JPH0811732B2

JPH0811732B2 - 抗腫瘍剤

Info

Publication number: JPH0811732B2
Application number: JP19649886A
Authority: JP
Inventors: 茂生鈴木; 益子鈴木; 均堅山
Original assignee: Ihara Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Ihara Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 1986-08-15
Filing date: 1986-08-23
Publication date: 1996-02-07
Anticipated expiration: 2011-02-07
Also published as: JPS63183536A

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、ガラクトサミンからなる多糖を有効成分と
して含有する新規な抗腫瘍剤に関するものである。本発
明の抗腫瘍剤は特に悪性腫瘍の治療剤として有用であ
る。

（従来の技術）従来、ガラクトサミンからなる多糖として、アスペル
ギルス・パラシティカス（Aspergillus parasticus）の
生産するガラクトサミン・ポリマー〔ジャーナル・オブ
・バイオロジカル・ケミストリー（Journal of Biologi
cal Chemistry）第235巻第2538〜2541頁、1969年〕及び
ペエシロマイセス（Paecilomyces）属に属する菌株ペエ
シロマイセス（Paecilomyces）sp.I−１（微工研寄託番
号FERM−P 3928）の生産するガラクトサミンからなる多
糖PF−101〔特公昭56−12639号公報、アグリカルチュラ
ル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Agricult
ural and Biological chemistry）第49巻第3159〜3164
頁、1985年〕、等が知られている。また、PF−101が凝
集剤として有用な凝集活性を有することも知られている
〔特公昭56−12639号公報、アグリカルチュラル・アン
ド・バイオロジカル・ケミストリー（Agricultural and
Biological Chemistry）第49巻第3159〜3164頁、1985
年〕。

さらにまた従来、抗腫瘍活性を有する多糖としては、
シイタケから抽出されるグルコースのβ−（１→３）結
合を主鎖とする多糖であるレンチナン（特公昭47−3700
2号公報、同49−484号公報）、カワラタケから抽出され
るグルコースのβ−（１→４）結合を主鎖とする蛋白多
糖であるPSK（商品名クレスチン）（特公昭55−23271号
公報、同57−40159号公報）、及びＮ−アセチルグルコ
サミンがβ−（１→４）結合した多糖であるキチン（特
開昭59−27826号公報）、等が知られている。

（発明が解決とようとする問題点）しかしながら、前記多糖を有効成分とする抗腫瘍剤は
副作用が少ない等の安全性にすぐれているが、治療効果
を実際にあげるために必要とされる有効成分の投与量、
投与回数等が多く抗腫瘍剤として未だ充分満足できるも
のではなく、更に安全性、薬効のすぐれた抗腫瘍剤の開
発が望まれていた。

（問題点を解決するための手段）本発明者らは、従来の、前記の多糖を有効成分とする
抗腫瘍剤の有する問題点を解決し、更に優れた抗腫瘍剤
を提供すべく鋭意研究を重ねた結果、ガラクトサミンか
らなる多糖が意外にも抗腫瘍活性及び免疫増強活性を有
し、しかもその投与量、投与回数を少なくしてもすぐれ
た抗腫瘍剤活性を示すことを見出し、本発明を完成する
に至った。

本発明の抗腫瘍剤の有効成分として用いられるガラク
トサミンからなる多糖は、ポリガラクトサミンと記載さ
れ得る物質、ならびにガラクトサミン分子を単位として
これらがα−（１→４）結合で相互に結合してなるポリ
マーを主鎖とする平均分子量10万以上を有する多糖を包
含し、これら多糖のガラクトサミン部分のアミノ基が部
分的にアセチル化されていてもよい。

本発明で用いられるガラクトサミンからなる多糖の例
としては、具体的にはジャーナル・オブ・バイオロジカ
ル・ケミストリ（Journal of Biological Chemistry）
第235巻第2538〜2541頁、（1969年）記載のアスペルギ
ルス・パラシティカス（Aspergillus parasticus）の生
産するガラクトサミン・ポリマー、ならびに特公昭56−
12639号公報及びアグリカルチュラル・アンド・バイオ
ロジカル・ケミストリー（Agricultural and Biologica
l chemistry）第49巻第3159〜3164頁、（1985年）記載
のペエシロマイセス（Paecilomyces）属に属する既知の
菌株ペエシロマイセスsp.I−１（微工研寄託番号FERM−
P No.3928）の生産するガラクトサミンからなる多糖PF
−101およびPF−102、等が挙げられる。

