JPH08196276A - 光合成細菌のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 ロドシュードモナス（Rhodopseudomonas）属
に属する光合成細菌由来のホスホエノールピルビン酸カ
ルボキシラーゼをコードする遺伝子（ｐｐｃ遺伝子）を
提供する。 【構成】 Rhodopseudomonas sp. No.7株の染色体ＤＮ
Ａファージライブラリーから、各種ｐｐｃ遺伝子の相同
性の高い部位のアミノ酸配列に基づいて作製したオリゴ
ヌクレオチドプローブを用いたプラークハイブリダイゼ
ーションにより、ｐｐｃ遺伝子を得る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ロドシュードモナス
（Rhodopseudomonas）属に属する光合成細菌、特にRhod
opseudomonas sp. No.7株由来のホスホエノールピルビ
ン酸カルボキシラーゼ（phosphoenolpyruvate carboxyl
ase）（ＥＣ４．１．１．３１）をコードするＤＮＡに
関する。

【０００２】

【従来の技術】ホスホエノールピルビン酸カルボキシラ
ーゼ（以下これを「ＰＥＰＣ」と略称することがある）
は、解糖系の代謝中間化合物であるホスホエノールピル
ビン酸に二酸化炭素（重炭酸イオン）を固定することに
よりオキザロ酢酸を生成し、トリカルボン酸（ＴＣＡ）
サイクルに４炭素（Ｃ₄）化合物を補充する生理的役割
を果たすとされている。ＴＣＡサイクルはアミノ酸等各
種有用物質生合成系において重要な代謝経路である。該
遺伝子を利用することにより、ＴＣＡサイクルへの物質
供給が強化され、アミノ酸等有用物質生産能の増強、菌
体収率の向上等が期待される。また、二酸化炭素を有機
化合物へ固定する触媒機能を有することから、地球環境
保全への寄与も期待できる。

【０００３】ホスホエノールピルビン酸カルボキシラー
ゼは大部分の細菌、原生動物、すべての植物において存
在が確認されている。該酵素をコードする遺伝子に関し
ては、高等植物に関し多数研究されているものの、細菌
に関しては、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）
由来の遺伝子［J.Biochem.，９５，９０９−９１６，１
９８４参照］及びコリネバクテリアム・グルタミカム
（Corynebacterium glutamicum）由来の遺伝子[Gene, 7
7, 237-251(1989)]が単離されているのみである。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】エシェリヒア・コリ
（Escherichia coli）由来のＰＥＰＣに関しては、該酵
素の反応機構等の基礎的研究が精力的に行われているも
のの、本発明者らが知る限り工業的観点からの利用につ
いては殆ど検討されていない。さらに光合成細菌由来の
ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（以
下、これを「ｐｐｃ遺伝子」と略称することがある。）
に関する基礎的研究、工業的応用検討は未だ十分ではな
く、解明すべき諸種の課題が山積されている。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、産業上重
要である光合成細菌が有するｐｐｃ遺伝子の単離及び工
業的応用を目的とし鋭意研究を重ねた結果、光合成細菌
（Rhodopseudomonas sp.）No.7株からｐｐｃ遺伝子が単
離可能であることを見いだし、本発明を完成するに至っ
た。

【０００６】すなわち本発明は、ロドシュードモナス
（Rhodopseudomonas）属に属する光合成細菌由来のホス
ホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードするＤ
ＮＡである。

【０００７】また本発明は、配列番号５に示すアミノ酸
配列を有し、ホスホエノールピルビン酸に二酸化炭素を
固定することによりオキザロ酢酸を生成する活性を実質
的に害さないアミノ酸残基の置換、欠失、挿入を有して
もよいホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコ
ードするＤＮＡを提供する。

【０００８】本発明は、上記ＤＮＡの具体的態様とし
て、配列番号５に示す塩基配列又はこれと実質的に同一
な塩基配列を有するＤＮＡを提供する。以下、ホスホエ
ノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードするＤＮＡ
をｐｐｃ遺伝子または本発明のＤＮＡともいう。

【０００９】以下、本発明について詳細に説明する。本
発明の「ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼを
コードするＤＮＡ（ｐｐｃ遺伝子）」とは、ホスホエノ
ールピルビン酸に二酸化炭素を固定化しオキザロ酢酸を
生成する反応を触媒する酵素をコードするＤＮＡであ
り、更にこれに５’非翻訳領域、３’非翻訳領域、プロ
モーター等を含むＤＮＡを含んでいてもよい。

【００１０】本発明のｐｐｃ遺伝子の塩基配列として
は、配列番号５のアミノ酸配列中のアミノ酸番号１〜ア
ミノ酸番号９３６に示すアミノ酸配列をコードし得る塩
基配列が挙げられる。また、本発明のＤＮＡは、この配
列に限定されるものではなく、前記アミノ酸配列のう
ち、ホスホエノールピルビン酸に二酸化炭素を固定化し
オキザロ酢酸を生成する活性を実質的に害さない限り、
アミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は転移を有するＰＥ
ＰＣをコードするＤＮＡのいずれもが本発明の遺伝子Ｄ
ＮＡに包含されるものである。

【００１１】本発明のｐｐｃ遺伝子の塩基配列としてよ
り具体的には、配列番号５に示す塩基配列、及びこれと
実質的に同一な塩基配列が挙げられる。ここで実質的に
同一とは、本発明のＤＮＡがコードするＰＥＰＣが、配
列番号５に示す塩基配列によりコードされる酵素と酵素
学的性質が実質的に同一であることをいう。

