JPH08157372A - 新規抗ｈｉｖ剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 下記一般式（Ｉ）で示される５′位末端リン
酸化ホスホロチオエート結合型オリゴデオキシヌクレオ
チドから選択される１種または２種以上を有効成分とし
て含有する抗ＨＩＶ剤。 ｐ（Ｇｓ）_ｎＧ （Ｉ） （式中、Ｇはデオキシグアノシン構造を表し、ｓは隣接
するＧとエステル結合を形成しているホスホロチオリン
酸残基を表し、各ｓは、式中向かって左側のＧとはその
３′位水酸基と、また右側のＧとはその５′位水酸基と
それぞれエステル結合を形成しているものであり、左端
のｐは隣接するＧとエステル結合を形成しているリン酸
残基を表し、５′位末端水酸基とモノエステル結合を形
成しているものであり、ｎは２ないし７の整数を表
す）。 【効果】 ＨＩＶ（ＡＩＤＳウィルス）に起因する疾
患、ＡＩＤＳ、ＡＲＣの治療に有効である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【技術分野】本発明は、特に、ＨＩＶ（Ｈｕｍａｎ Ｉ
ｍｍｎｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙＶｉｒｕｓ）による
疾患において、優れた抗ウィルス作用を示す５′位末端
リン酸化ホスホロチオエート結合型オリゴデオキシヌク
レオチドを有効成分とする抗ＨＩＶ剤に関するものであ
る。

【０００２】

【背景技術】オリゴホモデオキシヌクレオチドに関する
従来の知見としては、１５塩基および２０塩基のホスホ
ロチオエート結合体にＨＩＶ増殖阻止作用があることが
アグラワル等により報告され、その効果は、２０もしく
は１５塩基という長さのホモオリゴマーであることに起
因し塩基の種類に依存しないと報告されている（Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５，７０
７９，１９８８）。また、マツクラ等により２８塩基の
デオキシチジンホスホロチオエート結合体にＨＩＶ増殖
阻止作用があることが報告されている（Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７７０６，１
９８７）。

【０００３】さらに最近、ワイアット等により８塩基の
ホスホロチオエート結合体にＨＩＶ増殖阻止作用がある
ことが報告された（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ，９１，１３５６，１９９４）。しかし、
これらの作用点はＨＩＶ感染初期であり、ＡＩＤＳ発症
と関連のある慢性的感染には無効であるとされている。
また、いずれも８塩基以上の長鎖ヌクレオチドのため、
これを調製する上で問題があり、生体内に投与した場合
に吸収性、安定性の点においても問題がある。

【０００４】本発明者は、かかる問題点を解決するた
め、ＨＩＶ増殖抑制作用を有するオリゴヌクレオチド化
合物の低分子化について種々検討を重ね、先に４〜８塩
基の短鎖オリゴデオキシグアニル酸および２〜８塩基の
短鎖オリゴグアニル酸がＨＩＶ増殖阻止作用を有するこ
とを見出した。本発明者は、さらに研究を重ねた結果、
５′位末端リン酸化ホスホロチオエート結合型オリゴデ
オキシグアニル酸が初期感染および慢性感染のいずれに
おいても優れたＨＩＶ増殖阻止作用を有することを見出
した。本発明はかかる知見に基づくものである。

【０００５】

【発明の開示】本発明は下記一般式（Ｉ）で示される
５′末端リン酸化ホスホロチオエート結合型オリゴデオ
キシヌクレオチドから選択される１種または２種以上を
有効成分として含有することを特徴とする抗ＨＩＶ剤 ｐ（Ｇｓ）_ｎＧ （Ｉ） （式中、Ｇはデオキシグアノシン構造を表し、ｓは隣接
するＧとエステル結合を形成しているホスホロチオリン
酸残基を表し、各ｓは、式中向かって左側のＧとはその
３′位水酸基と、また右側のＧとはその５′位水酸基と
それぞれエステル結合を形成しているものであり、左端
のｐは隣接するＧとエステル結合を形成しているリン酸
残基を表し、５′位末端水酸基とモノエステル結合を形
成しているものであり、ｎは２ないし７の整数を表す）
を提供するものである。