上記のPF−101は既知の物質であるが、PF−102は特開
昭62−294093号（特公平１−41160号）明細書（出願
人：ヒゲタ醤油株式会社、昭和61年６月12日出願）に示
される新規物質であり後記する方法で製造されて後記の
理化学的性質を有するものである。

本発明の抗腫瘍剤は、通常は、有効成分として用いら
れるガラクトサミンからなる多糖、例えばポリガラクト
サミン、PF−101、PF−102等の少なくとも一つを常法で
薬学的に許容できる液状又は固体状の公知担体と配合し
且つ必要に応じて溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定
化剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤等を加えて注射
剤、錠剤、顆粒剤、散剤、粉末剤、カプセル剤等に製剤
して使用される。

本発明の抗腫瘍剤は、注射剤として製剤し静脈内投与
して使用することができ、皮下、皮肉、筋肉内または腹
腔内投与により使用することもできる。また、本剤は錠
剤、顆粒剤、散剤、粉末剤として製剤し経口投与により
使用することもできる。

本発明の抗腫瘍剤が有効である腫瘍細胞としては、例
えばザルコーマ180、エールリッヒ・カリシノーマ、ロ
イケミアＬ−1210、ロイケミアＰ−388、MM−46、Meth
−Ａ、Lewis肺癌、BC47膀胱癌等の実験腫瘍、Ｘ−5536
プラズマ細胞腫、AC−755、Ｂ−16等が挙げられる。

また、本発明の抗腫瘍剤の有効成分投与量は成人１日
当り0.1μg/kg〜10mg/kg好ましくは0.1μg/kg〜100μg/
kgの範囲である。

（本発明の作用及び効果）本発明の抗腫瘍剤は免疫系を介して作用し、免疫増強
作用を有するものである。

本発明の抗腫瘍剤は、人体に対する毒性、副作用が実
用上ほとんどなく、極めて安全性にすぐれること、注射
剤等の製剤化および投与が簡便で且つ薬効の発現が早い
こと、さらにまた極めて少ない有効成分投与量で抗腫瘍
性を示す等のすぐれた利点を有する。

本発明の抗腫瘍剤において有効成分として用い得る前
記のPF−102は新規物質であるから、この物質の物性及
び製造法について次に説明する。

PF−102は、ほとんどすべての酸の水溶液に溶解し酸
塩を形成する。PF−102を遊離の塩基性物質として単離
することは可能であるが、それは水に難溶であるたえ、
取扱いが困難となる。従って、PF−102の理化学的性質
のうち、凝集活性、凝集活性pH範囲、凝集活性温度範
囲、紫外吸収スペクトル、呈色反応の測定にはPF−102
の塩酸塩を用いた。

PF−102はアミノ基を含有する物質であって次の理化
学的性質を有している。

（１）凝集活性；きわめて微量で添加しても、水中の懸
濁微細物を凝集する。

（２）凝集活性pH範囲;pH2〜９で安定に凝集活性を示
す。

（３）凝集活性温度範囲;0〜100℃で凝集活性が認めら
れる。

（４）凝集活性イオン強度；炭酸およびFe₂（SO₄）_３に
よりPF−102の凝集活性が阻害されるが、それ以外の各
種イオン及びイオン強度によって凝集活性に影響はな
く、NaCl、K₂SO₄で1Mまで全く影響を与えない。

（５）元素分析；窒素8.64％、炭素42.80％、水素6.87
％一般式：（C₆H₁₁NO₄・xH₂O）_ｎ（６）紫外吸収スペクトル；添付図面の第１図に示すと
おり。

（７）赤外吸収スペクトル；添付図面の第２図に示すと
おり。

（８）呈色反応；ニンヒドリン反応：＋キサントプロテイン反応：− エーリッヒ反応： − モリッシュ反応： − フェノール硫酸法： ± レローゼントテスト： − （９）電気泳動；密度勾配等電点電気泳動法によ単一物
質として確認され、等電点（pI）は8.5である。

