JPH08114593A - 免疫測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 固相化抗体、抗原及び標識抗体を１段階で反
応させる１ステップサンドイッチ型免疫測定法におい
て、抗体に対する標識物質の結合モル比が１．０〜２．
０である標識抗体を検量線作製用標準品の最高濃度溶液
中に存在する抗原モル量の３〜２０倍モル量の範囲で用
いることを特徴とする免疫測定方法。 【効果】 高濃度の抗原物質を免疫測定方法により定量
する場合、フック現象を回避し得る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、高濃度の抗原物質を定
量する場合に生ずるフック現象を回避できる免疫測定方
法に関する。

【０００２】

【従来の技術】生体中に含まれる微量物質の精度の高い
検出系の１つとして、抗原抗体反応を用いた免疫測定方
法が開発されている。免疫測定方法の１つに非均一系免
疫測定方法があるが、この原理は、少なくとも２つの抗
体で試料中の抗原を挟み込んで検出するものである。そ
の際、一方の抗体は不溶化担体に固相化し、他方の抗体
は標識物質で標識化したものを使用する。また、非均一
系免疫測定方法では、抗原抗体反応で生じた結合型生成
物（Ｂｏｕｎｄ体）と非結合型生成物（Ｆｒｅｅ体）と
の分離（Ｂ／Ｆ分離）を必要とする。この中で、サンド
イッチ法には抗原抗体反応を１段階で行う１ステップサ
ンドイッチ法と２段階で行う２ステップサンドイッチ法
の２種類の方法があるが、１ステップサンドイッチ法の
方が反応時間が短く、操作も簡単であるため、迅速性及
び簡易性において優れている。

【０００３】しかしながら、１ステップサンドイッチ法
により高濃度に抗原が存在する試料を測定した場合、得
られるべき値よりも実際の測定結果が低く測定されるフ
ック現象が生じ、問題となっている（図１参照）。

【０００４】かかるフック現象の改善方法として、野村
ら（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａ
ｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．５６（１９８３）１３−１７）に
より固相化抗体及び標識抗体の量を増加させる方法が開
示されているが、この場合、吸光度測定に上限のある分
光光度計では測定範囲が減少してしまうという問題点が
あった。

【０００５】また、ベックマンの特許公報（特公平５−
３０２１３号）には、標識抗体に未標識の抗体を添加す
る方法も開示されているが、この方法では測定範囲は減
少しないが、低濃度域測定において感度が悪くなるとい
う問題点を残していた。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】従って本発明の目的
は、１ステップサンドイッチ法により高濃度の抗原をフ
ック現象を回避できる免疫測定方法を提供することにあ
る。

【０００７】

【課題を解決するための手段】斯かる実情に鑑み本発明
者らは鋭意研究を行った結果、抗体に対する標識物質の
結合モル比が一定の範囲にある標識抗体をある一定範囲
の量用いることによりフック現象をより高濃度側へ回避
し得ることを見出し、本発明を完成した。

【０００８】すなわち本発明は、固相化抗体、抗原及び
標識抗体を１段階で反応させる１ステップサンドイッチ
型免疫測定法において、抗体に対する標識物質の結合モ
ル比が１．０〜２．０である標識抗体を検量線作製用標
準品の最高濃度溶液中に存在する抗原モル量の３〜２０
倍モル量の範囲で用いることを特徴とする免疫測定方法
を提供するものである。

