JPS6237012B2

JPS6237012B2 -

Info

Publication number: JPS6237012B2
Application number: JP56052003A
Authority: JP
Inventors: Tomoyuki Ishikura; Kimio Moryama; Kageaki Kono
Original assignee: SANRAKU CO Ltd
Current assignee: SANRAKU CO Ltd
Priority date: 1981-04-06
Filing date: 1981-04-06
Publication date: 1987-08-10
Also published as: JPS57165320A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はコリネバクテリウム属又はミクロバク
テリウム属の細菌類の菌体の稀酸性あるいはアル
カリ性水溶液抽出物を溶剤で沈澱せしめたものを
有効成分とする抗腫瘍性剤に関するものである。従来より、コリネバクテリウム属の細菌類の菌
体より抗腫瘍性物質を得る方法についてはいくつ
かの文献類もあるが、それらは菌体成分を直接投
与、或いは他の抗腫瘍性剤と併用してその効果を
みたものであつて、本発明におけるが如き、菌体
を稀酸あるいはアルカリ性水溶液で抽出した抽出
物の溶剤沈澱物を使用するものではない。また、
ミクロバクテリウム属に属する細菌類の菌体に含
まれる抗腫瘍性成分については未だ何も検討され
ていない。本発明者等はコリネバクテリウム属またはミク
ロバクテリウム属に属する細菌類の菌体の稀酸性
水溶液抽出区分またはアルカリ性水溶液抽出区分
が強い抗腫瘍性を示すことを見出して本発明を完
成した。即ち、本発明はコリネバクテリウム属ま
たはミクロバクテリウム属に属する細菌類の菌体
を稀酸性あるいはアルカリ性水溶液で抽出した抽
出液の溶剤沈澱物を有効成分とする抗腫瘍性剤で
ある。本発明に使用する菌株として、その菌体を回収
するために使用し得る菌株は、コリネバクテリウ
ム属、ミクロバクテリウム属に属するグルタミン
酸、リジンなどのアミノ酸生産菌株その他広く醗
酵工業において用いられる菌株が挙げられ、それ
らのうちの入手可能な公知菌としては、コリネバ
クテリウム・アセトアシドフイラム
（Corynebacterium acetoacidophilum）ATCC
13870及びミクロバクテリウム・アムモニアフイ
ラム（Microbacterium ammoniaphilum）ATCC
21490がある。これらの菌体より本発明の抗腫瘍性剤を得るに
際しては、グルタミン酸などのアミノ酸醗酵やそ
の他の醗酵によつて得られた菌体も使用すること
ができるし、また、これらの菌体は菌株を培養す
ることによつても得られる。この培養は通常のコ
リネバクテリウム属及びミクロバクテリウム属菌
株の培養に用いる醗酵方法を用いることができ
る。この場合の培地組成としては、資化し得る栄
養物質を使用するが、炭素源としてグルコース、
蔗糖、澱粉加水分解物、麦芽糖、甘蔗廃糖蜜、甜
菜糖廃糖蜜などの糖質物質、或いは酢酸などの有
機酸、エチルアルコール等が用いられ、窒素源と
してはアンモニア、硫安、硝安、燐安などの無機
窒素源及び尿素、大豆粕、綿実粕、ペプトン、コ
ーンステイープリカー、酵母エキスなどの有機窒
素源、及び無機塩類などの微量必須要素を加えた
ものが使用され得、培養条件も通常のコリネバク
テリウム属、ミクロバクテリウム属菌株の培養条
件と同様である。これらの増殖培地から菌体を回
収するには公知の方法の何れも採用することがで
きる。通常は遠心分離によつて6000〜12000r.p.
m.で遠沈処理し、水で洗浄して遠沈処理を繰返
すことにより、本発明における抽出のための菌体
を得ることができる。かくして得られた菌体を稀酸性水溶液で抽出す
るには、酸としては塩酸、硫酸などの無機酸、酢
酸などの有機酸を用いるのが好適である。硫酸の
場合は大体0.1N乃至1Nの濃度のもので抽出す
る。抽出時間、温度などは使用する酸の濃度によ
り適宜変えられる。例えば低濃度の場合は、80℃
位までに加温し、高濃度の場合は常温で行い、抽
出時間は30分乃至１昼夜撹拌しながら保持する。
かくして抽出された抽出液を遠心分離により分離
し、これを溶剤沈澱に付す。これに用いられる溶
剤はアセトン、アルコール等の水混和性溶剤であ
る。抽出液に上記溶剤（好適にはエタノール等の
低級アルコール）を加え沈澱物を生成せしめ採取
する。この沈澱物は必要に応じ純水に懸濁させ、
純水に対して透析し、透析内液を減圧濃縮、凍結
乾燥し本発明の有効成分である物質を得る。また、菌体をアルカリ性水溶液で抽出するに
は、アルカリとしては苛性ソーダ、苛性カリ等の
アルカリ金属水酸化物、アンモニア等が好適であ
る。この塩基性化合物の５％乃至30％程度の水溶
液をアルカリ性水溶液として用いる。上記菌体を
このアルカリ性水溶液で抽出する場合、低濃度の
時は若干加温し、高濃度の場合は常温で行われ
る、例えば常温で30〜15％濃度のアルカリ水溶液
で抽出するときは一夜乃至一昼夜撹拌しつゝ抽出
を行う。かくして抽出された抽出液を遠心分離等
により分離し酸性化の後、これを溶剤沈澱に付
す。この操作溶剤は前述の酸性水溶液で行つた場
合と同様である。かくして得た、稀酸性水溶液抽出物およびアル
カリ性水溶液抽出物の物理化学的状況を下記に示
す。

