JPH08228782A - タンパク質結合磁気微粒子及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 固定化等の処理を行う必要がなく、形質転
換された磁性細菌を培養し、菌体内に生成した磁気微粒
子を分離するだけで酵素、抗体その他の有用タンパク質
を磁気微粒子の有機膜に結合した状態で安定して得るこ
とができる磁気微粒子の提供。 【解決手段】 磁気微粒子と、該磁気微粒子の表面を被
覆している有機膜に結合している、(a) 磁性細菌ＡＭＢ
−１の菌体内に生成する磁気微粒子を被覆する有機膜に
結合したｍａｇＡタンパク質のアミノ酸配列中の疎水性
領域（配列表に記載の配列番号２の第７〜第３８０アミ
ノ酸残基の領域）をコードする塩基配列で表されるＤＮ
Ａ配列を含むｍａｇＡ遺伝子断片と、(b) 該ｍａｇＡ遺
伝子断片の一方又は両方の末端に融合された、一又は二
の有用タンパク質をコードする一又は二のＤＮＡ配列
と、からなる融合ＤＮＡ配列でコードされた一又は二の
機能性タンパク質を含有する融合タンパク質とを有す
る、機能性タンパク質結合磁気微粒子。前記融合ＤＮＡ
配列を含むプラスミドで形質転換された磁性細菌を培養
することで菌体内に得られる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の技術分野】本発明は、タンパク質結合磁気微粒
子及びその製造方法、並びにそれらに関連した新規遺伝
子、遺伝子断片、融合ＤＮＡ配列、組み換えプラスミ
ド、形質転換された磁性細菌に関する。

【０００２】

【従来の技術】磁気微粒子に固定化された酵素、抗体等
の生理活性を有するタンパク質は、磁気的手段で誘導す
ることができるため、従来困難であった局所的な位置へ
の誘導が可能であり、磁気により集めたり、分離したり
することができるため、医療や発酵の分野を初めとする
各種産業において利用が期待されている。

【０００３】従来、磁気微粒子への生理活性物質の固定
化は特公平６−１２９９４に示されるように磁性細菌よ
り磁気微粒子をアルカリ処理で分離し、これをγ−アミ
ノプロピルトリエトキシシランやグルタルアルデヒドで
処理したのち、これに生理活性物質を化学的に固定化す
ることが行われていた。また、酵素処理により、磁性菌
から脂質から成る有機薄膜に被覆された状態で磁気微粒
子を分離し、グルタルアルデヒド処理後にタンパクの固
定化を行う方法も知られている。また、ＳＰＤＰを用い
る化学的結合法により生理活性物質を磁気微粒子に固定
化する方法も知られている（特開平５−２０９８８
４）。

【０００４】さらに、これらの方法で化学的に生理活性
物質を固定化した磁気微粒子を用いて抗原抗体反応を行
なわせる、抗原又は抗体の測定方法が提案されている
（特開平４−２８５８５７、同５−２０９８８４、特開
平５−９９９２６）。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】しかし、これらはいず
れも酵素、抗体等のタンパク質を化学的に磁気微粒子に
結合させる必要があるため、固定化処理に長時間を要す
る、固定化処理によりタンパク質の生理活性が低下す
る、得られる固定化タンパク質の固定化量にロット間バ
ラツキが大きくかつ活性のバラツキも大きい、固定化に
用いられるタンパク質は一般に高価であるので固定化タ
ンパク質は高コストにならざるを得ない、等の問題があ
った。

【０００６】そこで、本発明の課題は、これらの問題を
解決したタンパク質結合磁気微粒子等を提供することに
ある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明は、第一に、磁性
細菌ＡＭＢ−１の菌体内に生成する磁気微粒子を被覆す
る有機膜に結合したタンパク質をコードし、配列表に記
載の配列番号１で示されるＤＮＡ配列からなる、単離、
精製されたｍａｇＡ遺伝子を提供する。

【０００８】また、本発明は、磁性細菌ＡＭＢ−１の菌
体内に生成する磁気微粒子を被覆する有機膜に結合した
タンパク質であって、後述の配列表に記載の配列番号２
で示されるアミノ酸配列からなる、単離、精製されたｍ
ａｇＡタンパク質を提供する。

【０００９】本発明は、ｍａｇＡタンパク質の磁性細菌
内に生成される磁気微粒子を被覆する有機膜との結合性
に着目し、融合タンパク質の状態で別の有用タンパク質
を磁気微粒子に固定する方法、磁気微粒子上に有用タン
パク質を生成せしめる方法等を提供する。ｍａｇＡ遺伝子 本発明者は、後述の配列表に記載の配列番号１で示され
る塩基配列で表されるＤＮＡ配列からなり、磁性細菌の
菌体内に生成する磁気微粒子を被覆するリン脂質を主成
分とする有機膜に結合したタンパク質をコードするｍａ
ｇＡ遺伝子を見いだした。

【００１０】上記のｍａｇＡ遺伝子は、磁性細菌ＡＭＢ
−１（微工研菌寄第13282 号) から次のようにして見い
だされ、単離、精製された。

【００１１】磁性細菌ＡＭＢ−１に、薬剤耐性因子（Ｋ
ｍ）を持った転移性の遺伝子であるトランスポゾンＴｎ
５を導入することでゲノムに部位非特異的にミューテー
ションを生じさせ、磁気微粒子精製機能を欠損したミュ
ータントを作製した。次に、薬剤耐性因子（Ｋｍ）を指
標に磁気応答しない菌体を分離し、このミュータントか
らゲノムをCureent Protocols in Molecular Biologyの
方法で抽出した。EcoRI で切断後、サザンハイブリダイ
ゼーションでトランスポゾンＴｎ５とのハイブリッドの
形成を指標にｍａｇＡ遺伝子を含む遺伝子断片を単離
し、ｐＵＣ１９にクローニンすることで精製を行った。
遺伝子解析の結果、ｍａｇＡ遺伝子１．３ｋｂを見出し
た。ｍａｇＡタンパク質 該ｍａｇＡ遺伝子の配列の上流にはプロモーター配列が
隣接している。該タンパク質のアミノ酸配列は、後記の
配列表の配列番号２に示す（前記塩基配列とともに表
示）通りであり、Ｎ末端から第１〜第６アミノ酸残基の
範囲が親水性領域であり、それに続く第７〜第３８０ア
ミノ酸残基の範囲が疎水性領域であり、続く第３８１〜
４３４アミノ酸残基の範囲が第二の親水性領域である。
中央の長い疎水性領域が膜結合部位であり、両端の親水
性領域は膜から露出した状態にある。詳細には、疎水性
領域は短い親水性部分を約４箇所含んでおり、これらの
部分は膜から一部露出しているものと推定される。

【００１２】このタンパク質は次のようにして単離、精
製された。磁性細菌ＡＭＢ−１を定常期まで培養し、遠
心集菌後フレンチプレスより細胞を破砕した。この破砕
物からサマリウムコバルト磁石で磁気微粒子を抽出し、
精製した。次に１％Tryton 10mM トリス緩衝液中で２時
間攪拌し、磁気微粒子と膜を分離した。このように処理
した抽出物についてタンパク電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ）を行ったところ、前記ｍａｇＡ遺伝子からコードさ
れるタンパク質の分子量として既知である、46.8kDa の
ところにバンドが確認された。

