JPH08208700A - 抗ヒト大腸癌粘液モノクローナル抗体、その製造法、およびその抗体を用いた大腸癌スクリーニング法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 従来の腫瘍マーカーとは異なるマーカーを検
索し、そのマーカーを特異的に認識するモノクローナル
抗体を開発して、偽陽性率の低い確実な大腸癌スクリー
ニングに応用することを目的とする。 【構成】 ＩｇＭクラスに属しかつ大腸粘液中の分子量
２５万〜５０万の多糖を認識するがヒトヘモグロビンは
認識しない抗ヒト大腸癌粘液モノクローナル抗体であ
る。この抗体は、予めヒトヘモグロビンを除去した大腸
癌患者の大腸粘液を免疫抗原として哺乳動物を免疫後、
Ｂ細胞調製工程、細胞融合工程、スクリーニング工程、
クローニング工程、ハイブリドーマ培養工程および抗体
の分離精製工程を実施することにより得られる。大腸癌
スクリーニングは、ヒト大腸より採取したヒト大腸粘液
またはヒト便中に含まれるヒト大腸粘液の中の上記の多
糖の量を、上記の抗体を用いた酵素免疫測定法により測
定することによりなされる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、大腸粘液中の特定の多
糖を認識する抗ヒト大腸癌粘液モノクローナル抗体、そ
の抗体の製造法、およびその抗体を用いた大腸癌のスク
リーニング法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】近年、我が国では大腸癌が増加してきて
いる。１９６５年の大腸癌死亡者数は６６００人であっ
たが、１９８７年には２１０７６人と約 3.2倍に増加し
ている。しかもその発生頻度はさらに増加しており、青
森県の調査では、直腸癌は１９７４年の人口１０万対
6.1から１９８７年には16.7と約 2.7倍、結腸癌は 5.1
から24.2と約 4.7倍となっている。（田村研ら、癌の臨
床、37: 329-332, 1991 参照）

【０００３】このような状況から大腸癌を早く発見して
対処策を講じる二次予防の必要性が高まり、免疫学的便
潜血検査の普及により、大腸癌検診が広く行われるよう
になった。

【０００４】１９８６年から１９８７年までの青森県の
便潜血検査による大腸集検では、延べ受診者数１３２３
０８人に対して精密検査者数は３２２８人（2.4 ％）で
あり、このうち発見大腸癌は９７例（延べ受診者数に対
する癌発見率は0.07％）であった。また精密検査者数に
対する便潜血検査の陽性的中率は 100×97／3228＝ 3.0
％であり、このように偽陽性率が高いことが従来より指
摘されている。また１回の検便では陽性率が低下するこ
となども問題とされている。

【０００５】現在までに知られている腫瘍マーカーに
は、癌胎児性抗原（以下ＣＥＡと略す）、糖鎖抗原など
があり、すでに臨床の場で広く用いられている。またＣ
Ａ１９−９、ＮＣＣ−ＳＴ−４３９、ＣＡ１２５等のＣ
ＥＡ以外の腫瘍マーカーについても検討がなされてい
る。これらのモノクローナル抗体により認識される癌患
者の血清中の抗原の多くは、高分子量の糖蛋白質や糖脂
質である。

【０００６】大腸癌などの検査に用いるモノクローナル
抗体については、次のような出願もなされている。

【０００７】たとえば、特開昭６３−２２２７００号公
報には、癌の血清診断に有用なモノクローナル抗体につ
き開示があり、大腸癌細胞等の抗原でマウス等を免疫
し、免疫されたマウスから抗体産生細胞を分離した後、
この細胞と骨髄腫細胞とを融合させてモノクローナル抗
体を得、この抗体を回収して、大腸癌患者の腹水中の分
子量１００万以上の糖蛋白質抗原と反応し、ヒト大腸
癌、ヒト胃癌、ヒト胆管癌、ヒト肺腺癌、ヒト卵巣粘液
嚢胞腺癌、ヒト気管支上皮の一部、ヒト子宮頚管腺の一
部などと反応する性質を有するＩｇＭクラスに属するモ
ノクローナル抗体を分離することが示されている。

【０００８】特開昭６２−１１１６９７号公報には、ヒ
トの消化器官の癌細胞、膵臓の腫瘍細胞の確立された培
養細胞株で免疫された哺乳動物から脾細胞とミエローマ
細胞株を融合させてハイブリドーマ株を得ることによ
り、大腸癌等ヒトの消化器癌の診断のためのモノクロー
ナル抗体を得ることが示されている。