【０００６】本発明の抗ＨＩＶ剤の有効成分である上記
一般式（Ｉ）で表わされる５′位末端リン酸化ホスホロ
チオエート結合型オリゴデオキシヌクレオチドは、一般
にオリゴヌクレオチド合成に通常用いられる手法により
合成することができる（Ｓｃａｒｉｎｇｅ ｅｔ ａ
ｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ１８ ５４３３；Ｄａ
ｍｈａ ＆ Ｏｇｉｌｖｉｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ
Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０８１；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ａｎ
ｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ ５４ ３６７）。

【０００７】たとえば、ホスホアミダイト法で固相合成
する場合について詳細に説明すると、目的とするＤＮＡ
の３′位末端ヌクレオシドが、市販のコントロールポア
グラス（ＣＰＧ）等の支持体に結合したものを出発原料
とし、このヌクレオシドの５′位水酸基の保護基である
４，４′−ジメトキシトリチル基をトリクロロ酢酸等で
除き、３′位末端側からの２番目に相当する市販の単量
体としての核酸塩基のアミノ基をイソブチル基で保護し
たアミダイト試薬（５′−ｏ−ジメトキシトリチル−
３′−メトキシ−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノホスフ
ィンデオキシヌクレオシド）を、テトラゾールを縮合剤
として縮合させる。この際、未反応の５′位末端水酸基
は、無水酢酸、ジメチルアミノピリジン等によるアセチ
ル化等により保護しておくことが望ましい。つぎに、テ
トラエチルチウラムジスルヒド（または３Ｈ−１，２−
ベンゾジチオル−３−オン １，１−ジオキサイド）を
用いてリン部分の硫化を行ない、ホスホロチオトリエス
テル体に導く。この後、上記一般式（Ｉ）のｎが３〜８
の各オリゴヌクレオチドについては、以上の反応を目的
とする鎖長になるまで繰り返した後、最終的には、５′
位末端にリン酸化試薬（２−〔２−（４，４′−ジメト
キシトリチロキシ〕エチルスルホニル−（２−シアノエ
チル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）−ホスホラミダイ
ト）を縮合させた後、ヨウ素を用いてリン部分の酸化を
行ない、リン酸トリエステル体に導き、次にチオフェノ
ール処理により、各インターヌクレオチドをトリエステ
ル体からジエステル体に変換し、また、アンモニア処理
により、支持体からの離脱と同時に塩基部の脱保護基を
行ない、かくして、目的とする５′位末端リン酸化ホス
ホロチオエート結合型オリゴデオキシヌクレオチドを得
る。

【０００８】〔実験例〕次に実験例を挙げ、本発明をさ
らに詳しく説明するが、本発明の趣旨はこれら実験例に
より制約されるものではない。 〈ＭＴ−４細胞（Ｔ細胞系）を用いた抗ＨＩＶ活性試
験〉予め段階希釈した各種オリゴデオキシヌクレオチド
が入っている９６穴マイクロプレートにＭＴ−４細胞を
６×１０^４細胞／穴の量で撒き、さらにエイズウィルス
（ＨＩＶ−１（ＩＩＩＢ）またはＨＩＶ−２（ＲＯ
Ｄ）：約５０ＴＣＩＤ_５０（５０％培養細胞感染濃度）
／穴〕を感染させ、３７℃、５％二酸化炭素下で５日間
培養した。感染による細胞障害抑制判定は、５日間培養
後の生細胞をＭＴＴ法（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ，２０，３０９，１９８８）で測定することにより求
めた。この結果を表１および表２に示す。表中、表示し
た各オリゴヌクレオチドにおいて、式中、Ｇはヌクレオ
チド単位構造がデオキシグアノシン、Ａはデオキシアデ
ノシン、Ｃはデオキシシチジン、Ｔはチミジンを表し、
ｐはその５′位末端水酸基のリン酸モノエステルを表
し、各ｓは５′位と３′位の水酸基をつなぐホスホロチ
オエステル結合を表す。

