JPH08238092A

JPH08238092A - 遺伝子治療用アデノウイルス由来組換えベクター

Info

Publication number: JPH08238092A
Application number: JP7243542A
Authority: JP
Inventors: Abraham Bout; ボウトアー; Bekkum D W Van; ウェーファンベックムデー; D Valerio; バレリオデー
Original assignee: Introgene BV
Current assignee: Introgene BV
Priority date: 1994-08-16
Filing date: 1995-08-16
Publication date: 1996-09-17
Also published as: DK0707071T3; ATE246252T1; EP0707071A1; US6204052B1; DE69531387D1; EP1369487A3; AU711269B2; DE69531387T2; EP0707071B1; AU2853395A; CA2156132A1; EP1369487A2

Abstract

(57)【要約】（修正有）【課題】特に遺伝子治療に適する新規アデノウイルス
由来ベクターの提供。【解決手段】野性型アデノウイルスに比べ、Ｅ１領域
が機能的な態様では存在しないベクター。これはアデノ
ウイルスのＥ３領域の生物学的に機能的な一部を含有す
る。この結果、通常はアデノウイルスのタンパク質の発
現を起こさないが、そのタンパク質が発現された場合に
は、そのタンパク質に対する宿主の免疫応答を抑制す
る。それにより、そのベクターに感染した宿主細胞は長
く生きる。従って、前記細胞中に導入される治療用の物
質は、より大量に又はより長期間産生される。このベク
ターはアンチセンス療法のための、又はサイトカイン、
特にＩｌ−１等の、もしくは単純ヘルペスウイルスチミ
ジンキナーゼ等のいわゆる自殺遺伝子などガンと闘う遺
伝子のための遺伝情報を含む。前記ベクターの作製方法
及びこれらを用いた遺伝子治療の方法も開示されてい
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、組換えＤＮＡ技術
の分野、さらにくわしくは遺伝子治療の分野に関する。

【０００２】とくに本発明は、トランスジェニック動物
の作成などの他の組換え発現目的のためには用いること
ができたが、とくに遺伝子治療における用途においては
新規であるベクターに関する。

【０００３】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】遺伝
子治療は、最近発展した発想であり、広い範囲の適用が
可能であり、また計画されている。

【０００４】遺伝子治療では、遺伝情報を運搬する分子
を、その遺伝情報が宿主の遺伝情報に機能的な形式で付
加されるように、宿主のいくつかまたはすべての細胞に
導入する。

【０００５】付加される遺伝情報は、遺伝子、またはｃ
ＤＮＡのような遺伝子の誘導体であって、タンパク質を
コードしている。このばあいに、機能的な形式とは、タ
ンパク質が宿主細胞の機構によって発現可能であること
を意味する。

【０００６】前記遺伝情報が、宿主細胞中に存在するヌ
クレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の配列に対して相補
的なヌクレオチドの配列であることも可能である。

【０００７】このばあいの機能的な形式とは、付加され
たＤＮＡ（核酸）分子またはｉｎｓｉｔｕで作られたそ
の複製物が、宿主細胞中に存在する相補的な配列と塩基
対を形成しうることである。あるいは、付加されたＤＮ
Ａまたはｉｎｓｉｔｕで作られたその複製物が、細胞
中に存在するタンパク質と相互作用することもある。

【０００８】適用には、遺伝疾患のために宿主中に存在
しないか、または少なくとも不充分量しか存在しないタ
ンパク質または他の物質を補うことによる、その遺伝疾
患の治療、腫瘍または（自己）免疫疾患もしくは感染症
など（他の）後天的疾病の治療が含まれる。

【０００９】前記より明らかであるように、遺伝子治療
には基本的に２つの異なるアプローチがあり、１つは
（哺乳動物）宿主中の欠損を補うことを指向し、もう１
つは望まれない物質（器官または細胞）を取り除くまた
は排除することを指向する。

【００１０】本発明は、両方の遺伝子治療に好適なベク
ターを提供する。

【００１１】哺乳動物宿主中に何らかの異物を導入す
る、とくに全身経路により導入することにともなう問題
は、常に免疫応答を誘導する危険があるということであ
る。これは遺伝子治療においても真実である。免疫応答
を引き起しうるような媒体によって遺伝的情報を与える
ばあい、その結果は、そのような遺伝的情報はけっして
標的細胞中に取り込まれることがないか、または取り込
まれるが、その細胞は免疫系によって排除されることに
なる。

【００１２】どちらのばあいにも、新しい遺伝情報はき
わめて短時間しか有用ではないので、いずれの種類の遺
伝子治療も有効ではない。さらに、反復治療は不可能で
あろう。

【００１３】遺伝子治療の目的のために、欠失を含むア
デノウイルスが、適切なビヒクル（ｖｅｈｉｃｌｅ）と
して提案されている。

【００１４】アデノウイルスは、エンベロープをもたな
いＤＮＡウイルスである。そのゲノムは、約３６ｋｂ³²
の線状二本鎖ＤＮＡ分子からなる。組換えアデノウイル
スベクターは、遺伝子トランスファーの目的のために作
成された。現在用いられているすべてのアデノウイルス
は、Ｅ１領域に欠失を有し、そこに新規な遺伝的情報を
導入することができる。Ｅ１欠失により、組換えウイル
スは複製不全となる。組換えアデノウイルスは、アカゲ
ザルの気道上皮へ組換え遺伝子を効率的にトランスファ
ーすることができることが証明された（１、２）。さら
に本発明者らは、アデノウイルスにより媒介された、ｉ
ｎｖｉｔｒｏにおけるさまざまな腫瘍細胞への、なら
びにｉｎｖｉｖｏでの動物モデルにおける固形ガン
（肺腫瘍、神経膠腫）および免疫不全マウス中のヒト異
種間移植片（ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ）（肺腫瘍）への非
常に効率的な遺伝子トランスファーを観察している。

【００１５】たとえばレトロウイルスに比べて、アデノ
ウイルスは、ａ）宿主細胞ゲノム中に取り込まれず、
ｂ）非分裂細胞に感染することができ、ｃ）ｉｎｖｉ
ｖｏにおいて組換え遺伝子をきわめて効率的にトランス
ファーすることができる。それらの特徴により、アデノ
ウイルスは、たとえば腫瘍細胞中の自殺遺伝子（ｓｕｉ
ｃｉｄｅｇｅｎｅ）および／またはサイトカイン遺伝
子などのｉｎｖｉｖｏにおける遺伝子トランスファー
のための魅力的な候補となる。最近、アデノウイルスに
より媒介されたｉｎｖｉｔｒｏにおけるＩｌ−２の遺
伝子トランスファーが報告された（３）。

【００１６】たとえば国際公開第９３／１９１９１号パ
ンフレットにおいて開示されているように、ウイルスの
Ｅ３領域、これはｉｎｖｉｔｒｏにおいてウイルスの
増殖に必須ではなく、ｉｎｖｉｖｏにおける感染にも
必須ではない、も、ウイルスベクターから欠失してい
る。

【００１７】本発明のより良い理解のために、Ｅ３領域
の簡単な説明を以下に記す（（４）に概説されてい
る）。

【００１８】Ｅ３領域から９つのｍＲＮＡが、グループ
Ｃ（グループＣ＝Ａｄ２およびＡｄ５は、通常、カゼの
ような呼吸感染を引き起こす）のアデノウイルスで同定
される（５）。そのｍＲＮＡのうちいくつかから、対応
タンパク質が同定されている。この領域によりコードさ
れているタンパク質は、１９、１４．７、１１．６、１
０．４および６．７ｋＤａの分子量を有する。グループ
Ｂのアデノウイルスは、明らかに、グループＣのアデノ
ウイルス中には見られない２つのＥ３タンパク質（２
０．１および２０．４ｋＤ）をコードしている。Ｅ３タ
ンパク質のうちいずれのものも、培養細胞中でのアデノ
ウイルスの複製、またはハムスターもしくはコットンラ
ット（ｃｏｔｔｏｎｒａｔ）の肺への急性感染に必要
ではない。これにもかかわらず、常にＥ３は天然のアデ
ノウイルス単離物中に保持されている（４）。いくつか
のＥ３タンパク質の機能についての短い記述が存在する
（４−６）：糖タンパク質であるためにｇｐ１９Ｋと呼
ばれる１９ｋＤａタンパク質の機能は、アデノウイルス
感染細胞を、ＭＨＣクラスＩ拘束された細胞障害性Ｔ細
胞による溶解から保護することである。この糖タンパク
質は、クラスＩ組織適合性抗原と細胞内で複合化し、そ
れによって細胞の免疫系による感染細胞の認識を減ず
る。

【００１９】Ｅ３領域の別のタンパク質（１４．７ｋＤ
ａ）は、ＴＮＦによる細胞溶解の抑制に関与する。ＴＮ
Ｆは、活性化されたマクロファージおよびリンパ球によ
り分泌され、特定の腫瘍細胞に対して細胞毒性または細
胞増殖抑制性を有する（概説（６）参照のこと）。ＴＮ
Ｆは、特定のウイルスにより感染された細胞も溶解し、
インフルエンザウイルスによる感染の際に放出される。
領域Ｅ３を欠いたアデノウイルス変異体に感染されたマ
ウスＣ３ＨＡ繊維芽細胞が、ＴＮＦによって溶解される
ことが示されている。感染されていない細胞はＴＮＦに
よって溶解されず、野生株のアデノウイルスに感染した
細胞もＴＮＦによって溶解されない。Ｅ３−１０．４
Ｋ、Ｅ３−１４．５ＫおよびＥ３−１４．７Ｋを発現し
ないアデノウイルス組換え変異体は、好中球の浸潤の増
加を誘導した。Ｅ３−１４．７Ｋ、ＴＮＦまたは両方の
タンパク質を発現するワクチニアウイルスベクターが作
られた。ＴＮＦ発現ベクターは、コントロールのベクタ
ーよりもマウスにおいて毒性が少なく、一方Ｅ３−１
４．７Ｋは、ＴＮＦ発現ベクターの毒性を増加させた。
このことから、Ｅ３−１４．７Ｋは、ｉｎｖｉｖｏに
おけるＴＮＦの抗ウイルス効果を妨害するものであると
いう結論が導かれる。

【００２０】Ｅ３領域によりコードされる１０．４ｋＤ
ａおよび１４．５ｋＤａのタンパク質は、アデノウイル
ス感染細胞中のＥＧＦレセプター（チロシンキナーゼ）
のダウンレギュレーションに協調して作用する。ＥＧＦ
−Ｒのキナーゼ活性の刺激の結果、細胞代謝の活性化が
起こり、ついにはＤＮＡ合成および有糸分裂の誘導が起
こる。

【００２１】ＥＧＦ−Ｒのダウンレギュレーションの生
物学的重要性は、知られていない。アデノウイルスが静
止状態の細胞を活性化するメカニズムでありうるＥＧＦ
−Ｒのキナーゼ活性の活性化において、１０．４Ｋ／１
４．５ＫがＥＧＦを模擬することが示唆されている。あ
るいは、おそらく１０．４Ｋ／１４．５Ｋの目的は、Ｅ
ＧＦ−Ｒがシグナルを送らないようにこれを排除するこ
とである。これらのレセプターの排除により、ＥＧＦに
より誘導される炎症反応が妨げられるべきである
（６）。

【００２２】今までのところ知られている機能とは別の
機能も、Ｅ３によってもたらされるかもしれない。Ｅ３
領域が、Ｅ３様の特性をもたない他の遺伝子によって置
換されている組換えアデノウイルスに比べて、Ｅ３領域
の欠失によって、より速やかな複製および毒性の増加が
起こることが証明されたということは興味深い。アデノ
ウイルスの両方の鎖がタンパク質をコードする配列を含
むということに注意すべきである。１鎖の上のＥ３領域
の反対にある配列は、Ｅ４およびＥ２領域を隔ててい
る。この領域に由来する転写物は知られていないが、そ
のことによって、欠失がウイルスの複製に影響を有する
ということが除外されるのではない。

【００２３】完全なＥ１領域を有するが、Ｅ３領域が大
きく欠失されている変異体が、コットンラットの肺にお
いて野生株のウイルスのように複製することが見いださ
れたが、リンパ球およびマクロファージ／単球の炎症反
応は、著しく増加された。感染後２〜４日に最大の力価
に到達した、ウイルス増殖の初期のすぐ後に、気管支周
囲、血管周囲および肺胞隔膜のリンパ球およびマクロフ
ァージ／単球の浸潤の累進的増加が起こり、ついには気
管支基底壁（ｂａｓａｌｂｒｏｎｃｈｉｏｌａｒｗ
ａｌｌ）から上皮中へのリンパ球浸潤が起こった（５、
７）。