【００１３】ｍａｇＡタンパク質のホモロジー検索を行
った結果、大腸菌のカリウムイオン流出機構を司るタン
パク質と高いホモロジーを示した。これよりｍａｇＡタ
ンパク質はカチオンイオンの流出に関与すると考えられ
る。そこでｍａｇＡ遺伝子を大腸菌内で発現させ、細胞
外膜を除去した後に逆転膜リポソームを作製し、このリ
ポソームの鉄イオン流出現象をラジオアイソトープ標識
した鉄を用いて確認した。この結果、ｍａｇＡタンパク
質は鉄イオンの排出を行っていることが分かった。

【００１４】該ｍａｇＡタンパク質は前記のｍａｇＡ遺
伝子によりコードされるものであるが、より一般的に
は、配列表に記載の配列番号３で示される塩基配列を融
合するＤＮＡ配列によりコードされる。

【００１５】本発明者は、ｍａｇＡタンパク質の疎水性
領域が該タンパク質を磁気微粒子の有機膜に結合する機
能を有し、両端の親水性領域は有機膜から露出すること
に着目し、親水性領域に別の有用タンパク質をコードす
るＤＮＡ配列を融合すると、得られる融合ＤＮＡ配列は
磁性細菌内で該有用タンパク質を磁気微粒子の有機膜に
結合した状態で生成することを見いだした。ｍａｇＡ遺伝子断片 そこで、本発明は、第二に、磁性細菌ＡＭＢ−１の菌体
内に生成する磁気微粒子を被覆する有機膜に結合したｍ
ａｇＡタンパク質のアミノ酸配列中の疎水性領域（配列
表に記載の配列番号２の第７〜第３８０アミノ酸残基の
領域）をコードする塩基配列で表されるＤＮＡ配列を含
むｍａｇＡ遺伝子断片を提供する。

【００１６】該ｍａｇＡ遺伝子断片は融合タンパク質を
有機膜に結合した状態で生成させるための、固定手段と
して有用である。

【００１７】該ｍａｇＡ遺伝子断片は上記の疎水性領域
を含むことを必須とするが、３’末端側又は５’末端側
にｍａｇＡ遺伝子に存在する塩基配列の全部又は一部が
存在してもよい。融合ＤＮＡ配列 また、本発明は、第三に、(a) 該ｍａｇＡ遺伝子断片
と、(b) 該ｍａｇＡ遺伝子断片の一方又は両方の末端に
融合された、一又は二の有用タンパク質をコードする一
又は二のＤＮＡ配列と、からなる融合ＤＮＡ配列を提供
する。

【００１８】有用タンパク質をコードするＤＮＡ配列は
ｍａｇＡ遺伝子断片の３’末端側及び５’末端側のいず
れか一方に融合されてもよいし、両方に融合されてもよ
い。両方に融合される場合には、３’末端に導入される
ＤＮＡ配列と５’末端に導入されるＤＮＡ配列とは同一
のタンパク質をコードするものでもよいし、異なるタン
パク質をコードするものでもよい。両方に融合する利点
は、次のような場合に得られる。 １）両末端に同一のタンパク質をコードするＤＮＡ配列
を導入することで、磁気微粒子への該タンパク質の固定
化量を向上させることができる。 ２）５’末端と３’末端に２つの連続する複合酵素系又
は酵素と補酵素再生酵素などのタンパク質をコードする
ＤＮＡ配列を導入することで、酵素系の反応を迅速に進
めることができる。 ３）５’末端と３’末端にサブユニットを形成するタン
パク質をコードするＤＮＡ配列を導入することで、この
サブユニットを迅速にかつ完全に形成させることができ
る。

【００１９】該ｍａｇＡ遺伝子断片に前記有用タンパク
質をコードするＤＮＡ配列を融合させる位置は、融合部
に生成する塩基配列がアミノ酸合成に適したものとなる
限り制限されない。前記疎水性領域をコードするＤＮＡ
配列に近接する形で有用タンパク質をコードするＤＮＡ
配列が導入されてもよいし、疎水性領域をコードするＤ
ＮＡ配列と有用タンパク質をコードするＤＮＡ配列との
間に前記親水性領域をコードするＤＮＡ配列が部分的に
存在してもよい。また、ｍａｇＡ遺伝子断片の一方又は
両方の端に、都合のよい制限酵素切断部位が生じるよう
に人工的に延長されたＤＮＡ配列が存在してもよい。特
に５’末端側の親水性領域は短いので、これらは全て存
在していてもよいし、必要に応じこの部分が延長されて
いてもよい。目的とする有用タンパク質をコードするＤ
ＮＡ配列を挿入する部位として有用な５’末端側の制限
酵素切断部位としては、ｍａｇＡ遺伝子内に導入したＳ
ｃａＩ切断部位があり、３’末端側の制限酵素切断部位
としてはＳｐｈＩ切断部位、ＤｒａΙΙΙ切断部位があ
る。ＳｐｈＩ切断部位とＤｒａΙΙΙ切断部位はｍａｇ
Ａ遺伝子の疎水性領域から僅かに下流側に寄った親水性
領域内に存在するので、好都合な部位の一つである。組み換えプラスミド 本発明は、第四に、上記の融合ＤＮＡ配列を発現させる
のに用いる組み換えプラスミドを提供する。

【００２０】即ち、本発明は、前記の融合ＤＮＡ配列を
含有する組み換えプラスミドを提供する。

【００２１】該組み換えプラスミドは、前記のｍａｇＡ
遺伝子断片及び目的とするタンパク質をコードするＤＮ
Ａ配列からなる融合ＤＮＡ配列を公知の方法により適当
なべクタープラスミドに導入することにより得られる。

【００２２】組み換えプラスミドの調製に用いるベクタ
ーとしては、例えば、ｐＲＫ４１５の系統、ｐＫＴ２３
０の系統のものを用いることができる。選択したベクタ
ーに遺伝子を組み込む。ベクターに最も効率よく、また
遺伝子が目的の向きに並ぶように、遺伝子を組み込む
順、用いる制限酵素を決定する。遺伝子を導入する手順
が決定したなら、制限酵素によってＤＮＡを切断し、電
気泳動を行うことにより導入する目的遺伝子断片を分離
する。その後、リガーゼを用いてライゲーションを行い
ＤＮＡを連結する。遺伝子断片の連結部分が合わない場
合は末端部分を平滑化処理し、ライゲーションを行う。
制限酵素、リガーゼ、末端平滑化用の酵素などは全て市
販のものを用いて行うことができる。最後に目的のプラ
スミドができているかどうか制限酵素の切断パターンを
確認する。

【００２３】この際、ｍａｇＡ遺伝子と融合させる、別
のタンパク質をコードする遺伝子の種類は特に限定され
るものではない。形質転換された磁性細菌 本発明は、第五に、上記の組み換えプラスミドで形質転
換された磁性細菌を提供する。

【００２４】磁性細菌の上記プラスミドによる形質転換
は公知の方法により行うことができる。宿主として用い
る磁性細菌としては、例えば、Magnetospirillum種の微
生物（例：菌株AMB-1(微工研菌寄13282), MS-1(IFO 152
72, ATCC 31632, DSM 3856),MSR-1(IFO 15272, DSM 636
1)、及びDesulfovibrio 種の微生物（例：菌株RS-1(微
工研菌寄13283)) が挙げられる。

【００２５】こうして得られた磁性細菌を適切な条件下
で培養することにより菌体内に目的とする有用タンパク
質を有する磁気微粒子が生成する。具体的には、目的と
するタンパク質は、ｍａｇＡ遺伝子断片によりコードさ
れる膜結合性タンパク質と融合した状態で、その磁気微
粒子を被覆している有機膜に結合した状態で得られる。