【００１２】本発明のｐｐｃ遺伝子は、その塩基配列が
決定された後においては合成することも可能であるが、
通常は光合成細菌からクローニングされ、その供給源と
なるロドシュードモナスに属する光合成細菌としては、
Rhodopseudomonas sp. No.7株又はその誘導体［石田
ら、生物工学会誌、71, 397 (1993), Agric.Biol.Che
m., 47, 2747 (1983)]が好適である。これらの供給源微
生物からｐｐｃ遺伝子を調製するための基本操作の一例
を述べれば次のとおりである。

【００１３】ｐｐｃ遺伝子は、例えば上記Rhodopseudom
onas sp. No.7株の染色体上に存在し、この染色体由来
のＤＮＡバンクから以下に述べるハイブリダイゼーショ
ン法によりｐｐｃ遺伝子を分離・取得することができ
る。Rhodopseudomonas sp. No.7株は、通商産業省工業
技術院生命工学工業技術研究所にFERM P-14661の受託番
号で寄託されている。

【００１４】先ず、Rhodopseudomonas sp. No.7株の培
養物から染色体ＤＮＡを抽出する。この染色体ＤＮＡを
適当な制限酵素、例えばＥｃｏＲＩを用いて部分分解す
る。得られる様々なＤＮＡ断片をラムダファージベクタ
ー、例えばλＦＩＸII（東洋紡績（株）製）に挿入し、
ライブラリーを作成する。このファージベクターを用い
てエシェリヒア・コリ 例えば、Ｐ２３９２（Ausubel e
t al., Nucleic Acid Res.７,１５１３−１５２３）
に感染させ、寒天培地上に重層することによりプラーク
を形成させる。

【００１５】次いで、このプラーク中のファージＤＮＡ
をニトロセルロース膜に移し取り、このファージＤＮＡ
をニトロセルロース膜に固定し、公知の各種ｐｐｃ遺伝
子において保存されている領域、例えばエシェリヒア・
コリ由来のｐｐｃ遺伝子［J.Biochem.,95, 909-916,(19
84)］、及びトウモロコシ由来のｐｐｃ遺伝子［Plant.
Mol. Biol.,12, 579-589,(1989)］の共通領域配列であ
る後記配列表の配列番号３及び配列番号４に示す配列を
有する合成オリゴヌクレオチドをプローブとして用い
た、プラークハイブリダイゼーションを行う。尚、配列
番号３、４に示す配列中、RはAまたはG、YはCまたはTを
示し、Nはデオキシイノシンである。

【００１６】こうして、ファージベクターに挿入された
Rhodopseudomonas sp. No.7株の染色体由来のｐｐｃ遺
伝子を有するファージクローンを選択することができ
る。そのファージからファージＤＮＡを抽出し、挿入断
片を制限酵素ＥｃｏＲＩで切り出すことで本発明のＤＮ
Ａを含むＤＮＡ断片を取得することができる。

【００１７】このようにして得られるＤＮＡ断片の１つ
として、上記Rhodopseudomonas sp.No.7株染色体ＤＮＡ
を 制限酵素ＥｃｏＲＩの完全分解により切断して得ら
れる大きさが約６．８ｋｂのＤＮＡ断片を挙げることが
できる。

【００１８】この約６．８ｋｂのｐｐｃ遺伝子を含むＤ
ＮＡ断片を、各種の制限酵素で切断したときの認識部位
数および切断断片の大きさは、表１に示すとおりであ
る。

【００１９】

【表１】

【００２０】尚、本明細書において、制限酵素による
「認識部位数」は、ＤＮＡ断片またはこれを含むプラス
ミドを制限酵素の存在下で完全分解し、それらの分解物
をそれ自体既知の方法に従い１％アガロースゲル電気泳
動及び４％ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、分
離可能な断片の数から決定した値を採用した。

【００２１】また、「切断断片の大きさ」及びプラスミ
ドの大きさは、アガロースゲル電気泳動を用いる場合に
は、エシェリヒア・コリのラムダ・ファージ（λ ｐｈ
ａｇｅ）のＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄIIIで切断して得
られる分子量既知のＤＮＡ断片混合物を同一アガロース
ゲル上で泳動させたときの泳動距離で描かれる標準線に
基づき、また、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用い
る場合には、エシェリヒア・コリのファイ・エックス１
７４ファージ（φＸ１７４ ｐｈａｇｅ）のＤＮＡを制
限酵素ＨａｅIIIで切断して得られる分子量既知のＤＮ
Ａ断片混合物を同一ポリアクリルアミドゲル上で泳動さ
せたときの泳動距離で描かれる標準線に基づき、切断Ｄ
ＮＡ断片またはプラスミドの各ＤＮＡ断片の大きさを算
出することができる。尚、各ＤＮＡ断片の大きさの決定
において、１ｋｂ以上の断片の大きさについては、１％
アガロースゲル電気泳動によって得られる結果を採用
し、約０．１ｋｂから１ｋｂ未満の断片の大きさについ
ては４％ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって得ら
れる結果を採用することによって、正確な測定が可能と
なる。

【００２２】一方、上記のRhodopseudomonas sp. No.7
株の染色体ＤＮＡを 制限酵素ＥｃｏＲＩで直接切断す
ることにより切断して得られる大きさが約６．８ｋｂの
ＤＮＡ断片については、その塩基配列をプラスミドｐＧ
ＥＭ-Ｔベクタ−（PROMEGA製）を用いるジデオキシヌク
レオチド酵素法〔dideoxy chain termination法 Sange
r,F.et.al.，プロシーディング・オブ・ナショナル・ア
カデミー・オブ・サイエンス・オブ・ユナイテッド・ス
テイツ・オブ・アメリカ（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）,
Vol.74, p.5463 (1977)〕により決定することができ
る。

