JPH09124505A

JPH09124505A - 角膜障害治療・予防剤

Info

Publication number: JPH09124505A
Application number: JP7308338A
Authority: JP
Inventors: Katsuhiko Nakada; 勝彦中田; Masatane Nakamura; 雅胤中村
Original assignee: SAMU KENKYUSHO KK
Current assignee: SAMU KENKYUSHO KK
Priority date: 1995-10-31
Filing date: 1995-10-31
Publication date: 1997-05-13

Abstract

(57)【要約】【解決手段】レシチン化スーパーオキシドディスムター
ゼ、特に化学的架橋を介してレシチンと結合したスーパ
ーオキシドディスムターゼを有効成分とする角膜障害、
特に角膜上皮障害の治療・予防剤。【効果】本発明により、紫外線惹起角膜障害に対する優
れた予防効果および治療効果を有する点眼液を提供する
ことができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、レシチン化スーパ
ーオキシドディスムターゼを有効成分とする角膜障害治
療・予防剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】スーパーオキシドジスムターゼ（以下、
ＳＯＤと略記する場合もある）は、動物、植物、微生物
等の生体内に広く分布し、反応性に富む活性酸素である
スーパーオキシドアニオンラジカル（以下、単にＯ₂ ^-
と略記することもある）を分解する酵素として知られて
いる。薬物的面では、抗リウマチ剤の使用後や、心筋梗
塞や臓器移植の際に用いられる抗血栓剤の使用後に生じ
るラジカルの除去等や、ラジカルが起因となる種々の炎
症の治療にこのＳＯＤが適用されることが期待されてい
る。また、最近ではこのＳＯＤの胃粘膜障害への適用も
検討され、その治療効果が期待されている（過酸化脂質
研究、１６巻、７４頁（1992年))。一般に、静脈内投与
した場合ＳＯＤは細胞親和性が低く、かつその血中半減
期は僅か４〜６分とされており、ＳＯＤは速やかに尿中
に排泄される。このＳＯＤの血中半減期を延長させるた
めに、ＳＯＤをフィコール、ポリエチレングリコール、
ラットアルブミン、デキストラン等で修飾して巨大分子
化させることが試みられてきた。しかしながら、フィコ
ール又はポリエチレングリコールで修飾されたＳＯＤ
は、ＳＯＤ本来の酵素活性が大幅に低下し、かつ依然と
して細胞親和性低いことが報告されている。又、ラット
アルブミンで修飾されたＳＯＤには、ヒトの体内におけ
る抗原性が認められることが報告されている。さらに、
デキストランにより修飾されたＳＯＤは、ＳＯＤが本来
有する抗炎症作用が増強される点で優れているが、これ
もヒトの体内における抗原性が認められることが報告さ
れている。

【０００３】近年、ＳＯＤのような生物活性蛋白をレシ
チン（フォスファチジルコリン：以下、ＰＣと略記する
こともある）で化学修飾した物質が報告されている。こ
のＰＣ結合修飾生物活性蛋白は、細胞親和性が著しく上
昇し、また生物体内分布も従来の非修飾生物活性蛋白と
は著しく異なることが報告されている。また、生物活性
蛋白の薬理活性の強化、副作用の低下、吸収促進も期待
できるといわれている。また、ＰＣ化ＳＯＤ（以下、Ｐ
Ｃ−ＳＯＤと略記することもある）が火傷による炎症の
治癒を促進する効果を示すことも報告されている（特開
平３−１６３１００号公報、特開平３−１７０４３８号
公報、米国特許第５, １０９, １１８号明細書）。更
に、抗原性等の副作用もなく、抗炎症剤として有用であ
るともいわれている。特開平６−５４６８１号公報に
は、Forssman抗血清による呼吸抵抗に対する、ＰＣ−Ｓ
ＯＤの効果について記載されている。また、ＰＣ−ＳＯ
Ｄの潰瘍性胃腸障害に対する効果も報告されている。さ
らに、筋萎縮性側索硬化症等の運動ニューロン疾患に対
するＰＣ−ＳＯＤの効果についても報告されている。し
かし、レシチン化スーパーオキシドディスムターゼの眼
科用途、特に角膜障害に対する治療または予防効果につ
いてはこれまで検討されたことはない。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、角膜障害を予防ないし治療するためのレシチン化ス
ーパーオキシドディスムターゼを有効成分とする角膜障
害治療・予防剤を提供することにある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】以上の情況に鑑み、本発
明者らは、モデル動物としてラットを用い、角膜障害を
惹起させた後、レシチン化スーパーオキシドディスムタ
ーゼ含有点眼液を点眼投与し経時的に角膜上皮障害面積
と角膜混濁を観察したところ、レシチン化スーパーオキ
シドディスムターゼ含有点眼液は紫外線惹起角膜上皮障
害を抑制し、かつ、上皮障害治癒過程で生じる角膜混濁
発生を抑制することが明らかとなった。本発明はかかる
知見に基づきさらに研究を進めて完成するに至ったもの
である。