【００２６】このタンパク質結合磁気微粒子は、該タン
パク質が機能性タンパク質である場合に特に有用であ
る。磁気により該磁気微粒子を所望の箇所へ移動し、そ
の箇所でそのタンパク質が有する機能を発揮させること
ができるからである。機能性タンパク質結合磁気微粒子 そこで、本発明は、第六に、磁気微粒子と、該磁気微粒
子の表面を被覆している有機膜に結合している、前記の
融合ＤＮＡ配列（但し前記有用タンパク質が機能性タン
パク質である）でコードされた一又は二の機能性タンパ
ク質を含有する融合タンパク質とを有する、機能性タン
パク質結合磁気微粒子を提供する。タンパク質結合磁気微粒子の製造方法 また、本発明は、第七に、上記の融合ＤＮＡ配列を含む
プラスミドにより形質転換された磁性細菌を培養するこ
とにより、前記融合ＤＮＡ配列を発現させ、有用タンパ
ク質を含む融合タンパク質を、磁気微粒子を被覆する有
機膜に結合した状態で該菌体内に生成させることからな
る、上記有用タンパク質結合磁気微粒子を製造する方法
を提供する。

【００２７】該有用タンパク質結合磁気微粒子は、培養
により増殖した磁性細菌の菌体を通常の方法によって破
砕又は溶解したのち磁気を利用して容易に集めることが
できる。

【００２８】本発明によりｍａｇＡ遺伝子断片と融合さ
れる有用なタンパク質をコードする遺伝子も、それによ
り発現されるタンパク質も特に限定されない。医療、発
酵を利用する産業等の目的に使用される場合には何らか
の機能、例えば、生理活性を有するタンパク質が用いら
れよう。しかし、これに限定されるものではなく、通常
の方法では分離、取得が困難であるタンパク質の製造に
本発明を利用することができる。即ち、このようなタン
パク質を融合タンパク質の形で磁気微粒子上に生成さ
せ、磁気的に容易に分離し集めることができる。

【００２９】有用タンパク質の内、機能性タンパク質と
しては、例えば、抗原、抗体、プロテインＡ等の免疫関
連タンパク質、レクチン、アビジン等の結合能を有する
タンパク質、補酵素、加水分解酵素、酸化還元酵素、異
性化酵素、転移酵素、脱離酵素、制限酵素等の酵素類が
挙げられる。

【００３０】また、上記の有用タンパク質の製造方法
は、そのタンパク質が機能性を有しない有用タンパク質
である場合であっても、そのタンパク質が従来の製造方
法によっては純粋な形で得ることが困難であるときに
は、該タンパク質の製造方法として有用である。この場
合有用タンパク質は磁気微粒子に結合した状態で得られ
るが、上記の方法で磁石等を用いる磁気的方法で容易に
他の細胞成分から分離、精製することができる。利用可能性 本発明は、例えば、次のような利用可能性を有する。 1)酵素結合担体 一般に部位特異的に働くことが理想であると考えられる
酵素はすべて磁気微粒子表面で発現させる価値がある。
例えば、生化学反応において反応系の中で局所的にある
酵素反応を行いたい場合にはこの酵素を発現させた磁気
微粒子は有用である。また、ある酵素系の疾患において
は器官に特異的にその酵素を投与したい場合磁気微粒子
表面に発現させた酵素を磁気的に誘導することによっ
て、治療することが可能である。 2)DNA キャリア DNA やRNA との結合能を持つタンパク質、例えばリプレ
ッサーなどのタンパク質の遺伝子をｍａｇＡ遺伝子断片
と融合し、本発明により磁気微粒子に固定すると、この
磁気微粒子を遺伝子の輸送を行うキャリアとして用いる
ことが可能である。リプレッサーなどのタンパク質はあ
る特定の物質の存在下で結合力を失う特性がある。これ
を利用して、遺伝子の輸送を行うことができる。リプレ
ッサータンパク質の例としてはＬａｃＩが挙げられる。
ＬａｃＩとはラクトース分解酵素の遺伝子発現を制御す
るタンパク質で、プロモーターの下流域に結合すること
によって、遺伝子の転写を抑制するリプレッサーであ
る。このＬａｃＩはラクトースや、ＩＰＴＧなどの化学
物質と結合することによって、ＤＮＡとの結合能を失
う。つまり、分解する基質が存在するときに発現する仕
組みになっているのである。また、ＬａｃＩが結合する
特定のＤＮＡドメインがある。ＤＮＡドメインを組み込
んだ遺伝子はＬａｃＩが結合することができる。

【００３１】例えば、このＬａｃＩを磁気微粒子表面で
発現させることによって、ＬａｃＩがＤＮＡドメインを
組み込んだ遺伝子と結合する。一方、ＬａｃＩは、ＩＰ
ＴＧという物質によってＤＮＡとの結合能を失う。これ
を用いてある特定の場所からＤＮＡを磁気輸送し、ＩＰ
ＴＧの添加によってＤＮＡを遊離させることができる。
こうして、遺伝子を所要の場所へ輸送することができ
る。

【００３２】したがって、本発明の磁気微粒子は、遺伝
子治療における遺伝子移送担体などに応用することが考
えられる。例えば、目的遺伝子の相補鎖からできるアン
チセンスＲＮＡを発現させることによって、その目的の
遺伝子の発現をＲＮＡハイブリッドの形成によって抑え
るという治療法が現在盛んに研究されているが、そのア
ンチセンスのＲＮＡを発現するＤＮＡを運ぶ手段として
用いることができる。

【００３３】また、さらに、金属結合性のタンパク質を
磁気微粒子表面に発現させ、これを金属の回収、また
は、検出に用いることができる。回収、検出は磁気回収
によって行うことができる。 3)タンパク質生産システム 一般に分離精製が困難であると言われるタンパク質は、
磁気微粒子上にMagAタンパク質との融合タンパク質とし
て発現させることで、分離精製が容易になる。即ち、磁
気微粒子表面で発現させたタンパク質は、最後に磁気に
より容易に回収できるからである。磁性細菌から得られ
る磁気微粒子の分散性の高さを考えると、タンパク質に
よっては、磁気微粒子に固定化された状態で使用可能な
ものも多く存在すると考えられる。例えばアルコール発
酵用の酵素などは磁気微粒子と結合したままの状態でも
酵素の活性さえあれば十分に使用可能であると考えられ
る。

【００３４】

【実施例】

例１Ｉ．組み換えプラスミドの調製 蛍ルシフェラーゼ遺伝子（ｌｕｃ遺伝子、東洋インキ
製）を磁性細菌内で発現させ、該遺伝子でコードされる
発光タンパク質を磁気微粒子を被覆する有機膜上に生成
させるため、ｍａｇＡ−ｌｕｃ融合遺伝子を結合したプ
ラスミドｐＫＭＬ、及びｍａｇＡ遺伝子を含まずｌｕｃ
遺伝子のみを結合したプラスミドｐＫＰＬを図１に示す
方法で作製した。 (1) ベクターには磁性細菌ＡＭＢ−１に接合伝達による
遺伝子導入が可能であり、テトラサイクリン耐性遺伝子
を持つプラスミドｐＲＫ４１５（Ｎ．Ｔ．Ｎｅｅｎ，
Ｓ．Ｔａｍａｋｉ，Ｄ．Ｋｏｂａｙａｓｈｉ ａｎｄ
Ｄ．Ｔｒａｌｌｉｎｇｅｒ，１９８８，Ｇｅｎｅ ７
０：１９１−１９７）を用いた。ｐＲＫ４１５にｌｕｃ
遺伝子を組み込み、プラスミドｐＫＬＣを作製した。プ
ラスミドｐＫＬＣをｌｕｃ遺伝子の上流部に存在するＢ
ａｍＨＩで切断し、ブランティングキット（Ｂｌｕｎｔ
ｉｎｇ Ｋｉｔ）（宝酒造製）で平滑末端化した。 (2) ＡＭＢ−１のクロモゾームをＥｃｏＲＩで切断し、
λＤＮＡであるλＺＡＰＩＩにランダムに組み込んでλ
ＺＡＰＩＩジーンバンクを作製した。これはファージ粒
子中にパッケージし、大腸菌に感染させることによっ
て、プラークの形でジーンバンクを作製している。ｐＵ
Ｍ５ＡはλＺＡＰＩＩジーンバンクより分離したｍａｇ
Ａ遺伝子を含む２．６ｋｂｐのＥｃｏＲＩ遺伝子断片を
ｐＵＣ１９にクローニングして得た（図２）。分離の際
にはプラークサザンハイブリダイゼーションを行った。

