JPH08113593A - 界面活性剤を用いるタンパク凝集反応の増強法 - Google Patents
界面活性剤を用いるタンパク凝集反応の増強法Info
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- JPH08113593A JPH08113593A JP24227095A JP24227095A JPH08113593A JP H08113593 A JPH08113593 A JP H08113593A JP 24227095 A JP24227095 A JP 24227095A JP 24227095 A JP24227095 A JP 24227095A JP H08113593 A JPH08113593 A JP H08113593A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】沈殿剤を用いるタンパク凝集反応増強剤
【構成】ポリオキシエチレングリコールソルビタンモノ
アルキルエステル系、ポリオキシエチレン−ポリオキシ
プロピレングリコールエーテル系、ポリエチレングリコ
ール系界面活性剤を、タンパク沈殿剤とともに用い、タ
ンパク凝集を増強する。
アルキルエステル系、ポリオキシエチレン−ポリオキシ
プロピレングリコールエーテル系、ポリエチレングリコ
ール系界面活性剤を、タンパク沈殿剤とともに用い、タ
ンパク凝集を増強する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、タンパク沈殿剤による
タンパク凝集反応において、それを増強する物質及びそ
れを利用したタンパク定性、定量方法に関する。
タンパク凝集反応において、それを増強する物質及びそ
れを利用したタンパク定性、定量方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】総タンパクの定量法としては、比重法、
屈折率法、紫外部法、沈殿法、比濁法、色素結合法など
の物理化学的方法の他、ケルダール法、ビュレット法、
Ｆｏｌｉｎ法、Ｌｏｗｒｙ法、Ｇｏｌｄｂｅｒｇ法など
の化学的方法がある［日本分析化学会編、第２版、１２
６〜１２９ページ、１９７９年、東京化学同人］。この
うち、タンパク凝集反応を利用する測定法は、沈殿法及
び比濁法であるが、現在沈殿法はほとんど利用されてお
らず、比濁法がよく用いられている。この比濁法と原理
は同じであるが、検出を光学的に行うのではなく、水晶
振動子センサーによる方法もある。これら比濁法及び水
晶振動子法の感度を上げるために、タンパク凝集増強剤
を用いる方法が報告されている［特願平６−２３８３３
４、及び平６−２７０１３７号］。しかし、これら報告
された増強剤は、用途によっては用いられない場合があ
り、同様の効果を有する種々の増強剤を見出すことが必
要である。
屈折率法、紫外部法、沈殿法、比濁法、色素結合法など
の物理化学的方法の他、ケルダール法、ビュレット法、
Ｆｏｌｉｎ法、Ｌｏｗｒｙ法、Ｇｏｌｄｂｅｒｇ法など
の化学的方法がある［日本分析化学会編、第２版、１２
６〜１２９ページ、１９７９年、東京化学同人］。この
うち、タンパク凝集反応を利用する測定法は、沈殿法及
び比濁法であるが、現在沈殿法はほとんど利用されてお
らず、比濁法がよく用いられている。この比濁法と原理
は同じであるが、検出を光学的に行うのではなく、水晶
振動子センサーによる方法もある。これら比濁法及び水
晶振動子法の感度を上げるために、タンパク凝集増強剤
を用いる方法が報告されている［特願平６−２３８３３
４、及び平６−２７０１３７号］。しかし、これら報告
された増強剤は、用途によっては用いられない場合があ
り、同様の効果を有する種々の増強剤を見出すことが必
要である。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】トリトン系界面活性
剤、アミノカルボン酸系界面活性剤以外で、タンパク凝
集増強作用を有する界面活性剤を見出す。
剤、アミノカルボン酸系界面活性剤以外で、タンパク凝
