ール：クロロホルム（1:1）で抽出した。得られたＧ−
テイル形成プラスミドDNAをセフアデツクスG-50カラム
に通過させ、エタノールで沈殿させた。
平均3-5kbの長さを有する標的SAC DNAフラグメント
は、下記の条件下に30μｌの反応で15-20℃残基のテイ
ルを形成させた:4-5μg SAC DNA、20μM dCTP、200mM K
/カコジレート、1mM CoCl2、1mM β−SH、4.5単位ター
ミナル・デオキシヌクレオチジル・トランスフエラー
ゼ、37℃、12分。Ｃ−テイルを形成したSAC NDAの反応
停止およびその後の処理は上記同様に行なつた。
プラスミドと標的SAC DNAとのアニーリングは、2-5μ
ｇのプラスミドおよび4.0μｇの標的SAC DNAを300μｌ
の10mMトリス−塩酸、pH8.0;1mM EDTA;100mM NaCl中で
混合し、そして68℃で10分間加熱することにより開始し
た。このアニーリング溶液を次いで55℃で１時間、230
℃で１時間インキユベートし、必要時まで４℃に貯蔵し
た。
実施例６ DNAフラグメントの結合（ligation） 互いの末端を重ねた二つのDNAフラグメントの結合
は、100-200単位/mlのT4 DNAリガーゼ（ベセスダ・リサ
ーチ・ラボラトリーズ）;66μM ATP;66mMトリス−塩
酸、pH7.6;6.6mM MgCl2;10mMジチオスレイトール;12
℃、12-16時間の条件で行なつた。
実施例７ 大腸菌MS371の形質転換 新鮮な一夜培養菌液をＬ−ブロスで1:100に希釈し、3
7℃で振とう培養してOD600＝0.1-0.15まで増殖させた。
菌体をペレツト状に集め（ベツクマンJ2-20遠心機のJA2
0ローターにより５℃で５分間5000rpmの遠心による）、
もとの半容量の氷冷50mM MnCl2;10mM NaC2H3O2、pH5.6
中に再懸濁させ、そして０℃にて20分間静置した。前記
同様にペレツト状に集め、氷冷100mM MnCl2;75mM CaC
l2;10mM NaC2H3O2、pH5.6に再懸濁させた。この菌0.1ml
分を10μｌのDNA形質転換溶液と混合し、40分間氷上に
置いた。次いで菌に熱衝撃（25-30℃、2.5分）を与え、
そして菌0.1ml分当り1.5μｌの2.0Mトリス−塩酸、pH7.
4および0.5mlのＬ−ブロスを加えた。次いで菌を15-25
μｌづつ10μg/mlテトラサイクリン〔シグマ（Sigma）
製〕を加えた1.5％寒天Ｌ−ブロスプレート上に接種
し、37℃で一夜インキユベートした。1.0×107コロニー
／μg pBR322DNAの形質転換効率が恒常的に観察され
た。
実施例８ ミニライゼート（Mini-Lysate）したプラス
ミドDNA ミニライゼートしたプラスミドの調製は、新鮮一夜培
養菌液1mlを１％グルコースを添加したＬ−ブロス9ml中
に加え、37℃で振とうしてOD550が1.0になるまで増殖さ
せることから始めた。次いでクロラムフエニコールを15
0μg/mlになるよう加え、培養物を37℃で12-16時間イン
キユベートした。次いで菌を遠心分離してペレツト状に
回収し（RC-3遠心機で23℃、3000rpm、５分）、氷冷TE
バツフアーに再懸濁させ、そして1.5mlエツペンドルフ
チユーブに移して再度遠心分離でペレツト状に回収し
た。得られた菌ペレツトを渦巻攪拌して50mMトリス−塩
酸、pH8.0;50mM EDTA;15％蔗糖（W/V）に再懸濁させ
た。この菌懸濁液に10％SDS10μｌを加え、70℃で10分
間インキユベートした。得られたライゼート物に氷冷4M
酢酸カリウム62.5μｌを加え、ライゼート物を氷上で少
なくとも２時間静置した。遠心分離の後、上澄液の容量
を水で0.5mlで調整し、DNAを二倍量の無水エタノールで