【００２３】このようにして決定された上記約６．８ｋ
ｂのＤＮＡ断片の塩基配列には、オープンリーデイング
フレームの存在が確認され、Rhodopseudomonas sp. No.
7株のｐｐｃ遺伝子（構造遺伝子）は、後記配列表の配
列番号５に示すアミノ酸配列中のアミノ酸番号１〜アミ
ノ酸番号９３６の９３６個のアミノ酸配列をコードする
２８１１塩基対（終止コドンを含む）から構成されてい
る。

【００２４】本発明のＤＮＡは、天然のRhodopseudomon
as sp. No.7染色体ＤＮＡから分離されたもののみなら
ず、通常用いられるＤＮＡ合成装置、例えばアプライド
・バイオシステムズ(Applied Biosystems)社製３９４Ｄ
ＮＡ／ＲＮＡシンセサイザーを用いて合成されたもので
あってもよい。

【００２５】また、前記の如くRhodopseudomonas sp. N
o.7株の染色体ＤＮＡから取得される本発明の二酸化炭
素固定に関与するｐｐｃ遺伝子は、ｐｐｃ遺伝子産物の
機能を実質的に損なうことがない限り塩基配列の一部の
塩基が他の塩基と置換されていてもよく、又は削除され
ていてもよく、或いは新たに塩基が挿入されていてもよ
く、さらに塩基配列の一部が転位されているものであっ
てもよい。更にまた、これらの塩基配列にハイブリダイ
ズし得る塩基配列であってもよい。このような塩基配列
の一部の塩基の置換、欠失、挿入または転移を有するＰ
ＥＰＣをコードするＤＮＡ、更にこれらの塩基にハイブ
リダイズし得るＰＥＰＣをコードするＤＮＡの何れも
が、本発明のＤＮＡに包含されるものである。

【００２６】本発明のｐｐｃ遺伝子は、適当な発現プラ
スミド、例えばｐＵＣ１１８（宝酒造製）へ挿入し、こ
れを用いて適当な宿主微生物、例えばエシェリヒア・コ
リＪＭ１０９（宝酒造製）を形質転換することにより発
現させることができる。発現したｐｐｃ遺伝子産物であ
るＰＥＰＣの確認は、該形質転換体から粗酵素液を抽出
し、Teraokaらの方法[H.Teraoka and K.Izui, Bioche
m., 13, 5121 (1974)]により直接ＰＥＰＣ活性を測定す
る、あるいはｐｐｃ遺伝子欠損変異株への上記発現プラ
スミドの導入による相補試験[Mol.Gen.Genet., 218, 33
0 (1989)]により確認することができる。

【００２７】本発明のｐｐｃ遺伝子及びこれを含むＤＮ
Ａ断片は、これを微生物に導入することにより、ＰＥＰ
Ｃの産生に利用することができる。本発明のＤＮＡ及び
これにより産生されるＰＥＰＣは、アミノ酸等の有用物
質の効率的生産に応用できることが期待される。

【００２８】以上に本発明を説明してきたが、下記の実
施例により更に具体的に説明する。しかしながら、実施
例は本発明の具体的な認識を得る一助とみなすべきのも
のであり、本発明の範囲を限定するものではないことを
理解すべきである。

【００２９】

【実施例】

〔実施例１〕 Rhodopseudomonas sp. No.7株由来のｐ
ｐｃ遺伝子のクローン化 （Ａ）Rhodopseudomonas sp. No.7の全ＤＮＡの抽出 完全合成培地Ａ培地１Ｌ［組成：MgCl₂・6H₂O 0.4g, NaC
l 0.1g, CaCl₂・2H₂O 0.05g, NaMoO₄・2H₂O 0.75mg, KH₂P
O₄ 1.0g, NH₄Cl 1.0g, （ビオチン 0.01mg,ニコチン酸
1.0mg, 塩酸チアミン 0.2mg, p-アミノ安息香酸
1.0mg）, （ZnSO₄・7H₂O 10mg, FeSO₄・7H₂O 7mg, Mg
Cl₂・4H₂O 1.5mg, CuSO₄・5H₂O 0.5mg, CoCl₂・6H₂O
0.2mg, EDTA・2Na 2.5mg）, ノルマルプロパノール
1.0g,NaHCO₃ 1.0g］に、Rhodopseudomonas sp. No.7株
を白金耳を用いて植菌し、対数増殖期後期まで３０℃で
光嫌気培養し、菌体を集めた。

【００３０】得られた菌体を１０ｍｇ／ｍｌの濃度にな
るよう、１０ｍｇ／ｍｌ リゾチーム、１０ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ、２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８.０）及び１ｍＭ
ＥＤＴＡ・２Ｎａの各成分を含有する溶液１５ｍｌ
（各成分の濃度は最終濃度である）に懸濁した。次にプ
ロテナーゼＫを最終濃度が１００μｇ／ｍｌになるよう
に添加し、３７℃で１時間保温した。さらにドデシル硫
酸ナトリウム（ＳＤＳ）を最終濃度が０.５％になるよ
うに添加し、５０℃で６時間保温して溶菌した。この溶
菌液に、等量のフェノール／クロロホルム溶液を添加
し、室温で１０分間ゆるやかに振盪した後、全量を遠心
分離（５,０００×ｇ， ２０分間，１０〜１２℃）し、
上清画分を分取した。この上清に酢酸ナトリウムを０.
３Ｍとなるよう添加した後、２倍量のエタノールをゆっ
くりと加えた。水層とエタノール層の間に存在するＤＮ
Ａをガラス棒でまきとり、７０％エタノールで洗浄した
後、風乾した。得られたＤＮＡに１０ｍＭトリス緩衝液
（ｐＨ７.５）−１ｍＭＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液５ｍｌを
加え、４℃で一晩静置し、以後の実験に用いた。