【表】

【表】以上の如くして得られた本発明の抗腫瘍性剤の
有効成分物質の組成を確かめるため、上記のコリ
ネバクテリウム・アセトアシドフイラム
ATCC13870から得た抽出物のうちアルカリ性水
溶液抽出物質を水可溶性画分、水不溶性画分に分
け、水可溶性画分を、DEAE−セフアデツクスＡ
−50によるカラムクロマトグラフイーによつて分
画した。これを第１図に示す。図中黒丸はコマー
シ・ブリアント・ブルーで発色させた595nｍに
おける蛋白質の吸光度カーブで、白丸はアンスロ
ン硫酸法による620nｍにおける糖の吸光度カー
ブ、白四角は260nｍにおける核酸の吸光度カー
ブである。更に、このDEAE−セフアデツクスＡ
−50によるカラムクロマトグラフイーでピークを
示すＦ−ａ画分及びＦ−ｂ画分をセフアデツクス
Ｇ−50によるカラムクロマトグラフイーによつて
分画した。そのＦ−ａ部分の吸光度カーブを第２
図に示す。図中黒丸、白丸、白四角は前述と同様
である。クロマトグラフイーでピクを示す部分は
Ｆ−ａ−１及びＦ−ａ−２の２画分である。第１図に示されるＦ−ｂ画分のセフアデツクス
Ｇ−50によるゲル過を行つた吸光度カーブを第
３図に示す。図中黒丸、白丸、白四角は前述と同
様である。このゲル過でＦ−ｂ−１、Ｆ−ｂ−
２、Ｆ−ｂ−３が得られる。Ｆ−ａ−１画分は中
性糖からなりその糖組成はアラビノース及びマン
ノースが主体である。更に、上記のミクロバクテリウム・アムモニア
フイラムATCC21490から得た抽出物のうちアル
カリ性水溶液抽出物質を水可溶性画分、水不溶性
画分に分け、水可溶性画分を、DEAE−セフアデ
ツクスＡ−50によるカラムクロマトグラフイーに
よつて分画した。これを第４図に示す。図中黒丸
はコマーシ・ブリリアント・ブルーで発色させた
595nｍにおける蛋白質の吸光度カーブで、白丸
はアンスロン硫酸法による620nｍにおける糖の
吸光度カーブ、白四角は260nｍにおける核酸の
吸光度カーブである。更に、このDEAE−セフア
デツクスＡ−50によるカラムクロマトグラフイー
でピークを示すＦ−ａ画分及びＦ−ｂ画分をセフ
アデツクスＧ−50によるカラムクロマトグラフイ
ーによつて分画した。そのＦ−ａ部分の吸光度カ
ーブを第５図に示す。図中黒丸、白丸、白四角は
前述と同様である。クロマトグラフイーでピーク
を示す部分はＦ−ａ−１及びＦ−ａ−２の２画分
である。第４図に示されるＦ−ｂ画分のセフアデツクス
Ｇ−50によるゲル過を行つた吸光度カーブを第
６図に示す。図中黒丸、白丸、白四角は前述と同
様である。このゲル過でＦ−ｂ−１、Ｆ−ｂ−
２、Ｆ−ｂ−３が得られる。Ｆ−ａ−１画分は中
性糖からなりその糖組成はアラビノース及びマン
ノースが主体である。次に菌体からの酸性、アルカリ性水溶液抽出物
を用いて抗腫瘍性を試験した結果を示す。本試験は試験動物としてddY♀の５週令マウス
中から20〜25ｇのものを選びザルコーマ
（Sarcoma）−180を植え継ぎして１週間後のもの
を細胞数10⁵となるように生理食塩水のりん酸バ
ツフア（PBS^(-)）で稀釈して腹腔内に移植する。
この動物に対して、後記実施例１及び２と同様の
方法で得た菌体の0.1N塩酸抽出物、1.0N塩酸抽
出物、0.1N硫酸抽出物、1.0N硫酸抽出物、0.1N
苛性カリ抽出物、1.0N苛性カリ抽出物、0.1N苛
性ソーダ抽出物、1.0N苛性ソーダ抽出物を１
mg／0.2mlとなるように無菌的に生理食塩水のり
ん酸バツフアー（PBS^(-)）に懸濁し、0.2mlずつ
10回腹腔内に投与する。この投与はザルコーマー
180移植前に２回（６日、３日前）、移植後８回
（２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、
９日後）投与する。対照として生理食塩水のりん
酸バツフアー（PBS^(-)）のみを投与する。試験マ
ウス10頭中の100日以上の生存数を観察した結果
は下記表の通りであつた。