【０００６】即ち、本発明の要旨は、（１）レシチン
化スーパーオキシドディスムターゼを有効成分とする角
膜障害治療・予防剤、（２）角膜障害が、角膜上皮に
生ずるものである前記（１）記載の角膜障害治療・予防
剤、（３）角膜障害が、紫外線惹起角膜上皮障害であ
る前記（１）記載の角膜障害治療・予防剤、（４）剤
型が点眼液である前記（１）〜（３）いずれかに記載の
角膜障害治療・予防剤、（５）レシチン化スーパーオ
キシドディスムターゼ含有量が０．００１〜１重量％で
ある前記（４）記載の角膜障害治療・予防剤、（６）
レシチン化スーパーオキシドディスムターゼが化学的架
橋を介してレシチンと結合したスーパーオキシドジスム
ターゼである前記（１）または（２）記載の角膜障害治
療・予防剤、（７）化学的架橋を介してレシチンと結
合したスーパーオキシドジスムターゼが下記一般式
（Ｉ）ＳＯＤ−〔Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ₂)_n−Ｃ（Ｏ）−Ｘ〕_m （Ｉ）（式中、ＳＯＤはスーパーオキシドジスムターゼを表
し、Ｘはグリセロールの２位に水酸基を有するリゾレシ
チンの、その２位の水酸基の水素原子を除いた残基を表
し、ｍはＳＯＤ１分子への平均結合数であり、１以上の
整数を表し、ｎは２以上の整数を表す）。で表される前
記（６）記載の角膜障害治療・予防剤、（８）一般式
（Ｉ）において、ＳＯＤがヒト由来のＳＯＤである前記
（７）記載の角膜障害治療・予防剤、（９）一般式
（Ｉ）において、ＳＯＤが、そのアミノ酸配列１１１位
のアミノ酸が、Ｓ−（２−ヒドロキシエチルチオ）シス
テインである、ヒト由来のＣｕ／Ｚｎスーパーオキシド
ジスムターゼである前記（７）記載の角膜障害治療・予
防剤、（１０）一般式（Ｉ）において、ｎが２以上１
０以下のいずれかの整数である前記（７）〜（９）いず
れかに記載の角膜障害治療・予防剤、（１１）一般式
（Ｉ）において、ｎが３である前記（１０）記載の角膜
障害治療・予防剤、（１２）一般式（Ｉ）において、
ｍが１以上１６以下の数である前記（７）〜（１１）い
ずれかに記載の角膜障害治療・予防剤、並びに（１３）
一般式（Ｉ）において、ｍが４である前記（１２）記
載の角膜障害治療・予防剤、に関する。

【０００７】

【発明の実施の形態】以下に、本発明の実施の形態につ
いて説明する。（１）本発明の角膜障害治療・予防剤は、レシチン化
スーパーオキシドジスムターゼ、特に化学的架橋を介し
てレシチンと結合したスーパーオキシドジスムターゼを
有効成分とする角膜障害治療・予防剤である。本明細書
において「レシチン」は、フォスファチジルコリンを意
味する通常のレシチンの他に、そのグリセロールの１位
又は２位に結合している脂肪酸１分子がとれた「リゾレ
シチン」も含む。さらに、本明細書における「スーパー
オキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）」は、生体内の活性酸
素Ｏ₂ ^-の分解というその本来の機能を発揮し得る限り
において、その起源等は特に限定されるものではなく、
各種の動植物又は微生物が有するＳＯＤを広く用いるこ
とが可能である。しかしながら、本発明は、医薬品用途
としての発明であり、生体内での抗原性を可能な限り減
じることが好ましいことを考慮すれば、本発明の角膜障
害治療・予防剤を投与する動物種に応じて、適宜適切な
ＳＯＤを選択することが好ましい。例えば、最も本発明
の角膜障害治療・予防剤が必要とされると考えられるヒ
トを対象とする場合には、ヒト体内における抗原性を可
能な限り減ずるべく、ヒト由来のＳＯＤを本発明におい
て用いることが好ましい。そしてその中でも、ヒト由来
のＣｕ／ＺｎＳＯＤ（活性中心に銅と亜鉛を含むヒト由
来のＳＯＤ；以下、ヒトＣｕ／ＺｎＳＯＤと略記するこ
ともある）が、細胞内における発現量が多く、また遺伝
子工学的手法による生産技術が本発明完成時点において
確立しており、現時点で大量に調製することが可能であ
り、特に好ましい。