沈殿させた。次いでDNAを100μｌのTEに再懸濁させ、Na
Clで塩濃度を0.1Mに調整し、そして二倍量のエタノール
で再沈殿させて制限酵素分析に付した。
実施例９ プラスミドDNAの大量調製 25mlの培養をテトラサイクリンを10μg/ml添加したＬ
−ブロス中で一夜行なつた。この一夜培養菌液5mlをM-9
培地１に加え、ロータリーインキユベーター（200rp
m）により37℃で、OD600が0.6に達するまで増殖させ
た。次いでクロラムフエニコール（シグマ社製）を250m
g/l添加し、培養液を37℃で12-16時間振とうした。次い
で菌を遠心分離して収穫し（6000rpm、20分、２℃、ベ
ツクマンJA-10ローター）、ペレツトを氷冷TEバツフア
ーで一度洗つた。洗浄したペレツトは−60℃で凍結する
かまたは直ちに抽出した。純化ライゼート物の調製は、
菌体ペレツトを最初の培養菌液１当り、50mMトリス−
塩酸、pH8.0中の25％蔗糖6.25mlに懸濁し、次いで新た
に作成した10mg/mlのライソゾーム（シグマ社製）溶液
1.5mlを加えることから始めた。この懸濁液を氷上で５
分間連続的に旋回攪拌し、0.5M Na2 EDTA、pH8.0を1.25
ml加えそして、氷上の旋回攪拌を５分間続けた。もとの
培養量１当り10mlの10Xトリトン（10mlの10％トリト
ンX-100;125mlの05M EDTA、pH8.0;50mlの1.0Mトリス−
塩酸、pH8.0;および800mlのH2O）を加え、懸濁液を氷上
で15分間旋回攪拌した。次いでこのライゼート物を遠心
分離し（JA-20ローター中、19000rpm、４℃、30分）、
上澄をメスシリンダーに移した。上澄にCsClを0.95g/ml
に溶解し、TEバツフアー中に10mg/mlに溶かしたEtBrを1
/10容量加えた。プラスミドとクロモゾームDNAとの分離
はベツクマンTi 50.2ローターによる遠心分離（23℃、4
4000rpm、24時間及びひき続き38000rpm36時間）により
行なつた。
グラジエント上のプラスミドDNAバンドはU.V.ランプ
で肉眼識別し、シリンジを用いた側穿刺によつて21g針
で採取した。EtBrの除去はイソブチルアルコールで繰返
し抽出して行なつた。このプラスミド溶液を次いでTEバ
ツフアーで一夜透析し、塩濃度を0.1M NaClに調節し、
二倍量の無水エタノールでDNAの沈殿を行なつた。
実施例10 125I-IgG−プロテインＡバインデイングアツ
セイ バクテリアコロニーにおけるプロテインＡ様活性の発
現は、ニトロセルロースフイルター上に固定したコロニ
ーの溶菌菌体への125I-IgGの結合により検出した。組み
変えプラスミドを有する大腸菌並びにSAC（陽性コント
ロール）およびSAW（陰性コントロール）菌を取り、栄
養寒天プレートに線上に塗り、一夜増殖させた。このプ
レート上にニトロセルロースフイルターデイスク〔BA8
5、87mm、シユライヒヤー・アンド・シユエル、ケー
ネ，エヌー．ハー．（Schleicher and Schuell,Keene,
N.H.）〕を注意深く重ねて下面のコロニーを吸着させ、
このフイルターを持ち上げてワツトマン3MM紙に押し
あてて乾燥した。フイルターに結合した菌の溶菌は、フ
イルターをコロニー側を上にして、0.5M NaOHで飽和さ
せたワツトマン3MM紙上に重ね、23℃で10分間溶菌さ
せることにより行つた。溶菌終了後、フイルターを紙
で乾燥させ、1.0Mトリス−塩酸、pH7.0で飽和させた
紙で中和した。このフイルターを再度紙で乾燥させ、
プロテイン・バインデイング溶液（10mMトリス−塩酸、
pH7.0;100mM NaCl;5mM EDTA;0.13％NP40;0.1％SDS;0.1
％デオキシコール酸ナトリウム;0.2％フイコール400;0.