（10）物質の色；淡褐色（11）塩基性、酸性、中性の区別； 0.5％w/vの濃度で水に懸濁した場合のpHは7.5（脱イ
オンのpH5.8）である。

（12）溶剤に対する溶解性；熱水に僅溶、冷水に難溶であるが、希酸水溶液に易容
である。希アルカリ水溶液に難溶であり、アルコール
類、アセトン、クロロホルム、ベンゼン、ｎ−ペンタン
に不溶である。

（13）平均分子料： 16万以上 PF−102の酸塩としては、燐酸塩、塩酸塩、酢酸塩、
乳酸塩、クエン酸塩などが好ましい。PF−102の塩酸塩
の赤外吸収スペクトルは、第３図に示される。

新規物質PF−102は、特公昭56−12639号及びアグリカ
ルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー
（Agricultural and Biological Chemistry）第49巻第3
159〜3164頁（1985年）に記載のペエシロマイセス（Pae
cilomyces）属に属する既知の菌株ペエシロマイセスsp.
I−１（微工研寄託番号FERM−P3928;特公昭56−12639号
公報に記載された菌学的性質をもち微工研から分譲され
うる）を通常の糸状菌の液体培養方法で培養することに
よって製造できる。

すなわち、ペエシロマイセスsp.I−１菌株（FERM−P
No.3928）の胞子また菌糸を液体培地に接種し、好気的
に培養することによって培地中にPF−102は生産され
る。培地の炭素源としてはブドウ糖、麦芽糖、蔗糖、澱
粉、廃糖蜜等を使用することができるが、好ましくはブ
ドウ等を用いるのが良い。窒素源としては硫酸アンモニ
ウム、硫酸ナトリウムなどの無機窒素源、ペプトン、酵
母エキスなどの有機窒素源が使用出来る。

培養温度はPF−102生産菌が本物質を生産する範囲内
で適宜変更し得るが、通常20〜25℃で培養することが好
ましい。培養時間は培養条件によって異なるが、通常４
〜５日程度であり、本物質の蓄積が最高に達する時間を
見積って適当な時間に終了すればよい。ここで得られた
培養液の培養濾液を減圧濃縮、限外濾過等の方法で濃縮
して濃縮液としてエタノール等の有機溶媒を加えて沈澱
すれば、特公昭56−12639号公報に記載の既知物質PF−1
01が得られるのである。

PF−102は、上記の培養瀘液または瀘液濃縮液に各種
の塩を添加して塩析法によって、また沈澱が生じない場
合は必要によってはアルカリを追加して添加してpHを７
〜９もしくはそれ以上として、固体として析出させ、析
出物を分離し、水洗し、これを希酸水溶液に溶解し、再
び塩を添加するが、アルカリ等の添加によってpHを７〜
９もしくはそれ以上として、析出させることによって、
高度に精製されたPF−102を得ることができる。

PF−102の含有溶液に添加される塩としては、次の例
示の塩を含めて塩の１又は２つ以上がある。即ち、塩化
カリ、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化アンモニ
アなどの塩化物、硝酸カリ、硝酸ナトリウムなどの硝酸
塩、酢酸ナトリウムなどの酢酸塩、硫酸２カリ、硫安、
硫酸カルシウム、硫酸銅などの硫酸塩、リン酸２カリ、
リン酸１カリ、リン酸２ナトリウム、リン酸１ナトリウ
ムなどのリン酸塩などが例示される。

添加する塩は溶解した状態であれば、どれだけの添加
量でもよいが、好ましいのはPF−10含有液に対し、0.5
〜50％、より好ましくは２〜40％程度である。

添加する塩の種類によっては、液のpHが７以上になる
ので、この場合はpHの調整を行なうことなく、PF−102
が析出するので、析出物を分離すればよい。

塩の添加によってもpHが７より下の場合は水酸化ナト
リウム等のアルカリを用いて、pHを７〜９、好ましくは
等電点である8.5附近にpHの調整を行う必要がある。

PF−102含有液に塩の添加とpH7〜９の調整を行えば、
夾雑物の妨害によって容易に析出しなかったPF−102が
析出を起し、夾雑物とは分離して析出する。この析出物
は遠心分離又は濾布による濾過によって分取できる。