【００２４】ヒトアデノウイルスの複製に対して非許容
性（ｎｏｎｐｅｒｍｉｓｉｖｅ）である、マウスでの実
験に基づいて、肺炎を起こすためには初期遺伝子の発現
のみが必要であると結論された（８）。これらのデータ
により、早期に炎症を起こす病理学的なできごとは、圧
倒的にサイトカイン、主にＴＮＦ−アルファの産生によ
って起こるが、一方後期（すなわち５〜７日）の気管支
周囲および血管周囲のリンパ球浸潤は、細胞障害性Ｔ細
胞の反応の結果であることがわかった。Ｅ３領域が欠失
されると、病理学的な反応は著しく増加する（５、７、
８）。

【００２５】Ｅ３１４．７ｋＤタンパク質の発現を欠
いているウイルスは、初期の病理学的反応を示す
（５）。

【００２６】

【課題を解決するための手段】本発明は、これまでに同
じ目的のために開示されてきたウイルスベクターに関す
るいくつかの欠点をもたない、改善された遺伝子治療用
アデノウイルスベクターを提供する。

【００２７】本発明は、アデノウイルスをコードするＤ
ＮＡの少なくともＥ１領域が欠失されており、Ｅ３領域
の少なくとも機能的部分がベクター中に存在する、アデ
ノウイルス由来組換えベクターを提供する。

【００２８】

【発明の実施の形態】既に述べたように、Ｅ３領域は、
ｉｎｖｉｔｒｏにおけるアデノウイルスの増殖に、お
よびｉｎｖｉｖｏにおけるアデノウイルスの感染にな
くてもすむものである。組換えアデノウイルスは、隣接
した初期（ｉｍｍｅｄｉａｔｅｅａｒｌｙ）Ｅ１領域
の欠失のため、いかなるアデノウイルス遺伝子も発現し
ないことが期待される。この領域は、アデノウイルス発
現およびＤＮＡ複製に必須であるからである（９）。し
かしながら、アデノウイルス遺伝子を発現することがで
き、Ｅ１が欠失されたアデノウイルスの低レベルの複製
すら持続することのできる細胞のサブタイプがあること
が認められた（１０）。いくつかの型の細胞において発
現される特定の細胞要素は、アデノウイルスのＥ１領域
の代用となることができ、アデノウイルス遺伝子の発現
およびアデノウイルスＤＮＡの複製を媒介する（１０、
１１）。たとえば、Ｅ１およびＥ３を欠いている組換え
アデノウイルスに感染した後、ヒヒの肺の細胞ではアデ
ノウイルスのＥ２ａタンパク質が合成され（１２）、こ
れには肺での炎症反応が伴うことが見いだされた（１
３）。

【００２９】観察された炎症反応は、複製能力のあるウ
イルスを齧歯類に投与した後に見られる炎症反応に類似
していた（５、７、８、１４、１５）。

【００３０】マウスの肝臓では、Ｅ１／Ｅ３欠失のアデ
ノウイルスに感染した後のＥ２ａタンパク質の発現は、
感染細胞に対するＣＴＬ反応、およびしたがって、組換
え遺伝子の発現の速やかな低下に関与していた（１
６）。同様の効果が、Ｅ１／Ｅ３欠失のアデノウイルス
を与えたのちのコットンラット肺において観察された
（１５）。

【００３１】また、いくつかの腫瘍細胞もＥ１の不在に
おけるアデノウイルスのタンパク質の制限された合成を
持続することができる（１０）。目的の１つは、それゆ
え、アデノウイルス感染細胞に対する宿主の反応を起こ
させない組換えアデノウイルスを設計することである。
したがって、組換えアデノウイルスは、Ｅ３欠失のベク
ターに対して引き出される宿主の反応を回避することが
できるように設計されなくてはならない。

【００３２】この目的のため、Ｅ３領域を保持するアデ
ノウイルスを構築した（実施例ｈＩｌ−１ａ、ｒＩｌ−
３およびＡｄ．ＴＫを参照のこと）。Ｅ３領域は組換え
ウイルス中に必ずしも必要ではないが、本発明者らがこ
の領域を保持するウイルスを作製する理由は、低レベル
のアデノウイルス遺伝子の発現および／または複製を持
続することができ、そのため宿主細胞の反応に感受性で
ある細胞は、低レベルのＥ３タンパク質を発現すること
もできるであろう、ということである。Ｅ３タンパク質
は、感染細胞に対する宿主細胞の反応を妨げるか、また
は減ずることができるので、Ｅ３領域を含む組換えベク
ターは、Ｅ３欠失のベクターよりも優れている。

【００３３】これは、遺伝病およびガンなどの後天的疾
病の両方の遺伝子治療にとって有利である。たとえば、
アカゲザルにおける嚢胞性線維症の遺伝子治療の前臨床
試験では、Ｅ１およびＥ３欠失の組換えアデノウイルス
は、気管支周囲リンパ球浸潤および肺の肺胞領域におけ
る細胞間質肺炎を引き起こした（１）。嚢胞性線維症の
遺伝子治療のためには、そのような不利な病理学的変化
は、遺伝子発現の低下および患者への不利な効果のた
め、非常に望ましくない。そのような炎症反応は、同様
の発見がＥ１／Ｅ３欠失の組換えウイルスの投与後、ヒ
ヒの肺において観察された（１２）ので、肺のこの領域
中の感染細胞におけるアデノウイルスタンパク質の発現
によって最も引き起こされやすい。後者のばあいに、ア
デノウイルスタンパク質（たとえばＥ２ａおよびヘキソ
ン）の合成が観察された。

【００３４】そのような不利な効果は、Ｅ１が欠失され
ているが、Ｅ３領域を保持する組換えアデノウイルスベ
クターを用いることにより妨げうる。

【００３５】ガンの治療のための組換えアデノウイルス
のｉｎｖｉｖｏにおける投与によって、かなりの数の
正常細胞への遺伝子トランスファーが生じうることとな
る。たとえば、悪性神経膠腫に対する臨床研究におい
て、我々は手術によって腫瘍塊の大部分を除去（ｄｅｂ
ｕｌｋ）した後の創傷床（ｗｏｕｎｄ−ｂｅｄ）に組換
えアデノウイルスを投与することを計画している。正常
脳細胞の形質導入が避けられないことは、明らかであろ
う。免疫反応による正常細胞の破壊は避けるべきであ
り、脳のような非再生組織が関与するばあいにはとくに
そうである。さらに、たとえばＨＳＶ−ｔｋを発現して
いる非分裂の正常細胞は、結果的に腫瘍細胞に取り込ま
れて腫瘍細胞を殺すリン酸化ガンシクロビルの合成によ
り、いわゆる傍観者（ｂｙｓｔａｎｄｅｒ）効果を増し
うる。したがって、そのような細胞の溶解は、自殺遺伝
子治療の抗腫瘍効果を減ずるであろう。

【００３６】正常細胞に対する反応に加えて、アデノウ
イルス感染ガン細胞に対する宿主反応も予期すべきであ
る。腫瘍細胞はとくにアデノウイルスタンパク質の合成
および低レベルのアデノウイルス複製を支持することが
できるからである（１０）。したがって、治療用遺伝子
（たとえばサイトカインまたは自殺遺伝子）の最大の効
果をえるためには、アデノウイルスのコードするタンパ
ク質に対する宿主反応、とくに１４．７ｋＤタンパク質
によって妨げられる早期の反応は望まれない。サイトカ
イン遺伝子のトランスファーのために、腫瘍抗原に対す
る免疫応答を除去するべきである。したがって、アデノ
ウイルスのコードするタンパク質に対する免疫応答は、
回避すべきである。同じことが、たとえばＨＳＶ−ＴＫ
遺伝子の腫瘍への導入によるような、自殺遺伝子治療に
も有効である。この種の遺伝子治療の傑出した面は、ガ
ンを破壊するために、わずか１０％のガン細胞しかＴＫ
遺伝子を発現しなくてよいということである（１７）
（傍観者効果）。ＴＫ発現細胞の（早期）破壊は、傍観
者効果を妨げるであろう。したがって、ガン自殺遺伝子
治療のためにも、Ｅ３を含むアデノウイルスベクター
は、Ｅ３欠失のベクターよりも優れている。それゆえ、
本発明者らはＥ１が削除されているがＥ３領域は保持す
る組換えアデノウイルスを構築した（Ａｄ．Ｉｌ−１
ａ、Ａｄ．ｒＩｌ−３およびＡｄ．ＴＫ実施例を参照の
こと）。

【００３７】まとめると、Ｅ３含有ベクターは、アデノ
ウイルス感染細胞のＣＴＬ．細胞溶解およびＴＮＦによ
る細胞溶解を妨げる、または減ずることができるので、
Ｅ３欠失の同等物によりも優れている。

【００３８】本発明のベクターでは、Ｅ３領域全体を保
持することは、その保持されている一部分が依然として
感染細胞に対する宿主の反応を減ずる機能を有している
限り、必ずしも必要でないと理解されるであろう。たと
えば、Ｅ３−１４．７ｋＤの発現のみで、ＴＮＦにより
媒介される早期の反応を減ずるのに充分でありうる（実
施例（５）または（８）を参照のこと）。

【００３９】上で述べたたように、これらのベクターは
嚢胞性線維症、デュシェーヌ分子ジストロフィー（Ｄｕ
ｃｈｅｎｎｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｄｙｓｔｒｏｐｈ
ｙ）、高コレステロール血症、血液凝固異常（血友病）
などのような遺伝子病の遺伝子治療用に大変有用であ
る。

【００４０】また、上で述べたように、それらは腫瘍、
肝炎、（自己）免疫疾患、再挟窄などのような後天的疾
患の治療に大変有用である。

【００４１】治療すべき疾患によって、種々の遺伝子ま
たは遺伝子の誘導体を本発明のベクターに取り入れるこ
とができる。これらの遺伝子は、ゲノムである必要はな
く、ｃＤＮＡも用いることができる。問題となっている
天然のタンパク質ではなく、その孤立作用する（ｌｏｎ
ｅｒａｃｔｉｎｇ）もしくはより安定な変形、いわゆ
るミューテイン（ｍｕｔｅｉｎ）をコードする遺伝子を
構築することも可能である。遺伝子またはその誘導体の
一部分のみの取り入れでも、充分でありうる。

【００４２】広くさまざまなコード遺伝子に適用しても
よい。それらには、血液凝固カスケード中の因子（第VI
II因子、第IX因子など）、Ｉｌ−１、Ｉｌ−２、Ｉｌ−
３などのようなサイトカイン、ＴＮＦ、腫瘍マーカーに
対する抗体、任意にエンドトキシンを有する融合タンパ
ク質として、ＨＳＶチミジンキナーゼのような自殺遺伝
子またはシトシンデアミナーゼ、ｔＰＡなどが含まれる
が、これらに限られるものではない。

【００４３】上で述べたように、遺伝子治療用のタンパ
ク質をコードする遺伝子を含むことは必要ではない。し
ばしば、宿主の配列と相補的な配列の転写物は、いわゆ
るアンチセンス治療戦術に用いられうる。

【００４４】本発明のベクターは、アデノウイルス自身
に由来するプロモーターおよびエンハンサーなどの制御
要素を含有してよいが、これらの要素はサイトメガロウ
イルス、ラウス肉腫ウイルス（ＬＴＲ）などの他の種に
由来するもの、またはたとえばＳＶ４０のポリアデニレ
ーションシグナルであってよい。

【００４５】好ましい実施態様における発明は、単純ヘ
ルペスウイルスの自殺遺伝子チミジンキナーゼ（ＨＳＶ
−ＴＫ）を用いる腫瘍治療法を提供する。

【００４６】別の好ましい実施態様では、本発明はサイ
トカインＩｌ−１またはＩｌ−３を用いる腫瘍の遺伝子
治療を提供する。

【００４７】これらの２つのアプローチを実施例として
用いて、本発明をさらに詳しく説明する。

【００４８】サイトカイン遺伝子を腫瘍細胞中に導入す
ることによるガンの遺伝子治療過去数年の間に、実験的
固形ガンに対する免疫応答を促進するまったく新しいア
プローチが述べられている。このアプローチの基礎とな
っている概念は、腫瘍の内側でサイトカインを高レベル
に産生させ、それに対し全身濃度は低く保ち、そうする
ことでサイトカインの毒性の副作用を減じ、または妨げ
るということである。サイトカイン遺伝子の腫瘍細胞中
へのトランスファーの効果は、さまざまな齧歯類の腫瘍
モデルにおいて研究されている。さまざまな研究におい
て、たとえばＩｌ−１、ＩＦＮ−ｇ、ＩＦＮ−ａ、Ｉｌ
−２、Ｉｌ−４、Ｉｌ−７、ＴＮＦ、Ｇ−ＣＳＦおよび
ＧＭ−ＣＳＦの遺伝子を用いた、マウス腫瘍細胞遺伝子
のレトロウイルス媒介形質導入の後、サイトカイン産生
腫瘍細胞によって起こされる局所的炎症反応の結果、腫
瘍の退縮が起こった（１８）。前記のサイトカイン遺伝
子での形質導入後の腫瘍の拒絶はＴ細胞依存性であり、
いくつかの研究では、細胞傷害性免疫応答は同じマウス
に移植された同じ腫瘍の非形質導入細胞（親細胞）に対
しても起こった。たとえばＩＮＦ−ｇの遺伝子のマウス
線維肉腫ファイブロサルコーマ細胞中へのトランスファ
ーの結果、ＩＮＦ−ｇ産生腫瘍細胞がえられる。これら
の形質転換細胞の移植の後に、続いて接種された非形質
転換腫瘍細胞の拒絶により判断して、長期持続のＴ細胞
媒介免疫が起こった（１９）。