【０００９】特表昭６１−５０２７０１号公報には、患
者から採取した生理的液体の検体（血液、血清または血
漿）を小腸ムチン抗原（ＳＩＭＡ）および／または大腸
ムチン抗原（ＬＩＭＡ）に対するモノクローナル抗体と
接触させることにより、胃腸管癌のインビトロ検出を行
うことが示されている。なおこの公報には、従来技術の
説明の中で、抗原であるＣＥＡ、ＣＡ１９−９と、それ
らを腫瘍マーカーとするときの問題点につき詳細な説明
がある。

【００１０】特表平４−５０５０９７号公報には、マウ
スまたはラットを腫瘍−Ｍ２−ＰＫ（ピルビン酸キナー
ゼ−アイソザイムＭ２型）で免疫化し、免疫した動物の
脾臓由来のＢ−リンパ球を骨髄腫細胞と融合し、形成し
たハイブリドーマをクローニングし、腫瘍−Ｍ２−ＰＫ
結合性抗体を分泌するハイブリドーマを単離し、さらに
クローニングし、培養することによりモノクローナル抗
体を取得すること、この腫瘍−Ｍ２−ＰＫ特異抗体を使
用して腫瘍−Ｍ２−ＰＫを体液または組織・粘液内で検
出することが示されている。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】先にも述べたように、
現在までに知られている腫瘍マーカーにはＣＥＡなどが
あるが、血清ＣＥＡの大腸癌全体における陽性率は約４
０〜６０％と報告されており、病気の進行と共に陽性率
は上昇するが、早期癌では陽性となる症例は少ない。Ｃ
Ａ１９−９、ＮＣＣ−ＳＴ−４３９、ＣＡ１２５等のＣ
ＥＡ以外の腫瘍マーカーについても同様の結果となって
いる。

【００１２】森らは、大腸癌の早期発見を目指して便中
ＣＥＡを測定し、大腸癌の72.6％で陽性であったと報告
している（島野高志ら、日本臨床、46, 387, 1988 ）。
また大倉らも便中ＣＥＡを測定し、大腸癌の進行度に関
係なく高い陽性率を示したが、炎症性超疾患、胆石、
胃、十二指腸潰瘍などの良性疾患でも高値を示し、５７
７例の集団検診に応用したところ、便潜血反応陰性で便
中ＣＥＡ陽性者２１例中、大腸癌１例、大腸腺腫１例、
大腸憩室２例、胃ポリープ１例、胆石３例が発見された
と報告している（大倉久直ら、中外医学社、19: 136, 1
992 ）。

【００１３】このように、大腸癌集団検診に応用されつ
つあるＣＥＡについても偽陽性が認められ、現在のとこ
ろ大腸癌においては早期診断における腫瘍マーカーの有
用性は乏しいとされている。

【００１４】上述の特開昭６３−２２２７００号公報、
特開昭６２−１１１６９７号公報、特表昭６１−５０２
７０１号公報、特表平４−５０５０９７号公報の方法
も、ＣＥＡの場合と同様に、集団検診のような場合に適
用するには一定程度の限界がある。

【００１５】本発明は、このような背景下において、従
来の腫瘍マーカーとは異なるマーカーを検索し、そのマ
ーカーを特異的に認識するモノクローナル抗体を開発し
て、偽陽性率の低い確実な大腸癌スクリーニングに応用
することを目的とするものである。

【００１６】

【課題を解決するための手段】本発明の抗ヒト大腸癌粘
液モノクローナル抗体は、ＩｇＭクラスに属しかつ大腸
粘液中の分子量２５万〜５０万の多糖を認識するがヒト
ヘモグロビンは認識しないことを特徴とするものであ
る。

【００１７】本発明の抗ヒト大腸癌粘液モノクローナル
抗体の製造法は、予めヒトヘモグロビンを除去した大腸
癌患者の大腸粘液を免疫抗原として哺乳動物を免疫後、
Ｂ細胞調製工程、細胞融合工程、スクリーニング工程、
クローニング工程、ハイブリドーマ培養工程および抗体
の分離精製工程を実施することにより、ＩｇＭクラスに
属しかつ大腸粘液中の分子量２５万〜５０万の多糖を認
識するがヒトヘモグロビンは認識しない抗ヒト大腸癌粘
液モノクローナル抗体を得ることを特徴とするものであ
る。