【０００９】本発明方法に用いる標識抗体は、抗体１モ
ルに対し、標識物質が１．０〜２．０モル結合したもの
であるが、特に１．３〜１．７モル結合したものが好ま
しい。また、本発明においては、標識抗体のモル量を検
量線作製用標準品の最高濃度溶液中に存在する抗原モル
量の３〜２０倍とする必要があるが、５〜１０倍のモル
量とするのがより好ましい。この標識抗体モル量を検量
線作製用標準品の最高濃度の抗原モル量の２０倍を超え
る量とするとフック現象は、より高濃度側へ回避できる
が、その場合、抗体と標識物質の結合モル比を１．０未
満まで低下させなければ、その測定範囲を維持できず、
検量線作製用標準品の最低濃度（０濃度）の吸光度に上
昇がみられ、所定の最低検出感度が維持できない現象が
起こる。また、標識抗体モル量を検量線作製用標準品の
最高濃度の抗原モル量の３倍未満にするとフック現象が
検量線作製用標準品の最高濃度の１００倍未満で現れ、
なおかつ、所定の測定範囲を維持するためには標準抗体
に対する標識物質の結合モル比を２．０を超える割合で
調製するか、固相化抗体を多量に使用しなければならな
いため、不経済である。検量線作製用標準品の最高濃度
溶液とは、検量線の測定範囲の最大値を示す標準品緩衝
溶液をいう。最高濃度溶液は、患者検体の抗原物質の分
布範囲、市販キットの測定範囲から定まる。例えば、γ
−Ｓｍの場合は１００ng／ml〜５００ng／ml、好ましく
は１５０ng／ml〜４００ng／mlが選ばれる。

【００１０】本発明方法によれば、抗原低濃度域におけ
る感度、同時再現性に優れていること等、従来の非均一
系免疫測定方法の利点を維持したまま、フック現象を少
なくとも検量線作製用標準品の最高濃度の１００倍以上
まで高濃度側へ回避することができる。

【００１１】本発明の免疫測定方法は、上記の条件以外
は常法により実施することができる。例えば試料（抗
原）、固相化抗体及び標識抗体を反応させ、Ｂ／Ｆ分離
を行った後、標識量を定量すればよい。

【００１２】本発明方法が適用できる試料は、特に限定
されず、例えば血液、血漿、血清、脳脊髄液、唾液、羊
水、乳、尿、汗及び肉汁等の生物由来の液状試料が挙げ
られる。

【００１３】また、試料中の抗原も特に限定されず、例
えばポリペプチド、蛋白質、複合蛋白質、多糖類、脂
質、複合脂質、核酸、ホルモン類、ビタミン類、薬剤、
抗生物質、腫瘍関連抗原及び農薬等が挙げられるが、血
液中、血漿中及び血清中に存在するポリペプチド、蛋白
質、複合蛋白質及び腫瘍関連抗原等が好ましい。

【００１４】抗体を固相化させる不溶化担体の材料とし
ては、アガロース、セルロース、ポリアクリルアミド、
微結晶セルロース、架橋アガロース、架橋ポリアクリル
アミド、ガラス、シリカゲル、ケイ藻土、二酸化チタ
ン、ケイ砂、ポリスチレン等の各種合成樹脂の他、多孔
質層の素材又は磁性微粒子等が挙げられ、このうちポリ
アクリルアミド、架橋ポリアクリルアミド、ポリスチレ
ン又は微結晶セルロース等が好ましい。

【００１５】そして、これら不溶化担体と抗体との結合
に際しては、公知の方法である化学的又は物理的に直接
結合させる方法を用いることができる。

【００１６】また、標識物質としては酵素、放射性物質
及び蛍光物質等が挙げられるが、このうちβ−Ｄ−ガラ
クトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダ
ーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルタメートデヒドロ
ゲナーゼ及びアミラーゼ等の酵素が特に好ましい。

【００１７】これら標識物質と抗体との結合に際して
は、石川栄治、河合忠、宮井潔著「酵素免疫測定法（第
３版）医学書院１９８７年」に記載されている方法を参
考にすることができる。

【００１８】また、抗体は、モノクローナル抗体又はポ
リクローナル抗体の何れでもよく、ＩｇＧ、ＩｇＭ、Ｉ
ｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥの各分画、或いはこれらの抗体
を酵素処理することにより得られるＦａｂ、Ｆａｂ’及
びＦ（ａｂ’）₂を用いることができ、これらの抗体は
単一で使用しても、複数の抗体を組み合わせて使用して
もよい。