【００４９】Ｉｌ−１を用いる免疫遺伝子治療２０年以上前、肺のガンを外科的に切除した後に膿胸
（ｅｍｐｙｅｍａ）ができた患者の生存期間が著しく改
善されたことが報告されて（２０、２１）、免疫療法は
肺ガン患者の予測される生存期間をかなり延長すると考
えられた。免疫リンパ球と細菌性抗原の間の反応によっ
てマクロファージが活性化され、免疫的非特異的メカニ
ズムを通して残った腫瘍細胞を破壊すると信じられてい
た。これらの分析は、明らかに回顧的である。切除後の
患者に、意図的に膿胸を導入することは倫理的に正しく
ないので、いくつかの研究はＢＣＧの胸膜内付着（ｄｅ
ｐｏｓｉｔｉｏｎ）を用いて行われた。当初の有望な結
果（２２、２３）は、後の無作為抽出された（ｒａｎｄ
ａｍｉｚｅｄ）試験では立証されなかった（２４〜２
７）。手術に対するアジュバントなどのさまざまな他の
免疫刺激治療が研究されてきた。それらの中で、レビサ
モール（ｌｅｖｉｓａｍｏｌｅ）を用いた長期の治療、
およびとくに特殊な腫瘍関連抗原をフロインドのアジュ
バントとの組み合わせて用いる治療が、有意な改善をも
たらすことが２、３人の著者によって報告されている
が、他の者によっては報告されていない（２８、２
９）。そのような観察は、腫瘍の中および周りでの、免
疫反応およびリンホカイン媒介炎症プロセスの活性化に
よって、相当数の腫瘍細胞を殺すことのできるマクロフ
ァージおよびリンパ球が引き寄せられるという、ガン細
胞溶解（ｃａｒｃｉｎｏｌｙｓｉｓ）と呼ばれるプロセ
スの有望さを維持するように思われる。これらの期待
は、移植可能な腫瘍を担った実験動物における他の多く
の研究によって、立証される。

【００５０】Ｉｌ−１は、免疫炎症反応の中心的メディ
エーターの１つである（３０）。したがって、前記のよ
うな免疫炎症反応は、腫瘍細胞によるＩｌ−１の産生に
よって喚起されることが推量される。いくつかの腫瘍細
胞系は、リポ多糖（ＬＰＳ）によって処置されることに
より、Ｉｌ−１を産生するように誘導することができ
る。そのような研究の結果は、ゾーラー（Ｚｏｌｌｅ
ｒ）らによって記載された（３１）。ゾーラーらは、動
物への注入前にＬＰＳ処置することによりＩｌ−１を産
生するように誘導した腫瘍細胞は、拒絶されることを観
察した。彼らはさらに、腫瘍細胞は、プロ−Ｉｌ−１ａ
タンパク質をコードするＤＮＡ発現構築物でトランスフ
ェクトすると、動物中にトランスファーした後に拒絶さ
れることも観察した。彼らはまた、両方のばあいにおい
て、Ｉｌ−１産生細胞と親の系の腫瘍との混合物も拒絶
されることを観察した。

【００５１】Ｉｌ−１の生物学的特徴インターロイキン−（Ｉｌ−１）は、炎症、代謝、生
理、造血および免疫の広い活性スペクトルを有する２つ
のタンパク質（Ｉｌ−１ａおよびＩｌ−１ｂ）に対する
用語である。Ｉｌ−１は、白血球系の細胞と同様に非白
血球系の細胞（繊維芽細胞、内皮、上皮、樹状および小
膠細胞ならびに星状膠細胞）によってもつくられる（３
２）。Ｉｌ−１の効果は、白血球のみに限られず、ほと
んどすべての組織に現れる。その効果はたとえば、繊維
芽細胞（３３）、滑膜細胞（３４）、視床細胞（３０）
および筋肉細胞（３５）において見られた。Ｉｌ−１の
最初の翻訳産物は、３１ｋＤａのプロ−Ｉｌ−１前駆体
である。Ｉｌ−１ａおよびＩｌ−１ｂ前駆体の配列分析
により、それらは従来のＮ末端疎水性シグナル配列を含
んでいないことが明らかになった（３６、３７）。細胞
結合Ｉｌ−１の所在は、ほとんど細胞質であり、小胞
体、ゴルジ体または原形質膜の画分にはない（３８、３
９）。単球における細胞結合Ｉｌ−１ａの半減期は１５
時間であり、一方Ｉｌ−１ｂでは、２．５時間である
（４０）。Ｉｌ−１ａのプロセシングに関わるタンパク
質は、カルパインプロテアーゼのファミリーに属する
（４１、４２）が、Ｉｌ−１ｂはアスパラギン酸塩特異
的プロテアーゼによって開裂される（４３、４４）。

【００５２】マクロファージは、Ｉｌ−１ａよりも（３
４）１０倍多くＩｌ−１ｂを含有する（３４）が、内皮
細胞およびＴリンパ球はＩｌ−１ｂよりもＩｌ−１ａを
蓄積する（４５）。

【００５３】ｈＩｌ−１ａをコードする２つの異なるｃ
ＤＮＡ配列が、単離された（３６、４６、４７）。それ
らは２つのヌクレオチドにおいて異なっており、そのう
ち１つはタンパク質コード領域にある。この変異によ
り、前駆体タンパク質の１１４番目の位置（これは、成
熟タンパク質ではアミノ酸２である）での、Ａｌａまた
はＳｅｒのいずれかがコードされている、アミノ酸多形
性（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）が起こる（４７）。前
駆体および成熟、両方のタンパク質が、完全な生物学的
活性を有することが示されており（４７）、したがって
天然の多形性に相当すると思われる。

【００５４】Ｉｌ−１は、炎症反応の重要なレギュレー
ターである。炎症は、免疫機構の細胞を引き寄せ、反応
のカスケードを起こし、引き寄せられた免疫細胞による
他のサイトカインの産生を包含し、ガン細胞溶解にいた
る。したがって、ガンの遺伝子療法は、腫瘍細胞による
ヒトＩｌ−１の産生によって達成しうる。Ｉｌ−１の分
泌は、全身性の副作用を避けるため、腫瘍細胞による局
所的分泌でなくてはならない。したがって、ｉｎｖｉ
ｖｏにおけるＩｌ−１ａの遺伝子またはＩｌ−１ａの前
駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの遺伝子のトラン
スファーが必要である。

【００５５】組換えアデノウイルスによるＩｌ−１ａ前
駆体のｉｎｖｉｖｏにおける遺伝子トランスファーを
用いる理由は：・Ｉｌ−１ａは、通常広い種類の細胞において産生され
る。・Ｉｌ−１ｂの前駆体は、生物学的に非活性（たとえば
４９〜５１参照）または非常に小さい活性しか有さない
（５１）と報告されているのに対して、Ｉｌ−１ａの前
駆体の形（そのままでは分泌されない）は、生体におい
て活性である（３６、４８）。両方の前駆体タンパク質
とも、細胞内タンパク質である。しかしながら、遺伝子
治療が、たとえば放射線治療、化学療法または自殺遺伝
子トランスファーのような他のガン遺伝子治療の方法と
併用され、Ｉｌ−１ａ前駆体ｃＤＮＡを含む腫瘍細胞が
それらの治療の結果として溶解されるとき、この結果生
体において生物学的に活性なＩｌ−１ａが放出され、し
たがってこれらの治療の共同効果がえられうる。

【００５６】・Ｉｌ−１ａはマクロファージおよび単球
のＩｌ−１ｂ分泌を誘導することができ、したがって腫
瘍の部位でのＩｌ−１の総量を増加させる。・アデノウイルスは、ｉｎｖｉｖｏにおける体細胞へ
の遺伝子の効率的送り渡しを行うことができることが証
明されている。

【００５７】したがって、組換えアデノウイルスは、ｉ
ｎｖｉｖｏにおいてＩｌ−１ａ前駆体ｃＤＮＡを腫瘍
細胞中にトランスファーする好ましい媒体である。

【００５８】

【実施例】

実施例１のちにガンシクロビルの全身の注射を行なう、ＨＳＶ−
ＴＫ遺伝子を含む組換えアデノウイルスによるガンの治
療１．１ＨＳＶ−ＴＫ配列のクローニングａ）ＴＫ−ｃＤＮＡはバーンズ(Berns)、アダム(A´da
m)からのｐＨＡ１４０プラスミド由来である。

【００５９】ＴＫ遺伝子をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ
Ｒ）によって増幅した。

【００６０】酵素：ディープベント(Deep Vent)（ニ
ューイングランドバイオラブズ（New England Biol
abs)）、１ユニットを用い９０℃で１分間、６０℃で１
分間および７２℃で２分間のサイクルを３０回行なっ
た。

【００６１】プライマー：上流５´−ＣＴＣＴＡＡＧＣＴＴＧＡＡＧＣＧＣＧＣＧＴＡＴＧＧＣＴＴＣＧ−３′ 下流５´−ＡＣＡＣＴＣＴＡＧＡＧＴＧＴＴＴＣＡＧＴＴＡＧＣＣＴＣＣ−３´ えられたＰＣＲフラグメントをＢａｍＨＩおよびＨｉｎ
ｄIIIで切断し、同一の制限酵素を用いて切断されたｐ
ＳＰ６５中へ結合した。えられたクローンをｐＳＰ６
５．ＴＫと命名した。

【００６２】ｂ）クローン化されたＨＳＶ−ＴＫ−遺伝
子（１１３０塩基対）の配列決定：ｐＳＰ６５．ＴＫの
ＴＫ遺伝子を配列決定した。ＨＳＶ−ＴＫ配列はマクナ
イト（ＭｃＫｎｉｇｈｔ）により報告されている（５
６）。この配列と比較すると、３つの差異が存在する：
１６番目がＴにかわりＧ、１２６番目がＣにかわりＴお
よび２６７番目がＧにかわりＡ。

【００６３】Ｆｉｇ．１に示したＨＳＶ−ＴＫ配列は、
オリジナルの配列（ｐＨＡ１４０中に存在）と同一であ
る。この事実は、ＰＣＲおよびクローニング手順により
人為構造(artefacts)が導入されなかったことを示して
いる。

【００６４】１．２ｐＭＬＰ．ｎｌｓ．ｌａｃＺの構
築（Ｆｉｇ．２）ｐＭＬＰ．ｎｌｓ．ｌａｃＺをＦｉｇ．２に示される図
式にしたがい構築した。ｐＭＬＰ１０（５３）をＨｉｎ
ｄ IIIおよびＢａｍＨＩで切断した。ｎｌｓｌａｃＺを
ＡｖｒIIおよびＢａｍＨＩを用いてＬ７ＲＨβｇａｌ
（５４）から切り出し、Ｈｉｎｄ III−ＸｂａＩリンカ
ー配列とともに、Ｈｉｎｄ IIIおよびＢａｍＨＩで切断
されたｐＭＬＰ１０へ結合した。この新たな規構築物を
ｐＭＬＰ．ｎｌｓ．ｌａｃＺ／−Ａｄと命名した。

【００６５】Ｈｉｎｄ III−ＸｂａＩリンカー配列は以
下に示すオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション
により作成された。

【００６６】ＬＫ１５´−AGCTTGAATTCCCGGGTACCT−３´リンカーＬＫ２５´−CTAGAGGTACCCGGGAATTCA−３´リンカーアデノウイルス５型由来のＢｇｌII−ＳｃａＩ（ヌクレ
オチド（ｎｔ．）３３２８〜６０９２）をＢａｍＨＩお
よびＮｒｕＩで切断されたｐＭＬＰ．ｎｌｓ．ｌａｃＺ
／−Ａｄ中に結合した。