【００１８】本発明の大腸癌スクリーニング法は、ヒト
大腸より採取したヒト大腸粘液またはヒト便中に含まれ
るヒト大腸粘液の中の上記の分子量２５万〜５０万の多
糖の量を、上記の抗ヒト大腸癌粘液モノクローナル抗体
を用いた酵素免疫測定法により測定し、その測定値に基
いて大腸癌か否かをスクリーニングすることを特徴とす
るものである。

【００１９】以下本発明を詳細に説明する。

【００２０】本発明の抗ヒト大腸癌粘液モノクローナル
抗体を得るにあたっては、まず、予めヒトヘモグロビン
をそれが検出されない程度に除去した大腸癌患者の大腸
粘液を免疫抗原として哺乳動物を免疫する。

【００２１】というのは、本発明における抗ヒト大腸癌
粘液モノクローナル抗体を得るための免疫抗原は大腸癌
患者の大腸粘液であるが、大腸癌患者の大腸粘液（以下
大腸癌粘液と略す）にはヘモグロビンが含まれているこ
とが多いところ、ヘモグロビンが存在するとそのヘモグ
ロビンをも認識する抗体ができやすい。そこで、ヘモグ
ロビンを認識しない抗体を産生すべく、ヘモグロビンを
障害にならない程度にまで除去することが必要になるの
である。

【００２２】ヘモグロビンを除去するための方法には、
ゲルろ過、ＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）セルロー
ス、ハイドロキシアパタイトなどによる吸着処理がある
が、本発明においては、抗ヒトヘモグロビンモノクロー
ナル抗体をリガンドとするイムノアフィニティー法によ
りヘモグロビンを除去することが特に望ましい。より具
体的には、抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体をＣ
Ｎ−Ｂｒ活性化セファロース４Ｂなどに常法により固定
してカラムに充填し、リン酸緩衝液を溶かした大腸癌粘
液を４℃程度の低温で循環させ、適宜の限外ろ過装置で
濃縮し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動）後、ウェスタンブロ
ッティングでヒトヘモグロビンのバンドが検出されない
程度に大腸癌粘液中のヒトヘモグロビンを除去するので
ある。

【００２３】本発明の抗ヒト大腸癌粘液モノクローナル
抗体は、典型的には、次のようにして得られる。すなわ
ち、たとえば、上記で得られたヒトヘモグロビン除去大
腸癌粘液を（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）エマルジョン
（商品名ＲＩＢ：フナコシ社製）と等量混和し、BALB/c
マウス（メス）に免疫後、Ｂ細胞調製工程、細胞融合工
程、スクリーニング工程、クローニング工程、ハイブリ
ドーマ培養工程、さらには抗体の分離精製工程を順に実
施する。

【００２４】〈Ｂ細胞調製工程〉マウス、ラット等の哺
乳動物を、ヒトヘモグロビン除去ヒト大腸癌粘液で免疫
する。投与手段としては、腹腔内注射、皮下注射、静脈
注射、脾内注射、皮内注射などが採用される。最初の免
疫は皮下および腹腔注射で、追加免疫は皮下注射でとい
うように、組み合わることも好ましい。最終免疫後、３
〜５日にマウス等の脾臓からＢ細胞を採取する。

【００２５】〈細胞融合工程〉前工程で採取したＢ細胞
とマウス等のミエローマ細胞とを混和し、細胞融合促進
剤（たとえば分子量２０００〜５０００の５０％ポリエ
チレングリコール）を加えることにより細胞融合を行
う。細胞融合後、細胞をＨＡＴ培地に懸濁し、３７℃、
５％炭酸ガス中で５日間培養後、ＨＴ培地を各穴に 0.1
mlずつ加えてさらに培養を続けると、１０日から１４日
でハイブリドーマが生育する。ここでミエローマ細胞と
しては、上述のＢ細胞調製工程で用いた被免疫動物と同
種の動物由来のもので、かつハイブリドーマ選択培地で
生育できず、しかもそれ自身が抗体を分泌しないものを
用いることが好ましい。このようなミエローマ細胞はす
でに市販されているので（たとえばマウスミエローマ細
胞 P3-X63-Ag8-653 など）、これを用いるのが簡便かつ
有効である。