集増強作用を有する界面活性剤を見出す。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明は、タンパク凝集
反応を著しく増強する界面活性剤のうち、トリトン系及
びアミノカルボン酸以外の界面活性剤を用いる。このよ
うな界面活性剤は、沈殿剤によってタンパク凝集が生
じ、それがさらに結合し大きな沈殿となるのを防ぎ、適
切かつ、同じ大きさの凝集体を保つ作用を有することが
必要である。また、沈殿剤によるタンパク凝集を妨げて
はならない。さらに、それ自身が沈殿剤との作用を有し
ないほうがよい（ブランクの増大となり、良い結果は得
られない）。これらの種々の条件を満足し、かつ、極め
て増強作用の大なる界面活性剤として、本発明では、ポ
リオキシエチレングリコールソルビタンモノアルキルエ
ステル（Ｔｗｅｅｎ）、ポリオキシエチレン−ポリオキ
シプロピレングリコールエーテル（Ｅｐａｎ，第一工業
薬品製）、ポリエチレングリコール系界面活性剤を用い
る。これらは強力とはいえないが、十分なタンパク凝集
増強作用を有することを見出した。
反応を著しく増強する界面活性剤のうち、トリトン系及
びアミノカルボン酸以外の界面活性剤を用いる。このよ
うな界面活性剤は、沈殿剤によってタンパク凝集が生
じ、それがさらに結合し大きな沈殿となるのを防ぎ、適
切かつ、同じ大きさの凝集体を保つ作用を有することが
必要である。また、沈殿剤によるタンパク凝集を妨げて
はならない。さらに、それ自身が沈殿剤との作用を有し
ないほうがよい（ブランクの増大となり、良い結果は得
られない）。これらの種々の条件を満足し、かつ、極め
て増強作用の大なる界面活性剤として、本発明では、ポ
リオキシエチレングリコールソルビタンモノアルキルエ
ステル（Ｔｗｅｅｎ）、ポリオキシエチレン−ポリオキ
シプロピレングリコールエーテル（Ｅｐａｎ，第一工業
薬品製）、ポリエチレングリコール系界面活性剤を用い
る。これらは強力とはいえないが、十分なタンパク凝集
増強作用を有することを見出した。
【０００５】この場合、対象となる試料は、タンパク質
（アルブミン、グロブリン等）を含む試料なら何でもよ
いが、栄養飲料、血清、尿、髄液など、カラムクロマト
グラフィーで分画したものが適している。測定法は比濁
法、ネフエロメトリー、光散乱法水晶振動子センサーな
ど、沈殿凝集物を検出する方法なら全て適用可能であ
る。タンパク凝固試薬としては、スルホサルチル酸、ス
ルホサルチル酸にアラビアゴムを加えたもの、スルホサ
ルチル酸に硫酸ナトリウムを加えたもの、トリクロル酢
酸，ナフタレンスルホン酸などがある。界面活性剤のう
ち、Ｔｗｅｅｎ系界面活性剤としては、Ｔｗｅｅｎ２
０，Ｔｗｅｅｎ４０，Ｔｗｅｅｎ６０，Ｔｗｅｅｎ８０
が通常濃度（０．００５〜１％のいずれか）において効
果を有する。Ｅｐａｎ系界面活性剤としては、Ｅｐａｎ
４２０，Ｅｐａｎ４５０，Ｅｐａｎ４８５が通常濃度に
おいて効果を有する。ポリエチレングリコール系界面活
性剤としては、分子量 数百〜数十万のもので水溶性の
ものが有効である。（分子量の大きい方が有効性が大き
い。）
（アルブミン、グロブリン等）を含む試料なら何でもよ
いが、栄養飲料、血清、尿、髄液など、カラムクロマト
グラフィーで分画したものが適している。測定法は比濁
法、ネフエロメトリー、光散乱法水晶振動子センサーな
ど、沈殿凝集物を検出する方法なら全て適用可能であ
る。タンパク凝固試薬としては、スルホサルチル酸、ス
ルホサルチル酸にアラビアゴムを加えたもの、スルホサ
ルチル酸に硫酸ナトリウムを加えたもの、トリクロル酢
酸，ナフタレンスルホン酸などがある。界面活性剤のう
ち、Ｔｗｅｅｎ系界面活性剤としては、Ｔｗｅｅｎ２
０，Ｔｗｅｅｎ４０，Ｔｗｅｅｎ６０，Ｔｗｅｅｎ８０
が通常濃度（０．００５〜１％のいずれか）において効
果を有する。Ｅｐａｎ系界面活性剤としては、Ｅｐａｎ
４２０，Ｅｐａｎ４５０，Ｅｐａｎ４８５が通常濃度に
おいて効果を有する。ポリエチレングリコール系界面活
性剤としては、分子量 数百〜数十万のもので水溶性の
ものが有効である。（分子量の大きい方が有効性が大き