【００３５】次に、ｍａｇＡ遺伝子をプラスミドｐＵＭ
５ＡのＳｐｈＩで切断し、ｍａｇＡ遺伝子断片を分離
し、同様に平滑末端化し、プラスミドｐＫＬＣと接続
し、プラスミドｐＫＭＬを作製した。こうしてｍａｇＡ
の読み訳とずれることなくｌｕｃ遺伝子は翻訳され融合
タンパク質を生産することが出来る。 (3) プラスミドｐＵＭ５ＡからＥｃｏＲＩ、ＮｃｏＩで
切断し、プロモーターの配列のみを分離したものを、同
様に平滑末端化したプラスミドｐＫＬＣに接続しプラス
ミドｐＫＰＬを作製した。

【００３６】以上の操作によりプロモーター領域のみを
ｌｕｃ遺伝子と結合したプラスミドｐＫＰＬとｍａｇＡ
−ｌｕｃ融合遺伝子を結合したｐＫＭＬの２種を作製し
た。ｐＫＭＬの制限酵素切断部位地図を図３に示す。II. 接合伝達体の作製 次に、Ｉで得られた二種の組み換えプラスミドを接合伝
達により野生株ＡＭＢ−１に導入し、接合伝達体の作製
を行った。接合伝達における供与菌体として用いたE. c
oli S17-1 はｔｒａ遺伝子を有しているため、接合伝達
を行う際、ヘルパープラスミドなしで接合伝達が可能で
ある。接合伝達にはＭＳＧＭ培地で培養した対数期中期
から後期の磁性細菌約８×１０⁷ ｃｅｌｌｓ／ｍｌを用
い、供与菌体は前日にプラスミドを導入し発生したコロ
ニーをかき取って１０⁹ から１０¹⁰ｃｅｌｌｓ／ｍｌに
なるように懸濁して用いた。１：５０（磁性細菌：大腸
菌）で菌を混合し、寒天プレート上にスポットし、メイ
ティングを行った。６時間後スポットをメスで切り取り
５ｍｌ程度のＭＳＧＭ培地を用い菌体を回収した。この
懸濁液をテトラサイクリン２．５μｇ／ｍｌを添加した
ＭＳＧＭ培地に植菌した。２５℃で培養し、増殖した細
胞を接合伝達体とした。この際、大腸菌はＭＳＧＭ培地
では増殖しない。

【００３７】次に接合伝達後ＭＳＧＭ培地で培養した磁
性細菌より磁気微粒子の分離を行った。磁性細菌を遠心
分離により集菌後１０ｍＭトリスバッファーで２回洗浄
後、菌体濃度０．１ｇ ｗｅｔ ｃｅｌｌ／ｍｌを超え
ない濃度で懸濁し、出力１２０Ｗ、３０秒間５回の超音
波破砕を行った。細胞破砕懸濁液を容器内で氷冷しなが
らＮｄ−Ｃｏ磁石を容器外壁面に当てて３０分処理し、
磁気微粒子を懸濁液中から分離した。さらに懸濁液を
５，０００Ｇ、１５分遠心分離することで細胞膜成分を
分離し、１００，０００Ｇ、１．５時間超遠心する事で
細胞質を分離した。

【００３８】磁気微粒子、細胞膜及び細胞質の各分画の
ルシフェーラーゼ活性をピッカジーン発光キット（東洋
インキ製）を用いルミノメーターで発光量を測定するこ
とで行い、導入したルシフェラーゼ遺伝子の発現及び発
現量を測定した。結果を表１に示す。

【００３９】

【表１】 （単位：キロカウント／ｍｇタンパク質） 表１に示すように、プロモーター領域の配列のみをｌｕ
ｃ遺伝子と結合したｐＫＰＬ遺伝子を導入した磁性細菌
は細胞質分画の発光量が高く、磁気微粒子表面でのタン
パク質の発現効率が低いのに対し、ｍａｇＡ−ｌｕｃ融
合遺伝子を結合したｐＫＭＬを導入した磁性細菌では磁
気微粒子分画と細胞膜分画で高い発光量が得られた。即
ち、膜結合性タンパク質であるｍａｇＡ融合タンパク質
が磁気微粒子分画でも発現しており、磁気微粒子を被覆
する有機膜上でのｌｕｃタンパク質の生産及び分離が示
された。例２ 抗ウサギＩｇＧ抗体の抗原認識部位をコードした遺伝子
（ｉｇｇ遺伝子、ファルマシア社）を該遺伝子でコード
される抗体タンパク質を磁気微粒子を被覆するリン脂質
を主成分とする有機膜上に生成させるため、ｍａｇＡ−
ｉｇｇ融合遺伝子を結合したプラスミドｐＫＭＧを図４
に示す方法で作成した。

【００４０】即ち、ベクターには磁性細菌ＡＭＢ−１に
接合伝達による遺伝子導入が可能であり、テトラサイク
リン耐性遺伝子を持つプラスミドｐＲＫ４１５を用い
た。ｐＲＫ４１５をＥｃｏＲＩで切断し平滑末端化しｉ
ｇｇ遺伝子を組み込み、プラスミドｐＫＧＣを作製し
た。

【００４１】次に、磁性細菌ＡＭＢ−１のクロモゾーム
をＥｃｏＲＩで切断し、λＤＮＡであるλＺＡＰII（Ｓ
ＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）にランダムに組み込みλＺＡ
ＰIIジーンバンクを作製した。これはファージ粒子中に
パッケージし、大腸菌に感染させることでプラークの形
でジーンバンクを作製した。λＺＡＰIIジーンバンクよ
り分離したｍａｇＡ遺伝子を含む２．６ｋｂｐのＥｃｏ
ＲＩ遺伝子断片をｐＵＣ１９にクローニングしｐＵＭ５
Ａを作製した。

【００４２】次に、ｍａｇＡ遺伝子をプラスミドｐＵＭ
５ＡのＳｐｈＩで切断し、ｍａｇＡ遺伝子を分離し、平
滑末端化し、プラスミドｐＫＧＣと接続しプラスミドｐ
ＫＭＧを作製した。ｐＫＭＧの制限酵素切断部位地図を
図５に示す。