【００２６】Ｂ細胞とミエローマ細胞の混合比は、１ :
１〜２０: １とすることが多いが、必ずしもこの範囲内
に限られるものではない。Ｂ細胞とミエローマ細胞との
細胞融合はランダムに起きるので、目的のハイブリドー
マを選別する必要がある。そこで上記操作の後、融合促
進剤を洗浄除去し、ミエローマ細胞用培地に懸濁したハ
イブリドーマの 0.1〜 0.5mlずつをたとえば９６穴培養
皿にまき、培養する。培養中ＨＡＴ培地などの公知の選
択培地を添加し、その割合を徐々に高める。最終的には
同様にして、さらに選択培地をハイブリドーマ培地と交
換する。このような培地交換により、ハイブリドーマ以
外の細胞は死滅する。なお、細胞融合方法としては、細
胞融合促進剤を用いる方法のほか、電気的手段による方
法なども採用できる。

【００２７】〈スクリーニング工程〉ハイブリドーマの
スクリーニングは、培養液中の抗体のヒトヘモグロビン
除去大腸癌粘液および健常者の大腸粘液への反応性を調
べること、より具体的には、物理吸着によりヒトヘモグ
ロビン除去大腸癌粘液と健常者大腸粘液とを固相化した
各９６穴プレートとの反応性を酵素免疫測定法により調
べることで行うことができる。この方法により、ヒト大
腸癌粘液に特異的な抗ヒト大腸癌粘液抗体を産生するハ
イブリドーマをスクリーニングすることができる。

【００２８】〈クローニング工程〉スクリーニングした
ハイブリドーマは、限界希釈法によりモノクローン化さ
れる。限界希釈法によるクローニングを実施する場合、
これを少なくとも３回以上繰り返して行うことで、より
確実にモノクローン化されたハイブリドーマが作成でき
る。

【００２９】〈ハイブリドーマ培養工程〉前工程で作製
したハイブリドーマをin vitroまたはin vivo で培養す
れば、目的のモノクローナル抗体が生産できる。in viv
o での培養は、予めプリスタン（２，６，１０，１４−
テトラメチルペンタデカン、シグマ社製）を腹腔投与し
たBALB/cマウスの腹腔内に、たとえば約１×１０⁷ 〜３
×１０⁷ 個のハイブリドーマを接種することにより実施
でき、接種後、１４日から２０日でモノクローナル抗体
を含む腹水を得ることができる。

【００３０】in vitroでの培養は、たとえば数個のハイ
ブリドーマの９６穴培養皿での培養からはじめ、しだい
に培養規模を上げることにより行うことができ、これに
より培養液中にモノクローナル抗体が分泌、蓄積され
る。

【００３１】〈分離精製工程〉腹水または培養物からの
モノクローナル抗体は、そのアイソタイプによって精製
方法が異なる。ＩｇＧであればプロテインＡ等のアフィ
ニティークロマトグラフィーによる精製が一般的である
が、ＩｇＭであればバイオゲル(Biogel) A-5mやセファ
クリル S 300-HR 等のゲルろ過によっても精製できる。
なお抗体のクラスの判別は、市販の抗体クラスを判定す
るキット、たとえばアマシャム製の「アイソタイピング
キット」を使用することにより行うことができる。

【００３２】〈抗原の精製〉得られた抗ヒト大腸癌粘液
モノクローナル抗体をＣＮ−Ｂｒ活性化セファロース４
Ｂに固定し、大腸癌粘液と反応させる。リガンドに結合
した抗原を溶出させ、ドットブロッティングで抗ヒト大
腸癌粘液モノクローナル抗体と反応する画分を集めて１
０mMリン酸緩衝液に対して透析した後、バイオゲル(Bio
gel) A-0.5mカラムで分画することにより、抗ヒト大腸
癌粘液モノクローナル抗体が認識する抗原を精製するこ
とができる。

【００３３】図１は、大腸癌粘液および精製抗原のＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ（２〜２０％ゲル）−ウエスタンブロッテ
ィングで、クマシ−ブリリアントブルーＲ２５０による
蛋白染色並びにペルオキシダーゼ標識抗ヒト大腸癌粘液
モノクローナル抗体による染色の結果を示したものであ
る。図１から、上記抗原からは蛋白質は検出されないこ
とがわかる。

【００３４】このように、抗ヒト大腸癌粘液モノクロー
ナル抗体をリガンドとするイムノアフィニティーとゲル
ろ過の組み合わせで得られる抗ヒト大腸癌粘液モノクロ
ーナル抗体と反応する抗原は、大腸癌患者の大腸粘液中
により多量に存在する分子量２５万〜５０万の多糖であ
る。

【００３５】〈大腸癌スクリーニング法〉触診により得
たヒト大腸粘液またはヒト便中に含まれるヒト大腸粘液
中の上記の多糖を、上記の抗ヒト大腸癌粘液モノクロー
ナル抗体を用いた酵素免疫測定法により測定する。そし
て、その多糖の量の多少に基き大腸癌か否かをスクリー
ニングする。