分取した析出物は多量の塩を含んでいるので、これを
水や溶媒で洗滌して脱塩し、酸に溶解する。

酸としては酢酸などの有機酸、塩酸などの無機酸など
いずれの酸でもよく、また、濃度としては0.01〜３モル
程度のものがよい。このように析出物を酸に溶解した後
は、pH7〜９の等電点附近の処理のみで容易に析出する
ようになるので、水酸化ナトリウム等のアルカリを添加
し、pH7〜９、好ましくはpH8.5とpH調整し、析出物を得
る。

更に、精製するためには、この析出物を水等で洗滌
し、再び酸に溶解し、pH7〜９へのpH調整を行い、析出
物を得ることができる。この精製処理は何度でも行なう
ことができ、精製が完了した時点で、析出物はほぼ純粋
となり、PF−102が得られるのである。

（実施例）本発明において、有効成分として用いられる前記のPF
−102の製造例を参考例１及び参考例２で以下に示す。

参考例１ PF−101の製造特公昭56−12639号実施例４に従って次のようにしてP
F−101を製造した。20容ジャーファーメンターにグル
コース300g、カザミノ酸45g、CaO110gを加え塩酸でpH6.
0に調整した。その後最終液量を15にし、120℃、150
分間加熱殺菌後、500ml三角フラスコに100mlのG.Ye培地
で５日間振盪培養したペエシロマイセスＩ−１菌株（FE
RM−P3928）を接種し、５日間通気撹拌培養した（通気
量10/min、200r.p.m）。培養後、培養液を濾布濾過
し、培養濾液をフラッシュエバポレーターで濃縮し、濃
縮液を2.3得た。次に濃縮液に等量のエタノール（95
％）を加え、沈澱物を遠心分離により集め75％エタノー
ルで洗浄後凍結乾燥し、5.2gの粉末標品を得た。

得られた粉末標品3gを0.5のふっとう水に加え、更
に15分間加熱し溶解した。一部不溶物があるので、遠心
分離上清を得た。このもののフェノール硫酸法により49
0mμの吸光度（A490）から濃度約4mg/mlであった。

この溶液100mlをセフアロース6Bのカラムに通しゲル
濾過した。最初に1/40モルトリス−塩酸緩衝液を通して
まず不純物を溶出し、次いで1/40モル、トリス−マレイ
ン酸緩衝液で目的物を溶出させた。

次いでこれにエタノール250mlを加え沈澱を得、この
沈澱を更に75％エタノールで３回洗浄し、凍結乾燥し、
ガラクトサミンからなる多糖PF−101の凍結乾燥標品を
得た。

参考例２ PF−102の製造グルコース600g、ポリペプトン60g、CaCl₂・2H₂Oの12
5gを水道水17に溶解し、濃NaOH溶液でpH7.0に調整し
た後、30容ジャーファーメンターに移した。

この培地溶液に蒸気を注入することにより加圧、加熱
滅菌（121℃、20分間）を行った。冷却後の培地（最終
液量20）に、500ml三角フラスコに150ml同組成の培地
（グルコース３％、ポリペプトン0.3％、CaCl₂0.5％、p
H7.0）で26℃、４日間振盪培養したペエシロマイセスＩ
−１菌株（FERM−P No.3928）を無菌的に容量比で約10
％接種した。接種後27℃、通気量5VVM、撹拌数200RPMの
条件で５日間培養した。

培養終了後、培養物を濾布濾過することにより培養濾
液17を得た。この培養瀘液を50℃〜60℃に加熱しなが
ら分画分子量16万の限外濾過膜（三菱レイヨン・エンジ
ニアリング社製UF膜チューブラー・モジュールＦタイ
プ）を通過させることにより、低分子画分を除き液量が
約３になる迄濃縮した。更に、約14000×Ｇで遠心分
離することにより菌体残渣、熱変性蛋白質を除去した。