【００６７】１．３ｐＭＬＰ．ＴＫの構築（Ｆｉｇ．
３）はじめに、アデノウイルス５型配列のヌクレオチド３３
２８〜６０９２である中間構築物を作成した。ｐＳａｄ
と命名されたこのクローンは、ＥｃｏＲＩでのｐＭＬ
Ｐ．ｎｌｓ．ｌａｃＺの切断および再結合により作成さ
れた。

【００６８】ｐＭＬＰ．ＴＫは以下のフラグメントの結
合により作成した：ｐＭＬＰ１０のＡａｔII−Ｈｉｎｄ
IIIフラグメント（残されたＩＴＲおよびＭＬＰプロモ
ータ配列を含む）、ｐＳＰ６５．ＴＫのＨＳＶ−ＴＫを
含むＨｉｎｄIII−ＥｃｏＲＩフラグメントおよびＡａ
ｔII−ＥｃｏＲＩで切断されたｐＳａｄ。えられたクロ
ーンをｐＭＬＰ．ＴＫと命名した。

【００６９】この構築物の完全性（integrity）を、制
限酵素分析もしくはＴＫおよびＭＬＰプロモーター間、
ＴＫおよびＳＶ４０ポリ（Ａ）シグナルを含むアデノウ
イルスフラグメント（Ａｄ５のヌクレオチド３３２８〜
６０９２）間の境界の配列分析により評価した。

【００７０】ＴＫ陰性骨肉腫（１４３）細胞へのトラン
スフェクションによって、ＨＡＴおよびガンシクロビル
感受性が起こり、これによってＨＳＶ−ＴＫが機能しう
ることが示される。

【００７１】１．４ｐＭＬＰ．ｌｕｃの構築（Ｆｉ
ｇ．４）ＭＬＰの制御下にあるホタルルシフェラーゼ遺伝子（ｌ
ｕｃ）（ｐＭＬＰ．ｌｕｃ）を含む類似のアデノウイル
ス構築物を作成した。ｌｕｃを、制限酵素Ｈｉｎｄ III
およびＳｓｐＩを用いてｐＲＳＶ．ｌｕｃ（５５）より
単離し、Ｈｉｎｄ IIIおよびＳｍａＩで切断されたｐＢ
ｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ストラタジーン(Stratagene)）中
へ結合した。えられたクローンをｐＢＳ．ｌｕｃと命名
した。

【００７２】ｐＭＬＰ．ＴＫ中のＨＳＶ−ＴＫを、切断
およびそれぞれの各Ｈｉｎｄ III−ＢａｍＨＩフラグメ
ントの結合により、ｐＢＳ由来のｌｕｃと交換した。

【００７３】１．５ｐＣＭＶ．ＴＫおよびｐＣＭＶ．
ｌｕｃの構築（Ｆｉｇ．５、６および７）主後期プロモーター（Major Late Promoter)（ＭＬＰ）
の活性はかなり低いので、組換え遺伝子（ＨＳＶ−Ｔ
Ｋ、ｌｕｃなど）が強力なプロモーターであるサイトメ
ガロウイルス（ＣＭＶ）即時型初期プロモーター（imme
diate early promoter）によって作動するさらなる、組
換えのアデノウイルスを作成した。ＣＭＶプロモーター
を含む新たな基礎構築物は、Ｆｉｇ．５に示される図式
にしたがい作成した。下流にＳＶ４０由来のイントロン
配列を持つＣＭＶプロモーターは、ｐＣＭＶβ（クロー
ンテック(Clontech)）をＰｓｔＩおよびＳｔｕＩで切断
することによってえて、ＰｓｔＩおよびＥｃｏＲＶで切
断されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ストラタジーン）中
へ結合させ、結果としてｐＢＳ．ＣＭＶをえた。

【００７４】ＣＭＶプロモーターを含むフラグメント
を、ＳｍａＩおよびＣｌａＩを用いてｐＢＳ、ＣＭＶか
ら切り出し、ＰｖｕIIおよびＣｌａＩで切断されたｐＭ
ＬＰ１０中に結合した。この新たなクローンをｐＣＭ
Ｖ．１０と命名した。

【００７５】ｐＣＭＶ．ＴＫおよびｐＣＭＶ．ｌｕｃ
は、ｐＣＭＶ．１０のＨｉｎｄ III−ＰｖｕＩフラグメ
ントを同一の制限酵素で切断したｐＭＬＰ．ＴＫおよび
ｐＭＬＰ．ｌｕｃの各々に結合させることにより作成し
た。

【００７６】１．６組換えアデノウイルスの作成アデノウイルスＩＧ．Ａｄ．ＭＬＰ．ＴＫ、ＩＧ．Ａ
ｄ．ＣＭＶ．ＴＫ、ＩＧ．Ａｄ．ＭＬＰ．ｎｌｓ．ｌａ
ｃＺ、ＩＧ．Ａｄ．ＭＬＰ．ｌｕｃおよびＩＧ．Ａｄ．
ＣＭＶ．ｌｕｃを、２９３細胞中における組換えおよび
プラーク精製により作成した。手順をＦｉｇ．８に図式
的に示す。組換えアデノウイルスを、アデノウイルス構
築物（ｐＭＬＰ．ＴＫ、ｐＣＭＶ．ＴＫ、ｐＭＬＰ．ｌ
ｕｃおよびｐＣＭＶ．ｌｕｃ）ならびに野生型ヒトアデ
ノウイルス５型の巨大ＣｌａＩフラグメントの同時トラ
ンスフェクション(co-transfection）により調製した。
同時トランスフェクションより２日後、細胞を集め、３
回の凍結／融解サイクルに付した。上清を新鮮な２９３
細胞に適用し、翌日寒天で覆った。感染より６日後、プ
ラークを可視化するためのニュートラルレッドを含む寒
天を用いて、２回目の寒天による被覆を行なった。プラ
ークを選び取り、２００ｍｌの培養培地へ入れた。この
ウイルス懸濁液２０ｍｌを２９３細胞へ添加した。充分
な細胞変性効果（ＣＰＥ）を示した時点で、溶解（１ｙ
ｓｅ）した細胞を集め、ＨＳＶ．ＴＫ（サザンブロッテ
ィングによる）またはルシフェラーゼ（ルシフェラーゼ
活性の評価による）の存在を評価した。陽性プラークを
２回目のプラーク精製に付し、前回と同様に評価した。
１つの陽性プラークを用いて、７５ｃｍ²フラスコ中の
２９３細胞にそのプラーク精製物を接種することにより
ウイルスのマスターストック(virus master stock)を作
成した。ウイルスのマスターストック４ｍｌを２９３細
胞を含む２０本の１７５ｃｍ²フラスコに接種した。７
２時間後、充分なＣＰＥがみられたとき、２９３細胞を
集め、ウイルスをＣｓＣｌ密度勾配により精製し、慣例
手順（５６）にしたがい透析した。

【００７７】えられたウイルスの同一性を、制限酵素分
析およびサザンブロッティングにより調べた。これらの
すべてのウイルスは野生型のＥ３領域を含んでいる。

【００７８】１．７ラット中皮腫の治療のためのＩ
Ｇ．Ａｄ．ＣＭＶ．ＴＫの使用体重２５０〜３６０ｇのフィッシャー３４４ラット（Fi
sher 344 rat）（ｎ＝１６）をエーテルを用いて麻酔し
た。右側の８番目および９番目の肋骨のあいだに小さな
開口を作成した。II４５ラット中皮腫細胞１×１０⁵個
を含むＰＢＳ２００μｌを、胸内へ注射した。針を引き
抜いたのち、肋間の開口部は４×０非外傷性縫合（４×
０ sutures atraumatic）により閉鎖した。皮膚の傷は
９ｍｍオートクリップ（autoclip）により閉鎖した。腫
瘍細胞移植１日後、同様の位置に同様の手順で組換えア
デノウイルスを注射した。ＩＧ．Ａｄ．ＣＭＶ．ＴＫ７
×１０⁹感染単位(infection unit)（ｎ＝８）を含むＰ
ＢＳ２００μｌまたはＰＢＳ２００μｌ（ｎ＝８）を注
射した。２４時間後、１３日間のＧＣＶ（５０ｍｇ／ｋ
ｇ／日）またはＩＰを加えたＰＢＳによる処置を１日に
２回の割合で開始した。動物を４群に分けた：１−ＰＢ
Ｓの注射／ＰＢＳによる処置（ｎ＝４）、２−ＰＢＳ／
ＧＣＶ（ｎ＝４）、３−ＩＧ．Ａｄ．ＣＭＶ．ＴＫ／Ｐ
ＢＳ（ｎ＝４）、４−ＩＧ．Ａｄ．ＣＭＶ．ＴＫ／ＧＣ
Ｖ（ｎ＝４）。１４日目、ラットを屠殺し、肉眼で確認
できる胸内への腫瘍の浸湿潤の存在を検査した。可能な
限り腫瘍を含む胸部内容物(thoracic contents)(肺、心
臓、縦隔、気管および横隔膜の重量を測定した。

【００７９】

【表１】

【００８０】結論のちにＧＣＶによる処置を行なうＩＧ．Ａｄ．ＣＭＶ．
ＴＫの投与による中皮腫ラット治療の結果、腫瘍細胞は
死滅する。

【００８１】１．８のちに腹腔内へのガンシクロビル
注射を行なう、アデノ−ＴＫの腫瘍内注射によるラット
脳腫瘍の治療ラット（９Ｌ神経膠腫）モデル（５７）を使用し、悪
性脳腫瘍におけるＩＧ．Ａｄ．ＭＬＰ．ＴＫおよびＧＣ
Ｖの効果を研究した。体重２００〜４００ｇのフィッシ
ャー３４４ラットを無作為抽出し、エーテルを用いて麻
酔し、定位フレーム（stereo taxic frame）に据えた。
ブレグマ（bregma）の前方１ｍｍかつ中央線（midline)
の側方２ｍｍの位置にバー穴（burr hole)を形成した。
９Ｌラット−神経膠肉腫細胞４×１０⁴個を含むハンク
スの緩衝生理食塩水（Hank´s buffered saline）１μ
ｌを、マイクロリッターシリンジ（２７規格針(gauge n
eedle)、ハミルトン（Hamilton））を用いて頭がい骨下
４ｍｍ深さの左前脳に注射した。細胞を２分間かけて注
射した。針をゆっくりと引き抜き、バー穴をボーンワッ
クス（bonewax）（ブラウン(Braun)）を用いて閉鎖し
た。皮膚を９ｍｍオートクリップを用いて閉鎖した。そ
ののち、同様の位置に同様の手順で組換えアデノウイル
スを注射した。１０μｌを針跡(needle track)に沿って
５分間かけて注入した。腫瘍細胞移植３日後、ＩＧ．Ａ
ｄ．ＭＬＰ．ＴＫまたはコントロールとしてのＩＧ．Ａ
ｄ．ＭＬＰ．ｌｕｃの異なる量を、８つの異なるラット
群（ＩＧ．Ａｄ．ＭＬＰ．ＴＫを５×１０⁸ＰＦＵ（ｎ
＝６）、１０⁸ＰＦＵ（ｎ＝１６）、１０⁷ＰＦＵ（ｎ＝
１０）および１０⁶ＰＦＵ（ｎ＝１０）ならびにＩＧ．
Ａｄ．ＭＬＰ．ｌｕｃを５×１０⁸ＰＦＵ（ｎ＝７）、
１０⁸ＰＦＵ（ｎ＝１２））の同じ部位に注射した。細
胞の倍加時間１８〜２０時間（５７）に基づいて各々の
ウイルス接種の時点で１０⁵個の腫瘍細胞量を仮定する
ことにより、３日目にＩＧ．Ａｄ．ＭＬＰ．ＴＫおよび
ＩＧ．Ａｄ．ＭＬＰ．ｌｕｃを用いて処置された異なる
群は、約５０００ｍ．ｏ．ｉ、１０００ｍ．ｏ．ｉ、１
００ｍ．ｏ．ｉおよび１０ｍ．ｏ．ｉならびに５０００
ｍ．ｏ．ｉ、１０００ｍ．ｏ．ｉでそれぞれ感染してい
ることが算出された。ウイルス注射４８時間後、ラット
にガンシクロビル（シンテックス(Syntex)）１５ｍｇ／
ｋｇまたはＰＢＳを１日に２度、１０日間、腹腔内へ投
与した。死亡したすべてのラットより、脳腫瘍を解剖
し、重量を測定した。結果をＦｉｇ．８にグラフで示
す。この図より、ＩＧ．Ａｄ．ＭＬＰ．ｌｕｃまたはＧ
ＣＶ処置なしのＩＧ．Ａｄ．ＭＬＰ．ＴＫを投与したラ
ットと比較して、５０００ｍ．ｏ．ｉおよび１０００
ｍ．ｏ．ｉのＩＧ．Ａｄ．ＭＬＰ．ＴＫで処置したラッ
トはかなり延長された生存期間を示す（ｌｏｇランク検
定、ｐ＜０．０１）と結論づけた。５０００ｍ．ｏ．ｉ
で処置した群の２匹および１０００ｍ．ｏ．ｉで処置し
た群の１匹は、バー穴を通じた腫瘍細胞の漏れ(spill)
により引き起こされた軟膜表面の腫瘍により死亡した。
これらのラットにおいて、大脳内の腫瘍は存在しなかっ
た。加えて、コントロール群の平均１５．７日間の生存
と比較して、ＩＧ．Ａｄ．ＭＬＰ．ＴＫを１００ｍ．
ｏ．ｉで処置したラットは平均で１８．３日間生存した
（Ｆｉｇ．９）。この処置を行なった群の生存期間はコ
ントロールと比較してかなり延長された（ｌｏｇランク
検定、ｐ＜０．０５）。１０⁶ＰＦＵ（１０ｍ．ｏ．
ｉ）で処置したラットの生存はコントロールと大きな差
はなかった（ｌｏｇランク検定、ｐ＞０．０５）。