【００１９】

【実施例】以下、実施例、比較例を挙げて本発明を更に
詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるもので
はない。なお、以下の比較例、実施例に使用する標識抗
体は、次の方法により作製したものを使用した。

【００２０】標識抗体の作製方法： （１）ペルオキシダーゼ（以下、「ＨＲＰ」と記す。）
へのマレイミド基の導入 １．５mlのpH７．０，０．１Ｍリン酸緩衝液（以下、
「ＰＢＳ」と記す。）を用いて１０mgのＨＲＰ（シグマ
社製：ＴｙｐｅＸII）を溶解し、その溶液に、ジメチル
ホルムアミド（以下、「ＤＭＦ」と記す。）で１３mg／
mlに調製したＳｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ（ＰＩＥＲＣＥ社
製：品番２２３２２）溶液を１５０μl 添加した。

【００２１】室温で１時間、マグネチックスターラーで
２００rpm にて、反応液を攪拌しながら反応させた後、
セファデックスＧ−５０（ファルマシア社製）を用いて
ゲルクロマトグラフィーにかけた。その際の緩衝液は
０．１Ｍ ＰＢＳ（pH６．０）を用いた。

【００２２】２８０nmの吸光度測定により、マレイミド
基が結合したＨＲＰを含有する画分を集合した後、セン
トリプレップ１０（アミコン社製）で濃縮し、４．８mg
／mlのマレイミド基が結合したＨＲＰ溶液を１．１ml得
た。

【００２３】（２）モノクローナル抗体（以下、「Ｉｇ
Ｇ」と記す。）へのＳＨ基の導入 pH６．５の０．１Ｍ ＰＢＳを用いて１０mg／mlの濃度
に調製したＩｇＧ溶液にＤＭＦで６０mg／mlに調製した
Ｓ−アセチルメルカプトコハク酸（Ａｌｄｒｉｃｈ社
製）溶液を２０μl 添加した。

【００２４】室温で３０分、マグネチックスターラーで
２００rpm にて、反応液を攪拌しながら反応させた後、
０．１Ｍ ＥＤＴＡ（pH７．０）４０μl 、０．１Ｍ
トリス−ＨＣｌ（pH７．０）２００μl 及び１Ｍ ヒド
ロキシアミン−ＨＣｌ（pH７．０）２００μl を順次添
加した。次いでこれを１０分間、室温で放置した後、セ
ファデックスＧ−５０を用いてゲルクロマトグラフィー
にかけた。その際の緩衝液は０．１Ｍ ＰＢＳ（pH６．
５）を用いた。２８０nmの吸光度測定により、ＳＨ基の
結合したＩｇＧを含有する画分を集めた後、セントリプ
レップ１０で濃縮し、６．３mg／mlのＳＨ基が結合した
ＩｇＧ溶液を１．３ml得た。

【００２５】（３）ＩｇＧ−ＳＨとマレイミド−ＨＲＰ
の結合 結合モル比３．０付近を目標とした標識抗体は、（１）
で得られたマレイミド−ＨＲＰ ３８０μl （１．８m
g）と（２）で得られたＩｇＧ−ＳＨ ３７０μl
（２．３mg）をそれぞれ混合し、また、結合モル比１．
０付近を目標とした標識抗体は、（１）で得られたマレ
イミド−ＨＲＰ １３０μl （０．６mg）と（２）で得
られたＩｇＧ−ＳＨ ３７０μl （２．３mg）をそれぞ
れ混合し、４℃で１６時間、マグネチックスターラーを
用いて２００rpm にて攪拌しながら反応させた。