3％ゼラチン）で23℃、4-6時間ロータリープラツトフオ
ームシエーカー上で前処理した。この前処理後、フイル
ターをフイルター当り4.5mlのプロテイン・バインデイ
ング溶液を入れた１ビーカーに移した。125I-IgG〔抗
家兎羊血清、メイン州，ボストン，ニユー・イングラン
ド・ニユークリアー（New England Nuclear）製〕のバ
インデイングは、前記ビーカーに５×106cpm/mlの125I-
IgGを加え、定常回転振とうを４℃で一夜行なうことに
よつてバインデイングをひき起すことにより実施した。
フイルターの洗浄はプロテイン・バインデイング溶液50
0mlでの繰返し洗浄により行ない、その際第一回の洗浄
は４℃で、そして2-3回の追加洗浄は23℃で行なつた。
洗浄したフイルターを次いで紙で乾かし、生じた125I
-IgGバインデイングの検出は、コダツクXAR-5フイルム
および二つのデユポン・クロネツクス・ライトニング−
プラス増巾スクリーン（DuPont Cronex Lightning-Plus
enhancement screen）を用いるラジオオートグラフイ
ーで実施した。
実施例11 DNA配列の決定 DNA配列の決定はマキサム（Maxam）およびジルバート
（gilbert）およびハイデツカー（Heidecker）らの報告
した方法〔Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA,74:560（1977）お
よびGene,10:69（1980）参照〕を僅かに変形して行なつ
た。
実施例12 形質転換大腸菌中でのプロテインＡ様物質の
発現のスクリーニング 組み変えSAC遺伝子の蓄積中のプロテインＡ様物質を
コードする配列の発現をテストするため、各々52コロニ
ーの50プレートからのコロニー（2,600）をニトロセル
ロースデイスクに乗せ、125I-IgGバインデイングアツセ
イを行なつた。陽性コントロールおよび陰性コントロー
ルとして夫々SACおよびSAWコロニーを含むフイルターに
ついても同様に行なつた。アツセイの感度を評価するた
め、精製プロテインＡ〔ニユージヤージー州、ピスカタ
ウエイ，フアルマシア（Pharmacia）製〕の連続希釈も
ニトロセルロースデイスクにスポツトし、試験フイルタ
ーと並行してアツセイした。このアツセイの日常的感度
は精製プロテインＡについて1.0ないし0.01ngの範囲で
変動することが見出された。SACおよびSAW菌を含むフイ
ルターは、それぞれ陽性および陰性のオートラジオグラ
フイーシグナルを与えた。このアツセイおよびひき続く
アツセイにおいて、一つの形質転換コロニーが相当量の
125I-IgGを結合した。このコロニーをひき続く分析のた
めに採取した。このコロニーに含まれるプラスミドをpA
c37と命名する。
実施例13 pAc37の挿入フラグメントのプロテインＡ様
物質に相当する遺伝子領域の決定 pAC37プラスミドDNAの制限エンドヌクレアーゼ分析に
おいて、3.1、2.3、1.9および0.65kbの長さのPst I挿入
フラグメントの存在が明らかになつた。pAc37プラスミ
ドDNAをPst Iで消化し、T4リガーゼで再結合し、そして
大腸菌MS371の形質転換に使用した。得られた形質転換
菌を実施例12に記載した125I-IgG−バインデイングアツ
セイでスクリーニングした。
322の形質転換菌中、125I-IgG−バインデイング陽性
のコロニーが10個得られ、1.9kb Pst I挿入フラグメン
トを含む組み変えプラスミドを有することが見出され
た。125I-IgG−バインデイング能の無い形質転換コロニ
ーを任意に12個選びその組み変えプラスミドDNAを分析
したところ、それらはpAc37とPst Iフラグメントを１個
またはそれ以上含むが1.9kbフラグメントは含まないこ
とが判つた。従つてプロテインＡ様コード配列の少なく
とも一部はpAc37の1.9kb Pst Iフラグメント中に存在す
ると結論された。1.9kb挿入フラグメントを１個有する
組み変えプラスミドを有する一つの陽性コロニー（pAc3
7-6と命名する）を採取してさらに分析した。