【００３６】この抗原を測定する方法としては、ラジオ
イムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩ
Ａ）、免疫凝集法などがあげられるが、２種類のモノク
ローナル抗体を用いたサンドイッチ酵素免疫測定法が好
ましい。

【００３７】上記ＥＩＡ法において、抗ヒト大腸癌粘液
モノクローナル抗体の固相化は常法に従って行うことが
できる。固相化のための担体としては、たとえばポリス
チレン、多孔性ガラス等のビーズあるいは９６穴プレー
トを用いることができる。

【００３８】モノクローナル抗体の標識剤としては、ヨ
ウ素（ ¹²⁵Ｉ) 、¹⁴Ｃ、トリチウム等の放射性アイソト
ープ；フルオレッセインイソシアネート、ローダミン等
の蛍光物質；ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファタ
ーゼ等の酵素；があげられるが、キット化するには酵素
が望ましい。酵素は市販のものを使用できる。これらの
酵素でモノクローナル抗体を標識するには、公知の方法
が採用される。

【００３９】上記測定系に利用される緩衝液としては、
反応に悪影響を与えない通常の各種の緩衝液を利用する
ことができる。本発明においては、たとえば、免疫反応
では５０mMから１００mMのリン酸緩衝液 (pH 7.0〜7.3)
に塩化ナトリウムを 0.1Ｍ含ませ、 0.2％にカゼインを
含ませるのが好ましい。

【００４０】測定の際の免疫反応条件には特に制限はな
く、通常のこの種の測定法と同様のものとすることがで
きる。

【００４１】大腸癌スクリーニングにあたっては、検体
として、触診により得たヒト大腸粘液またはヒト便を用
いることができる。これら検体中には、上記の抗原を分
解する酵素の存在が示唆されることにより、検体の保存
は冷蔵庫あるいは凍結によることが望ましい。

【００４２】

【作用】上記の抗原の分子量は２５万〜５０万であり、
蛋白質は検出されないが（ＢＣＡ法あるいはローリー
法）、糖質は検出され（フェノール硫酸法）、多糖であ
ることがわかる。この分子量２５万〜５０万の多糖から
なる抗原は、上記のＩｇＭクラスに属する抗ヒト大腸癌
粘液モノクローナル抗体と反応し、検体中の測定妨害物
質の影響を受けずに直接検体よりその抗原量を定量する
ことができる。そしてこの抗原量は、健常者の大腸粘液
または便では著しく低値を示し、大腸癌患者の大腸粘液
または便中では高値を示す。従って、上記の抗ヒト大腸
癌粘液モノクローナル抗体を用いて検体中の抗原量を測
定することにより、集団検診のような場合であっても、
低い疑陽性率で大腸癌のスクリーニングを行うことがで
きる。

【００４３】

【実施例】次に実施例をあげて本発明をさらに説明す
る。

【００４４】実施例１（モノクローナル抗体の製造） 抗ヒト大腸癌粘液モノクローナル抗体を次の工程に従っ
て製造した。用いた培地は次の通りである。

【００４５】〈培地〉 (a) RPMI 1640 培地

【００４６】 (b) ミエローマ細胞（またはハイブリドーマ）用培地 RPMI 1640 培地に以下のものを添加した培地 15 % ウシ胎児血清(FCS) 2 mM グルタミン 1 mM ピルビン酸ナトリウム 100 U/ml ペニシリンＧカリウム 100 μg/ml ストレプトマイシン

【００４７】(c) ＨＡＴ培地 上記の培地(b) に以下のものを添加した培地 0.1 mM ヒポキサンチン 0.4 mM アミノプテリン 16μM チミジン 5 % ブライクローン（大日本製薬社製）

【００４８】(d) ＨＴ培地 上記の培地(b) に以下のものを添加した培地 0.1 mM ヒポキサンチン 16μM チミジン 5 % ブライクローン（大日本製薬社製）

【００４９】〈ヒトヘモグロビン除去大腸癌粘液〉大腸
癌患者の大腸粘液を免疫抗原として用いた。まずヘモグ
ロビンを除去するために、抗ヒトヘモグロビンモノクロ
ーナル抗体１０mgを５mlのＣＮ−Ｂｒ活性化セファロー
ス４Ｂ（ファルマシア製）に常法により固定してカラム
に充填し、５０mMリン酸緩衝液を溶かした大腸癌粘液を
４℃で４８時間から７２時間ペリスタポンプで循環さ
せ、モルカット（商品名）あるいはセントリコン（商品
名）で濃縮し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリ
ウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）後、ウェスタ
ンブロッティングでヒトヘモグロビンのバンドが検出さ
れない程度に大腸癌粘液中のヒトヘモグロビンを除去し
た。