【００８２】１．９ＩＧ．Ａｄ．ＭＬＰ．ＴＫおよび
ＩＧ．Ａｄ．ＣＭＶ．ＴＫを用いた軟膜転移の治療軟膜転移は癌患者の８％に起こる。軟膜転移は肺、乳房
の腫瘍および黒色腫に由来することが非常に多い（５
８）。Ａｄ．ＴＫ処置が軟膜転移治療に有効であるかど
うかを研究するために、９Ｌフィッシャー−ラットモデ
ルを使用した。９Ｌ腫瘍細胞４×１０⁴個を０日目に第
４脳室の脳脊髄液(liquor cerebrospinalisof the IVt
h)へ注射し、続いて３日目に組換えアデノウイルス（Ｉ
Ｇ．Ａｄ．ＭＬＰ．ＴＫまたはＩＧ．Ａｄ．ＣＭＶ．Ｔ
Ｋのどちらか一方）１０⁹ＰＦＵを同じ部位へ注入し
た。動物をガンシクロビルを用いて１４日間処理し、処
置は５日目に開始した。腫瘍細胞のみを注射しＧＣＶを
用いて処置またはウイルスのみを注射した動物モデルを
コントロールとした。それらの動物を毎日観察した。麻
痺のような病気の症候がみられたとき、動物モデルを屠
殺した。

【００８３】結果をＦｉｇ．１０に示す。この実験よ
り、組換えアデノウイルスを用いた軟膜転移の治療は、
ａ）健常な期間をかなり延長し、ｂ）ＩＧ．Ａｄ．ＣＭ
Ｖ．ＴＫはＩＧ．Ａｄ．ＭＬＰ．ＴＫよりも強力な抗腫
瘍効果を持つ、という結論をえる。おそらくこれは、強
力なＣＭＶプロモーター活性、さらにそのため導入され
た細胞においてＨＳＶ−ＴＫが高レベル産生されること
により説明されよう。

【００８４】１．１０正常ラット脳における組換えア
デノウイルスの毒性正常な脳組織におけるＩＧ．ＭＬＰ．Ａｄ．ＴＫの毒性
を評価するために、以下に示す表にしたがい、研究を行
なった。すべての群は３匹のラットにより構成した。い
くつかのコントロール群が含まれていたが、それらのう
ちの１つは病理学的な副作用に対する正のコントロール
として野生型アデノウイルス５型で処置した群であっ
た。

【００８５】処置プロトコールは以下のとおりである。

【００８６】１日目：ウイルスまたはコントロール物質
の大脳内への注射。

【００８７】２〜１４日目：ガンシクロビルまたはＰＢ
Ｓでの１日２回の動物の処置。

【００８８】１５日目：４％パラホルムアルデヒドを用
いての灌流。

【００８９】バイブラトーン(vibratome)を用いての５
０μｍ厚の脳切片の調製。

【００９０】ヘマトキシリン、フロキシンおよびサフラ
ン(Saphran)を用いての切片の染色。

【００９１】脳内注射１４日間の処置１．ＰＢＳ１ｍｌＰＢＳを１日２回２．ＰＢＳ１５ｍｇ／ｋｇＧＣＶを１日２回３．１×１０⁸ｐｆｕＩＧ．Ａｄ．ＭＬＰ．ＴＫ１ｍｌＰＢＳを１日２回４．１×１０⁸ｐｆｕＩＧ．Ａｄ．ＭＬＰ．ＴＫ１５ｍｇ／ｋｇＧＣＶを１日２回５．１×１０⁸ｐｆｕＩＧ．Ａｄ．ＭＬＰ．ＴＫ＋１％野生型Ａｄ．５１ｍｌＰＢＳを１日２回６．１×１０⁸ｐｆｕＩＧ．Ａｄ．ＭＬＰ．ＴＫ＋１％野生型Ａｄ．５１５ｍｇ／ｋｇＧＣＶを１日２回７．１×１０⁸ｐｆｕ野生型Ａｄ．５１ｍｌＰＢＳを１日２回８．１×１０⁸ｐｆｕ野生型Ａｄ．５１５ｍｇ／ｋｇＧＣＶを１日２回実験中、死亡または著しい病気の臨床的な徴候を示した
ラットはなかった。一連の脳切片の顕微鏡による分析
は、針跡のみが鉄を含有する赤血球およびマクロファー
ジの存在により依然として認識可能であることを示し
た。これは注射のあいだに多少の出血がおきたことを示
している。明らかな病理学的変化は、野生型アデノウイ
ルスを１０⁸ｐｆｕ注射した動物においてのみ見られ
た。白血球、おそらくはリンパ球、の浸潤が、深さ約
０．５ｍｍまでの１０個の連続切片においてみられた。
この変化は、この群の３匹すべての動物モデルにおいて
みられた。おそらくこれらの病理学的変化は、アデノウ
イルスに感染した細胞に対する免疫反応を反映している
のであろう。ラットは非許容(non-permissive)または半
許容(semi-permissive)であるので、野生型アデノウイ
ルスの複製がおこらなかったのかもしれない。しかし、
Ｅ１遺伝子の発現のため他のアデノウイルス遺伝子はト
ランス転写活性化(transactivate)されるかもしれな
い。アデノウイルス抗原の細胞内産生は細胞免疫応答を
引き出す。そのような病理学的反応は、ｉｎｖｉｖｏ
での野生型ヒトアデノウイルス５型のマウス肺への肺内
投与（８）ののちに述べられている。

【００９２】リンパ球の浸潤は、ＩＧ．Ａｄ．ＭＬＰ．
ＴＫおよび１％野生型Ａｄ５の混合物を注射した動物を
含む他のあらゆる処置群において見られなかった。コン
トロール群（１群および組換えウイルスで処置した群）
の切片間に差異はみられなかった。群の３匹のなかの１
匹は、脳梁(corpus calosum)においてわずかな浸潤を示
したが原因は不明である。

【００９３】組織学的異常がまったくみられなかった、
またあってもわずかしかみられなかったという観察結果
は、他で報告されている変化（５９）と対照的である。

【００９４】既報のデータ（５９）および本発明者らの
データ（２０倍量のウイルスを注射していることに注
意）とのあいだの著しい差異があることの理由は、はっ
きりしない。本発明者らは本発明のウイルス中のＥ３領
域の保持が副作用を妨げていると解釈している。

【００９５】１．１１ｉｎｖｉｔｒｏでのヒトおよ
びラット神経膠腫細胞に対するＩＧ．Ａｄ．ＭＬＰ．Ｔ
ＫおよびＩＧ．Ａｄ．ＣＭＶ．ＴＫならびにＧＣＶ処置
の抗腫瘍活性ラット９Ｌ神経膠腫細胞、ヒトＵ２５１神経膠腫細胞、
ヒトＤ３８４神経膠腫細胞およびヒトＬＷ５神経膠腫細
胞に、ＩＧ．Ａｄ．ＭＬＰ．ＴＫおよびＩＧ．Ａｄ．Ｃ
ＭＶ．ＴＫを感染させた。したがって、感染細胞をガン
シクロビルにさらした。４日後、培養および適当なコン
トロールをトリプシン処理(trypsinize)し、計数して生
存細胞数を評価した。結果をＦｉｇ．１１に図式的に示
す。実験結果より、以下の結論をえる。

【００９６】・ＩＧ．Ａｄ．ＣＭＶ．ＴＫはＩＧ．Ａ
ｄ．ＭＬＰ．ＴＫよりも効果的である（差がはっきりし
ないＵ２５１を除く）。これはＩＧ．Ａｄ．ＣＭＶ．Ｔ
Ｋ中に存在する強力なＣＭＶプロモーターによる。

【００９７】・ヒト細胞に対して、ＩＧ．Ａｄ．ＣＭ
Ｖ．ＴＫはＩＧ．Ａｄ．ＭＬＰ．ＴＫよりも毒性が高い
が、ラット細胞ではそうではない。

【００９８】・ＩＧ．Ａｄ．ＣＭＶ．ＴＫおよびＩＧ．
Ａｄ．ＭＬＰ．ＴＫは、ラット細胞よりもヒト細胞にお
いてより効果的である。

【００９９】１．１２ＩＧ．Ａｄ．ＭＬＰ．ＴＫおよ
びＩＧ．Ａｄ．ＣＭＶ．ＴＫの計画される使用組換えアデノウイルスを、少なくとも神経膠腫、中皮腫
および軟膜転移の治療の臨床研究に使用することが計画
されている。神経膠腫治療のために、臨床プロトコール
は、手術による腫瘍塊の大部分を除去したのちに、創傷
床へウイルスを適用することにより構成される。別の戦
略は精製したＩＧ．Ａｄ．ＭＬＰ．ＴＫまたはＩＧ．Ａ
ｄ．ＣＭＶ．ＴＫの腫瘍への直接注射を計画している。

【０１００】軟膜転移の治療案は、ＩＧ．Ａｄ．ＭＬ
Ｐ．ＴＫまたはＩＧ．Ａｄ．ＣＭＶ．ＴＫの脳脊髄液へ
の直接注入を含んでいる。中皮腫の治療は組換えアデノ
ウイルスの胸膜腔への投与より構成される。

【０１０１】また、本発明者らは、致死量の放射線を照
射したまたは照射していないアデノウイルス産生細胞
系、たとえばＩＧ．Ａｄ．ＭＬＰ．ＴＫまたはＩＧ．Ａ
ｄ．ＣＭＶ．ＴＫに感染した２９３細胞の投与をも含め
ている。Ａｄ．ＴＫ産生細胞（Ａｄ．ＴＫ producer）
の注射は、ｉｎｓｉｔｕでのアデノウイルス粒子の産
生だけでなく、チミジンキナーゼを非常に高いレベルで
産生する細胞をも誘導する。そのような細胞は抗腫瘍効
果にかなり寄与することが期待されている。

【０１０２】本発明者らは、本発明を神経膠腫、中皮腫
および軟膜転移に限定するのではなく、原則としてすべ
ての固形ガンは自殺遺伝子（ウイルス、パッケージング
細胞）およびガンシクロビルを用いた治療に付してもよ
い。

【０１０３】実施例２Ｉｌ−１αまたはＩｌ−３のｃＤＮＡを含む組換えアデ
ノウイルスを用いたガンの遺伝子治療２．１ｈＩＬ−１α前駆体ｃＤＮＡの単離およびクロ
ーニングＵ９３７細胞（ヒト単球細胞系）をリポ多糖（ＰＭＡ）
で刺激し、ＩＬ−１タンパク質の合成を誘導した。ＲＮ
Ａを刺激された単球より抽出し、逆転写してｃＤＮＡを
作成した。このｃＤＮＡをヒトＩｌ−１αに特異的なプ
ライマーを用いたＰＣＲ分析に付した。：正プライマー（forward primer）：５´−CAGCAAAGAAGTCAAGATGGCC−３´ 逆プライマー（reverse primer）：５´−GTGAGACTCCAGACCTACGCCTGG−３´ ＰＣＲ産物を、事前にＳｍａＩで切断されたｐＢｌｕｅ
ｓｃｒｉｐｔ（ストラタジーン）へ直接結合した。えら
れたクローンをｐＢＳ．ｈＩｌ−１αと命名した。