い。）
【０００６】次に本発明の実施態様を示す。タンパク量
が ０．１〜２００ｍｇ／ｄｌの試料１に対し １〜５
％の沈殿試薬 ２〜２０倍量を加えて混合し、数秒から
数分後に界面活性剤を ０．００１〜１％となるように
加えて混合する。５〜６０分間放置した後、透過率、又
は、吸光度を測定する。沈殿試薬と界面活性剤をあらか
じめ混合し、界面活性剤濃度として ０．００１〜１％
としたものを用いてもよい。この場合、試料と沈殿試薬
の混合を激しく行わないと、定量的な沈殿が得られない
ことがある。定性では濁りを目視で比較する。なお、沈
殿試薬の濃度、試薬液量、放置時間などは測定の基準と
なりうる標準と、目的試料とは同一条件で行う。スルホ
サルチル酸を沈殿試薬に用いる場合は、アラビアゴム、
スルホサルチル酸溶液中７％硫酸ナトリウムを溶解した
溶液を用いてもよい。
が ０．１〜２００ｍｇ／ｄｌの試料１に対し １〜５
％の沈殿試薬 ２〜２０倍量を加えて混合し、数秒から
数分後に界面活性剤を ０．００１〜１％となるように
加えて混合する。５〜６０分間放置した後、透過率、又
は、吸光度を測定する。沈殿試薬と界面活性剤をあらか
じめ混合し、界面活性剤濃度として ０．００１〜１％
としたものを用いてもよい。この場合、試料と沈殿試薬
の混合を激しく行わないと、定量的な沈殿が得られない
ことがある。定性では濁りを目視で比較する。なお、沈
殿試薬の濃度、試薬液量、放置時間などは測定の基準と
なりうる標準と、目的試料とは同一条件で行う。スルホ
サルチル酸を沈殿試薬に用いる場合は、アラビアゴム、
スルホサルチル酸溶液中７％硫酸ナトリウムを溶解した
溶液を用いてもよい。
【０００７】
【実施例１】
【タンパク量標準液の調製】透明、溶血のないヒト血清
を生理食塩水に溶解したタンパク濃度 ０．１，１，１
０，５０，１００ｍｇ／ｄｌのタンパク量標準液を調製
した。
を生理食塩水に溶解したタンパク濃度 ０．１，１，１
０，５０，１００ｍｇ／ｄｌのタンパク量標準液を調製
した。
【タンパク量の定量】試験管にタンパク量標準液 ０．
５ｍｌをとり、これに ３ｇ／ｄｌスルホサリチル酸に
７％となるよう硫酸ナトリウムを加えたもの２．５ｍｌ
を加え、まぜた後、Ｔｗｅｅｎ２０，Ｔｗｅｅｎ４０，
Ｔｗｅｅｎ６０，Ｔｗｅｅｎ８０の各１０％水溶液０．
１５ｍｌを加えてかき混ぜる。１０分放置後、６２０ｎ
ｍでの吸光度を測定した。界面活性剤を加えない場合の
タンパク ５０ｍｇ／ｄｌの吸光度は、０．１５、Ｔｗ
ｅｅｎ２０を加えた場合は ０．５１、Ｔｗｅｅｎ４０
は０．３７、Ｔｗｅｅｎ６０は０．３５、Ｔｗｅｅｎ８
０は０．３６であった。すなわち、それぞれ３．５倍〜
２倍の増感であった。
５ｍｌをとり、これに ３ｇ／ｄｌスルホサリチル酸に
７％となるよう硫酸ナトリウムを加えたもの２．５ｍｌ
を加え、まぜた後、Ｔｗｅｅｎ２０，Ｔｗｅｅｎ４０，
Ｔｗｅｅｎ６０，Ｔｗｅｅｎ８０の各１０％水溶液０．
１５ｍｌを加えてかき混ぜる。１０分放置後、６２０ｎ
ｍでの吸光度を測定した。界面活性剤を加えない場合の
タンパク ５０ｍｇ／ｄｌの吸光度は、０．１５、Ｔｗ
ｅｅｎ２０を加えた場合は ０．５１、Ｔｗｅｅｎ４０
は０．３７、Ｔｗｅｅｎ６０は０．３５、Ｔｗｅｅｎ８
０は０．３６であった。すなわち、それぞれ３．５倍〜
２倍の増感であった。
【０００８】
【実施例２】実施例１において、Ｔｗｅｅｎの代わりに
Ｅｐａｎ４２０，Ｅｐａｎ４５０，Ｅｐａｎ４８５を同
量用いた場合、Ｅｐａｎ４２０では０．３８、Ｅｐａｎ
４５０では０．３９、Ｅｐａｎ４８５では０．３０であ
り、約２〜２．５倍増感であった。
Ｅｐａｎ４２０，Ｅｐａｎ４５０，Ｅｐａｎ４８５を同
量用いた場合、Ｅｐａｎ４２０では０．３８、Ｅｐａｎ
４５０では０．３９、Ｅｐａｎ４８５では０．３０であ
り、約２〜２．５倍増感であった。
【０００９】
【実施例３】実施例１において、界面活性剤としてポリ
エチレングリコール６０００、ポリエチレングリコール
７００００を用いて実験した。ポリエチレングリコール
６０００では吸光度０．２３、ポリエチレングリコール