【表】更にコリネバクテリウム・アセトアシドフイラ
ムATCC13870及びミクロバクテリウム・アムモ
ニアフイラムATCC21490の菌体よりのアルカリ
性水溶液抽出物質中のDEAE−セフアデツクスＡ
−50カラムクロマトグラフイーにより分画し、こ
れを更にセフアデツクスＧ−50によるカラムクロ
マトグラフイーによつて分画した画分、Ｆ−ａ−
１、Ｆ−ｂ−１、Ｆ−ｂ−２の抗腫瘍効果を同様
に観察した結果を下記第３表に示す。

【表】前記の表に示すように100日後、対照区の全部
死亡に対し本発明の抗腫瘍性剤の有効成分は10頭
中かなりの頭数の生存数を示し、腹水癌に対して
顕著な抗腫瘍性を示した。本発明における細菌類の菌体の稀酸性あるいは
アルカリ性水溶液抽出液の溶剤沈澱物を投与する
場合は、注射用蒸留水又は生理食塩水に懸濁して
投与される。その場合の投与方法としては、動物
の場合、腹腔内注射、皮下注射、及び水可溶物は
静脈又は動脈への血管内注射及び局所投与等の注
射剤として、人の場合は静脈又は動脈への血管内
注射又は局所投与等の注射剤、又はカプセル等の
経口剤として投与され、その投薬量は、動物試験
の結果及び種々の状況を勘案して、総投与量が一
定量を越えない範囲で連続的又は間けつ的に投与
する。しかし、その投与量は、投与方法、患者又
は被処理動物の状況、例えば年令、体重、性別、
感受性、食餌、投与時間、併用する薬剤、患者又
はその病気の程度に応じた適宜に変えて投与する
ことは勿論であり、一定の条件の下における適量
と投与回数は専門医の適量決定試験によつて決定
されなければならない。毒性についていえば、
ddY♀５週令マウスを試験動物として静脈投与で
50mg／Kgを１日２回にわけて連続10日間投与した
が、10頭中10頭が生存した。実施例１酢酸アンモン５％、KH₂PO₄0.2％、MgSO₄・
7H₂O0.04％、ビタミンB₁10γ％、コーンスチー
プリカー0.2％、Fe⁺⁺、Mn⁺⁺各2ppm、「味液」
（大豆蛋白の加水分解物）0.1ml／dlの培地50mlを
500ml坂口コルベンに分注し、120℃、10分間殺菌
した。これに30℃ 24時間培養したコリネバクテ
リウム・アセトアシドフイラムATCC13870の１
白金耳を接種し、30℃で培養した。培養中は酢
酸、尿素またはアンモニアで培養液のPHを中性付
近に維持した。約72時間後、菌体を12000r.p.m.
で連続遠沈を行い、集菌し、6000r.p.m.10分２回
純水で洗浄した。この洗浄菌体を、予め100mlの
三角フラスコに最終濃度0.1Nとなるように硫酸
を加えておいた液に懸濁し、その後、0.2mlホル
マリンを加え、100mlとする。70℃、30分撹拌し
ながら抽出する。この抽出液を12000r.p.m.、30
分遠沈して、その上澄液を集め、最終濃度が85％
となるようにエタノールを加えて撹拌して沈澱物
を生ぜしめ、４℃で一夜放置する。この沈澱物を
6000r.p.m.で10分遠沈して集め、水道水で２日、
純水で１日透析の後、濃縮して凍結乾燥し、本発
明の抗腫瘍性物質を得る。また、同じ方法で培養
して得た菌体を集菌、洗浄後、この洗浄菌体を、
予め100mlの三角フラスコに最終濃度0.5Nとなる
ように苛性ソーダを加えておいた液に懸濁し、
100mlとする。室温で３時間撹拌しながら抽出す
る。この抽出液を12000r.p.m.、30分遠沈して、
その上澄液を集め、塩酸でPH６に酸性化の後、最