【０１０４】２．２組換えアデノウイルスの構築法ウイルス構築の第１段階は、ｐＭＬＰ．ＴＫの中のＨＳ
Ｖ．ＴＫをヒトＩｌ−１α前駆体ｃＤＮＡに交換するこ
とであった。Ｈｉｎｄ IIIを用いて部分切断しＥｃｏＲ
Ｉで部分切断することにより、ｐＢＳ．ｈＩｌ−１αか
ら５´側の４３０ｂｐ（Ｈｉｎｄ III−ＥｃｏＲＩ）を
単離した。ＩＬ−１α前駆体ｃＤＮＡの３´部分（７８
７ｂｐ）ＥｃｏＲＩ−ＡｖｒIIフラグメントは、ｈＩＬ
−１α前駆体ｃＤＮＡを含むが該遺伝子の最初４０ｂｐ
を欠くプラスミド（ｐＸＭ）由来である。これはＥｃｏ
ＲＩ−ＡｖｒIIフラグメントであった。これらのフラグ
メントをＨｉｎｄ IIIおよびＸｂａＩで切断されたｐＭ
ＬＰ．ＴＫ中へ結合した。えられたプラスミドをｐＭＬ
Ｐ．ｈＩＬ−１αと命名した（Ｆｉｇ．１２）。

【０１０５】２．３ｐＡｄ．ｈＩｌ−１αの特徴づけ２．３．１配列分析プラスミドｐＭＬＰ．ｈＩｌ−１αのＩｌ−１α前駆体
ｃＤＮＡの配列を完全に決定した。一方、Ｉｌ−１α前
駆体ｃＤＮＡに隣接する配列（ＳＶ４０ポリ（Ａ）シ
グナル、主後期プロモーター）を部分的に配列分析し、
クローニング手順がこれらの領域に影響を及ぼさなかっ
たことを確認した。前記のように、ヒトＩｌ−１αタン
パク質には多形性が存在する。配列分析により、えられ
た前駆体ｃＤＮＡが１１４番目にセリンを持つタンパク
質をコードしていることが示された。

【０１０６】２．３．２２９３細胞におけるヒトＩｌ
−１αの一時的な産生プラスミドｐＭＬＰ．Ｉｌ−１αが生物学的に活性のあ
るｈＩｌ−１αタンパク質を産生することができるかど
うか試験するために、該プラスミドを２９３細胞（ヒト
胚腎臓細胞）へトランスフェクトした。トランスフェク
ション２日後、細胞を集め、細胞溶解物をＤ１０細胞
（６０）を用いたバイオアッセイにおいて試験した。こ
の実験の結果をＦｉｇ．１３に示す。この結果は、生物
学的活性のあるｈＩｌ−１αがｐＭＬＰ．Ｉｌ−１αの
トランスフェクションののち産生されることを示してい
る。結果は配列のデータとともに、ｐＭＬＰ．ｈＩｌ−
１αが機能性のｈＩｌ−１αをコードしていることを示
している。

【０１０７】２．４ｈＩｌ−１α前駆体ｃＤＮＡを含
む組換えアデノウイルスの構築および産生Ｆｉｇ．８に示すスキームにしたがって前記のように
（実施例１参照）、ヒトＩｌ−１α前駆体ｃＤＮＡを含
む組換えアデノウイルス（ＩＧ．Ａｄ．ＭＬＰ．ｈＩｌ
−１α）をｐＭＬＰ．ｈＩｌ−１αおよびヒトアデノウ
イルス５型の巨大ＣｌａＩフラグメントの同時トランス
フェクションにより調製した。ウイルスの機能性は、商
業的に入手できるエリザキット（ELISA kit）（クォン
チカイン（Quantikine）、アールアンドディーシ
ステムズ（Ｒ＆Ｄ systems)）を用いた２９３細胞の上
清中のｈＩｌ−１αの測定により確認された。

【０１０８】２．５ラットインターロイキン−３
（ｒＩｌ−３）ｃＤＮＡのクローニングｒＩｌ−３ｃＤ
ＮＡを、ラットＩｌ−３遺伝子を含む構築物（ｐＩｌＲ
１）（６１）をＣＯＳ細胞にトランスフェクトさせるこ
とにより単離した。２日後、細胞より全RNAを単離し、
以下のプライマー：ラットＩｌ−３＃２：５′−ATGAGGATCCTTCAGGCTCCA−３′ を用いて逆転写に付した。このプライマーはｒＩｌ−３
ｃＤＮＡの翻訳停止コドンの下流にＢａｍＨＩ部位を導
入する。

【０１０９】えられたｃＤＮＡをプライマーラットＩ
ｌ−３＃２（前記）およびラットＩｌ−３＃１を用いて
ＰＣＲ増幅した。ラットＩｌ−３＃１の配列は以下のと
おりである。

【０１１０】ラットＩＬ−３＃１：５′−ACAAAGCTTTGGAGGACCAG−３′ このオリゴヌクレオチドは、Ｈｉｎｄ III部位をＡＴＧ
翻訳開始コドンの５′側に導入する。

【０１１１】えられたＰＣＲ産物をＢａｍＨＩおよびＨ
ｉｎｄ IIIで切断した。Ｈｉｎｄ IIIおよびＢａｍＨＩ
を用いたｐＭＬＰ．ＴＫの切断ならびにＨｉｎｄ III／
ＢａｍＨＩで切断されたラットＩｌ−３ｃＤＮＡの結合
により、ｐＭＬＰ．ＴＫのＨＳＶ．ＴＫをｒＩｌ−３ｃ
ＤＮＡと置換した。えられたクローンｐＭＬＰ．ｒＩｌ
−３中のｒＩｌ−３ｃＤＮＡを完全に配列決定した。ラ
ットＩｌ−３ｃＤＮＡ配列は以下のとおりである。

【０１１２】

【表２】

【０１１３】下線を引いた配列は、ｃＤＮＡのｐＭＬ
Ｐ．ＴＫ中へのクローニングのために用いられた、導入
されたＨｉｎｄ IIIおよびＢａｍＨＩ部位を表わしてい
る。

【０１１４】この配列は、文献６１には示されていない
本願のｃＤＮＡ配列によってコードされている３つの追
加のアミノ酸を除いて、ゲノム配列（６１）より導びか
れるエクソンと相同である。これらの配列はゲノム配列
中のイントロン１の末端にみられる（６１）。一方、本
発明者らは、これらの配列は転写され、したがってｃＤ
ＮＡ配列に属することを見いだしている。これらの配列
には前記配列において点線で下線を引いている。

【０１１５】ｒＩｌ−３ｃＤＮＡを含む組換えアデノウ
イルス（ＩＧ．Ａｄ．ＭＬＰ．ｒＩｌ−３）を、Ｆｉ
ｇ．８に示す図式にしたがい前記のＩＧ．Ａｄ．ＭＬ
Ｐ．ＴＫについての記載のようにして作製した。

【０１１６】ＩＧ．Ａｄ．ＭＬＰ．ｒＩｌ−３を、２９
３細胞の溶解液をＩｌ−３活性に適用することにより、
機能性ラットＩｌ−３の産生について分析した。分析
は、（マウス）Ｉｌ−３またはＧＭ−ＣＳＦに増殖を依
存しているＦＤＣＰ−１細胞（６２）で行なった。ラッ
トＩｌ−３に対しても感受性があることが判明した。

【０１１７】２．６実験ラット腫瘍へのｉｎｖｉｖ
ｏでのアデノウイルス産生細胞の投与サイトカインの最大産生を達成するために、アデノウイ
ルスを産生する細胞を腫瘍に直接注射した。アデノウイ
ルス産生細胞、およびアデノウイルス産生細胞より放出
されたアデノウイルスにより形質導入された腫瘍細胞に
より、サイトカインが産生されることが期待される。使
用した腫瘍モデルはＷａｇ／Ｒｉｊラット種におけるＬ
４２ラットＮＳＣＬＣであった（６３〜６５）。

【０１１８】１日目、Ｌ４２腫瘍を、動物の両側腹部に
皮下移植した。１０日目、１０⁷個の２９３細胞を含
む、ＰＢＳ３００μｌを左側腹部の腫瘍に注射した。２
９３細胞は４８時間前に、以下に示す組換えアデノウイ
ルス（１０m.o.i）に感染させておいた。

【０１１９】ラットは５つの群に分けられ、各群は４匹
を含んでいた。

【０１２０】１Ｌ４２腫瘍のみを注射した動物２未感染２９３細胞を注射した動物３ IG.Ad.MLP.LacZに感染した２９３細胞を注射した動
物４ IG.Ad.MLP.rIL-3に感染した２９３細胞を注射した
動物５ IG.Ad.MLP.hIL-1αに感染した２９３細胞を注射し
た動物注射前、腫瘍の大きさを測定した。平均の腫瘍の体積：
１３０ｍｍ³。

【０１２１】両側腹部の腫瘍の大きさを週２回測定し
た。

【０１２２】２０日目、左側腹部の腫瘍に、前記図式に
厳密にしたがい２９３細胞を再度注射した。腫瘍の大き
さを時間の関数として描き、Ｆｉｇ．１４に図示的に示
す。結果は、両側部の腫瘍の退縮はサイトカイン（hIl-
1αまたはrIl-3）遺伝子を含むアデノウイルスが投与さ
れるときのみ見られる（各サイトカインに対し３／４の
動物）ことを示している。これは、腫瘍に対する宿主の
応答は、腫瘍において多量のサイトカインが産出される
とき誘導されることを示唆している。

【０１２３】２．７ hIl-1αまたはIl-3を含む組換え
アデノウイルスの計画される使用ヒトIl-1α前駆体cDNAまたはIl-3cDNA配列を含む組換え
アデノウイルスは充分量まで増殖され、固形ガンへの直
接注射に使用される。はじめに使用される腫瘍はNSCLC
（非小細胞肺ガン（non small cell lung cancer））で
あろう。しかし、中皮腫、黒色腫および他の型の固形ガ
ンについても、hIl-1αおよび／またはIl-3cDNAを含む
組換えアデノウイルスの投与ののち、ガン細胞破壊およ
び腫瘍免疫（tumorimmunity）が調べられるだろう。ウ
イルスの投与量（フェーズＩ研究において決定される最
適投与量）を、腫瘍塊へ直接注射するかまたはウイルス
の適用がより容易なそれらの腫瘍の転移へ投与する。hI
l-1αタンパク質の放出が不充分であるために、IG.Ad.M
LP.hIl-1α注射の効果が期待よりも低いばあい、ウイル
スの点滴注入に続き、腫瘍の局部照射を行ない産生され
た組換えhIl-1αの放出を達成する。本発明者らは、IG.
Ad.MLP.hIl-1αを他のサイトカイン遺伝子または腫瘍抑
制遺伝子を含む組換えアデノウイルスと組み合わせて使
用することも計画している。あるいは、hIl-1αを用い
た治療は、IG.Ad.MLP.TK（単純ヘルペスウイルスチミジ
ンキナーゼ遺伝子を含む組換えアデノウイルス）のよう
な他のアデノウイルスの適用と組み合わされるだろう。
チミジンキナーゼを発現している細胞はガンシクロビル
（細胞に対し毒性なし）をリン酸化して、細胞に対し毒
性のあるガンシクロビルリン酸化物（ganciclovir phos
phate）にすることができる。hIL-1αを同時発現（coex
press）している細胞は、死ぬときに細胞内に蓄積され
た組換えhIl-1αを放出し、抗腫瘍活性を増加させるだ
ろう。in vivoでのIG.Ad.hIl-1αまたはIG.Ad.Il-3の腫
瘍内への注射に加え、本発明者らはIG.Ad.hIl-1αまた
はIG.Ad.Il-3のin vivoでの遺伝子トランスファーと組
み合わせるかまたは組み合わせないで、ウイルスをワク
チン接種型の研究に使用することも計画している。患者
の腫瘍細胞を単離し、IG.Ad.hIl-1αまたはIG.Ad.Il-3
を感染させ、放射線を照射し、患者に再注入するだろ
う。そのようなアプローチは、腫瘍細胞に対する免疫の
増加に役立つだろう。加えて、実施例に示すように、本
発明者らはアデノウイルス産生細胞（例、２９３細胞）
を腫瘍に直接投与し、産生細胞、およびウイルス産生細
胞より放出されたウイルスによって形質導入された腫瘍
細胞により、hIl-1αまたはIl-3を局所的に大量に産生
させることを計画している。