実施例14 pAc37-6DNAのプロテインＡ様コード配列の同
定 pAc37-6DNAのPst I 1.9kbフラグメント中のプロテイ
ンＡ様コード配列の存在の最終決定は、DNA配列決定に
より行なつた。pAc37-6DNAをHind IIIで消化し、γ32P-
ATPおよびポリヌクレオチドキナーゼでラベルし次いでP
st Iで消化した。0.6kb Hind III/Pst Iフラグメントの
部分を配列決定したところ、プロテインＡ分子のB-C結
合（junction）の公知アミノ酸と配列的一致を示した。
挿入フラグメント中のプロテインＡ様物質のB-C結合の
配列コードの位置は、pAc37-6プラスミドDNAの1.9kb挿
入片がプロテインＡ遺伝子の配列コードの大部分（リボ
ゾーム結合サイトおよび５′調節配列も含めて）を有す
ることを示唆した。
実施例15 大腸菌MS371（pAc37-6）、NRRL B-15131から
のプロテインＡ様物質の精製 大腸菌MS371（pAc37-6）を0.1N NaOHで溶菌して遠心
分離した。上澄を除き、リン酸−ナトリウムを25mM加
え、そしてこの溶液を1H HClでpH7.0に調整した。この
蛋白質液を25mMリン酸ナトリウムpH7.0にて透析し、次
いで遠心分離して澄明にした。
得られた溶液をIgG−セフアロースカラム（蛋白質1.3
mg当りベツドボリユーム30ml）に導入し、カラムをA280
で測定したときカラムからもはや蛋白質が流出しなくな
るまで0.1Mリン酸ナトリウムpH7.0で洗浄した。
プロテインＡ様物質は0.1Mグリシン−塩酸を使用して
溶出した。精製された蛋白質は80％飽和(NH4)2SO4で沈
殿濃縮し、10mMリン酸ナトリウムpH7.0で透析し、凍結
貯蔵した。
大腸菌MS371（pAc37）、NRRL B-15127からのプロテイ
ンＡ様物質の精製も上記同様に行ないうる。
実施例16 大腸菌MS371（pAc37-6）、NRRL B-15131から
の、プロテインＡ様物質に当るアミノ酸配列のサブフラ
グメントをコードするヌクレオチド配列の分離 プロテインＡに類似する生物活性を有するアミノ酸配
列をコードしうるコード領域の実質的に純粋なサブフラ
グメントを分離するためにプロテインＡ様物質をコード
するヌクレオチド配列を開裂するためには制限酵素を使
用することができる。例えば、Rsa I制限エンドヌクレ
アーゼによるpAc37-6DNAの開裂により、1199ヌクレオチ
ド長さの領域Ｅ、Ｄ、Ａ、ＢおよびＣを含むポリペプチ
ドをコードする一つのオリゴヌクレオチドが得られる。
他の制限酵素、例えばHinf Iによる消化または例えばHi
nd IIIおよびSau3Aの混合酵素による消化の使用によつ
て、プロテインＡの生物活性に類似の活性を有するアミ
ノ酸配列をコードする実質的に純粋な十分特定されたオ
リゴヌクレオチドフラグメントを生じさせることができ
る。
これら所望のオリゴヌクレオチドのサブフラグメント
は、次のようにして調製用アガロースゲル電気泳動によ
り実質的に純粋な形で単離可能である：アガロースを２
×Ｅバツフアー（0.08Mトリス−塩酸、pH7.8;0.01M NaC
2H3O2;0.002M EDTA）に１％に溶かし、バイオラツド社
（Bio-Rad:リツチモンド、Ca）のスラブゲル装置（slab
gel apparatus）に注入する。サンプルを10mMトリス−
塩酸、pH8.0;0.1mM EDTAに溶解し、２×Ｅ泳動バツフア
ーを用いて定電力で泳動する。
電気泳動後、一つのレーン（lane）をゲルから切り取
り、エチジウム・ブロマイド（0.5μg/ml）で染色し、D
NAバンドを紫外線下に肉眼で確認する。レーンを切り取
つた残りのゲルから目的のバンドを切り取り、軟化させ
てから20ゲージ針を通過させる。次いで等量の抽出バツ
フアー（10mMトリス−塩酸、pH8.0;2mM EDTA;1M NaCl）
を加えてゲルと混合する。混合物を47℃で16時間インキ
ユベートし、100,000gで１時間かけてアガロースをペレ
ツト状に沈殿させる。上澄を次いでtRNAが30μg/mlにな
るようにし、そして界面にアガロースが認められなるま