【０００８】このヒトＣｕ／ＺｎＳＯＤには、ヒト組織
から製造される天然のヒトＣｕ／ＺｎＳＯＤ；遺伝子工
学的手法により製造されるヒトＣｕ／ＺｎＳＯＤ；天然
のヒトＣｕ／ＺｎＳＯＤと実質上同一のアミノ酸配列を
有する組換えヒトＣｕ／ＺｎＳＯＤ等があり、いずれの
ヒトＣｕ／ＺｎＳＯＤをも本発明において用いる化学的
架橋を介してレシチンと結合したスーパーオキシドジス
ムターゼ（ＰＣ−ＳＯＤ）の素材とすることができる。
天然のヒトＣｕ／ＺｎＳＯＤの１１１位のアミノ酸はシ
ステインであるが、蛋白工学的手法、例えば部位特異的
変異法により、この１１１位をセリンに変換したヒトＣ
ｕ／ＺｎＳＯＤ（特開昭62-130684 号公報）や、化学的
にこの１１１のシステインを修飾したヒトＣｕ／ＺｎＳ
ＯＤ（特開平6-199895号公報）も報告されており、これ
らのヒトＣｕ／ＺｎＳＯＤを素材としたＰＣ−ＳＯＤの
いずれをも本発明の角膜障害治療・予防剤の有効成分と
して用いることができる。そして、これらのヒトＣｕ／
ＺｎＳＯＤのうちでも、電荷的及び分子量的に均一でか
つＳＯＤ活性が安定している、１１１位のシステインを
化学的に修飾した、例えばこのシステインをＳ−（２−
ヒドロキシエチルチオ）システインとしたヒトＣｕ／Ｚ
ｎＳＯＤを前記ＰＣ−ＳＯＤの素材として用いることが
好ましい。なお、本明細書においては、このようにヒト
Ｃｕ／ＺｎＳＯＤを部位特異的変異法等により一部アミ
ノ酸を変換したものや、ヒトＣｕ／ＺｎＳＯＤの一部の
アミノ酸を化学的に修飾して得られるものも含めて、単
にヒトＣｕ／ＺｎＳＯＤという。

【０００９】本発明において用いるＰＣ−ＳＯＤは、通
常、前記レシチンの残基に化学的架橋剤を予め結合させ
たレシチン誘導体を、スーパーオキシドジスムターゼ
（ＳＯＤ）に、その化学的架橋剤により形成される化学
的架橋を介して、１個以上のレシチンを結合させて得る
ことができる。なお、ここでＳＯＤに結合するレシチン
は特に限定されるものではないが、前記リゾレシチンが
結合したＰＣ−ＳＯＤを本発明において用いることが好
ましい。この本発明において好適なＰＣ−ＳＯＤは、次
式（Ｉ）ＳＯＤ−〔Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ₂)_n−Ｃ（Ｏ）−Ｘ〕_m （Ｉ）（式中、ＳＯＤはスーパーオキシドジスムターゼを表
し、Ｘはグリセロールの２位に水酸基を有するリゾレシ
チンの、その２位の水酸基の水素原子を除いた残基を表
し、ｍは１以上の整数を表し、ｎは２以上の整数を表
す）で表される。ここで、Ｘで表される「グリセロール
の２位に水酸基を有するリゾレシチンの、その２位の水
酸基の水素原子を除いた残基」は、次式（II） -O-CH(CH₂OR) [CH₂OP(O)(O^-)(OCH₂CH₂N⁺(CH₃)₃)] （II）（式中、Ｒは脂肪酸残基（アシル基）である）で表され
る。特に、炭素数１０〜２８の飽和又は不飽和の脂肪酸
残基が上記Ｒとして好ましく、より好ましくはミリスト
イル基、パルミトイル基、ステアロイル基、イコサノイ
ル基、ドコサノイル基、その他炭素数が１４〜２２の飽
和脂肪酸残基であり、特に好ましいのは炭素数１６の飽
和脂肪酸残基であるパルミトイル基である。また、前記
式（Ｉ）中、残基 −Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ₂)_n−Ｃ（Ｏ）− は、化学的架橋の残基を表す。この化学的架橋の残基
は、式ＨＯ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ₂)_n−Ｃ（Ｏ）−ＯＨで表される直鎖状ジカルボン酸、このジカルボン酸の無
水物、このジカルボン酸のエステル、このジカルボン酸
のハロゲン化物又はその他のこのジカルボン酸の反応性
誘導体等の化学的架橋剤分子の両端における水酸基（上
記ジカルボン酸の反応性誘導体の場合は、このジカルボ
ン酸の両端における水酸基に対応する部分）を除いた残
基である。

【００１０】この残基はＳＯＤとレシチンとを架橋して
結合させ得るので、本明細書中では、これを総称して
「化学的架橋」という。前記式（Ｉ）中の化学的架橋
は、その一端において、上記リゾレシチン残基（II）と
エステル結合により結合している。また、この化学的架
橋の他端は、ＳＯＤのアミノ基とアミド結合等により直
接結合していると考えられる。なお、この化学的架橋に
おいて、基−（ＣＨ₂)_n−は、直鎖状アルカンの両端の
炭素原子から１個ずつ水素原子を除いてできる２価基、
すなわちアルキレン基である。ｎは２以上の整数であ
り、好ましくはｎは２〜１０の整数であり、特に好まし
くは３である。また、前記式（Ｉ）中のｍは、上記の化
学的架橋を介してＳＯＤ１分子に結合したレシチンの平
均個数を表している。このｍは１以上の整数であり、ｍ
が１〜１６のものが好ましく、４のものが特に好まし
い。上記レシチン誘導体のＳＯＤへの結合は、具体的に
は例えば特開平６−５４６８１号公報に記載された方法
等に基づいて行うことが可能であり、これによりＰＣ−
ＳＯＤを製造することができる。このＰＣ−ＳＯＤの製
造過程の詳細は後述する製造例に記載する。