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monographs 6, 111-114

【図面の簡単な説明】

【図１】Ｆｉｇ．１は、ＨＳＶ−ＴＫのヌクレオチド配
列を示す。

【図２】Ｆｉｇ．２は、ｐＭＬＰ．ｎｌｓ．ｌａｃＺの
構築の過程を示す、概略図である。

【図３】Ｆｉｇ．３ａは、ｐＭＬＰ．ＴＫの構築の過程
を示す、概略図である。

【図４】Ｆｉｇ．３ｂは、ｐＭＬＰ．ＴＫの構築の過程
を示す、概略図である。

【図５】Ｆｉｇ．４は、ｐＭＬＰ．ｌｕｃの構築の過程
を示す、概略図である。

【図６】Ｆｉｇ．５は、ｐＣＭＶ１０、ｐＣＭＶ．ＴＫ
およびｐＣＭＶ．ｌｕｃの構築の過程を示す、概略図で
ある。

【図７】Ｆｉｇ．６は、ｐＣＭＶ１０、ｐＣＭＶ．ＴＫ
およびｐＣＭＶ．ｌｕｃの構築の過程を示す、概略図で
ある。

【図８】Ｆｉｇ．７はｐＣＭＶ１０、ｐＣＭＶ．ＴＫお
よびｐＣＭＶ．ｌｕｃの構築の過程を示す、概略図であ
る。

【図９】Ｆｉｇ．８は、組換えアデノウイルスの構築の
過程を示す、概略図である。

【図１０】Ｆｉｇ．９は、組換えアデノウイルス単回投
与および続くＧＣＶ療法の投与量段階的増加試験での脳
腫瘍ラットにおけるカプラン−メイヤー生存曲線を示す
グラフである。

【図１１】Ｆｉｇ．１０は、ＩＧ．Ａｄ．ＭＬＰ．ＴＫ
／ＩＧ．Ａｄ．ＣＭＶ．ＴＫで処置した軟膜転移ラット
における無症候期間を示すグラフである。

【図１２】Ｆｉｇ．１１ａは、ヒトおよびラット神経膠
腫細胞に対する、in vitroにおけるＩＧ．Ａｄ．ＭＬ
Ｐ．ＴＫおよびＩＧ．Ａｄ．ＣＭＶ．ＴＫの有効性を示
すグラフである。

【図１３】Ｆｉｇ．１１ｂは、ヒトおよびラット神経膠
腫細胞に対する、in vitroにおけるＩＧ．Ａｄ．ＭＬ
Ｐ．ＴＫおよびＩＧ．Ａｄ．ＣＭＶ．ＴＫの有効性を示
すグラフである。

【図１４】Ｆｉｇ．１２は、ｐＭＬＰ．ｈＩＬ−１αと
名付けられたプラスミドを説明する。

【図１５】Ｆｉｇ．１３は、Ｄ１０細胞を用いたバイオ
アッセイの結果を示すグラフである。

【図１６】Ｆｉｇ．１４ａは、アデノウイルス産生細胞
の実験的ラット腫瘍に対するin vivo投与の結果を示す
グラフである。

【図１７】Ｆｉｇ．１４ｂは、アデノウイルス産生細胞
の実験的ラット腫瘍に対するin vivo投与の結果を示す
グラフである。

【図１８】Ｆｉｇ．１４ｃは、アデノウイルス産生細胞
の実験的ラット腫瘍に対するin vivo投与の結果を示す
グラフである。

【手続補正書】

【提出日】平成８年２月７日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図面の簡単な説明

【補正方法】変更

【補正内容】

【図面の簡単な説明】

【図１】ＨＳＶ−ＴＫのヌクレオチド配列を示す。

【図２】ｐＭＬＰ．ｎｌｓ．ｌａｃＺの構築の過程を
示す、概略図である。

【図３ａ】ｐＭＬＰ．ＴＫの構築の過程を示す、概略図
である。

【図３ｂ】ｐＭＬＰ．ＴＫの構築の過程を示す、概略図
である。

【図４】ｐＭＬＰ．ｌｕｃの構築の過程を示す、概略図
である。

【図５】ｐＣＭＶ１０、ｐＣＭＶ．ＴＫおよびｐＣＭ
Ｖ．ｌｕｃの構築の過程を示す、概略図である。

【図６】ｐＣＭＶ１０、ｐＣＭＶ．ＴＫおよびｐＣＭ
Ｖ．ｌｕｃの構築の過程を示す、概略図である。

【図７】ｐＣＭＶ１０、ｐＣＭＶ．ＴＫおよびｐＣＭ
Ｖ．ｌｕｃの構築の過程を示す、概略図である。

【図８】組換えアデノウイルスの構築の過程を示す、概
略図である。

【図９】組換えアデノウイルス単回投与および続くＧＣ
Ｖ療法の投与量段階的増加試験での脳腫瘍ラットにおけ
るカプラン−メイヤー生存曲線を示すグラフである。

【図１０】ＩＧ．Ａｄ．ＭＬＰ．ＴＫ／ＩＧ．Ａｄ．Ｃ
ＭＶ．ＴＫで処置した軟膜転移ラットにおける無症候期
間を示すグラフである。

【図１１ａ】ヒトおよびラット神経膠腫細胞に対する、
ｉｎｖｉｔｒｏにおけるＩＧ．Ａｄ．ＭＬＰ．ＴＫお
よびＩＧ．Ａｄ．ＣＭＶ．ＴＫの有効性を示すグラフで
ある。

【図１１ｂ】ヒトおよびラット神経膠腫細胞に対する、
ｉｎｖｉｔｒｏにおけるＩＧ．Ａｄ．ＭＬＰ．ＴＫお
よびＩＧ．Ａｄ．ＣＭＶ．ＴＫの有効性を示すグラフで
ある。

【図１２】ｐＭＬＰ．ｈＩＬ−１αと名付けられたプラ
スミドを説明する。

【図１３】Ｄ１０細胞を用いたバイオアッセイの結果を
示すグラフである。

【図１４ａ】アデノウイルス産生細胞の実験的ラット腫
瘍に対するｉｎｖｉｖｏ投与の結果を示すグラフであ
る。

【図１４ｂ】アデノウイルス産生細胞の実験的ラット腫
瘍に対するｉｎｖｉｖｏ投与の結果を示すグラフであ
る。

【図１４ｃ】アデノウイルス産生細胞の実験的ラット腫
瘍に対するｉｎｖｉｖｏ投与の結果を示すグラフであ
る。

【手続補正２】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】全図

【補正方法】変更

【補正内容】

【図８】

【図１】

【図９】

【図２】

【図３ａ】

【図１０】

【図１１ａ】

【図３ｂ】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図１１ｂ】

【図１２】

【図１３】

【図１４ａ】

【図１４ｂ】

【図１４ｃ】

【手続補正書】

【提出日】平成８年３月１１日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００６３

【補正方法】変更

【補正内容】

【００６３】図１に示したＨＳＶ−ＴＫ配列は、オリジ
ナルの配列（ｐＨＡ１４０中に存在）と同一である。こ
の事実は、ＰＣＲおよびクローニング手順により人為構
造(artefacts)が導入されなかったことを示している。

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００６４

【補正方法】変更

【補正内容】

【００６４】１．２ｐＭＬＰ．ｎｌｓ．ｌａｃＺの構
築（図２）ｐＭＬＰ．ｎｌｓ．ｌａｃＺを図２に示される図式にし
たがい構築した。ｐＭＬＰ１０（５３）をＨｉｎｄ III
およびＢａｍＨＩで切断した。ｎｌｓｌａｃＺをＡｖｒ
IIおよびＢａｍＨＩを用いてＬ７ＲＨβｇａｌ（５４）
から切り出し、Ｈｉｎｄ III−ＸｂａＩリンカー配列と
ともに、Ｈｉｎｄ IIIおよびＢａｍＨＩで切断されたｐ
ＭＬＰ１０へ結合した。この新たな規構築物をｐＭＬ
Ｐ．ｎｌｓ．ｌａｃＺ／−Ａｄと命名した。

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００６７

【補正方法】変更

【補正内容】

【００６７】１．３ｐＭＬＰ．ＴＫの構築（図３ａお
よび図３ｂ）はじめに、アデノウイルス５型配列のヌクレオチド３３
２８〜６０９２である中間構築物を作成した。ｐＳａｄ
と命名されたこのクローンは、ＥｃｏＲＩでのｐＭＬ
Ｐ．ｎｌｓ．ｌａｃＺの切断および再結合により作成さ
れた。

【手続補正４】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００７１

【補正方法】変更

【補正内容】

【００７１】１．４ｐＭＬＰ．ｌｕｃの構築（図４）ＭＬＰの制御下にあるホタルルシフェラーゼ遺伝子（ｌ
ｕｃ）（ｐＭＬＰ．ｌｕｃ）を含む類似のアデノウイル
ス構築物を作成した。ｌｕｃを、制限酵素Ｈｉｎｄ III
およびＳｓｐＩを用いてｐＲＳＶ．ｌｕｃ（５５）より
単離し、Ｈｉｎｄ IIIおよびＳｍａＩで切断されたｐＢ
ｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ストラタジーン(Stratagene)）中
へ結合した。えられたクローンをｐＢＳ．ｌｕｃと命名
した。

【手続補正５】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００７３

【補正方法】変更

【補正内容】

【００７３】１．５ｐＣＭＶ．ＴＫおよびｐＣＭＶ．
ｌｕｃの構築（図５、図６および図７）主後期プロモーター（Major Late Promoter)（ＭＬＰ）
の活性はかなり低いので、組換え遺伝子（ＨＳＶ−Ｔ
Ｋ、ｌｕｃなど）が強力なプロモーターであるサイトメ
ガロウイルス（ＣＭＶ）即時型初期プロモーター（imme
diate early promoter）によって作動するさらなる、組
換えのアデノウイルスを作成した。ＣＭＶプロモーター
を含む新たな基礎構築物は、図５に示される図式にした
がい作成した。下流にＳＶ４０由来のイントロン配列を
持つＣＭＶプロモーターは、ｐＣＭＶβ（クローンテッ
ク(Clontech)）をＰｓｔＩおよびＳｔｕＩで切断するこ
とによってえて、ＰｓｔＩおよびＥｃｏＲＶで切断され
たｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ストラタジーン）中へ結合
させ、結果としてｐＢＳ．ＣＭＶをえた。

【手続補正６】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００７６

【補正方法】変更

【補正内容】

【００７６】１．６組換えアデノウイルスの作成アデノウイルスＩＧ．Ａｄ．ＭＬＰ．ＴＫ、ＩＧ．Ａ
ｄ．ＣＭＶ．ＴＫ、ＩＧ．Ａｄ．ＭＬＰ．ｎｌｓ．ｌａ
ｃＺ、ＩＧ．Ａｄ．ＭＬＰ．ｌｕｃおよびＩＧ．Ａｄ．
ＣＭＶ．ｌｕｃを、２９３細胞中における組換えおよび
プラーク精製により作成した。手順を図８に図式的に示
す。組換えアデノウイルスを、アデノウイルス構築物
（ｐＭＬＰ．ＴＫ、ｐＣＭＶ．ＴＫ、ｐＭＬＰ．ｌｕｃ
およびｐＣＭＶ．ｌｕｃ）ならびに野生型ヒトアデノウ
イルス５型の巨大ＣｌａＩフラグメントの同時トランス
フェクション(co-transfection）により調製した。同時
トランスフェクションより２日後、細胞を集め、３回の
凍結／融解サイクルに付した。上清を新鮮な２９３細胞
に適用し、翌日寒天で覆った。感染より６日後、プラー
クを可視化するためのニュートラルレッドを含む寒天を
用いて、２回目の寒天による被覆を行なった。プラーク
を選び取り、２００ｍｌの培養培地へ入れた。このウイ
ルス懸濁液２０ｍｌを２９３細胞へ添加した。充分な細
胞変性効果（ＣＰＥ）を示した時点で、溶解（１ｙｓ
ｅ）した細胞を集め、ＨＳＶ．ＴＫ（サザンブロッティ
ングによる）またはルシフェラーゼ（ルシフェラーゼ活
性の評価による）の存在を評価した。陽性プラークを２
回目のプラーク精製に付し、前回と同様に評価した。１
つの陽性プラークを用いて、７５ｃｍ²フラスコ中の２
９３細胞にそのプラーク精製物を接種することによりウ
イルスのマスターストック(virus master stock)を作成
した。ウイルスのマスターストック４ｍｌを２９３細胞
を含む２０本の１７５ｃｍ²フラスコに接種した。７２
時間後、充分なＣＰＥがみられたとき、２９３細胞を集
め、ウイルスをＣｓＣｌ密度勾配により精製し、慣例手
順（５６）にしたがい透析した。