【００４３】このプラスミドを接合伝達によって野生株
AMB-1 に導入し、接合伝達体を作製した。接合伝達体を
培養し、細胞を回収、破砕を行い、磁気微粒子を回収し
た。この磁気微粒子を用いて、ウサギIgG を抗原とした
イムノアッセイを行った。イムノアッセイはアルカリフ
ォスファターゼ標識した抗ウサギIgG 抗体を２次抗体と
して用いたサンドイッチ法を用い、検出はアルカリフォ
スファターゼと、AMPPD(Boehringer Mannheim Biochemi
ca) との反応による発光をルミノメーターで測定した。
この結果、抗原を検出することが可能であった。この実
験により、接合伝達体の磁気微粒子に抗体がMagA融合タ
ンパク質として結合することによって、抗体固定化操作
なしに抗原検出システムに用いることが可能な磁気微粒
子を生産することができた。例３ プロテインＡ遺伝子（ＰｒｏｔｅｉｎＡ ｇｅｎｅ、フ
ァルマシア社製ｐＥＺＺ１８より分離）を該遺伝子でコ
ードされるタンパク質を磁気微粒子を被覆するリン脂質
を主成分とする有機膜上に生成させるため、ｍａｇＡ−
プロテインＡ融合遺伝子を結合したプラスミドｐＫＭＡ
を図６に示す方法で作製した。

【００４４】即ち、ベクターには磁性細菌ＡＭＢ−１に
接合伝達による遺伝子導入が可能であり、テトラサイク
リン耐性遺伝子を持つプラスミドｐＲＫ４１５を用い
た。ｐＲＫ４１５をＥｃｏＲＩで切断しプロテインＡ遺
伝子を組み込み、プラスミドｐＫＡＣを作製した。

【００４５】次に、磁性細菌ＡＭＢ−１のクロモゾーム
をＥｃｏＲＩで切断し、λＤＮＡであるλＺＡＰII（Ｓ
ＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）にランダムに組み込みλＺＡ
ＰIIジーンバンクを作製した。これはファージ粒子中に
パッケージし、大腸菌に感染させることでプラークの形
でジーンバンクを作製した。λＺＡＰIIジーンバンクよ
り分離したｍａｇＡ遺伝子を含む２．６ｋｂｐのＥｃｏ
ＲＩ遺伝子断片をｐＵＣ１９にクローニングしｐＵＭ５
Ａを作製した。

【００４６】次に、ｍａｇＡ遺伝子をプラスミドｐＵＭ
５ＡのＳｐｈＩで切断し、ｍａｇＡ遺伝子を分離し、平
滑末端化したプラスミドｐＫＡＣと接続しプラスミドｐ
ＫＭＡを作製した。ｐＫＭＡの制限酵素切断部位地図を
図７に示す。

【００４７】このプラスミドを接合伝達によって野生株
AMB-1 に導入し、接合伝達体を作製した。接合伝達体を
培養し、細胞を回収、破砕を行い、磁気微粒子を回収し
た。この磁気微粒子に対し、プロテインＡのIgG との結
合能に注目し、抗杉花粉、抗小麦、抗卵IgG と混合し
た。混合した粒子は洗浄し、抗体固定化量を測定したと
ころ、従来用いられてきたSPDPを用いる化学結合法（特
開平５−２０９８８４）と同程度の固定化が可能である
ことが示された。また、実施例１と同様に、抗原検出実
験を行った結果、３種の抗原はどれも検出可能であっ
た。このようにプロテインＡのmagA融合タンパク質を用
いて様々なIgG を磁気微粒子表面に簡便に結合させるこ
とが可能であり、従来の化学結合に劣らない抗原検出が
可能であることが示された。例４ 蛍ルシフェラーゼ遺伝子（ｌｕｃ遺伝子）をｍａｇＡ遺
伝子の５’末端側に導入し、ｌｕｃ−ｍａｇＡ融合ＤＮ
Ａ配列を含むプラスミドｐＮＥＬＭを図８に示す方法で
作製した。 (1) ベクターには磁性細菌ＡＭＢ−１に接合伝達による
遺伝子導入が可能であり、テトラサイクリン耐性遺伝子
をもつプラスミドｐＲＫ４１５を用いた。このｐＲＫ４
１５のＮｃｏΙ切断部位とＥｃｏＮΙ切断部位を平滑末
端化処理により欠損させ、プラスミドｐＲＫ４１５ＮＥ
を作製した。ｐＲＫ４１５ＮＥをＳａｃＩで切断し、ｍ
ａｇＡプロモータ−ｌｕｃ融合遺伝子を組み込んだプラ
スミドｐＮＥＰＬを生成した。 (2) 次に、ｍａｇＡ遺伝子を保持するプラスミドｐＵＭ
５ＡにＳｃａＩ切断部位をデザインしたプライマーを用
い、ＰＣＲによりｍａｇＡ遺伝子を増幅させＳｃａＩで
切断し、ＥｃｏＮＩで切断後平滑末端化したプラスミド
ｐＮＥＰＬと接続し、プラスミドｐＮＥＬＭを作製し
た。ｐＮＥＰＬの制限酵素切断部位地図を図９に示す。 (3) このプラスミドを接合伝達によって野生株ＡＭＢ−
１に導入し、接合伝達体を作製した。接合伝達体を培養
して増殖させ、細胞を回収、破砕を行い、磁気微粒子を
磁石を用いて回収した。この磁気微粒子のルシフェラー
ゼ活性を、ピッカジーン発光キット（東洋インキ製）を
用いルミノメーターで発光量を測定した。結果を表２に
示す。

【００４８】

【表２】 （単位：キロカウント／μｇタンパク質） 次に、磁気微粒子上におけるｍａｇＡタンパク質のＣ末
端及びＮ末端の露出方向を確認するために、ｍａｇＡ遺
伝子の３’末端にｌｕｃ遺伝子を結合したプラスミドｐ
ＫＭＬを保持する接合伝達体由来の磁気微粒子と、ｍａ
ｇＡ遺伝子の５’末端にｌｕｃ遺伝子を結合したプラス
ミドｐＮＥＬＭを保持する接合伝達体由来の磁気微粒子
において、抗ルシフェラーゼＩｇＧ及びアルカリホスフ
ァターゼ標識抗ウサギＩｇＧを用いてイムノアッセイを
行った。検出はアルカリホスファターゼとＡＭＰＰＤ
（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｃａ）との反応による発光をルミノメーターで
測定した。結果を表３に示す。

【００４９】

【表３】 （単位：キロカウント／ｍｇタンパク質） この実験により、ｍａｇＡタンパク質のＮ末端及びＣ末
端は磁気微粒子を被覆する有機膜の外側に露出している
ことが明らかとなった。従って機能性タンパク質の性質
に応じてｍａｇＡタンパク質のＮ末端に融合した融合タ
ンパク質として生成させるかＣ末端に融合した融合タン
パク質として生成させるかを選択することができる。例５ 蛍ルシフェラーゼ遺伝子及びクロラムフェニコールアセ
チルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子を磁気微粒子
上に同時発現させるため、ｌｕｃ−ｍａｇＡ−ｃａｔ融
合ＤＮＡ配列を含む遺伝子であるプラスミドｐＮＥＬＭ
Ｃを図１０に示す方法で作製した。

【００５０】すなわち、ベクターには磁性細菌ＡＭＢ−
１に接合伝達による遺伝子導入が可能であり、テトラサ
イクリン耐性遺伝子をもつプラスミドｐＲＫ４１５を用
いた。このｐＲＫ４１５のＮｃｏΙ切断部位とＥｃｏＮ
Ι切断部位を平滑末端化処理により欠損させ、プラスミ
ドｐＲＫ４１５ＮＥを生成した。ｐＲＫ４１５ＮＥをＳ
ａｃＩで切断し、ｍａｇＡプロモーター−ｌｕｃ融合遺
伝子を組み込んだプラスミドｐＮＥＰＬを作製した。