でフエノールで抽出する。次いでDNAをエーテルで抽出
し、エタノールを沈殿させる。ゲルバツフアーおよび抽
出工程は、当業者により所望DNAフラグメントを回収す
るために変化されることができる。
実施例17 プロテインＡ様物質の領域Ｅ、Ｄ、Ａ、Ｂ、
およびＣのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列
の合成 例えば前記実施例に示したようにクローニングおよび
配列解析によつて特定アミノ酸配列をコードするヌクレ
オチド配列が決定されれば、このアミノ酸配列をコード
するオリゴヌクレオチドを化学的手法で合成することが
できる〔例えばエツジ，エム．デイー．（Edge,M.D.）
ら、ネイチヤー（Nature）、292:756-762（1981年）参
照〕。すなわち、プロテインＡ様分子のためのコード領
域のサブフラグメントまたは全コード領域を合成し、実
質的に純粋な形で単離することができ、これには領域
Ｅ、Ｄ、Ａ、ＢおよびＣをコードするコード配列の領域
も含む。
領域Ｅ、Ｄ、Ａ、ＢおよびＣの各々または種々の組合
せはプロテインＡと同様に、前記のように診断テストシ
ステムにおいてIgGを結合するために有用である。
実施例18 プロテインＡ様物質の領域Ｅ、Ｄ、Ａ、Ｂ、
およびＣのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列
のクローニングおよび形質発現 夫々実施例16および17で単離および合成された、プロ
テインＡ様物質またはその生物活性サブフラグメントを
コードする実質的に純粋なヌクレオチド配列は、発現ク
ローニングベクター（expression cloning vector）中
の適当な制限酵素部位へ結合（ligate）することができ
る。必要に応じ、リンカー分子を用いてヌクレオチド配
列に結合サイトを付加することもできる〔例えばノリ
ス，ケー．イー．（Norris,K.E.）ら、ジーン（Gen
e）、7:355-362（1979年）参照〕。こうして結合したDN
Aは、つづいて宿主微生物の形質転換に使用できる。他
の研究者らによる従来の研究により、クローニングした
ヌクレオチド配列による形質発現が期待しうることが示
されている〔例えば、ドエル．エム．テイー．（Doel,
M.T.）ら、ヌク．アシツズ・レス．（Nuc.Acids Re
s.）、8:4575-4592（1980年）；ロバーツ，テイー．（R
oberts T.）ら、プロス．ナト．アカド．サイ．（Proc.
Nat.Acad.Sci.）、76:760-764（1979年）；ガレンテ，
エル．（Guarente,L.）ら、セル（Cell）、20:543-553
（1980年）参照〕。こうして発現された生物活性物質
は、次いで実施例15に記載したようにして精製できる。
プラスミドpAc37およびpAc37-6は、永久寄託物として
大腸菌（E.coli）を宿主として、米国イリノイ州、ペオ
リア（Peoria）の米国農務省（U.S.Department of Agri
culture）、ノーザン・リージヨナル・リサーチ・ラボ
ラトリー（Northern Regional Research Laboratory:NR
RL）に寄託されている。その寄託番号は次のとおりであ
る： E.coli MS371（pAc37）……NRRL B-15127（1982年８月1
8日寄託） E.coli MS371（pAc37-6）……NRRL B-15131（1982年８
月18日寄託） E.coli MS371……NRRL B-15129（1982年８月18日寄託） プラスミドpBR322は公知かつ容易に入手し得るプラス
ミドである。このプラスミドはE.coli宿主中でATCC3701
7として維持されている。純化pBR322DNAは、ボリバー，
エフ，ロドリゲス，アール．エル.,グリーン，ピー．ジ
エイ.,ベトラツハ，エム．シー.,ハイネツカー，エイ
チ．エル.,ボイヤー，エイチ．ダブリユ.,クロサ，ジエ
イ．エイチ，およびフアルコウ，エス．（Bolivar,F.,R
odriquez,R.L.,Greene,P.J.,Betlach,M.C.,Heyneker,H.