【００３１】（Ｂ）Rhodopseudomonas sp. No.7株由来
のｐｐｃ遺伝子のクローン化及びｐｐｃ遺伝子を保持す
る組換え体ファージの創製 上記（Ａ）項で得たRhodopseudomonas sp. No.7株の全
ＤＮＡ溶液の９０μｌを制限酵素ＥｃｏＲＩ（５ｕｎｉ
ｔｓ）を用い、３７℃で１０分間反応させて部分分解し
た。この分解ＤＮＡとλＦＩＸII／ＸＨＯＩ ＰＡＲＴ
ＩＡＬＦＩＬＬ-ＩＮ ＶＥＣＴＯＲ ＫＩＴ及び Ｋｌ
ｅｎｏｗ ｆｒａｇｍｅｎｔ（東洋紡績社製）を用い
て、λＤＮＡライブラリーを作成した。

【００３２】次に、λＤＮＡライブラリーファージ溶液
（２〜５×１０⁴ｐｆｕ;ＳＭ緩衝液希釈）とエシェリヒ
ア・コリ Ｐ２３９２の培養液を当量混合し３７℃で１
５分間保温した。これに５０℃にて保温しておいた ３
〜４ｍｌのλ培地（１％ Ｔｒｙｐｔｏｎ，０.５％Ｙｅ
ａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ，０.５％ＮａＣｌ，０.２％Ｍ
ｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ，０.５％Ａｇａｒ）を加えλプレー
ト（１％ Ｔｒｙｐｔｏｎ，０.５％ ＮａＣｌ，０.２％
ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ,１％Ａｇａｒ）に均一に塗布し、
３７℃で１２〜１６時間培養した。

【００３３】この培地上に形成されたプラークをニトロ
セルロースフィルター上に吸着させ、順次５分間ずつ以
下に示すイ)〜ハ)の試薬に浸した濾紙上にフィルターを
のせて処理した。

【００３４】イ)０.５Ｍ ＮａＯＨ，１.５Ｍ ＮａＣｌ ロ)０.５Ｍ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ （ｐＨ７.５），１.５Ｍ
ＮａＣｌ，０.００１Ｍ ＥＤＴＡ ハ)２×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣ；ＮａＣｌ １７５.３
ｇ，クエン酸三ナトリウム二水和物 ８８.２ｇを蒸留水
１Ｌに溶解）

【００３５】上記フィルターを風乾後、８０℃にて２時
間乾熱処理をしてＤＮＡを固定した。このフィルターを
用い、後記配列表の配列番号３及び配列番号４に示す配
列を有する合成オリゴヌクレオチドをプローブとして常
法［Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laborato
ry Press(1989)］に従い、プラークハイブリダイゼーシ
ョンを行った。上記プローブは、エシェリヒア・コリ、
トウモロコシ由来のｐｐｃ遺伝子から推定されるアミノ
酸配列のうち特に相同性の高い領域に注目し、そのアミ
ノ酸配列（配列番号１及び配列番号２）より推定される
塩基配列を有するオリゴヌクレオチドの混合物として、
アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）
社製３９４型ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザーを用いて合
成したものである。なお、プローブの合成にあたって
は、プローブ混合物中のオリゴヌクレオチドの種類が著
しくなりすぎないように、混合の度合いが高い部位には
デオキシイノシンを用いた。配列番号３、４に示す配列
中、RはAまたはG、YはCまたはTを示し、Nはデオキシイ
ノシンである。

【００３６】合成した上記オリゴヌクレオチドプローブ
は、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造製）及び
[γ-³²Ｐ]ＡＴＰを用いて５’末端リン酸基をラジオア
イソトープラベルし[Anal.Biochem., 158, 307-315 (19
86)参照]、ハイブリダイゼーションに供した。

【００３７】その結果、ハイブリダイゼーション陽性の
プラークを選択し、そこからファージＤＮＡを抽出し
て、制限酵素ＥｃｏＲＩで挿入断片を切り出した。その
長さをアガロースゲル電気泳動により測定したところ、
約６．８ｋｂであった。

【００３８】（Ｃ）ｐｐｃ遺伝子を含むＤＮＡ断片のサ
ブクローニング 上記（Ｂ）項で得られた長さが約６．８ｋｂのＤＮＡ断
片の制限酵素地図を作製するために、該ＤＮＡ断片溶液
１４μｌと、クローニングベクターｐＵＣ１１８（宝酒
造より市販）を制限酵素ＥｃｏＲＩで切断した後、 脱
リン酸化処理したものとを混合し、これに５０ｍＭトリ
ス緩衝液（ｐＨ７.６）,１０ｍＭジチオスレイトール,
１ｍＭ ＡＴＰ,１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂ および Ｔ４ＤＮ
Ａリガーゼ１ｕｎｉｔの各成分を添加し（各成分の濃度
は最終濃度である）、１６℃で１０時間反応させ、ＤＮ
Ａ断片とベクターを結合させて組換えプラスミドを作製
した。