【００１１】なお、本発明に用いるＰＣ−ＳＯＤは、薬
学上許容される塩であっても良い。具体的に用いること
ができる塩は、用いるＰＣ−ＳＯＤの等電点によって異
なる。例えばＰＣ−ＳＯＤ分子の等電点が酸性の場合
は、アルカリとの薬学上許容される塩を使用することが
できる。逆に、ＰＣ−ＳＯＤ分子の等電点がアルカリ性
の場合は、酸との薬学上許容される塩を使用することが
できる。例えば、そのアミノ酸配列の１１１位をセリン
に変換したヒトＣｕ／ＺｎＳＯＤの等電点は酸性であ
り、かつこれをＰＣ化して得られるＰＣ−ＳＯＤの等電
点も酸性である。故に、この１１１位変換ヒトＣｕ／Ｚ
ｎＳＯＤに関しては、アルカリとの塩、例えばアルカリ
金属塩、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩等のう
ち、薬学上許容される塩を本発明において使用すること
ができる。このようにして製造したＰＣ−ＳＯＤを、後
述する剤形において有効成分として配合して所望の角膜
障害治療・予防剤とすることができる。

【００１２】（２）本発明の角膜障害治療・予防剤は
以下のようにして調製することができる。レシチン化ス
ーパーオキシドディスムターゼの投与は、局所投与が好
ましく、特に点眼投与が好適に用いられる。点眼投与の
剤型としては、点眼液が好ましい。点眼液の一般的調製
法としては、レシチン化スーパーオキシドディスムター
ゼの凍結乾燥標品を滅菌精製水に溶解して調製すればよ
いが、必要に応じて等張化剤、ｐＨ調節剤、緩衝化剤、
防腐剤等の点眼液に汎用されている添加物を適宜添加す
ることができる。点眼液の調製のための添加物は、特に
限定されるものではなく、レシチン化スーパーオキシド
ディスムターゼの酵素活性が阻害されず、安定性を損な
わず、かつ点眼液用の添加物として一般に使用されてい
るものはすべて基材として使用することができる。

【００１３】しかし、レシチン化スーパーオキシドディ
スムターゼは、塩類が存在すると安定性が損なわれるの
で、塩類の使用は最小限に抑えるのが好ましい。添加物
の例としては、等張化剤としてグリセリン、マンニトー
ル等が、ｐＨ調節剤として塩酸、水酸化ナトリウム等
が、緩衝化剤としてリン酸系緩衝剤が、防腐剤としてパ
ラオキシ安息香酸エステル、塩化ベンザルコニウム等が
挙げられる。

【００１４】点眼液に使用するレシチン化スーパーオキ
シドディスムターゼの含有量は、通常０．００１〜１．
０重量％、好ましくは０．００５〜０．５重量％、より
好ましくは０．０１〜０．１重量％である。なお、実施
例においては、ラット角膜障害モデルを用い本発明の点
眼液の効果を検討したが、ヒトの治療・予防に用いる場
合は、通常ラットにおける濃度の約１０倍程度の高濃度
が必要となる。

【００１５】本発明の角膜障害治療・予防剤を点眼液と
して臨床に適用する場合は、症状により異なるが通常１
日１〜数回、１回１〜３滴点眼する。なお、レシチン化
スーパーオキシドディスムターゼの安全性については、
後に詳述するように、ラットおよびカニクイザルについ
て急性毒性試験を行ったが、死亡例は観察されず、一般
状態、体重、剖検所見のいずれにおいても変化は認めら
れなかったことから、静脈内投与によるＰＣ−ＳＯＤの
致死量は１００mg／Kg以上と推定される。

【００１６】レシチン化スーパーオキシドディスムター
ゼの角膜障害に対する治療・予防効果は、ラット角膜障
害モデルを用いた角膜障害の軽減効果により明らかにさ
れる。ラット角膜障害モデルとして紫外線照射により角
膜上皮障害を惹起したモデルを用い、ＰＣ−ＳＯＤを種
々の濃度で含有する点眼液を点眼投与し、角膜障害の治
療・予防効果を検討することにより明らかにされる。効
果の判定は、角膜上皮障害の面積の測定および角膜混濁
度合いの測定によって行う。比較対照としてレシチン化
していないスーパーオキシドディスムターゼ（Ｕ−ＳＯ
Ｄ）を用い同様な実験を行う。その結果は、実施例に示
すように、ＰＣ−ＳＯＤはＵ−ＳＯＤに比べて顕著に優
れた効果を示し、またその効果は濃度依存的である。こ
のＰＣ−ＳＯＤとＵ−ＳＯＤの比較試験は、ＳＯＤがレ
シチン化されることの効果を明確に裏付けている。

【００１７】以上の事実によって明らかにされるよう
に、ＰＣ−ＳＯＤは角膜上皮障害を顕著に抑制し、その
回復を促進する効果を有し、角膜障害の治療・予防に有
用である。