【手続補正７】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００８１

【補正方法】変更

【補正内容】

【００８１】１．８のちに腹腔内へのガンシクロビル
注射を行なう、アデノ−ＴＫの腫瘍内注射によるラット
脳腫瘍の治療ラット（９Ｌ神経膠腫）モデル（５７）を使用し、悪
性脳腫瘍におけるＩＧ．Ａｄ．ＭＬＰ．ＴＫおよびＧＣ
Ｖの効果を研究した。体重２００〜４００ｇのフィッシ
ャー３４４ラットを無作為抽出し、エーテルを用いて麻
酔し、定位フレーム（stereo taxic frame）に据えた。
ブレグマ（bregma）の前方１ｍｍかつ中央線（midline)
の側方２ｍｍの位置にバー穴（burr hole)を形成した。
９Ｌラット−神経膠肉腫細胞４×１０⁴個を含むハンク
スの緩衝生理食塩水（Hank´s buffered saline）１μ
ｌを、マイクロリッターシリンジ（２７規格針(gauge n
eedle)、ハミルトン（Hamilton））を用いて頭がい骨下
４ｍｍ深さの左前脳に注射した。細胞を２分間かけて注
射した。針をゆっくりと引き抜き、バー穴をボーンワッ
クス（bonewax）（ブラウン(Braun)）を用いて閉鎖し
た。皮膚を９ｍｍオートクリップを用いて閉鎖した。そ
ののち、同様の位置に同様の手順で組換えアデノウイル
スを注射した。１０μｌを針跡(needle track)に沿って
５分間かけて注入した。腫瘍細胞移植３日後、ＩＧ．Ａ
ｄ．ＭＬＰ．ＴＫまたはコントロールとしてのＩＧ．Ａ
ｄ．ＭＬＰ．ｌｕｃの異なる量を、８つの異なるラット
群（ＩＧ．Ａｄ．ＭＬＰ．ＴＫを５×１０⁸ＰＦＵ（ｎ
＝６）、１０⁸ＰＦＵ（ｎ＝１６）、１０⁷ＰＦＵ（ｎ＝
１０）および１０⁶ＰＦＵ（ｎ＝１０）ならびにＩＧ．
Ａｄ．ＭＬＰ．ｌｕｃを５×１０⁸ＰＦＵ（ｎ＝７）、
１０⁸ＰＦＵ（ｎ＝１２））の同じ部位に注射した。細
胞の倍加時間１８〜２０時間（５７）に基づいて各々の
ウイルス接種の時点で１０⁵個の腫瘍細胞量を仮定する
ことにより、３日目にＩＧ．Ａｄ．ＭＬＰ．ＴＫおよび
ＩＧ．Ａｄ．ＭＬＰ．ｌｕｃを用いて処置された異なる
群は、約５０００ｍ．ｏ．ｉ、１０００ｍ．ｏ．ｉ、１
００ｍ．ｏ．ｉおよび１０ｍ．ｏ．ｉならびに５０００
ｍ．ｏ．ｉ、１０００ｍ．ｏ．ｉでそれぞれ感染してい
ることが算出された。ウイルス注射４８時間後、ラット
にガンシクロビル（シンテックス(Syntex)）１５ｍｇ／
ｋｇまたはＰＢＳを１日に２度、１０日間、腹腔内へ投
与した。死亡したすべてのラットより、脳腫瘍を解剖
し、重量を測定した。結果を図８にグラフで示す。この
図より、ＩＧ．Ａｄ．ＭＬＰ．ｌｕｃまたはＧＣＶ処置
なしのＩＧ．Ａｄ．ＭＬＰ．ＴＫを投与したラットと比
較して、５０００ｍ．ｏ．ｉおよび１０００ｍ．ｏ．ｉ
のＩＧ．Ａｄ．ＭＬＰ．ＴＫで処置したラットはかなり
延長された生存期間を示す（ｌｏｇランク検定、ｐ＜
０．０１）と結論づけた。５０００ｍ．ｏ．ｉで処置し
た群の２匹および１０００ｍ．ｏ．ｉで処置した群の１
匹は、バー穴を通じた腫瘍細胞の漏れ(spill)により引
き起こされた軟膜表面の腫瘍により死亡した。これらの
ラットにおいて、大脳内の腫瘍は存在しなかった。加え
て、コントロール群の平均１５．７日間の生存と比較し
て、ＩＧ．Ａｄ．ＭＬＰ．ＴＫを１００ｍ．ｏ．ｉで処
置したラットは平均で１８．３日間生存した（図９）。
この処置を行なった群の生存期間はコントロールと比較
してかなり延長された（ｌｏｇランク検定、ｐ＜０．０
５）。１０⁶ＰＦＵ（１０ｍ．ｏ．ｉ）で処置したラッ
トの生存はコントロールと大きな差はなかった（ｌｏｇ
ランク検定、ｐ＞０．０５）。

【手続補正８】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００８３

【補正方法】変更

【補正内容】

【００８３】結果を図１０に示す。この実験より、組換
えアデノウイルスを用いた軟膜転移の治療は、ａ）健常
な期間をかなり延長し、ｂ）ＩＧ．Ａｄ．ＣＭＶ．ＴＫ
はＩＧ．Ａｄ．ＭＬＰ．ＴＫよりも強力な抗腫瘍効果を
持つ、という結論をえる。おそらくこれは、強力なＣＭ
Ｖプロモーター活性、さらにそのため導入された細胞に
おいてＨＳＶ−ＴＫが高レベル産生されることにより説
明されよう。

【手続補正９】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００９５

【補正方法】変更

【補正内容】

【００９５】１．１１ｉｎｖｉｔｒｏでのヒトおよ
びラット神経膠腫細胞に対するＩＧ．Ａｄ．ＭＬＰ．Ｔ
ＫおよびＩＧ．Ａｄ．ＣＭＶ．ＴＫならびにＧＣＶ処置
の抗腫瘍活性ラット９Ｌ神経膠腫細胞、ヒトＵ２５１神経膠腫細胞、
ヒトＤ３８４神経膠腫細胞およびヒトＬＷ５神経膠腫細
胞に、ＩＧ．Ａｄ．ＭＬＰ．ＴＫおよびＩＧ．Ａｄ．Ｃ
ＭＶ．ＴＫを感染させた。したがって、感染細胞をガン
シクロビルにさらした。４日後、培養および適当なコン
トロールをトリプシン処理(trypsinize)し、計数して生
存細胞数を評価した。結果を図１１ａおよび図１１ｂに
図式的に示す。実験結果より、以下の結論をえる。

【手続補正１０】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１０４

【補正方法】変更

【補正内容】

【０１０４】２．２組換えアデノウイルスの構築法ウイルス構築の第１段階は、ｐＭＬＰ．ＴＫの中のＨＳ
Ｖ．ＴＫをヒトＩｌ−１α前駆体ｃＤＮＡに交換するこ
とであった。Ｈｉｎｄ IIIを用いて部分切断しＥｃｏＲ
Ｉで部分切断することにより、ｐＢＳ．ｈＩｌ−１αか
ら５´側の４３０ｂｐ（Ｈｉｎｄ III−ＥｃｏＲＩ）を
単離した。ＩＬ−１α前駆体ｃＤＮＡの３´部分（７８
７ｂｐ）ＥｃｏＲＩ−ＡｖｒIIフラグメントは、ｈＩＬ
−１α前駆体ｃＤＮＡを含むが該遺伝子の最初４０ｂｐ
を欠くプラスミド（ｐＸＭ）由来である。これはＥｃｏ
ＲＩ−ＡｖｒIIフラグメントであった。これらのフラグ
メントをＨｉｎｄ IIIおよびＸｂａＩで切断されたｐＭ
ＬＰ．ＴＫ中へ結合した。えられたプラスミドをｐＭＬ
Ｐ．ｈＩＬ−１αと命名した（図１２）。

【手続補正１１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１０６

【補正方法】変更

【補正内容】

【０１０６】２．３．２２９３細胞におけるヒトＩｌ
−１αの一時的な産生プラスミドｐＭＬＰ．Ｉｌ−１αが生物学的に活性のあ
るｈＩｌ−１αタンパク質を産生することができるかど
うか試験するために、該プラスミドを２９３細胞（ヒト
胚腎臓細胞）へトランスフェクトした。トランスフェク
ション２日後、細胞を集め、細胞溶解物をＤ１０細胞
（６０）を用いたバイオアッセイにおいて試験した。こ
の実験の結果を図１３に示す。この結果は、生物学的活
性のあるｈＩｌ−１αがｐＭＬＰ．Ｉｌ−１αのトラン
スフェクションののち産生されることを示している。結
果は配列のデータとともに、ｐＭＬＰ．ｈＩｌ−１αが
機能性のｈＩｌ−１αをコードしていることを示してい
る。

【手続補正１２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１０７

【補正方法】変更

【補正内容】

【０１０７】２．４ｈＩｌ−１α前駆体ｃＤＮＡを含
む組換えアデノウイルスの構築および産生図８に示すスキームにしたがって前記のように（実施例
１参照）、ヒトＩｌ−１α前駆体ｃＤＮＡを含む組換え
アデノウイルス（ＩＧ．Ａｄ．ＭＬＰ．ｈＩｌ−１α）
をｐＭＬＰ．ｈＩｌ−１αおよびヒトアデノウイルス５
型の巨大ＣｌａＩフラグメントの同時トランスフェクシ
ョンにより調製した。ウイルスの機能性は、商業的に入
手できるエリザキット（ELISA kit）（クォンチカイン
（Quantikine）、アールアンドディーシステムズ
（Ｒ＆Ｄ systems)）を用いた２９３細胞の上清中のｈ
Ｉｌ−１αの測定により確認された。

【手続補正１３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１１５

【補正方法】変更

【補正内容】

【０１１５】ｒＩｌ−３ｃＤＮＡを含む組換えアデノウ
イルス（ＩＧ．Ａｄ．ＭＬＰ．ｒＩｌ−３）を、図８に
示す図式にしたがい前記のＩＧ．Ａｄ．ＭＬＰ．ＴＫに
ついての記載のようにして作製した。

【手続補正１４】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１２２

【補正方法】変更

【補正内容】

【０１２２】２０日目、左側腹部の腫瘍に、前記図式に
厳密にしたがい２９３細胞を再度注射した。腫瘍の大き
さを時間の関数として描き、図１４ａ、図１４ｂおよび
図１４ｃに図示的に示す。結果は、両側部の腫瘍の退縮
はサイトカイン（hIl-1αまたはrIl-3）遺伝子を含むア
デノウイルスが投与されるときのみ見られる（各サイト
カインに対し３／４の動物）ことを示している。これ
は、腫瘍に対する宿主の応答は、腫瘍において多量のサ
イトカインが産出されるとき誘導されることを示唆して
いる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/66 ＡＤＵ (72)発明者デーバレリオオランダ王国、2314 エーゼットレイデン、ヘルブランディラーン 12

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】アデノウイルスをコードするＤＮＡの少
なくともＥ１領域が欠失されており、Ｅ３領域の少なく
とも機能的部分がベクター中に存在する、アデノウイル
ス由来組換えベクター。
【請求項２】アデノウイルスをコードするＤＮＡの少
なくともＥ１領域が欠失されており、Ｅ３領域の少なく
とも機能的部分がベクター中に存在する、遺伝子治療用
アデノウイルス由来組換えベクター。
【請求項３】宿主細胞中に導入されると発現されるよ
うな遺伝子または前記遺伝子のｃＤＮＡを含んでなる、
請求項１または２記載のベクター。
【請求項４】前記遺伝子がサイトカインをコードす
る、請求項３記載のベクター。
【請求項５】前記遺伝子が自殺遺伝子である、請求項
３記載のベクター。
【請求項６】前記遺伝子が、宿主に欠損しているかま
たは不充分量しか存在しないタンパク質をコードする、
請求項３記載のベクター。
【請求項７】前記遺伝子がガン抑制遺伝子である、請
求項３記載のベクター。
【請求項８】前記遺伝子が、アデノウイルス５型また
はアデノウイルス２型由来である、請求項１、２、３、
４、５、６または７記載のベクター。
【請求項９】請求項１、２、３、４、５、６、７また
は８記載のベクターの、遺伝子治療における用途。
【請求項１０】請求項１、２、３、４、５、６、７ま
たは８記載のベクターの、遺伝子病治療における用途。
【請求項１１】請求項１、２、３、４、５、６、７ま
たは８記載のベクターの、ガン治療における用途。
【請求項１２】固形ガンが治療される請求項１１記載
の用途。
【請求項１３】ベクターを、該ベクターが哺乳動物宿
主の標的細胞に与えられるように直接的または間接的に
該宿主に投与する、請求項１、２、３、４、５、６、７
または８記載のベクターを用いる遺伝子治療方法。
【請求項１４】前記標的細胞が宿主より取り出され、
ベクターと接触させられて、宿主に再び導入される、請
求項１３記載の方法。
【請求項１５】ベクターが宿主中の標的部位に直接導
入される、請求項１３記載の方法。
【請求項１６】請求項１、２、３、４、５、６、７ま
たは８のベクターおよび哺乳動物宿主への投与のための
適切な手段を含んでなる、請求項１５記載の方法に用い
るための薬学的製剤。