【００３９】上記で得られた組換えプラスミド混液を用
い、塩化カルシウム法（Journal ofMolecular Biolog
y，５３,１５９,１９７０）により エシェリヒア・コリ
ＪＭ１０９（宝酒造社製）を形質転換し、アンピシリン
５０μｇ／ｍｌを含む培地［トリプトン１０ｇ，イー
ストエキストラクト ５ｇ，ＮａＣｌ ５ｇおよび寒天１
６ｇを蒸留水１Ｌに溶解］に塗抹した。

【００４０】この培地上で生育した株を常法により液体
培養し、得られた菌体よりプラスミドＤＮＡを抽出し
た。該プラスミドＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで切断
し、アガロースゲル電気泳動後ナイロン膜に移し取り、
上記（Ｂ）で作製した合成ＤＮＡプローブを用いハイブ
リダイゼーションを用った。その結果、プラスミドｐＵ
Ｃ１１８の長さ３．２ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ約
６．８ｋｂのＤＮＡ断片を確認した。こうして、ｐｐｃ
遺伝子を含むＤＮＡ断片をプラスミドベクター中にサブ
クローニングすることができた。

【００４１】上記のようにして得られた約６．８ｋｂの
ＤＮＡ断片を、ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄIIIまたはＳｐｈ
Ｉで切断し、各々の切断部位数及び切断断片の大きさを
測定した。その結果は、前記第１表に示したとおりであ
る。このＤＮＡ断片の制限酵素切断地図を図１に示す。

【００４２】また、上記で得た組換えプラスミドを各種
制限酵素で切断して、切断断片の大きさを測定した。そ
の結果を下記の表３に示す。

【００４３】

【表２】

【００４４】以上のようにして、ｐｐｃ遺伝子を含む大
きさが約６．８ｋｂのＤＮＡ断片（ＥｃｏＲＩ断片）を
得ることができた。

【００４５】〔実施例２〕 ｐｐｃ遺伝子の塩基配列の
決定 実施例１の（Ｃ）項で得られたｐｐｃ遺伝子を含む長さ
が約６．８ｋｂのＤＮＡ断片について、その塩基配列を
プラスミドｐＧＥＭ-Ｔベクタ−（PROMEGA製）を用いる
ジデオキシヌクレオチド酵素法〔dideoxy chain termin
ation法 Sanger,F.et.al.，プロシーディング・オブ・
ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ユ
ナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Proc.Natl.Ac
ad.Sci.USA）, Vol.74, p.5463 (1977)〕により決定し
た。このようにして決定された上記約６．８ｋｂのＤＮ
Ａ断片の塩基配列には、オープンリーデイングフレーム
の存在が確認され、Rhodopseudomonas sp. No.7株のｐ
ｐｃ遺伝子（構造遺伝子）は、後記配列表の配列番号５
に示すアミノ酸配列中のアミノ酸番号１〜アミノ酸番号
９３６の９３６個のアミノ酸配列をコードする２８１１
塩基対（終止コドンを含む）から構成されることが判明
した。

【００４６】〔実施例３〕 ｐｐｃ遺伝子の発現の確認 実施例１の（Ｃ）項で得られたｐｐｃ遺伝子を含む約
６．８ｋｂのＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドｐＵＣ
１１８を用い、塩化カルシウム法によりｐｐｃ遺伝子欠
損変異株であるエシェリヒア・コリ ＣＧＳＣ＃３５９
４株［Genetics, 51, 167 (1965)］を形質転換し、アン
ピシリン ５０μｇ／ｍｌを含む最少培地［組成：KH₂PO
₄ 2g, K₂HPO₄ 7g, (NH₄)₂SO₄ 1g, MgSO₄・7H₂O 0.1g, L
-スレオニン50mg, L-ロイシン 50mg, L-ヒスチジン 50m
g, L-アルギニン 50mg, チアミン塩酸塩 10mg, グルコ
ース 2g, 寒天 15g, 蒸留水 1L］に塗抹し、相補試験を
行った。同時に対照として挿入遺伝子を含まないプラス
ミドｐＵＣ１１８を用いて、同様に上記欠損変異株を形
質転換し、上記培地に塗抹した。

【００４７】その結果、上記約６．８ｋｂのＤＮＡ断片
を含むプラスミドが導入された形質転換体のみが培地上
に生育することが観察され、ｐｐｃ遺伝子が発現してい
ることが確認された。

【００４８】

【発明の効果】本発明により、光合成細菌Rhodopseudom
onas sp. No.7由来のホスホエノールピルビン酸カルボ
キシラーゼをコードする遺伝子（ｐｐｃ遺伝子）が提供
される。このｐｐｃ遺伝子及びＤＮＡ断片を導入した形
質転換株が生産するＰＥＰＣを利用することにより、ア
ミノ酸等の有用物質生産効率等が向上することが期待さ
れる。

【００４９】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：８ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：ペプチド 起源 生物名：Rhodopseudomonas sp. 株名：No.7

【００５０】配列番号：２ 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：ペプチド 起源 生物名：Rhodopseudomonas sp. 株名：No.7

【００５１】配列番号：３ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ヌクレオチド） 配列 GTNCTNACNG CNCAYCCNAC NGAR 24

【００５２】配列番号：４ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ヌクレオチド） 配列 TCNTGGATGG GNGGNGAY 18