【００５１】次に、ｍａｇＡ遺伝子を保持するプラスミ
ドｐＵＭ５ＡにＳｃａＩ切断部位をデザインしたプライ
マーを用い、ＰＣＲによりｍａｇＡ遺伝子を増幅させＳ
ｃａＩで切断し、ＥｃｏＮＩで切断後平滑末端化したプ
ラスミドｐＮＥＰＬと接続し、プラスミドｐＮＥＬＭを
作製した。

【００５２】次に、ｃａｔ遺伝子に該遺伝子のＳＤ配列
を削除しＳｃａＩ切断部位をデザインしたプライマーを
用い、ＰＣＲによりｃａｔ遺伝子を増幅させた。これを
ＤｒａＩＩＩで切断後平滑末端化したプラスミドｐＮＥ
ＬＭと接続し、プラスミドｐＮＥＬＭＣを作製した。ｐ
ＮＥＬＭＣの制限酵素切断部位地図を図１１に示す。こ
のプラスミドを接合伝達によって野生株ＡＭＢ−１に導
入し、接合伝達体を生成した。接合伝達体を培養して増
殖させ、細胞を回収、破砕を行い、磁石で磁気微粒子を
回収した。この磁気微粒子のルシフェラーゼ活性を、ピ
ッカジーン発光キット（東洋インキ製）を用いルミノメ
ーターで発光量を測定したところｐＮＥＬＭと同等のル
シフェラーゼ活性を示した。

【００５３】次に、この磁気微粒子のＣＡＴアッセイを
行った結果、ＣＡＴ活性が検出された。ＣＡＴアッセイ
は、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ
とクロラムフェニコールとの反応によるクロラムフェニ
コールアセチル化体を薄層クロマトグラフィーにより検
出することで行った。この結果、ｍａｇＡ遺伝子タンパ
ク質の両末端に接続したそれぞれのタンパク質は、該タ
ンパク質を単独で接続したときと同等の活性を示した。
この実験より、ｍａｇＡ遺伝子タンパク質の両末端に機
能の異なるタンパク質をコードする遺伝子を接続した融
合遺伝子を構築することで、磁気微粒子上に同時発現す
ることが可能になり、これより多数の機能を有する磁気
微粒子を生産することができた。

【００５４】

【発明の効果】本発明によれば、固定化等の処理を行う
必要がなく、形質転換された磁性細菌を培養し、菌体内
に生成した磁気微粒子を分離するだけで酵素、抗体その
他の有用タンパク質を磁気微粒子の有機膜に結合した状
態で安定して得ることができる。有用タンパク質が機能
性タンパク質である場合には、磁気微粒子に固定化され
た機能性タンパク質を磁気的に制御することができるの
で、所要の局所へ効率的にその機能を発揮させることが
できる。

【００５５】また、所要のタンパク質をコードする遺伝
子を本発明のプラスミドに導入し、磁性細菌を形質転換
することでどのようなタンパク質も磁気微粒子上に生成
させることができる。

【００５６】高価な酵素、抗体等のタンパク質を用意す
る必要はなく、同じ菌株を維持し培養するだけで所要の
タンパク質結合磁気微粒子を半永久的に製造することが
でき、製造ロット間のタンパク質含有量や活性にバラツ
キがなく、しかも低コスト化のメリットも大きい。しか
も、こうして得られる磁気微粒子は、常に同一活性を有
するタンパク質を同一の量で含有するものである。