７０００では０．２７でであった。
エチレングリコール６０００、ポリエチレングリコール
７００００を用いて実験した。ポリエチレングリコール
６０００では吸光度０．２３、ポリエチレングリコール
７０００では０．２７でであった。
Claims (3)
- 【請求項１】タンパク質を含有する溶液に沈殿剤を加え
てタンパク凝集を行い、タンパクを定性又は定量する方
法において、一般式 【化１】 （式中のＲはアルキル基，ｎは自然数である。）で表わ
されるポリオキシエチレングリコールソルビタンモノア
ルキルエステル系界面活性剤を共存させるタンパク凝集
の増強法。 - 【請求項２】一般式 【化２】 （式中のｎ，ｍ，ｏは自然数である。）、 【化３】 （式中のｎ，ｍ，ｏは自然数である。）で表わされるポ
リオキシエチレン−ポリオキシプロピレングリコールエ
ーテル系界面活性剤を用いる請求項１記載のタンパク凝
集の増強法。 - 【請求項３】一般式 【化４】 （式中のｎは自然数である。）で表わされるポリエチレ
ングリコール系界面活性剤を用いる請求項１記載のタン
パク凝集の増強法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24227095A JPH08113593A (ja) | 1994-08-25 | 1995-08-16 | 界面活性剤を用いるタンパク凝集反応の増強法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6-238334 | 1994-08-25 | ||
| JP23833494 | 1994-08-25 | ||
| JP24227095A JPH08113593A (ja) | 1994-08-25 | 1995-08-16 | 界面活性剤を用いるタンパク凝集反応の増強法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08113593A true JPH08113593A (ja) | 1996-05-07 |
Family
ID=26533648
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP24227095A Pending JPH08113593A (ja) | 1994-08-25 | 1995-08-16 | 界面活性剤を用いるタンパク凝集反応の増強法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH08113593A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002061067A1 (en) * | 2001-02-01 | 2002-08-08 | Technische Universiteit Delft | A method of preparing cross-linked enzyme aggregates |
| CN100357325C (zh) * | 2005-10-23 | 2007-12-26 | 王贤理 | 一种抗apoA I、apoB抗体制备方法以及用于检测apoA I、apoB的试剂盒 |
-
1995
- 1995-08-16 JP JP24227095A patent/JPH08113593A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002061067A1 (en) * | 2001-02-01 | 2002-08-08 | Technische Universiteit Delft | A method of preparing cross-linked enzyme aggregates |
| CN100357325C (zh) * | 2005-10-23 | 2007-12-26 | 王贤理 | 一种抗apoA I、apoB抗体制备方法以及用于检测apoA I、apoB的试剂盒 |
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