終濃度が80％となるようにエタノールを加えて撹
拌して、４℃で一夜放置する。この沈澱物を
6000r.p.m.、10分遠沈して集め、水道水で２日、
純水で１日透析の後、濃縮して凍結乾燥し、本発
明の抗腫瘍性物質を得る。前記抗腫瘍性物質各々10mgを各２mlに懸濁させ
て注射剤とした。実施例２グルコース10％、硫酸アンモニウム４％、
KH₂PO₄0.1％、硫酸マグネシウム・7H₂O0.04
％、ビオチン300μｇ／、ビタミンB₁塩酸塩
200μｇ／、Fe⁺⁺及びMn⁺⁺各2ppm、味液（大
豆蛋白の加水分解物）２ml／及び炭酸カルシウ
ム５％からなる培地50mlを500ml容坂口コルベン
に分注し、120℃10分間殺菌した。これに30℃、
２時間培養したミクロバクテリウム・アムモニア
フイラムATCC21490の１白金耳を接種し、30℃
で培養した。培養中アムモニアでPHを中性付近に
維持しながら48時間培養を続けた。培養終了後実施例１と同様に処理し本発明の抗
腫瘍性物質を得ることができた。このうち、乾燥
菌体１グラム当りより抽出したアルカリ性水溶液
抽出物の凍結乾燥品130mgをアルカリ（0.1N苛性
ソーダ）水溶液に溶解し、DEAE−セフアデツク
スＡ−50によるカラムクロマトグラフイーによつ
て分画した。樹脂に吸着した画分を先ず水にて溶
出し、水可溶性画分（Ｆ−ａ部分）を採取し、更
に1.5モルの濃度勾配をつけた食塩水で水不溶性
画分（Ｆ−ｂ部分）を採取した。更に、前記のＦ
−ａ部分及びＦ−ｂ部分を、セフアデツクスＧ−
50によるカラムクロマトグラフイーによつて分画
し、それぞれピークを示すＦ−ａ−１、Ｆ−ａ−
２、Ｆ−ｂ−１、Ｆ−ｂ−２及びＦ−ｂ−３部分
を得た。その各々をエタノールにて沈澱を生成せ
しめ、これを採取し、水道水で48時間、純水で24
時間透析し、濃縮後凍結乾燥し、前記抗腫瘍性物
質各々15.5mg、２mg、16.2mg、24.2mg、及び1.5mg
を得た。これらを各々10mgを各２mlに懸濁させ注射剤と
した。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明のコリネバクテリウム・アセト
アシドフイラムATCC13870の菌体のアルカリ性
水溶液抽出物質の水可溶性画分を、DEAE−セフ
アデツクスＡ−50イオン交換クロマトグラフイー
に供した吸光度曲線を示す。第２図は第１図のＦ
−ａ画分をセフアデツクスＧ−50によるカラムク
ロマトグラフイーに供した吸光度曲線を示す。第
３図は第１図のＦ−ｂ画分をセフアデツクスＧ−
50によるカラムクロマトグラフイーに供した吸光
度曲線を示す。第４図は本発明のミクロバクテリ
ウム・アムモニアフイラムATCC21490の菌体の
アルカリ性水溶液抽出物質の水可溶性画分を、
DEAE−セフアデツクスＡ−50イオン交換クロマ
トグラフイーに供した吸光度曲線を示す。第５図
は第４図のＦ−ａ画分をセフアデツクスＧ−50に
よるカラムクロマトグラフイーに供した吸光度曲
線を示す。第６図は第４図のＦ−ｂ画分をセフア
デツクスＧ−50によるカラムクロマトグラフイー
に供した吸光度曲線を示す。

Claims

【特許請求の範囲】

１コリネバクテリウム（Corynebacterium）属
又はミクロバクテリウム（Microbacterium）属
の細菌類の菌体を稀酸性あるいはアルカリ性水溶
液で抽出した抽出液の溶剤沈澱物を有効成分とす
る抗腫瘍性剤。