遠心分離後に上澄液画分３に食塩約4.3kg（約25％
濃度）を加え撹拌し、溶解後、濃NaOHでpHを7.0〜8.5に
調整した。一夜放置し塩析物を十分析出させた後、サラ
ン（塩化ビニリデンと塩化ビニールの共重合体）製の布
上に塩析物を回収した。更にこの塩析物の上から大量の
微アルカリ性の水（pH7.0以上）を撤布することにより
余分の食塩及び培養液に同時に混在している中性糖、そ
の他の夾雑物を洗い流した。

次に、水洗後の塩析物に0.1M塩酸溶液を容量比で約３
倍量加え溶解した。この溶解物に濃NaOH溶液を加えポリ
ガラクトサミンの等電点であるpH8.5に合せた。一夜放
置し十分析出物を析出させた後、上記と同様にサラン製
の布上に析出物を回収し、大量の水道水で洗った。この
水洗物をもう１度0.1M塩酸に溶解後、等電点沈澱を行い
水洗を繰返すことにより精製した。

この精製した析出物を121℃、15分間滅菌後、凍結乾
燥することにより、ポリガラクトサミンを主成分とする
多糖PF−102の精製粉末（ポリガラクトサミンとしての
純度約99％）を7g得た。

また、用途により上記精製粉末の１部を01.M塩酸に溶
解し分画分子量30万の限外濾過膜（アミコン社製分子篩
膜タイプXM300）で分画し、平均分子量16〜30万のもの
と平均分子量30万以上のものに分画することもできる。

次に本発明の抗腫瘍剤を製剤例について説明する。

製剤例１参考例１で得られたガラクトサミンからなる多糖PF−
101の0.25gを加熱注射用蒸留水90mlに溶解し、次いでこ
れに注射用生理食塩水を加えて全容を100mlとして0.25
％注射剤を得た。

製剤例２参考例２で得られたガラクトサミンからなる多糖PF−
102の0.25gを0.05N塩酸水溶液90mlに分散させ６時間放
置して溶解させた後、これに撹拌下にトリス（ヒドロキ
シメチル）アミノメタン（溶解剤）を小量ずつ滴下して
pH6.8に調整し、次いでこれに注射用生理食塩水を加え
て全容を100mlとし0.25％注射剤を得た。

次に、本発明の抗腫瘍剤の抗腫瘍活性、免疫増強活性
を実験例によって例証する。

実験例１ MM−６固型腫瘍に対する抗腫瘍作用試験 C3H/HeSlc系の雄性マウス（１群10匹）のそけい部皮
下にMM−46腫瘍細胞５×10⁵個を移植接種し、腫瘍がマ
ウスに完全に生着した日より７日後すなわち腫瘍細胞移
植後14日目に、製剤例２に準じて調整したガラクトサミ
ンからなる多糖PF−102を有効成分とする注射剤を有効
成分の１μg/kgの投与量でマウス尾静脈内に投与した。
腫瘍細胞移植後27日目に腫瘍を取り出して腫瘍重量を測
定し腫瘍阻止率を求めた。尚、対照試験は生理食塩水の
みの注射液を用いて同様に行った。得られた結果を表−
１に示す。

実験例２抗体産生増強試験 C3H/HeSlc系の雄性マウス（４〜６週令、１群４匹）
の尾静脈内に抗原としてヒツジ赤血球をマウス当り１×
10⁸個投与して免疫を施し、これと同時に、製剤例２に
準じて調整したガラクトサミンよりなる多糖PF−102を
有効成分とする注射剤を有効成分１μg/kgマウスの投与
量で投与し、その４日後に脾臓を滴出して脾臓当りの抗
体産生細胞数をCunninghamのプラーク形成細胞測定法に
より算定した。また、同様にヒツジ赤血球を投与して免
疫を施したと同時に生理食塩水のみを投与したマウス
（対照試験）からも４日後に脾臓を滴出して抗体産生細
胞数を上記と同じプラーク形成細胞測定法で算定した。
抗体産生増強効果を次式により調べた。