【０００９】

【表１】

【００１０】

【表２】

【００１１】表１に示されているとおり、本発明の抗Ｈ
ＩＶ剤の有効成分である５′末端リン酸化ホスホロチオ
エート結合型オリゴグアニル酸は、ＨＩＶ−１に対し
て、３塩基でも効果が認められ、４〜８塩基ではさらに
優れた抗ＨＩＶ作用を示すことが認められた。なお１０
０μｇ／ｍｌの濃度において細胞毒性は示さなかった。
一方、ホスホロチオエート結合型オリゴデオキシアデニ
ル酸、デオキシチジン酸、チミジン酸オリゴデオキシヌ
クレオチドの６塩基の短鎖のものでは効果は認められな
いことからみて、ホスホロチオエート結合型オリゴデオ
キシグアニル酸の有効性が際だっていることを示してい
る。また表２に示されているとおり、本発明の５′位末
端リン酸化ホスホロチオエート結合型オリゴデオキシグ
アニル酸の４塩基体はＨＩＶ−２に対しても極めて優れ
た効果が認められた。

【００１２】〈ＨＩＶ−１慢性感染細胞を用いた抗ＨＩ
Ｖ活性試験〉本発明の抗ＨＩＶ剤の有効成分の１つであ
るホスホロチオエート結合型オリゴデオキシグアニル酸
の４塩基体について急性感染および慢性感染に対する活
性試験を行った。ＨＩＶが慢性的に感染しており培養液
中に常にＨＩＶを放出している細胞であるＨ９／ＩＩＩ
Ｂ細胞 （Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２４，４９７，１９８
４）を９６穴マイクロプレートに５×１０^４細胞／穴の
量で撒き、そこにホスホロチオエート結合型オリゴデオ
キシヌクレオチドを添加して、３７℃、５％二酸化炭素
下で５日間培養した。オリゴヌクレオチドは初日のみ、
あるいは２日毎に計３回添加した。培養液中に放出され
たＨＩＶ量をｐ２４抗原アッセイキット（コールター
社）を用いて測定した。またオリゴヌクレオチドの細胞
への障害を調べるため生細胞をＭＴＴ法で測定した。こ
の結果を表３に示す。表中、表示した各オリゴヌクレオ
チドにおいて、式中、Ｇはヌクレオチド単位構造がデオ
キシグアノシン、Ｔはチミジンを表し、ｐはその５′位
水酸基のリン酸モノエステルを表し、各ｓは５′位と
３′位の水酸基をつなぐホスホロチオエステル結合を表
す。

【００１３】

【表３】

【００１４】表３に示されているとおり、本発明の抗Ｈ
ＩＶ剤の有効成分である５′位末端リン酸化ホスホロチ
オエート結合型オリゴデオキシグアニル酸４塩基体は、
慢性感染ＨＩＶ−１に対しても、細胞毒性を示さない濃
度で抑制効果が認められた。このことは、ＡＩＤＳ治療
剤として優れた特性をもつことを示しているものであ
る。さらに表３に示されるように、また、ワイアット等
も報告しているようにホスホロチオエート結合型オリゴ
チミジン酸デオキシグアニル酸８塩基体（ＴｓＴｓＧｓ
ＧｓＧｓＧｓＴｓＴ）は１００μｇ／ｍｌの濃度で３回
投与しても抑制効果は認められず、慢性感染に対して無
効であり、本発明のｐＧｓＧｓＧｓＧがワイアットのそ
れよりも格段に有効であることが示された。

【００１５】〈ＨＩＶ−１感染後の種々の時間での薬物
添加による抗ＨＩＶ活性試験〉本試験では、５′位末端
リン酸化ホスホロチオエート結合型オリゴデオキシグア
ニル酸の４塩基体がＨＩＶ−１感染増殖生命環のどの過
程で作用して、抗ＨＩＶ活性を示すか試験を行った。Ｈ
９細胞をＨＩＶ−１感染させた後、９６穴マイクロプレ
ートに５×１０^４細胞／穴の量で撒き、種々の時間ごと
にホスホロチオエート結合型オリゴデオキシグアニル酸
を１００μｇ／ｍｌ添加して、３７℃、５％二酸化炭素
下で４８時間培養した。培養液中に放出されたＨＩＶ量
をｐ２４抗原アッセイキット（コールター社）を用いて
測定した。対照薬として作用点の判っている３′−デオ
キシ−３′−アジドチミジン、硫酸デキストラン（分子
量８０００）、ＨＩＶ−１プロテアーゼ阻害剤Ｒｏ ３
１−８９５９を比較のため用いた。この試験の結果を後
掲図１に示す。