【００５７】さらに、タンパク質を磁気微粒子上に生産
するため目的とするタンパク質を磁気的に短時間で分離
回収でき、効率的な分離精製が出来る。

【００５８】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：1302 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA ハイポセティカル配列：No アンチセンス起源 生物名：マグネトスピルラム属（ Magnetospirullum ) 株名：AMB-1 （微工研菌寄第13282 号） 配列： ATG GAA CTG CAT CAT CCC GAA CTG ACC TAT GCC GCC ATC GTC GCC CTG 48 GCC GCC GTG CTG TGC GGC GGG ATG ATG ACG CGC CTG AAG CAG CCG GCC 96 GTC GTC GGC TAC ATC CTG GCG GGG GTG GTG CTG GGA CCC AGC GGC TTC 144 GGG CTG GTG AGC AAC CGC GAC GCC GTG GCC ACC CTG GCC GAG TTC GGC 192 GTG CTG ATG CTG CTG TTC GTC ATC GGC ATG AAG CTG GAC ATC ATC CGC 240 TTT CTC GAA GTG TGG AAG ACG GCC ATC TTC ACC ACG GTT CTG CAG ATC 288 GCC GGC AGC GTG GGC ACG GCC CTG CTG CTG CGT CAC GGC CTG GGC TGG 336 AGC CTG GGG CTG GCG GTG GTG CTG GGC TGT GCC GTG GCG GTG TCG TCC 384 ACC GCC GTA GTG ATC AAG GTG CTG GAA TCC TCG GAC GAG CTG GAC ACG 432 CCG GTC GGC CGC ACC ACC CTT GGC ATC CTG ATC GCC CAG GAC ATG GCG 480 GTG GTG CCC ATG ATG CTG GTG CTG GAA TCC TTC GAG ACC AAG GCG CTG 528 CTG CCC GCC GAC ATG GCC CGG GTG GTG CTG TCG GTG CTG TTC CTG GTG 576 CTG CTG TTC TGG TGG CTG TCC AAG CGC CGC ATC GAC CTG CCG ATC ACC 624 GCC CGG CTT TCC CGC GAT TCT GAC CTT GCC ACC CTG TCG ACC CTG GCC 672 TGG TGT TTC GGC ACC GCC GCC ATC TCC GGC GTG CTG GAC TTG TCG CCG 720 GCC TAT GGC GCC TTC CTG GGC GGC GTG GTG CTG GGC AAT TCC GCC CAG 768 CGC GAC ATG CTG TTG AAG CGT GCC CAG CCC ATC GGC AGC GTG CTG CTG 816 ATG GTG TTC TTC CTG TCC ATC GGG CTG CTG CTC GAC TTC AAG TTC ATC 864 TGG AAG AAT CTG GGC ACC GTT CTC ACC CTG CTG GCC ATG GTG ACC CTG 912 TTC AAG ACG GCG CTG AAC GTC ACG GCG CTG CGC CTG GCG CGG CAG GAC 960 TGG CCC AGC GCC TTC CTG GCC GGC GTG GCC CTG GCC CAG ATC GGC GAG 1008 TTC TCG TTC CTG CTG GCC GAG ACC GGC AAG GCG GTC AAG CTG ATC AGC 1056 GCC CAG GAG ACC AAG CTG GTG GTG GCG GTC ACC GTG CTG TCC CTG GTG 1104 CTG TCG CCG TTC TGG CTG TTC ACC ATG CGG CGC ATG CAC CGG GTG GCG 1152 GCG GTG CAT GTC CAT TCG TTC CGC GAT CTG GTC ACG CGG CTG TAT GGC 1200 GAC GAG GCC CGC GCT TTC GCC CGC ACC GCG CGG CGG GCC CGT GTG CTG 1248 GTG CGG CGT GGT TCC TGG AGG GAT GAC CCC AAT GCC GGA CCT GGC TCT 1296 GGA ATT 1302 配列番号：２ 配列の長さ：434 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： ATG GAA CTG CAT CAT CCC GAA CTG ACC TAT GCC GCC ATC GTC GCC CTG 48 Met Glu Leu His His Pro Glu Leu Thr Tyr Ala Ala Ile Val Ala Leu 5 10 15 GCC GCC GTG CTG TGC GGC GGG ATG ATG ACG CGC CTG AAG CAG CCG GCC 96 Ala Ala Val Leu Cys Gly Gly Met Met Thr Arg Leu Lys Gln Pro Ala 20 25 30 GTC GTC GGC TAC ATC CTG GCG GGG GTG GTG CTG GGA CCC AGC GGC TTC 144 Val Val Gly Tyr Ile Leu Ala Gly Val Val Leu Gly Pro Ser Gly Phe 35 40 45 GGG CTG GTG AGC AAC CGC GAC GCC GTG GCC ACC CTG GCC GAG TTC GGC 192 Gly Leu Val Ser Asn Arg Asp Ala Val Ala Thr Leu Ala Glu Phe Gly 50 55 60 GTG CTG ATG CTG CTG TTC GTC ATC GGC ATG AAG CTG GAC ATC ATC CGC 240 Val Leu Met Leu Leu Phe Val Ile Gly Met Lys Leu Asp Ile Ile Arg 65 70 75 80 TTT CTC GAA GTG TGG AAG ACG GCC ATC TTC ACC ACG GTT CTG CAG ATC 288 Phe Leu Glu Val Trp Lys Thr Ala Ile Phe Thr Thr Val Leu Gln Ile 85 90 95 GCC GGC AGC GTG GGC ACG GCC CTG CTG CTG CGT CAC GGC CTG GGC TGG 336 Ala Gly Ser Val Val Gly Thr Ala Leu Leu Leu Arg His Gly Leu Gly 100 105 110 AGC CTG GGG CTG GCG GTG GTG CTG GGC TGT GCC GTG GCG GTG TCG TCC 384 Trp Ser Leu Gly Leu Ala Val Val Leu Gly Cys Ala Val Ala Ser Ser 115 120 125 ACC GCC GTA GTG ATC AAG GTG CTG GAA TCC TCG GAC GAG CTG GAC ACG 432 Thr Ala Val Val Ile Lys Val Leu Glu Ser Ser Asp Glu Leu Asp Thr 130 135 140 CCG GTC GGC CGC ACC ACC CTT GGC ATC CTG ATC GCC CAG GAC ATG GCG 480 Pro Val Gly Arg Thr Thr Leu Gly Ile Leu Ile Ala Gln Asp Met Ala 145 150 155 160 GTG GTG CCC ATG ATG CTG GTG CTG GAA TCC TTC GAG ACC AAG GCG CTG 528 Val Val Pro Met Met Leu Val Leu Glu Ser Phe Glu Thr Lys Ala Leu 165 170 175 CTG CCC GCC GAC ATG GCC CGG GTG GTG CTG TCG GTG CTG TTC CTG GTG 576 Leu Pro Ala Asp Met Ala Arg Val Val Leu Ser Val Leu Phe Leu Val 180 185 190 CTG CTG TTC TGG TGG CTG TCC AAG CGC CGC ATC GAC CTG CCG ATC ACC 624 Leu Leu Phe Trp Trp Leu Ser Lys Arg Arg Ile Asp Leu Pro Ile Thr 195 200 205 GCC CGG CTT TCC CGC GAT TCT GAC CTT GCC ACC CTG TCG ACC CTG GCC 672 Ala Arg Leu Ser Arg Asp Ser Asp Leu Ala Thr Leu Ser Thr Leu Ala 210 215 220 TGG TGT TTC GGC ACC GCC GCC ATC TCC GGC GTG CTG GAC TTG TCG CCG 720 Trp Cys Phe Gly Thr Ala Ala Ile Ser Gly Val Leu Asp Leu Ser Pro 225 230 235 240 GCC TAT GGC GCC TTC CTG GGC GGC GTG GTG CTG GGC AAT TCC GCC CAG 768 Ala Tyr Gly Ala Phe Leu Gly Gly Val Val Leu Gly Asn Ser Ala Gln 245 250 255 CGC GAC ATG CTG TTG AAG CGT GCC CAG CCC ATC GGC AGC GTG CTG CTG 816 Arg Asp Met Leu Leu Lys Arg Ala Gln Pro Ile Gly Ser Val Leu Leu 260 265 270 ATG GTG TTC TTC CTG TCC ATC GGG CTG CTG CTC GAC TTC AAG TTC ATC 864 Met Val Phe Phe Leu Ser Ile Gly Leu Leu Leu Asp Phe Lys Phe Ile 275 280 285 TGG AAG AAT CTG GGC ACC GTT CTC ACC CTG CTG GCC ATG GTG ACC CTG 912 Trp Lys Asn Leu Gly Thr Val Leu Thr Leu Leu Ala Met Val Thr Leu 290 295 300 TTC AAG ACG GCG CTG AAC GTC ACG GCG CTG CGC CTG GCG CGG CAG GAC 960 Phe Lys Thr Ala Leu Asn Val Thr Ala Leu Arg Leu Ala Arg Gln Asp 305 310 315 320 TGG CCC AGC GCC TTC CTG GCC GGC GTG GCC CTG GCC CAG ATC GGC GAG 1008 Trp Pro Ser Ala Phe Leu Ala Gly Val Ala Leu Ala Gln Ile Gly Glu 325 330 335 TTC TCG TTC CTG CTG GCC GAG ACC GGC AAG GCG GTC AAG CTG ATC AGC 1056 Phe Ser Phe Leu Leu Ala Glu Thr Gly Lys Ala Val Lys Leu Ile Ser 340 345 350 GCC CAG GAG ACC AAG CTG GTG GTG GCG GTC ACC GTG CTG TCC CTG GTG 1104 Ala Gln Glu Thr Lys Leu Val Val Ala Val Thr Val Leu Ser Leu Val 355 360 365 CTG TCG CCG TTC TGG CTG TTC ACC ATG CGG CGC ATG CAC CGG GTG GCG 1152 Leu Ser Pro Phe Trp Leu Phe Thr Met Arg Arg Met His Arg Val Ala 370 375 380 GCG GTG CAT GTC CAT TCG TTC CGC GAT CTG GTC ACG CGG CTG TAT GGC 1200 Ala Val His Val His Ser Phe Arg Asp Leu Val Thr Arg Leu Tyr Gly 385 390 395 400 GAC GAG GCC CGC GCT TTC GCC CGC ACC GCG CGG CGG GCC CGT GTG CTG 1248 Asp Glu Ala Arg Ala Phe Ala Arg Thr Ala Arg Arg Ala Arg Val Leu 405 410 415 GTG CGG CGT GGT TCC TGG AGG GAT GAC CCC AAT GCC GGA CCT GGC TCT 1296 Val Arg Arg Gly Ser Trp Arg Asp Asp Pro Asn Ala Gly Pro Gly Ser 420 425 430 GGA ATT Gly Ile 配列番号：３ 配列の長さ：1302 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列： ATG GAR YTN CAY CAY CCN GAR YTN ACN TAY GCN GCN ATH GTN GCN YTN 48 GCN GCN GTN YTN TGY GGN GGN ATG ATG ACN MGN YTN AAR CAR CCN GCN 96 GTN GTN GGN TAY ATH YTN GCN GGN GTN GTN YTN GGN CCN WSN GGN TTY 144 GGN YTN GTN WSN AAY MGN GAY GCN GTN GCN ACN YTN GCN GAR TTY GGN 192 GTN YTN ATG YTN YTN TTY GTN ATH GGN ATG AAR YTN GAY ATH ATH MGN 240 TTY YTN GAR GTN TGG AAR ACN GCN ATH TTY ACN ACN GTN YTN CAR ATH 288 GCN GGN WSN GTN GGN ACN GCN YTN YTN YTN MGN CAY GGN YTN GGN TGG 336 WSN YTN GGN YTN GCN GTN GTN YTN GGN TGY GCN GTN GCN GTN WSN WSN 384 ACN GCN GTN GTN ATH AAR GTN YTN GAR WSN WSN GAY GAR YTN GAY ACN 432 CCN GTN GGN MGN ACN ACN YTN GGN ATH YTN ATH GCN CAR GAY ATG GCN 480 GTN GTN CCN ATG ATG YTN GTN YTN GAR WSN TTY GAR ACN AAR GCN YTN 528 YTN CCN GCN GAY ATG GCN MGN GTN GTN YTN WSN GTN YTN TTY YTN GTN 576 YTN YTN TTY TGG TGG YTN WSN AAR MGN MGN ATH GAY YTN CCN ATH ACN 624 GCN MGN YTN WSN MGN GAY WSN GAY YTN GCN ACN YTN WSN ACN YTN GCN 672 TGG TGY TTY GGN ACN GCN GCN ATH WSN GGN GTN YTN GAY YTN WSN CCN 720 GCN TAY GGN GCN TTY YTN GGN GGN GTN GTN YTN GGN AAY WSN GCN CAR 768 MGN GAY ATG YTN YTN AAR MGN GCN CAR CCN ATH GGN WSN GTN YTN YTN 816 ATG GTN TTY TTY YTN WSN ATH GGN YTN YTN YTN GAY TTY AAR TTY ATH 864 TGG AAR AAY YTN GGN ACN GTN YTN ACN YTN YTN GCN ATG GTN ACN YTN 912 TTY AAR ACN GCN YTN AAY GTN ACN GCN YTN MGN YTN GCN MGN CAR GAY 960 TGG CCN WSN GCN TTY YTN GCN GGN GTN GCN YTN GCN CAR ATH GGN GAR 1008 TTY WSN TTY YTN YTN GCN GAR ACN GGN AAR GCN GTN AAR YTN ATH WSN 1056 GCN CAR GAR ACN AAR YTN GTN GTN GCN GTN ACN GTN YTN WSN YTN GTN 1104 YTN WSN CCN TTY TGG YTN TTY ACN ATG MGN MGN ATG CAY MGN GTN GCN 1152 GCN GTN CAY GTN CAY WSN TTY MGN GAY YTN GTN ACN MGN YTN TAY GGN 1200 GAY GAR GCN MGN GCN TTY GCN MGN ACN GCN MGN MGN GCN MGN GTN YTN 1248 GTN MGN MGN GGN WSN TGG MGN GAY GAY CCN AAY GCN GGN CCN GGN WSN 1296 GGN ATH