【００５３】配列番号 ：５ 配列の長さ：２８１１ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：Rhodopseudomonas 株名 ：sp. No.7 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置 ：１−２８１１ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列： ATG TCG TCG TTG AAC CTG TCC GCC GGT CCT GAG CCG GTT TCC GAA CGT 48 Met Ser Ser Leu Asn Leu Ser Ala Gly Pro Glu Pro Val Ser Glu Arg 1 5 10 15 CCT GAC GAC GCG GCC GCG ATC GAG GCC GAG ACC CGG CTG CGC AAC GAC 96 Pro Asp Asp Ala Ala Ala Ile Glu Ala Glu Thr Arg Leu Arg Asn Asp 20 25 30 ATC CGG CTG CTC GGC CGG ATC CTC GGC GAC ACT GTG CGC GAG CAG GAA 144 Ile Arg Leu Leu Gly Arg Ile Leu Gly Asp Thr Val Arg Glu Gln Glu 35 40 45 GGA CAG ACC GTG TTC GAT CTG GTC GAG AAC ATC CGC CAG ACC TCG ATC 192 Gly Gln Thr Val Phe Asp Leu Val Glu Asn Ile Arg Gln Thr Ser Ile 50 55 60 CGA TTC CAC CGC GAC GAC GAC AAG ACC GCA CGC GCC GAG CTC GAA GCC 240 Arg Phe His Arg Asp Asp Asp Lys Thr Ala Arg Ala Glu Leu Glu Ala 65 70 75 80 ATC CTG GAC GGG ATG TCG ATC CCC GAC ACG ATG CGG ATC GTT CGC GCC 288 Ile Leu Asp Gly Met Ser Ile Pro Asp Thr Met Arg Ile Val Arg Ala 85 90 95 TTC AGC TAT TTC TCA CAC CTC GCC AAC ATC GCC GAA GAC CAG AAC AAC 336 Phe Ser Tyr Phe Ser His Leu Ala Asn Ile Ala Glu Asp Gln Asn Asn 100 105 110 ATC CGC CAG ATG CGC GCC GGC TCG ACC GCG GGC TCG GCG CCG CGT GCC 384 Ile Arg Gln Met Arg Ala Gly Ser Thr Ala Gly Ser Ala Pro Arg Ala 115 120 125 GGA CTG CTC GCC AAG ACG CTG GCG CAC GCG CGG CAG GAA GGC ATC AGC 432 Gly Leu Leu Ala Lys Thr Leu Ala His Ala Arg Gln Glu Gly Ile Ser 130 135 140 GCC GCG GAG CTG CGC AAG TTC TTT GCG ACC GCG CTG GTG AGC CCG GTG 480 Ala Ala Glu Leu Arg Lys Phe Phe Ala Thr Ala Leu Val Ser Pro Val 145 150 155 160 CTG ACC GCG CAT CCG ACC GAA GTG CGC CGC AAG AGC ACG ATG GAC CGC 528 Leu Thr Ala His Pro Thr Glu Val Arg Arg Lys Ser Thr Met Asp Arg 165 170 175 GAA ATG CAG ATC GCT TCG CTG CTC GAT CAG CGC GAC CGC GTT CAG CTC 576 Glu Met Gln Ile Ala Ser Leu Leu Asp Gln Arg Asp Arg Val Gln Leu 180 185 190 ACC GCC GAC GAA TGG GCC GAC AAC GAG GAG CGG CTG CGC CGC GCC GTC 624 Thr Ala Asp Glu Trp Ala Asp Asn Glu Glu Arg Leu Arg Arg Ala Val 195 200 205 GAG ACG CTG TGG AAG ACC AAC CTG CTG CGC CGG ACA AAG CTG ACG GTG 672 Glu Thr Leu Trp Lys Thr Asn Leu Leu Arg Arg Thr Lys Leu Thr Val 210 215 220 CTG GAT GAA GTC ACC AAC GGC CTG TCG TTC TAC GAC TAC ACC TTC CTG 720 Leu Asp Glu Val Thr Asn Gly Leu Ser Phe Tyr Asp Tyr Thr Phe Leu 225 230 235 240 CGC GAG GTG CCG CGG CTG CAC AGT GCG CTG GAA GAC CGG CTT GCC GAT 768 Arg Glu Val Pro Arg Leu His Ser Ala Leu Glu Asp Arg Leu Ala Asp 245 250 255 GCG GCC AAG GCC GAA GGC GTC AAC AGC GAC GGC GAG CTG GCG AGC TTC 816 Ala Ala Lys Ala Glu Gly Val Asn Ser Asp Gly Glu Leu Ala Ser Phe 260 265 270 CTG CGG ATG GGA AGC TGG ATC GGC GGC GAT CGC GAT GGC AAT CCG TTC 864 Leu Arg Met Gly Ser Trp Ile Gly Gly Asp Arg Asp Gly Asn Pro Phe 275 280 285 GTC ACT GCC GAG GTG CTG CAC GGC ACC TTG AAG CTG CAG AGC ACG CGC 912 Val Thr Ala Glu Val Leu His Gly Thr Leu Lys Leu Gln Ser Thr Arg 290 295 300 GTG CTG CGC TAT TAT CTC GAC GAG CTG CAC GAG CTT GGC TCG GAG TTG 960 Val Leu Arg Tyr Tyr Leu Asp Glu Leu His Glu Leu Gly Ser Glu Leu 305 310 315 320 TCG CTG GCG TCG CAT CTC GCC GGC ACC ACC GAC ACC GTC AAG GCG CTG 1008 Ser Leu Ala Ser His Leu Ala Gly Thr Thr Asp Thr Val Lys Ala Leu 325 330 335 GCC GAA ACC TCG CCC GAC ACC TCA CCG CAT CGC AAA TAC GAG CCG TAT 1056 Ala Glu Thr Ser Pro Asp Thr Ser Pro His Arg Lys Tyr Glu Pro Tyr 340 345 350 CGC CTC GCG GTG TCC GGC ATC TAC GCG CGG CTG GCA GCG ACC GCG CTC 1104 Arg Leu Ala Val Ser Gly Ile Tyr Ala Arg Leu Ala Ala Thr Ala Leu 355 360 365 AAG CTC GAG GTC GAG AAC CTC CGC GCG CCG GTC GGC GAG GCC GAG CCT 1152 Lys Leu Glu Val Glu Asn Leu Arg Ala Pro Val Gly Glu Ala Glu Pro 370 375 380 TAC GCC AGC GCG CAG GAC TTC AAA GCC GAT CTC GAC GCG ATC CAT CTG 1200 Tyr Ala Ser Ala Gln Asp Phe Lys Ala Asp Leu Asp Ala Ile His Leu 385 390 395 400 TCG CTC ACC CAG CAC AAT TCC GGT GTG ATC GCG CGC GGC CGG CTG CGC 1248 Ser Leu Thr Gln His Asn Ser Gly Val Ile Ala Arg Gly Arg Leu Arg 405 410 415 CAG CTC CGC CGC GCG ATC GAC TGC TTT GGC TTC CAT CTC GCC AGC CTC 1296 Gln Leu Arg Arg Ala Ile Asp Cys Phe Gly Phe His Leu Ala Ser Leu 420 425 430 GAC ATG CGG CAG AAC TCG GCG GTG CAC GAG CGC ACC ATT ACC GAG CTG 1334 Asp Met Arg Gln Asn Ser Ala Val His Glu Arg Thr Ile Thr Glu Leu 435 440 445 ATG GAC GCG GCG CGG CCC GGC ACC TCC TAT GCG ATG CTC GAC GAG GAA 1392 Met Asp Ala Ala Arg Pro