【００５０】〈免疫およびＢ細胞調製工程〉上記で得ら
れたヒトヘモグロビン除去大腸癌粘液を、（ＭＰＬ＋Ｔ
ＤＭ＋ＣＷＳ）エマルジョン（商品名ＲＩＢ：フナコシ
社製）と等量混和し、BALB/cマウス（メス）に免疫し
た。BALB/cマウスの免疫は、初回は皮下および腹腔、そ
の１０日後に皮下の２ケ所、さらにその１０日後に皮下
の２ケ所に、前述したエマルジョン混和抗原を注射して
行い、最後の皮下注射から１０日後に上記のヒトヘモグ
ロビン除去大腸癌粘液を腹腔に注射し、その３日後に脾
臓を取り出してＢ細胞を採取した。

【００５１】〈融合工程〉対数増殖期にあるマウスミエ
ローマ細胞 P3-X63-Ag8-653 の１×１０⁷ 個と、上記で
採取したＢ細胞の１×１０⁸ 個とを混合し（混合比１：
１０）、遠心洗浄後、３７℃に保温した５０％ポリエチ
レングリコール（和光純薬社製、分子量４０００）１ml
を１分間かけてゆっくり撹拌しながら加えた。その後、
２分間静置し、３７℃に保温した２０mlのRPMI 1640 培
地(a) を１０分間かけて緩やかに撹拌しながら加え、遠
心し、上清を除去した。得られたペレットに５０mlの培
地(c) を加え、緩やかに混和し、この 0.1mlずつを９６
穴プレートにまき、３７℃において５％炭酸ガス中で培
養した。５日間培養後、 0.1mlの培地(d) を加え、さら
に培養した。培養開始後４〜６日目にハイブリドーマの
生育がはじまり、１４〜１６日で７０〜８０％の穴にハ
イブリドーマの生育が認められた。

【００５２】〈スクリーニング工程〉１４〜１５日後の
培養液中の抗体の有無を、次に示す酵素免疫測定法（Ｅ
ＩＡ）で調べた。

【００５３】ＥＩＡプレートの作成：ヒトヘモグロビン
除去大腸癌粘液および健常者大腸粘液をそれぞれ糖含量
で２μg/２５μl になるように５０mM炭酸ナトリウム緩
衝液 (pH 9.6) で稀釈し、各プレートの穴に２５μl
（糖含量で２μg)加え、３７℃で１時間静置した後、真
空デシケーター中で完全に乾燥させた。各穴に 0.5％カ
ゼイン−リン酸緩衝液（５０mM、0.1M塩化ナトリウム含
有、pH 7.2）を２５０μl 加え、３７℃で２時間、もし
くは４℃で１５〜２４時間静置することでブロッキング
を行った後、１０mMリン酸緩衝液 (pH 7.2) で１回洗浄
し、真空デシケーター中で乾燥させて、スクリーニング
用ＥＩＡプレートとした。

【００５４】ＥＩＡ法：上記プレートにハイブリドーマ
の生育している培養液を 0.1ml加えて３７℃で１時間か
ら２時間反応させ、0.05％ Tween 20 （１０mMリン酸緩
衝液、0.1M塩化ナトリウム含有、pH 7.0〜7.4 、以下洗
浄液と略す）で３回洗浄後、市販されている抗マウスイ
ムノグロブリンペルオキシダーゼ標識抗体（コスモバイ
オ社製）を 0.2％カゼイン−リン酸緩衝液（５０mM、0.
1M塩化ナトリウム含有、pH 7.2）で１０００倍に稀釈
し、 0.1ml加え、３７℃で約１時間反応させた。洗浄液
で３回から５回洗浄後、２，２−アジノ−ビス−３−エ
チルベンズチアゾリン−６−スルホン酸（ＡＢＴＳ）を
クエン酸−リン酸緩衝液 (pH 4.2) で1.4mg/mlの濃度に
溶かし、局方過酸化水素を0.01〜0.03％になるように加
えた発色基質液 0.1mlを加え、室温で約５分間反応させ
た。0.05％アジ化ナトリウムを５０μl 加えて反応を停
止し、プレートリーダー（４０５nmのフィルター）で吸
光度を測定した。