【００２６】１６時間後、０．１Ｍ ＰＢＳ（pH６．
５）で０．１Ｍに調製したエチルマレイミド（シグマ社
製）をそれぞれ２０μl ずつ上記２種の標識抗体に添加
し、反応を停止させた後、セファロースＣＬ−６Ｂ（フ
ァルマシア社製）でゲルクロマトグラフィーに供した。
その際の緩衝液は０．１Ｍ ＰＢＳ（pH６．５）を用い
た。ゲルクロマトグラフィー後、蛋白に特異的な２８０
nmとＨＲＰに特異的な４０５nmの２波長からＩｇＧに対
するＨＲＰの結合モル比を計算し、ＩｇＧに対するＨＲ
Ｐの結合モル比３．２の標識抗体を１０．３ml（抗体濃
度５６．５μg ／ml）、ＩｇＧに対するＨＲＰの結合モ
ル比１．４の標識抗体を８．２ml（抗体濃度６０．２μ
g ／ml）を得た。

【００２７】比較例１ 結合モル比３．２の標識抗体を用いたγ−セミノプロテ
イン（以下、「γ−Ｓｍ」と記す。）標準品及び高濃度
検体の測定：結合モル比３．２の標識抗体を１００ng／
mlの濃度に調製して、予めＰＢＳで調製したγ−Ｓｍ標
準品（２００，１００，５０，１０，２及び０ng／ml）
とＰＢＳで順次、希釈した高濃度検体２０，０００ng／
mlの希釈サンプルを測定した。

【００２８】γ−Ｓｍ標準品の吸光度の結果を表１に、
高濃度検体の希釈サンプルの結果を表２及び表２のフッ
ク現象をグラフに示した結果を図１に示す。表１より、
結合モル比３．２の標識抗体を用いた場合、標識抗体濃
度が１００ng／mlの時、γ−Ｓｍ標準品の最高濃度（２
００ng／ml）の４９２nmにおける吸光度が２．０付近に
なった。本試験では２５μl のγ−Ｓｍ抗原を使用して
おり、γ−Ｓｍの分子量が３０，０００であることか
ら、抗原量中には１．７×１０^-12モルのγ−Ｓｍが存
在している。また、２５０μl の標識抗体量を使用して
おり、ＩｇＧの分子量が１２０，０００であることか
ら、標識抗体量中には２．１×１０^-12モルのＩｇＧが
存在している。この条件では標識抗体のモル量は抗原モ
ル量の１．２５倍存在している。この標識抗体は表２及
び図１に見られるようにフック現象が希釈倍率４倍の
５，０００ng／ml付近で現れた。また、表１と表２の比
較より、原液（希釈倍率×１：２０，０００ng／ml）
は、濃度２００ng／ml以下の吸光度であるため、測定値
としては２００ng／ml以下の値となり、不都合な測定結
果を示していることが判る。

【００２９】

【表１】

【００３０】

【表２】

【００３１】実施例１ 結合モル比１．４の標識抗体を用いたγ−Ｓｍ標準品及
び高濃度検体の測定：結合モル比１．４の標識抗体を４
５０ng／mlの濃度に調製して、予めＰＢＳで調製したγ
−Ｓｍ標準品（２００，１００，５０，１０，２及び０
ng／ml）とＰＢＳで順次、希釈した高濃度検体２０，０
００ng／mlの希釈サンプルを測定した。

【００３２】γ−Ｓｍ標準品の吸光度の結果を表３に、
高濃度検体の希釈サンプルの結果を表４に及び表４のデ
ータをグラフに示した結果を図２に示す。表３より、結
合モル比１．４の標識抗体を用いた場合、標識抗体濃度
が４５０ng／mlの時、γ−Ｓｍ標準品の最高濃度（２０
０ng／ml）の４９２nmにおける吸光度が２．０付近にな
った。