【００１８】

【実施例】以下に、本発明の実施例を製造例及び試験例
として具体的に説明する。しかしながら、これらにより
本発明の技術的範囲が限定されるべきものではない。

【００１９】〔製造例〕（１）ヒトＣｕ／ＺｎＳＯＤ誘導体〔ＳＯＤの１１１位
のアミノ酸がＳ−（２−ヒドロキシエチルチオ）システ
インであるヒト由来のスーパーオキシドジスムターゼ）
の製造：このヒトＣｕ／ＺｎＳＯＤ誘導体は、特開平６
−１９９８９５号公報に記載された方法で製造すること
により得られる。具体的手順を次に示す。ヒトのＳＯＤ
遺伝子を導入することにより作成された、公知の大腸菌
５４５πＨＲ（ｐＨＴ３５１）を培養し、得られた培養
菌体を破砕し、ヒトＣｕ／ＺｎＳＯＤの粗抽出液を得
た。この粗抽出液に硫安沈澱、Ｑ−セファロースＦＦ
（ファルマシア社製）カラム、硫安沈澱を順に施して精
製し、さらに０．２μm フィルターで濾過した濾液を凍
結乾燥して無色の固体（組換えヒトアポＳＯＤ）を得
た。この組換えヒトアポＳＯＤを１０mMトリエタノール
アミン緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、ビス（２−ヒド
ロキシエチル）ジスルフィドを加え、ｐＨ７．０に再調
整した後、４℃で２４時間攪拌した。これにＮａＣｌ、
２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）及び０．１ＭＣｕＣｌ
₂ 水溶液を加え、４℃で１３時間攪拌した。この攪拌
後、ｐＨを７．０に調整し、硫安沈澱（４℃・１００％
飽和）で生じた沈澱を集めた。この沈澱を１０mMトリエ
タノールアミン緩衝液（ｐＨ７．０）で透析して脱塩し
た。この脱塩画分をＱ−セファロースＦＦカラムに通
し、ＮａＣｌ濃度を５mM、１０mM、２０mM、５０mMの順
に段階的に上昇させて展開し、ＳＯＤ画分を集めた。次
いで、このＳＯＤ画分を硫安沈澱（４℃・１００％飽
和）し、生じた沈澱を集めた。この沈澱を水溶液とし
て、０．５ＭＮａＣｌ水溶液、次いで精製水で透析
し、これらの透析終了後凍結乾燥してヒトＳＯＤ誘導体
を得た（以下、単にＳＯＤと記載することもある）。こ
のヒトＳＯＤ誘導体の１１１位のアミノ酸はＳ−（２−
ヒドロキシエチルチオ）システインとなった。

【００２０】（２）ＰＣ−ＳＯＤの製造：上記ヒトＳＯ
Ｄ誘導体を用い、特開平６−５４６８１号公報に記載さ
れた方法でＰＣ−ＳＯＤを製造した。２−（４−ヒドロキシカルボニルブチロイル）リゾレ
シチンの活性エステル体の合成（−Ａ）２−（４−ヒドロキシカルボニルブチロイ
ル）リゾレシチンの合成グリセロールの２位が水酸基であるリゾレシチンのクロ
ロホルム−ピリジン（８０ml／２０ml）懸濁液に、ＤＭ
ＡＰ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン）及び無水グル
タル酸を加え、６０℃で１５時間攪拌した。その後、反
応液を減圧濃縮し、残渣にクロロホルム：メタノール：
水＝４：５：１の溶媒を加えて溶解し、同液で平衡化し
たイオン交換カラム（Dowex 50W-X8, ダウケミカル社
製）に通した。ＴＬＣにより目的化合物を分画し、溶媒
を減圧濃縮した後、残渣をＯＤＳ（オクタデシルシラ
ン）を充填したカラムで精製して、標記の化合物を得
た。

【００２１】（−Ｂ）２−（４−ヒドロキシカルボニ
ルブチロイル）リゾレシチンの活性エステル体の合成 −Ａで得られたカルボン酸をジクロロメタンに溶解さ
せて０℃で冷却し、これにＮ−ヒドロキシスクシンイミ
ド及びテトラゾールを順に加え、次にＤＣＣ（１，３−
ジシクロヘキシルカルボジイミド）のジクロロメタン溶
液をゆっくり滴下し、室温で１５時間攪拌した。攪拌
後、不溶物をセライトで濾過し、活性エステル体のジク
ロロメタン溶液を得た。ＳＯＤ１分子あたりレシチン誘導体が平均４個結合し
たＰＣ−ＳＯＤの合成５０mMホウ酸緩衝液（ｐＨ８．
５）に溶解させた上記の工程に従って製造したＳＯＤ
と、このＳＯＤの全アミノ基に対して０．８倍モル量の
２−（４−ヒドロキシカルボニルブチロイル）リゾレシ
チンの活性エステル体とを次の方法により反応させた。

【００２２】上記活性エステル体溶液のジクロロメタン
を留去し、ＤＭＦ（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド）に
溶解させた。これを５０mMホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）
に添加し、不溶物を濾過後、同一緩衝液に溶解して０℃
に冷却したＤＭＦを５０％加えた上記ＳＯＤ溶液に滴下
した。これを０℃で１５時間攪拌後、反応液を濾過し、
セファクリルＳ−３００（ファルマシア社製）を担体と
したゲル濾過カラムに付し、５０mMホウ酸緩衝液（ｐＨ
８．５）で溶出し、ＰＣ−ＳＯＤ溶出分画を集め、イオ
ン交換クロマトグラフィーにより精製した。次いでこれ
を限外濾過により濃縮し、タンパク質濃度をローリー法
（Lowry,O.h.等、J. Biol. Chem., 193巻, 265 頁(1951
年))、ＳＯＤの残存アミノ基をＴＮＢＳ法（トリニト
ロベンゼンスルホン酸塩、Goodwin,J.F 等、Clin. Che
m.,16巻,24 頁(1970 年))で分析することにより、ＳＯ
Ｄ１分子あたりのレシチン誘導体の結合数を求めたとこ
ろ、平均４．０個であった。このＰＣ−ＳＯＤの性状
は、青緑色乃至緑色の透明な水溶液であり、ｐＨは７〜
８であった。また、分子量をＳＤＳ−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動法により調べたところ、ＰＣ−ＳＯＤサ
ブユニットのモノマー（前述した通り、ＰＣ−ＳＯＤは
サブユニットのホモダイマーである）あたり約１８００
０であった。