L.,Boyer,H.W.,Crosa,J.H.,and Falkow,S.）、ジーン
（Gene）、2:95-113（1977年）およびストクリフ，ジエ
イ．ジー．（Sutcliffe,J.G.）、ヌクレイツク・アシツ
ズ・レス（Nucleic Acids Res）、5:2721-2728（1978）
に記載された方法で得られる。
NRRL B-15127、NRRL B-15131およびNRRL B-15129は、
本明細書に記載された発明とともにこれらの寄託番号を
開示した特許の付与と同時に一般に入手可能となる。こ
れらの寄託物の入手可能性は、行政処分として付与され
た特許権を制限して本発明の実施例を許諾するものでな
いことに留意されたい。
E.coli MS371の代りに、例えば枯草菌（B.subtili
s）、ストレプトミセス（Streptomyces）属、およびイ
ーストなどが使用しうる宿主として公知である。
さらに、菌の増殖、DNAの抽出、制限酵素による消化
の実施、DNAフラグメントの電気泳動、プラスミドのテ
ール形成およびアニールならびにDNA挿入、DNAの結合、
E.coli菌の形質転換、プラスミドDNAの調製、IgG−バイ
ンデイングアツセイの実施、蛋白溶解物（protein lysa
tes）の調製、蛋白質の電気泳動およびDNAの配列決定等
に要求される条件を変化させることは当業者の慣用手段
の範囲である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:445） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:445） (56)参考文献 Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．73 （1977）ｐ．343〜351 Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．78 （1977）ｐ．421〜490

Claims (12)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】次式： で表されるアミノ酸配列を有するプロテインＡ様活性物
    質のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列からな
    るDNA。
  2. 【請求項２】次式： で表されるアミノ酸配列を有するプロテインＡ様活性物
    質のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列または
    該配列のサブフラグメントを含む組換えプラスミドを有
    する細菌宿主。
  3. 【請求項３】組換えプラスミドが含むヌクレオチド配列
    が、最後の209ヌクレオチド塩基を含まないことを除い
    て、特許請求の範囲第２項で定義したヌクレオチド配列
    と同じ配列または該配列と実質的に同じ生物活性のアミ
    ノ酸配列をコードするヌクレオチド配列である、特許請
    求の範囲第２項記載の細菌宿主。
  4. 【請求項４】寄託番号NRRL B-15127の大腸菌（E.coli）
    である、特許請求の範囲第２項記載の細菌宿主。
  5. 【請求項５】寄託番号NRRL B-15131の大腸菌（E.coli）
    である、特許請求の範囲第２項記載の細菌宿主。
  6. 【請求項６】特許請求の範囲第２項の式中で示されてい
    るプロテインＡ様物質の領域Ｄのアミノ酸配列をコード
    するヌクレオチド配列または該配列と実質的に同じ生物
    活性を有する分子をコードするヌクレオチド配列を含む
    組換えプラスミドを有する、特許請求の範囲第２項記載
    の細菌宿主。
  7. 【請求項７】特許請求の範囲第２項の式中で示されてい
    るプロテインＡ様物質の領域Ａのアミノ酸配列をコード
    するヌクレオチド配列またはこれと実質的に同じ生物活
    性を有する分子をコードするヌクレオチド配列を含む組
    換えプラスミドを有する、特許請求の範囲第２項記載の
    細菌宿主。
  8. 【請求項８】特許請求の範囲第２項の式中で示されてい
    るプロテインＡ様物質の領域Ｂのアミノ酸配列をコード
    するヌクレオチド配列またはこれと実質的に同じ生物活
    性を有する分子をコードするヌクレオチド配列を含む組
    換えプラスミドを有する、特許請求の範囲第２項記載の
    細菌宿主。
  9. 【請求項９】特許請求の範囲第２項の式中で示されてい
    るプロテインＡ様物質の領域Ｃのアミノ酸配列をコード
    するヌクレオチド配列またはこれと実質的に同じ生物活
    性を有する分子をコードするヌクレオチド配列を含む組
    換えプラスミドを有する、特許請求の範囲第２項記載の
    細菌宿主。
  10. 【請求項１０】特許請求の範囲第２項の式中で示されて
    いるプロテインＡ様物質の領域Ｅのアミノ酸配列をコー
    ドするヌクレオチド配列またはこれと実質的に同じ生物
    活性を有する分子をコードするヌクレオチド配列を含む
    組換えプラスミドを有する、特許請求の範囲第２項記載
    の細菌宿主。
  11. 【請求項１１】特許請求の範囲第２項の式中で示されて
    いるプロテインＡ様物質のカルボキシ末端領域のアミノ
    酸配列をコードするヌクレオチド配列またはこれと実質
    的に同じ生物活性を有する分子をコードするヌクレオチ
    ド配列を含む組換えプラスミドを有する、特許請求の範
    囲第２項記載の細菌宿主。
  12. 【請求項１２】特許請求の範囲第２項の式中で示されて
    いるプロテインＡ様生物活性を有するアミノ酸配列をコ
    ードする領域Ｅ、Ｄ、Ａ、ＢおよびＣのヌクレオチド配
    列の混合物またはこれらと実質的に同じ生物活性をコー
    ドするヌクレオチド配列の混合物を含む組換えプラスミ
    ドを有する特許請求の範囲第２項記載の細菌宿主。
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