【００３３】本試験では比較例１と同様の抗原、標識抗
体量を用いており、抗原量中には１．７×１０^-12モル
のγ−Ｓｍが存在している。また、標識抗体量中には
９．４×１０^-12モルのＩｇＧが存在している。この条
件では標識抗体のモル量は抗原モル量の５．６３倍存在
している。この標識抗体濃度でのフック現象は表４及び
図２に示す通り原液（×１）の２０，０００ng／mlでも
現れない。比較例１で誤認の可能性のあった２０，００
０ng／mlでも標準品２００ng／ml以上の吸光度で表現さ
れ、フック現象が比較例１と比較して４倍以上高濃度側
へ回避されたことが判る。また、この結合モル比の低い
本発明方法の標識抗体を用いても検量線最低濃度（０ng
／ml）及び２ng／mlの吸光度は、結合モル比３．２の標
識抗体を用いた比較例１の結果と比較してもほぼ同値で
あり、低濃度感度にもほとんど影響を与えないことが判
る。そして、ＣＶ値においても比較例１の標準品、高濃
度検体の測定値と比較してもほとんど変わらず、本標識
抗体を用いても１ステップサンドイッチ法の利点を維持
していることが判る。

【００３４】

【表３】

【００３５】

【表４】

【００３６】実施例２ 結合モル比１．２の標識抗体を用いたγ−Ｓｍ標準品及
び高濃度検体の測定：結合モル比１．２の標識抗体を６
４０ng／mlの濃度に調製して、予めＰＢＳで調製したγ
−Ｓｍ標準品（２００，１００，５０，１０，２及び０
ng／ml）とＰＢＳで順次、希釈した高濃度検体２０，０
００ng／mlの希釈サンプルを測定した。ここには示さな
いγ−Ｓｍ標準品の吸光度の結果より結合モル比１．２
の標識抗体を用いた場合、標識抗体濃度が４５０ng／ml
の時、γ−Ｓｍ標準品の最高濃度（２００ng／ml）の４
９２nmにおける吸光度が２．０付近になった。本試験で
は比較例１と同様の抗原、標識抗体量を用いており、抗
原量中には１．７×１０^-12モルのγ−Ｓｍが存在して
いる。また、標識抗体量中には１．４×１０^-11モルの
ＩｇＧが存在している。この条件では標識抗体のモル量
は抗原モル量の８．０倍存在している。この標識抗体濃
度でのフック現象は原液（×１）の２０，０００ng／ml
でも現れなかった。また、この結合モル比の低い本発明
方法の標識抗体を用いても検量線最低濃度（０ng／ml）
及び２ng／mlの吸光度は、結合モル比３．２の標識抗体
を用いた比較例１の結果と比較してもほぼ同値を示し、
低濃度感度にもほとんど影響を与えなかった。

【００３７】

【発明の効果】本発明により、１ステップサンドイッチ
法において、高濃度検体測定時におけるフック現象をよ
り高濃度側へ回避し、非均一系免疫測定法での試料の誤
認をなくすことができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】γ−Ｓｍモノクローナル抗体に対するＨＲＰ標
識物質の結合モル比が３．２、標識抗体モル量を検量線
作製用標準品の最高濃度溶液中に存在する抗原モル量の
１．２５倍の条件で用いた２０，０００ng／mlの高濃度
試料の希釈測定結果を示す図である。

【図２】γ−Ｓｍモノクローナル抗体に対するＨＲＰ標
識物質の結合モル比が１．４、標識抗体モル量を検量線
作製用標準品の最高濃度溶液中に存在する抗原モル量の
５．６３倍の条件で用いた２０，０００ng／mlの高濃度
試料の希釈測定結果を示す図である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 固相化抗体、抗原及び標識抗体を１段階
   で反応させる１ステップサンドイッチ型免疫測定法にお
   いて、抗体に対する標識物質の結合モル比が１．０〜
   ２．０である標識抗体を検量線作製用標準品の最高濃度
   溶液中に存在する抗原モル量の３〜２０倍モル量の範囲
   で用いることを特徴とする免疫測定方法。