【００２３】〔試験例〕上記製造例により製造したＰＣ
−ＳＯＤ（濃度３０mg／ml；比活性３．０７×１０³ Ｕ
／蛋白mg）について毒性試験及び薬効試験を行った。Ｐ
Ｃ−ＳＯＤは５％マンニトール水溶液に終濃度５mg／ml
になるように溶解した溶液（以下、ＰＣ−ＳＯＤ溶液と
略記することもある）を使用した。このＰＣ−ＳＯＤ溶
液の性状は、青緑色乃至緑色の透明な水溶液であり、ｐ
Ｈは６〜８であった。また、生理食塩液に対する浸透圧
比は約１であった。

【００２４】（１）急性毒性試験ラットを用いた急性毒性試験ＰＣ−ＳＯＤ溶液を、ＳＤ系ラット雌雄各５匹に尾静脈
から１００mg／Kgを投与した。投与後１４日間、一般状
態及び生死についての観察と体重の測定とを行った。そ
して、１５日目に剖検して、主要臓器の肉眼的観察を行
った。その結果、死亡したラットは観察されず、一般状
態、体重、剖検所見のいずれにおいても変化は認められ
なかったことから、静脈内投与によるＰＣ−ＳＯＤの致
死量は１００mg／Kg以上と推定された。サルを用いた急性毒性試験ＰＣ−ＳＯＤ溶液を雌のカニクイザル２頭に四肢の静脈
から１００mg／Kgを投与した。投与後１４日間、一般状
態及び生死についての観察と体重の測定とを行った。そ
の結果、死亡したカニクイザルは観察されず、一般状
態、体重、剖検所見のいずれにおいても変化は認められ
なかったことから、静脈内投与によるＰＣ−ＳＯＤの致
死量は１００mg／Kg以上と推定された。

【００２５】（２）薬効試験紫外線惹起角膜上皮障害に対するＰＣ−ＳＯＤの効果スーパーオキシドディスムターゼ（ＳＯＤ）は活性酸素
の一つであるスーパーオキサイドアニオン（Ｏ₂ ^-）を
特異的に消去することにより抗酸化作用を示す生体内物
質で、生体防御機構に重要な役割を果たしている。しか
し、ＳＯＤも通常の外来タンパクと同様に外部から投与
した場合には組織親和性や細胞親和性が充分ではない。
そこでラットに紫外線を照射して角膜障害を惹起したモ
デルを用い、組織親和性を高めるためレシチン化したＳ
ＯＤ（ＰＣ−ＳＯＤ）を主成分とする本発明の点眼液の
効果を検討すると共に、比較対照としてレシチン化して
いないＳＯＤ（Ｕ−ＳＯＤ）の点眼液についても検討し
た。コントロールとして基剤のみの点眼液（グリセリン
２．５５ｇを滅菌精製水１００ｍｌに溶解したもの）を
用いた。

【００２６】実験材料点眼液の調製製造例で合成したＰＣ−ＳＯＤの凍結乾燥粉末０．０１
ｇの滅菌精製水１００ｍｌ溶液にグリセリン２．５５ｇ
を加え、微量の１Ｎ−塩酸および１Ｎ−水酸化ナトリウ
ム水溶液でｐＨ７．０に調整し、０．０１％ＰＣ−ＳＯ
Ｄ点眼液を調製した。ＰＣ−ＳＯＤの量を変え、同様に
して０．００１％、０．００３％の点眼液を調製した。
なお、比較実験に用いる０．１％Ｕ−ＳＯＤ点眼液も同
様に調製した。

【００２７】実験動物として、生後６週齢のＳ．Ｄ．ラ
ット（日本エスエルシー社から購入）１２匹を用い、点
眼液としては、上記の０．０１％ＰＣ−ＳＯＤ、０．１
％Ｕ−ＳＯＤおよび基剤のみからなる点眼液を用いた。