【図面の簡単な説明】

【図１】例１で調製したプラスミドｐＫＰＬ及びｐＫＭ
Ｌの調製方法の説明図である。

【図２】例１で調製したプラスミドｐＵＭ５Ａの調製方
法の説明図である。

【図３】プラスミドｐＫＭＬの制限酵素切断部位地図で
ある。

【図４】例２で調製したプラスミドｐＫＭＧの調製方法
の説明図である。

【図５】プラスミドｐＫＭＧの制限酵素切断部位地図で
ある。

【図６】例３で調製したプラスミドｐＫＭＡの調製方法
の説明図である。

【図７】プラスミドｐＫＭＡの制限酵素切断部位地図で
ある。

【図８】例４で調製したｐＮＥＬＭの調製方法の説明図
である。

【図９】プラスミドｐＮＥＬＭの制限酵素切断部位地図
である。

【図１０】例５で調製したｐＮＥＬＭＣの調製方法の説
明図である。

【図１１】プラスミドｐＮＥＬＭＣの制限酵素切断部位
地図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｇ０１Ｎ 33/553 Ｇ０１Ｎ 33/553 // Ｇ０１Ｎ 33/533 Ｇ０１Ｎ 33/533 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:01）

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 磁性細菌ＡＭＢ−１の菌体内に生成する
   磁気微粒子を被覆する有機膜に結合したタンパク質をコ
   ードし、配列表に記載の配列番号１で示されるＤＮＡ配
   列からなる、単離、精製されたｍａｇＡ遺伝子。
2. 【請求項２】 磁性細菌ＡＭＢ−１の菌体内に生成する
   磁気微粒子を被覆する有機膜に結合したタンパク質であ
   って、配列表に記載の配列番号２で示されるアミノ酸配
   列からなる、単離、精製されたｍａｇＡタンパク質。
3. 【請求項３】 磁性細菌ＡＭＢ−１の菌体内に生成する
   磁気微粒子を被覆する有機膜に結合したｍａｇＡタンパ
   ク質のアミノ酸配列中の疎水性領域（配列表に記載の配
   列番号２の第７〜第３８０アミノ酸残基の領域）をコー
   ドする塩基配列で表されるＤＮＡ配列を含むｍａｇＡ遺
   伝子断片。
4. 【請求項４】 (a) 磁性細菌ＡＭＢ−１の菌体内に生成
   する磁気微粒子を被覆する有機膜に結合したｍａｇＡタ
   ンパク質のアミノ酸配列中の疎水性領域（配列表に記載
   の配列番号２の第７〜第３８０アミノ酸残基の領域）を
   コードする塩基配列で表されるＤＮＡ配列を含むｍａｇ
   Ａ遺伝子断片と、(b) 該ｍａｇＡ遺伝子断片の一方又は
   両方の末端に融合された、一又は二の有用タンパク質を
   コードする一又は二のＤＮＡ配列と、からなる融合ＤＮ
   Ａ配列。
5. 【請求項５】 前記の一又は二の有用タンパク質が機能
   性タンパク質である、請求項4 に記載の融合ＤＮＡ配
   列。
6. 【請求項６】 請求項4 に記載の融合ＤＮＡ配列を含有
   する組み換えプラスミド。
7. 【請求項７】 宿主磁性細菌に請求項6 に記載の組み換
   えプラスミドが導入されてなる、形質転換磁性細菌。
8. 【請求項８】 請求項7 に記載の宿主磁性細菌が、Magn
   etospirillum種又はDesulfovibrio 種の微生物である、
   形質転換磁性細菌。
9. 【請求項９】 磁気微粒子と、該磁気微粒子の表面を被
   覆している有機膜に結合している、請求項4 に記載の融
   合ＤＮＡ配列でコードされた一又は二の機能性タンパク
   質を含有する融合タンパク質とを有する、機能性タンパ
   ク質結合磁気微粒子。
10. 【請求項１０】 請求項9 の機能性タンパク質結合磁気
    微粒子であって、前記の一又は二の機能性タンパク質が
    生理活性を有するものである磁気微粒子。
11. 【請求項１１】 請求項10の磁気微粒子であって、前記
    の生理活性を有するタンパク質が、免疫関連タンパク
    質、結合能を有するタンパク質、又は酵素である磁気微
    粒子。
12. 【請求項１２】 請求項4 に記載の融合ＤＮＡ配列を含
    むプラスミドにより形質転換された磁性細菌を培養する
    ことにより、前記融合ＤＮＡ配列を発現させ、有用タン
    パク質を含む融合タンパク質を、磁気微粒子を被覆する
    有機膜に結合した状態で該菌体内に生成させることから
    なる、有用タンパク質結合磁気微粒子の製造方法。
13. 【請求項１３】 前記有用タンパク質が機能性タンパク
    質である、請求項12に記載の製造方法。