【００１６】図１から明らかなように、硫酸デキストラ
ンは感染直後においては有効であるが、感染後４時間以
降の添加においては効果が弱められた。３′−デオキシ
−３′−アジドチミジンは感染後徐々に効果は薄れ、１
４時間以降では１次感染に対する効果は硫酸デキストラ
ンと同様認められなかった。ＨＩＶ−１プロテアーゼ阻
害剤Ｒｏ ３１−８９５９は２０時間後の添加まで充分
効果を認めた。本発明の５′位末端リン酸化ホスホロチ
オエート結合型オリゴグアニル酸の４塩基結合体は、感
染直後で最も高い効果を示し、その後の添加によりやや
効果が薄らぐものの２０時間後の添加においても充分な
効果が認められた。このように、本発明の有効成分であ
るホスホロチオエート結合型オリゴデオキシグアニル
酸、特にその４塩基結合体は、ＨＩＶ−１感染過程の少
なくとも２過程（感染初期とウィルス遺伝子が宿主細胞
遺伝子に統合された後期）において作用することが示唆
され、したがって多過程に作用する薬剤として、治療上
問題になる薬剤耐性ウィルスの出現が起こり難いという
効果も期待されるものである。

【００１７】以上詳細に述べたように、本発明の抗ＨＩ
Ｖ剤の有効成分である一般式（Ｉ）で表わされる５′位
末端リン酸化ホスホロチオエート結合型オリゴグアニル
酸は、極めて優れた抗ＨＩＶ作用を示し、その安全性に
ついては、５′位末端リン酸化ホスホロチオエート結合
型オリゴグアニル酸の４塩基結合したものを用いてマウ
スに２０ｍｇ／ｋｇの静脈内投与を行なってこれを確認
した。また、別の試験において同物質の１００ｍｇ／ｋ
ｇの経口投与において死亡例が認められず安全性の高い
ものであることが確認された。

【００１８】本発明に係る新規な抗ＨＩＶ剤は、ＡＩＤ
Ｓ等のレトロウィルス感染症治療剤として特に有用なも
のであり、その投与形態については、特定されず、公知
の医薬用担体を用いて適宜の剤形のものが選択して使用
され、その例としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細
粒剤、散剤などの経口投与剤や、注射剤、点滴用剤、坐
薬などの非経口投与剤とすることができる。経口剤とし
ての所要量は、患者の年齢、体重、疾患の程度により異
なるが、通常、成人での投与量は、０．１ｇ〜６ｇを１
日に数回に分けて服用する。

【００１９】上記の錠剤、カプセル剤、顆粒剤等の経口
投与剤を調製するには、例えば、デンプン、乳糖、白
糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、無機塩
類などの賦形剤を用いて常法に従って製造することがで
きる。この種の製剤には、前記賦形剤の他に適宜、結合
剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味
剤、着色剤、香料等を選択し、使用することができる。
それぞれの具体例は、以下に示すとおりである。

【００２０】〔結合剤〕デンプン、デキストリン、アラ
ビアゴム末、ゼラチン、ヒドロキシプロピルスターチ、
メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリ
ウム、ヒドロキシプロピルセルロース、結晶セルロー
ス、エチルセルロース、ポリビニルセルロース、マクロ
ゴール。 〔崩壊剤〕デンプン、ヒドロキシプロピルスターチ、カ
ルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチ
ルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロー
ス、低置換ヒドロキシプロピルセルロース。

【００２１】〔界面活性剤〕ラウリル硫酸ナトリウム、
大豆レシチン、ショ糖脂肪酸エステル、ポリソルベート
８０。 〔滑沢剤〕タルク、ロウ類、水素添加植物油、ショ糖脂
肪酸エステル、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレ
ングリコール。 〔流動性促進剤〕軽質無水ケイ酸、乾燥水素化アルミニ
ウムゲル、合成ケイ酸アルミニウム、ケイ酸マグネシウ
ム。