Gly Thr Ser Tyr Ala Met Leu Asp Glu Glu 450 455 460 GCG CGG ATC GCG CTC TTG ATC AGC GAG CTG CGC AGC ACC CGG CCG CTG 1440 Ala Arg Ile Ala Leu Leu Ile Ser Glu Leu Arg Ser Thr Arg Pro Leu 465 470 475 480 ACC TCG ATG TTC GTC AAA TAC AGC GAC GAG ACG GTC GGC GAG CTT GCA 1488 Thr Ser Met Phe Val Lys Tyr Ser Asp Glu Thr Val Gly Glu Leu Ala 485 490 495 GTG TTC CGC GAA GCC GCG AAG GCG CAC GCG ACC TAC GGG GCG GCG GCG 1536 Val Phe Arg Glu Ala Ala Lys Ala His Ala Thr Tyr Gly Ala Ala Ala 500 505 510 ATC CCC CAA TGC ATC ATC TCG ATG ACC AAG GGC GTT TCC GAC CTC TTG 1584 Ile Pro Gln Cys Ile Ile Ser Met Thr Lys Gly Val Ser Asp Leu Leu 515 520 525 GAG GTC GCG GTG CTG CTC AAG GAA GTC GGG CTG ATC GAT CCG TCG GGG 1632 Glu Val Ala Val Leu Leu Lys Glu Val Gly Leu Ile Asp Pro Ser Gly 530 535 540 CGC AGC GCC ATC AAC GTG GTG CCG CTG TTC GAG ACC ATC GAG GAC CTG 1680 Arg Ser Ala Ile Asn Val Val Pro Leu Phe Glu Thr Ile Glu Asp Leu 545 550 555 560 CAG GCC TGC GCC AAG ATC ATG GAC CGG CTG CTG TCG ATC CCG GAA TAT 1728 Gln Ala Cys Ala Lys Ile Met Asp Arg Leu Leu Ser Ile Pro Glu Tyr 565 570 575 CGC CGG CTG GTC GAC AGC CGC GGC TCG GTG CAG GAG GTG ATG CTC GGC 1776 Arg Arg Leu Val Asp Ser Arg Gly Ser Val Gln Glu Val Met Leu Gly 580 585 590 TAC TCC GAC AGC AAT AAG GAC GGC GGC TTC GTC ACC TCG GGC TGG GAG 1824 Tyr Ser Asp Ser Asn Lys Asp Gly Gly Phe Val Thr Ser Gly Trp Glu 595 600 605 CTG TAC AAG GCC GAG ATC GGA CTG ATC GAG ATC TTC GAG CAC CAT GGC 1872 Leu Tyr Lys Ala Glu Ile Gly Leu Ile Glu Ile Phe Glu His His Gly 610 615 620 GTG CGG TTG CGG CTG TTC CAC GGC CGC GGC GGC TCG GTC GGC CGC GGC 1920 Val Arg Leu Arg Leu Phe His Gly Arg Gly Gly Ser Val Gly Arg Gly 625 630 635 640 GGC GGC CCG AGC TAC GAC GCC ATC GTG GCG CAG CCG GGT GGG GCG GTG 1968 Gly Gly Pro Ser Tyr Asp Ala Ile Val Ala Gln Pro Gly Gly Ala Val 645 650 655 AAC GGC CAG ATC CGC ATC ACC GAG CAG GGC GAG ATC ATC ACC AGG AAA 2016 Asn Gly Gln Ile Arg Ile Thr Glu Gln Gly Glu Ile Ile Thr Arg Lys 660 665 670 TAT TCC AAC GTC GAA GTC GGC CGC AAC AAC CTC GAG ATC CTC GCC GCC 2064 Tyr Ser Asn Val Glu Val Gly Arg Asn Asn Leu Glu Ile Leu Ala Ala 675 680 685 GCG ACG TTG GAA GCA AGC CTG CTG CAG CCG AAG CGG GTG GCG CCG CAT 2112 Ala Thr Leu Glu Ala Ser Leu Leu Gln Pro Lys Arg Val Ala Pro His 690 695 700 CGC GAT TAT CTC GAG GCG ATG GAG CAG CTC TCC GCG CTC GCC TTC AAG 2160 Arg Asp Tyr Leu Glu Ala Met Glu Gln Leu Ser Ala Leu Ala Phe Lys 705 710 715 720 GCG TAT CGC GGC CTG GTG TAC GAG ACC GAC GGA TTC GTC GAC TAC TTC 2208 Ala Tyr Arg Gly Leu Val Tyr Glu Thr Asp Gly Phe Val Asp Tyr Phe 725 730 735 TGG GCC TCG ACG GTG ATC AAC GAG ATC TCG ACG CTG AAC ATC GGC AGC 2256 Trp Ala Ser Thr Val Ile Asn Glu Ile Ser Thr Leu Asn Ile Gly Ser 740 745 750 CGT CCG GCC TCG CGC AAG AAA ACG CGC GCG ATC GAG GAC CTG CGC GCG 2304 Arg Pro Ala Ser Arg Lys Lys Thr Arg Ala Ile Glu Asp Leu Arg Ala 755 760 765 ATC CCC TGG GTA TTC TCG TGG GCG CAG TGC CGG CTG ATG CTG CCG GGC 2352 Ile Pro Trp Val Phe Ser Trp Ala Gln Cys Arg Leu Met Leu Pro Gly 770 775 780 TGG TAC GGT TTC GGC AGC GCG GTG TCG GCC TGG GTC ACC GCG CAT CCC 2400 Trp Tyr Gly Phe Gly Ser Ala Val Ser Ala Trp Val Thr Ala His Pro 785 790 795 800 GAG ACG GGC ATC GCC TTC CTG CAA AAG ATG TAT CAG GAG TGG CCG TTC 2448 Glu Thr Gly Ile Ala Phe Leu Gln Lys Met Tyr Gln Glu Trp Pro Phe 805 810 815 TTT CGC ACG CTG CTG TCG AAC ATG GAC ATG GTG CTG TCG AAG AGC TCG 2496 Phe Arg Thr Leu Leu Ser Asn Met Asp Met Val Leu Ser Lys Ser Ser 820 825 830 ATC GGC ATC GCC TCG CGA TAT GCC GAG CTG GTG GAG GAC GTC GAT GTT 2544 Ile Gly Ile Ala Ser Arg Tyr Ala Glu Leu Val Glu Asp Val Asp Val 835 840 845 CGC GAG CGC ATC TTC GGC CGC ATC CGC GCC GAA TGG CAT TCC TCG ATC 2592 Arg Glu Arg Ile Phe Gly Arg Ile Arg Ala Glu Trp His Ser Ser Ile 850 855 860 GAG TAT CTG TTC GCG ATC ATG CAG CAG GAC CGC CTG CTG CAG AGC AAC 2640 Glu Tyr Leu Phe Ala Ile Met Gln Gln Asp Arg Leu Leu Gln Ser Asn 865 870 875 880 CCG CTG CTC GAA CGC TCG ATC CGC CAC CGC TTC CCG TAT CTC GAC CCC 2688 Pro Leu Leu Glu Arg Ser Ile Arg His Arg Phe Pro Tyr Leu Asp Pro 885 890 895 CTG AAC CAC GTC CAG GTC CAG CTG CTG CGC GAA CAC CGC ACC CAC GAC 2786 Leu Asn His Val Gln Val Gln Leu Leu Arg Glu His Arg Thr His Asp 900 905 910 CCA GAC GAA CAG GTG CTC CGC GGC GTG CAA CTG ACG ATC AAC GGG ATT 2784 Pro Asp Glu Gln Val Leu Arg Gly Val Gln Leu Thr Ile Asn Gly Ile 915 920 925 TCG GCG GGG CTG CGG AAT AGC GGG TGA 2811 Ser Ala Gly Leu Arg Asn Ser Gly 930 935