【００５５】〈クローニング工程〉大腸癌粘液に特異的
な抗体産生株を選び、限界希釈法によりクローニングを
行った。BALB/cマウスの胸腺細胞と脾細胞の混合細胞を
フィーダー細胞として２×１０⁵ 個／穴加えて、培養を
行った。

【００５６】〈ハイブリドーマ培養工程〉予めプリスタ
ン0.5 mlを腹腔投与したBALB/cマウスに対し、上記で得
たハイブリドーマ１×10⁷ 個を腹腔内に接種した。１５
日目に目的とするモノクローナル抗体を含む腹水 3 ml/
マウスを得た。

【００５７】〈モノクローナル抗体精製工程〉目的とす
るモノクローナル抗体（ＩｇＭ、Ｌ鎖はκ類）を含む腹
水３mlをバイオゲル(Biogel) A-5m カラム（φ 2.5×４
０cm）にアプライし、５mlずつのフラクションコレクタ
ーで分画し、ＩｇＭ画分を集めて精製モノクローナル抗
体とした。腹水１mlより約８〜１２mgのモノクローナル
抗体が得られた。

【００５８】実施例２（抗原の精製法） 実施例１で得た抗ヒト大腸癌粘液モノクローナル抗体１
５mgを６mlのＣＮ−Ｂｒ活性化セファロース４Ｂに常法
により固定してカラム（φ 1.0×１０cm）に充填し、５
０nMリン酸緩衝液 (pH 7.0〜7.3)に溶かした大腸癌粘液
を２４時間から３６時間、ペリスタポンプで循環させた
後、上記リン酸緩衝液で充分に洗浄した（４〜６時
間）。

【００５９】リガンドに結合した抗原を 0.2Ｍグリシン
／塩酸緩衝液（0.5M塩化ナトリウムを含有するpH 2.5）
で溶出し、フラクションコレクターで分画し、ドットブ
ロッティングで抗ヒト大腸癌粘液モノクローナル抗体と
反応する画分を集めて１０mMリン酸緩衝液 (pH 7.0〜7.
3)に対して透析した。アフィニティー精製抗マウスイム
ノグロブリン抗体（ダコ社製、 3.6mg）をリガンドとす
るＣＮ−Ｂｒ活性化セファロース４Ｂ（３ml）を加え、
４℃で２４時間ローテイターで撹拌して反応させ、リー
クした抗ヒト大腸癌粘液モノクローナル抗体を除去した
後、濃縮し、バイオゲル(Biogel) A-0.5m カラム（φ
1.6×９０cm）で分画し、ドットブロッティングで抗原
画分を確認した後、目的とする画分を集めて濃縮し、精
製抗原とした。その結果、ヒト大腸癌粘液約２０mlよ
り、糖含量１２０μg/ml、蛋白質は検出されない分子量
２５万〜５０万の多糖抗原が 1.5ml（全糖量として１８
０μg)得られた。

【００６０】実施例３（酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）） 抗ヒト大腸癌粘液モノクローナル抗体を５０mM炭酸ナト
リウム緩衝液 (pH 9.6) で２μg/２５μl となるように
稀釈し、９６穴プレートに２５μl ずつ加え（２μg/
穴）、３７℃に１時間静置した後、真空デシケーター中
で完全に乾燥させた。実施例１のＥＩＡプレート作成と
同様の方法でブロッキングした後、ＥＩＡ乾燥プレート
を作成した。

【００６１】上記抗ヒト大腸癌粘液モノクローナル抗体
とは異なるエピトープを認識する抗ヒト大腸癌粘液モノ
クローナル抗体１ml (５mg/ml)を 0.9％塩化ナトリウム
で透析後、過ヨウ素酸処理したペルオキシダーゼ１ml
(５mg/ml)と混和し、速やかに１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝
液 (pH 9.6) を５０μl 加えてｐＨを 9.6とし、２５℃
で２時間反応させた。反応終了後、氷で冷やして４mg/m
l の水素化ホウ素ナトリウムを 0.1ml加え、４℃で２時
間還元処理を行った。 0.5Ｍリン酸緩衝液 (pH 6.0) を
発泡しなくなるまで加え（約１ml）、セファクリル S-3
00HRカラムで分画し、ペルオキシダーゼ標識抗ヒト大腸
癌粘液モノクローナル抗体を作成した（ペルオキシダー
ゼの回収率約９０％）。