【００２２】前記の一般式（Ｉ）で表わされるオリゴデ
オキシヌクレオチドは、懸濁液、エマルジョン液、シロ
ップ剤、エリキシル剤としても投与することができ、こ
れらの各種剤形には、矯味矯臭剤、着色剤を含有させる
ことができる。非経口剤としての所要量は、患者の年
齢、体重、疾患の程度によって異なるが、通常、成人で
前記のオリゴヌクレオチド１日１〜１００ｍｇ程度の量
であり、静注、点滴静注、皮下注射、筋肉注射により投
与される。

【００２３】この非経口剤は慣用の方法で製造すること
ができる。その場合、希釈剤としては、一般に、注射用
蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、注射用植物油、
ゴマ油、ラッカセイ油、ダイズ油、トウモロコシ油、プ
ロピレングリコール、ポリエチレングリコール等を用い
ることができる。また、必要に応じて、殺菌剤、防腐
剤、安定剤を加えることができる。この非経口剤は、安
定性の観点からは、バイアル等に充填した後、冷凍し、
通常の凍結乾燥技術により水分を除去し、使用時に、こ
の凍結乾燥物から液剤を再調製することができる。製剤
化に際しては、必要に応じて、適宜、等張化剤、安定
剤、防腐剤、無痛化剤等を加えることもできる。その他
の非経口剤の例としては、外用液剤、軟膏等の塗布剤、
直腸投与のための坐剤等が挙げられ、これらは、いずれ
も慣用の方法で製造することができる。

【００２４】

【実施例】次に実施例を示し、本発明を詳細に説明する
が、下記の実施例により本発明は制限されるものではな
い。

【００２５】上記の処方に従ってとおよびの一部
を均質になるまで混合し、圧縮成型した後、粉砕し、こ
れにの残量ととを加えて混合し、打錠機にて圧縮成
型して、一錠２００ｍｇの錠剤を得た。この一錠中に
は、ｐＧｓＧｓＧｓＧｓＧ２０ｍｇが含有されている。
この錠剤は、成人１日４〜８錠を数回に分けて服用され
る。

【００２６】

【００２７】上記の処方に従ってとととを均質に
なるまで混合し、常法により捏和し、押し出し造粒機に
より、乾燥、破砕した後、これにととを混合し、打
錠機にて圧縮成型して、一錠２００ｍｇの錠剤を得た。
この一錠中には、ｐＧｓＧｓＧｓＧ ２０ｍｇが含有さ
れている。この錠剤は、成人１日４〜８錠を数回に分け
て服用される。

【００２８】 に対し、ととを溶解させた後、５ｍｌのアンプル
に注入し、１２１℃で１５分間加熱滅菌を行って注射剤
を得た。

【００２９】

【発明の効果】本発明に係る新規な抗ＨＩＶ剤は、ＨＩ
Ｖ（ＡＩＤＳウィルス）に起因する疾患、ＡＩＤＳ、Ａ
ＲＣの治療に有効である。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＨＩＶ−１感染後の種々の時間での各種薬物添
加による抗ＨＩＶ活性試験の結果を示したものである。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記一般式（Ｉ）で示される５′位末端
   リン酸化ホスホロチオエート結合型オリゴデオキシヌク
   レオチドから選択される１種または２種以上を有効成分
   として含有することを特徴とする抗ＨＩＶ剤。 ｐ（Ｇｓ）_ｎＧ （Ｉ） （式中、Ｇはデオキシグアノシン構造を表し、ｓは隣接
   するＧとエステル結合を形成しているホスホロチオリン
   酸残基を表し、各ｓは、式中向かって左側のＧとはその
   ３′位水酸基と、また右側のＧとはその５′位水酸基と
   それぞれエステル結合を形成しているものであり、左端
   のｐは隣接するＧとエステル結合を形成しているリン酸
   残基を表し、５′位末端水酸基とモノエステル結合を形
   成しているものであり、ｎは２ないし７の整数を表
   す）。
2. 【請求項２】 前記一般式（Ｉ）のｎが３で示される
   ５′位末端リン酸化ホスホロチオエート結合型オリゴデ
   オキシヌクレオチドを有効成分として含有する請求項１
   に記載の抗ＨＩＶ剤。