【図面の簡単な説明】

【図１】 本発明のｐｐｃ遺伝子を含む約６．８ｋｂの
ＤＮＡ断片の制限酵素切断地図。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 9/88 Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 浅井 陽子 東京都港区西新橋２−８−11 第７東洋海 事ビル８階財団法人 地球環境産業技術研 究機構内 (72)発明者 今井 りつ子 東京都港区西新橋２−８−11 第７東洋海 事ビル８階財団法人 地球環境産業技術研 究機構内 (72)発明者 湯川 英明 東京都港区西新橋２−８−11 第７東洋海 事ビル８階財団法人 地球環境産業技術研 究機構内

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ロドシュードモナス（Rhodopseudomona
   s）属に属する光合成細菌由来のホスホエノールピルビ
   ン酸カルボキシラーゼをコードするＤＮＡ。
2. 【請求項２】 配列番号５に示すアミノ酸配列を有し、
   ホスホエノールピルビン酸に二酸化炭素を固定すること
   によりオキザロ酢酸を生成する活性を実質的に害さない
   アミノ酸残基の置換、欠失、挿入を有してもよいホスホ
   エノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードする請求
   項１記載のＤＮＡ。
3. 【請求項３】 配列番号５に示す塩基配列又はこれと実
   質的に同一な塩基配列を有する請求項１記載のＤＮＡ。