【００２８】実験方法ラット１２匹を３群に分け、ネンブタール^R注射液（大
日本製薬社製）を体重１００ｇ当たり０．１ｍｌ腹腔内
投与し麻酔した。ラット両眼の上下の瞼を書類綴用クリ
ップで挟み、眼球を充分に開瞼させた後、３１２ｎｍの
紫外線ランプ（コスモバイオ、ＣａｔＮｏ．ＣＳＬ６
Ｂ）の真下に静置し、ラット１匹毎に１ｋＪ／ｍ²の紫
外線を照射した。照射直後より各群にそれぞれ０．０１
％ＰＣ−ＳＯＤ、０．１％Ｕ−ＳＯＤおよび基剤を、１
日６回、１．５時間間隔で両眼に点眼した。紫外線照射
直後から１２時間毎に１％フルオレセイン−Ｎａを１μ
Ｌ点眼し、生理食塩液で充分に洗浄して障害部を染色
後、スリットランプで観察を行い、さらにコバルトフィ
ルター付きメディカルニッコールで前眼部を撮影した。
角膜上皮障害面積は、得られた写真上のフルオレセイン
染色面積を画像解析システム（ＣＯＳＭＯＺＯＮＥ１
ＳＡ、Ｎｉｋｏｎ）を用いて測定した。また、上皮障害
治癒過程で生じる角膜混濁も同時に観察し、下表に従
い、スコア評価した。

【００２９】統計学的解析フルオレセインの染色面積はパラメトリック手法を用い
てＤｕｎｎｅｔｔ型多重比較検定の両側検定により有意
性を検討した。角膜混濁スコアはノンパラメトリック手
法を用いてＳｈｅｆｆｅ型多重比較検定の両側検定によ
り有意性を検討した。なお、有意水準はいずれの場合も
５％以下とした。角膜混濁スコア混濁が認められない・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・０混濁がわずかに認められる程度で、混濁・非混濁部の境界が不鮮明なもの・・・・・・・・・・・・・・・・１半透明な領域が容易に見分けられ、混濁・非混濁部の境界が明瞭であるもの・・・・・・・・・・・・・・２明らかな不透明の領域が角膜全体に広がっているもの・・・・３

【００３０】結果および結論（１）角膜上皮障害に対するＰＣ−ＳＯＤの効果０．０１％ＰＣ−ＳＯＤ、０．１％Ｕ−ＳＯＤおよび基
剤点眼群におけるフルオレセイン染色面積の経時変化を
図１に示す。基剤点眼群では紫外線照射２４時間後から
角膜上皮障害が認められ始め、照射３６時間後にはピー
クに達した。照射４８時間後以降、上皮障害の面積は徐
々に減少して、照射８４時間後ではほぼ全例治癒すると
いう経過を示した。０．０１％ＰＣ−ＳＯＤ点眼群では
照射１２時間後に角膜上皮障害が認められ始め、照射４
８時間後にピークに達したが、その上皮障害の程度は基
剤群と比較して顕著に抑制した。その後障害の面積は減
少し、照射７２時間後には全例治癒した。また、０．１
％Ｕ−ＳＯＤ点眼群では０．０１％ＰＣ−ＳＯＤ点眼群
とほぼ同様の経過を示し、照射１２０時間後に前例治癒
した。

【００３１】（２）角膜混濁に対するＰＣ−ＳＯＤの影
響紫外線照射４８時間後までは、いずれの群においても角
膜混濁は認められなかった。紫外線照射３６時間後から
１２０時間後までの角膜混濁スコアを図２に示す。基剤
点眼群では紫外線照射６０時間後より角膜混濁が認めら
れ始め、照射８４時間後にピークに達した後、混濁は徐
々に消失した。０．０１％ＰＣ−ＳＯＤ点眼群では基剤
群と同様に、照射６０時間後に混濁が認められ始めた
が、その混濁スコアは基剤点眼群と比較して顕著な抑制
を示し、照射７２時間後をピークに、その後徐々に消失
して照射９６時間後では基剤群と比較して有意に角膜混
濁を抑制した。また、０．１％Ｕ−ＳＯＤ群では照射４
８時間後より混濁が発現し、０．０１％ＰＣ−ＳＯＤ群
と同様に基剤点眼群と比較して抑制傾向を示し、照射７
２時間後をピークとして、その後徐々に混濁は消失し
た。以上の結果からＰＣ−ＳＯＤは、０．０１％の濃度
で紫外線惹起角膜上皮障害の顕著な抑制を示し、上皮障
害治癒過程で生じる角膜混濁を有意に抑制した。その抑
制効果は、１０倍も高濃度である０．１％Ｕ−ＳＯＤの
それと同程度以上であった。

【００３２】紫外線惹起角膜上皮障害に対する低濃
度ＰＣ−ＳＯＤの効果において、ＰＣ−ＳＯＤは０．０１％の濃度で紫外線
惹起角膜上皮障害を顕著に抑制し、上皮障害治癒過程で
生じる角膜混濁を有意に抑制した。そこで、同じモデル
を用い、さらに低濃度のＰＣ−ＳＯＤ点眼群（０．００
１％、０．００３％および基剤）の効果を検討した。実
験材料、使用点眼液、実験動物、および実験方法は、い
ずれもに記載したものと同様であった。

【００３３】結果および結論（１）角膜上皮障害に対するＰＣ−ＳＯＤの効果０．００１％ＰＣ−ＳＯＤ、０．００３％ＰＣ−ＳＯ
Ｄ、および基剤点眼群におけるフルオレセイン染色面積
の経時変化を図３に示す。基剤点眼群では紫外線照射１
２時間後から角膜上皮障害が認められ始め、照射３６時
間後にピークに達した。その後障害の面積は徐々に消失
し、照射７２時間後にはほぼ全例治癒するという経過を
示した。ＰＣ−ＳＯＤ点眼群では、照射２４時間後から
上皮障害が認められ始め、照射３６時間後にピークに達
し、その後は障害は徐々に消失した。角膜上皮障害の発
症と治癒の経過は基剤群とＰＣ−ＳＯＤ点眼群とであま
り差は見られなかったが、ピーク時の障害の程度はＰＣ
−ＳＯＤ点眼群で顕著な抑制を示し、その作用は０．０
０３％の方が強かった。