但し:PF−102を投与されたマウス脾臓の抗体産生細胞
数 C:生理食塩水を投与されたマウス脾臓の抗体産生細胞
数。

同様にして、夫々に別群のマウスを用いて、PF−102
投与後５日目、10日目または15日目にそれぞれヒツジ赤
血球をマウス当り１×10⁸個投与し、その４日目すなわ
ちPF−102投与後９日目、14日目または19日目にそれぞ
れ脾臓を滴出した抗体産生増強効果の持続生を調べた。

尚、対照試験は生理食塩水のみの注射液を用いて同様
に行った。得られた結果を表−２に示す。

実験例３細胞性免疫増強試験 C3H/HeSlc系の雄性マウス（４〜６週令、１群４匹）
の足蹠皮下に抗原としてヒツジ赤血球をマウス当り１×
10⁸個投与して免疫を施し、同時に、製剤例２に準じて
調製したガラクトサミンからなる多糖PF−102を有効成
分とする注射剤を有効成分１μg/kgマウスの投与量でマ
ウス静脈内に投与し、その４日後に、再び抗原としてヒ
ツジ赤血球をもう一方のマウス足蹠皮下にマウス当り１
×10⁸個投与し、その１日後にマウス足蹠の腫脹をノギ
スで測定して浮腫増加率を算定し細胞性免疫増強効果を
調べた。

尚、対照試験は生理食塩水のみが注射液を用いて同様
に行った。得られた結果を表−３に示す。

実験例４ MM−46固形腫瘍に対するPF−101の腹腔前投
与の抗腫瘍作用試験 C3H/HeSlc系の雄性マウス（１群７匹）の腹腔に、製
剤例１に準じて調製したガラクトサミンからなる多糖PF
−101を有効成分とする注射剤を１回当りに有効成分50m
g/kgマウスの投与量で腫瘍細胞移植の５日前、３日前お
よび１日前に１日１回計３回投与した。次いで、PF−10
1の３回投与の翌日、マウス腹腔にMM−46腫瘍細胞１×1
0⁵個移植接種してから、60日間にわたってマウスの生死
数を観察した。その結果、腫瘍細胞移植後60日目でも、
PF−101を投与されたマウス７匹中の７匹全数が生存し
ていた。

尚、生理食塩水のみの注射剤を用いて同様に行った対
照試験では、腫瘍移植後28日目でマウス７匹中の７匹全
数が死亡した。

実験例５ MM−46固形腫瘍に対するPF−101の腹腔全投
与の抗腫瘍作用試験 C3H/HeSlc系の雄性マウス（１群７匹）の腹腔に、MM
−46腫瘍細胞１×10⁵個移植接種し、その翌日より製剤
例１に準じて調製したガラクトサミンからなる多糖PF−
101を有効成分とする注射剤を１回当りに有効成分50mg/
kgマウスの投与量で隔日に１日１回計３回、マウス腹腔
に投与した。腫瘍細胞移植後60日間にわたってマウスの
生死数を観察した。その結果、腫瘍細胞移植後60日目で
も、PF−101を投与されたマウス７匹中の７匹全数が生
存していた。

実験例６急性経口毒性体重26〜28gのddY−Ｎ系雄性マウス（約５週令、１群
８匹）にガラクトサミンからなる多糖PF−101またはPF
−102を300mg/kgの投与量でマウスに胃ゾンデにより１
回強制経口投与した。投与後１週間観察したが、いずれ
も死亡例はなく、また特筆すべき中毒症状も認められな
かった。

実験例７急性腹腔内毒性体重26〜28gのddY−Ｎ系雄性マウス（約５週令、１群
８匹）にガラクトサミンからなる多糖PF−101またはPF
−102を300mg/kgの投与量でマウスに１回腹腔内投与し
た。投与後１週間観察したが、いずれも死亡例はなく、
また特筆すべき中毒症状も認められなかった。

【図面の簡単な説明】

第１図はPF−102の塩酸塩の紫外吸収スペクトル図、第
２図はPF−102の赤外吸収スペクトル図、第３図はPF−1
02の塩酸塩の赤外吸収スペクトル図である。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ガラクトサミンからなる多糖を有効成分と
することを特徴とする抗腫瘍剤。