【００６２】上記ＥＩＡ乾燥プレートの穴に大腸癌粘液
あるいは稀釈精製抗原 0.1mlを加え、３７℃で１時間反
応させた後、洗浄液で３回洗浄後、上記ペルオキシダー
ゼ標識抗体を 0.2％カゼイン−リン酸緩衝液で２μg/ml
の濃度となるように稀釈して0.1ml加え、３７℃で１時
間反応させた。反応終了後、洗浄液で３回洗浄した後、
実施例１のＥＩＡ法と同様にしてＡＢＴＳ液を調製して
発色し、測定を行った。図２は、このときのＥＩＡ法に
よる精製抗原の稀釈曲線である。

【００６３】適用例（臨床診断） 免疫学的便潜血検査に用いた採便液および大腸癌スクリ
ーニングで触診で得られた大腸粘液を検体として実施例
３で述べた方法で測定し、大腸癌との関係を調べた。触
診で得られた粘液７１例中３例が 2.5μg/mlよりも高値
を示し、そのうち２例が大腸癌と診断された。他の６８
例は全て 1.5μg/ml以下であった。また免疫学的潜血反
応検査に用いられた便２６例では、１例が 7.7μg/mlで
大腸癌と診断され、他の２５例は全て 1.0μg/ml以下で
あった。

【００６４】

【発明の効果】上記の抗原は分子量２５万〜５０万の多
糖であり、蛋白質は検出されないが（ＢＣＡ法あるいは
ローリー法）、糖質は検出される（フェノール硫酸
法）。ヒト大腸粘液に含まれるこの分子量２５万〜５０
万の多糖からなる抗原は、本発明のＩｇＭクラスに属す
る抗ヒト大腸癌粘液モノクローナル抗体と反応し、検体
中の測定妨害物質の影響を受けずに直接検体よりその抗
原量を定量することができる。そしてこの抗原量は、健
常者の大腸粘液または便では著しく低値を示し、大腸癌
患者の大腸粘液または便中では高値を示す。従って、上
記の抗ヒト大腸癌粘液モノクローナル抗体を用いて検体
中の抗原量を測定することにより、集団検診のような場
合であっても、低い疑陽性率で大腸癌のスクリーニング
を行うことができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】大腸癌粘液および精製抗原のＳＤＳ−ＰＡＧＥ
（２〜２０％ゲル）−ウエスタンブロッティングで、ク
マシ−ブリリアントブルーＲ２５０によるタンパク染色
並びにペルオキシダーゼ標識抗ヒト大腸癌粘液モノクロ
ーナル抗体による染色の結果を示したものである。

【図２】実施例３におけるＥＩＡ法による精製抗原の稀
釈曲線である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 高橋 俊雄 京都府京都市左京区修学院桧峠町６−５ (72)発明者 西川 一義 滋賀県甲賀郡甲南町耕心４丁目1078−34 (72)発明者 金光 健宅 滋賀県甲賀郡甲西町菩提寺330−328

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ＩｇＭクラスに属しかつ大腸粘液中の分子
   量２５万〜５０万の多糖を認識するがヒトヘモグロビン
   は認識しないことを特徴とする抗ヒト大腸癌粘液モノク
   ローナル抗体。
2. 【請求項２】予めヒトヘモグロビンを除去した大腸癌患
   者の大腸粘液を免疫抗原として哺乳動物を免疫後、Ｂ細
   胞調製工程、細胞融合工程、スクリーニング工程、クロ
   ーニング工程、ハイブリドーマ培養工程および抗体の分
   離精製工程を実施することにより、ＩｇＭクラスに属し
   かつ大腸粘液中の分子量２５万〜５０万の多糖を認識す
   るがヒトヘモグロビンは認識しない抗ヒト大腸癌粘液モ
   ノクローナル抗体を得ることを特徴とする抗ヒト大腸癌
   粘液モノクローナル抗体の製造法。
3. 【請求項３】大腸癌患者の大腸粘液からのヒトヘモグロ
   ビンの除去を、抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体
   をリガンドとするイムノアフィニティー法により行うこ
   とを特徴とする請求項２記載の抗ヒト大腸癌粘液モノク
   ローナル抗体の製造法。
4. 【請求項４】ヒト大腸より採取したヒト大腸粘液または
   ヒト便中に含まれるヒト大腸粘液の中の請求項１の分子
   量２５万〜５０万の多糖の量を、請求項１の抗ヒト大腸
   癌粘液モノクローナル抗体を用いた酵素免疫測定法によ
   り測定し、その測定値に基いて大腸癌か否かをスクリー
   ニングすることを特徴とする大腸癌スクリーニング法。