【００３４】（２）角膜混濁に対するＰＣ−ＳＯＤの影
響紫外線照射３６時間後から１４４時間後までの角膜混濁
スコアを評価した結果を図４に示す。紫外線照射３６時
間後まではいずれの群においても角膜混濁は認められな
かった。基剤点眼群では紫外線照射４８時間後から角膜
混濁が認められ始め、照射７２時間後にピークに達した
後、混濁は徐々に消失した。０．００１％ＰＣ−ＳＯＤ
点眼群では照射６０時間後から混濁が発生し、照射９６
時間後をピークとしてその後徐々に消失した。０．００
３％ＰＣ−ＳＯＤでは照射６０時間後に角膜混濁が発生
し始め、照射８４時間後にピークを示したが、その混濁
の程度は基剤点眼群と比較していずれの観察期間におい
ても顕著な抑制を示した。

【００３５】以上の結果から、ＰＣ−ＳＯＤは紫外線惹
起角膜上皮障害を抑制する傾向を示し、その作用は０．
００３％の方が強かった。また、上皮障害治癒過程で生
じる角膜混濁発生に対しては、０．００３％ＰＣ−ＳＯ
Ｄの方が０．００１％ＰＣ−ＳＯＤよりも顕著な抑制効
果を示すことが分かる。

【００３６】

【発明の効果】本発明により、紫外線惹起角膜障害に対
する優れた予防効果および治療効果を有する点眼液を提
供することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、フルオレセイン染色法で測定された紫
外線惹起角膜上皮障害に対するＰＣ−ＳＯＤ含有点眼液
の効果を示す図である。

【図２】図２は、角膜混濁からみた紫外線惹起角膜上皮
障害に対するＰＣ−ＳＯＤ含有点眼液の効果を示す図で
ある。

【図３】図３は、フルオレセイン染色法で測定された紫
外線惹起角膜上皮障害に対する低濃度ＰＣ−ＳＯＤ含有
点眼液の効果を示す図である。

【図４】図４は、角膜混濁からみた紫外線惹起角膜上皮
障害に対する低濃度ＰＣ−ＳＯＤ含有点眼液の効果を示
す図である。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】レシチン化スーパーオキシドディスムタ
ーゼを有効成分とする角膜障害治療・予防剤。
【請求項２】角膜障害が、角膜上皮に生ずるものであ
る請求項１記載の角膜障害治療・予防剤。
【請求項３】角膜障害が、紫外線惹起角膜上皮障害で
ある請求項１記載の角膜障害治療・予防剤。
【請求項４】剤型が点眼液である請求項１〜請求項３
いずれか１項に記載の角膜障害治療・予防剤。
【請求項５】レシチン化スーパーオキシドディスムタ
ーゼ含有量が０．００１〜１重量％である請求項４記載
の角膜障害治療・予防剤。
【請求項６】レシチン化スーパーオキシドディスムタ
ーゼが化学的架橋を介してレシチンと結合したスーパー
オキシドジスムターゼである請求項１〜請求項５いずれ
か１項に記載の角膜障害治療・予防剤。
【請求項７】化学的架橋を介してレシチンと結合した
スーパーオキシドジスムターゼが下記一般式（Ｉ）ＳＯＤ−〔Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ₂)_n−Ｃ（Ｏ）−Ｘ〕_m （Ｉ）（式中、ＳＯＤはスーパーオキシドジスムターゼを表
し、Ｘはグリセロールの２位に水酸基を有するリゾレシ
チンの、その２位の水酸基の水素原子を除いた残基を表
し、ｍはＳＯＤ１分子への平均結合数であり、１以上の
整数を表し、ｎは２以上の整数を表す）。で表される請
求項６記載の角膜障害治療・予防剤。
【請求項８】一般式（Ｉ）において、ＳＯＤがヒト由
来のＳＯＤである請求項７記載の角膜障害治療・予防
剤。
【請求項９】一般式（Ｉ）において、ＳＯＤが、その
アミノ酸配列１１１位のアミノ酸が、Ｓ−（２−ヒドロ
キシエチルチオ）システインである、ヒト由来のＣｕ／
Ｚｎスーパーオキシドジスムターゼである請求項７記載
の角膜障害治療・予防剤。
【請求項１０】一般式（Ｉ）において、ｎが２以上１
０以下のいずれかの整数である請求項７〜請求項９いず
れか１項に記載の角膜障害治療・予防剤。
【請求項１１】一般式（Ｉ）において、ｎが３である
請求項１０記載の角膜障害治療・予防剤。
【請求項１２】一般式（Ｉ）において、ｍが１以上１
６以下の数である請求項７〜請求項１１いずれか１項に
記載の角膜障害治療・予防剤。
【請求項１３】一般式（Ｉ）において、ｍが４である
請求項１２記載の角膜障害治療・予防剤。