JPH0823986A

JPH0823986A - 炎症抑制物質の製造方法

Info

Publication number: JPH0823986A
Application number: JP6166729A
Authority: JP
Inventors: Koji Inagaki; 孝司稲垣; Akihiko Fujiwara; 昭彦藤原; Yoshiko Abe; 佳子阿部
Original assignee: Sekisui Chemical Co Ltd
Current assignee: Sekisui Chemical Co Ltd
Priority date: 1994-07-19
Filing date: 1994-07-19
Publication date: 1996-01-30
Anticipated expiration: 2019-12-15
Also published as: JP3602574B2

Abstract

(57)【要約】【目的】放線菌Ｓ．ノビリスを用いて、アレルギー性及
び非アレルギー性のいずれの炎症反応にも有効な炎症抑
制物質を、効率的に大量に精製する方法を提供する。【構成】放線菌Ｓ．ノビリスの菌体を溶剤により抽出処
理して得られる菌体抽出物を、ＯＤＳカラムクロマトグ
ラフィー及び溶剤からの再結晶化を用いて精製する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、アレルギー性及び非ア
レルギー性のいずれの炎症反応にも有効な炎症抑制物質
の製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】炎症反応はアレルギー性炎症と非アレル
ギー性炎症に大別される。アレルギーは、ある抗原との
２度目の接触の際に生じる免疫反応が、個々人によって
過度にあるいは不適切な形で現れる一種の病的症状であ
って、関与する抗体の種類からＩ型、II型、III 型及び
IV型の反応に分類されている。これら４つの型のうち、
III 型反応（免疫複合体反応：アルサス反応）及びIV型
反応（細胞性免疫反応：遅延型過敏症反応）に関与する
アレルギー性炎症反応は、慢性関節リウマチのような自
己免疫疾患、更には喘息、肝炎、腎炎、皮膚炎のような
種々の炎症性疾患の発症進展に重要な役割を演じてい
る。

【０００３】ところで、従来より放線菌培養濾液中には
種々の抗生物質が見つけられており、当該培養濾液は生
理活性物質の宝庫と言われている。しかしながら、アレ
ルギー性炎症を抑制する物質はこれまで放線菌培養濾液
から見つけられた例がなかった。また、従来の抗炎症剤
であるアスピリン（日経サイエンス,3:70,1991）やイン
ドメタシン（Ther.Res.,3:1057,1985 ）はアレルギー性
炎症に対して抑制作用がきわめて弱いという問題点があ
る。

【０００４】そこで、放線菌を用いてアレルギー性炎症
抑制作用を有する物質の探索を行った結果、放線菌スト
レプトマイセス・ノビリス（以下、「Ｓ．ノビリス」と
する）培養液の粗抽出物に、アレルギー性炎症反応に対
する顕著な抑制作用と安全性を確認し、抗炎症剤として
全く問題がない極めて有用な組成物を見出すことに成功
し（特開平５−２５０５３号公報）、同培養液から種々
のカラムクロマトグラフィーを用いてアレルギー性炎症
反応抑制物質を単離することを提案している。更に、同
培養液に硫酸アンモニウムを添加し、その時の沈殿物を
溶剤で抽出して得られる抽出物を、ＯＤＳカラムクロマ
トグラフィー及び溶剤からの再結晶化を用いて炎症抑制
物質を効率的に精製する方法についても提案している。

【０００５】しかしながら、従来の精製方法では、硫酸
アンモニウムによる沈殿物中の不純物量が非常に多いた
め、その抽出操作が煩雑となることが問題となった。そ
のため、炎症抑制物質を大量に確保するためには、複数
回に分けて精製を行わなければならず、非常に多くの時
間を必要とした。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記問題点
を解決するためになされたものであり、その目的は、効
率よく短時間で炎症抑制物質を大量に精製する方法を提
供することである。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、放線菌
Ｓ．ノビリスの菌体を溶剤により抽出処理して得られる
菌体抽出物を、ＯＤＳカラムクロマトグラフィー及び溶
剤からの再結晶化を用いて精製することにより、炎症抑
制物質が単品で得られることを見出し、この知見に基づ
き本発明を完成するに至った。

【０００８】本発明において、原料である放線菌Ｓ．ノ
ビリスは、公的保存機関から入手可能であり、例えば理
化学研究所の保存菌（ＪＭＣ４２７４）（これは米国に
おいてＡＴＣＣ１９２５２及びオランダにおいてＣＢＳ
１９８．６５としても保存）等の菌が使用できる。

【０００９】上記放線菌Ｓ．ノビリスの培養は、然るべ
き栄養物を含んだ培地を用いて行われる。液体培養の場
合、その培地の成分としては、例えばブドウ糖等の糖
類、ペプトンや麦芽エキス等のタンパク質類、ビタミン
類、核酸類、アミノ酸類、複合糖質などを一種以上含む
水溶液が好適に用いられる。代表的な培地としては、例
えば澱粉・アンモニウム系の液体培地（可溶性澱粉、Ｋ
₂ＨＰＯ₄、ＮＨ₄Ｃｌを含む）が挙げられる。液体培
地のｐＨは２〜９の範囲が好ましく、培養温度は１５〜
４２℃が好ましい。また、液体培養の培養時間は１〜１
４日が好ましい。

【００１０】このようにして得た培養液を濾過し、放線
菌Ｓ．ノビリスの菌体を得る。該菌体について溶剤によ
り抽出処理を行い、菌体抽出物を得る。なお、抽出処理
に際しては、菌体をそのまま溶剤と接触させてもよい
が、あらかじめ乳鉢等ですりつぶしたり、ホモジナイザ
ー、超音波発生機等で粉砕して用いるのが好ましい。

【００１１】上記抽出処理に用いる溶剤としては特に限
定されないが、有機溶剤が好ましく、例えば酢酸エチル
等のエステル類、メタノール、エタノール、プロパノー
ル等のアルコール類、エチルエーテル、ジオキサン等の
エーテル類、アセトン、メチルエチルケトン等のケトン
類、ジクロロメタン、クロロホルムなどが挙げられ、特
にジクロロメタン、酢酸エチル、アセトンが好ましい。
これらは単独あるいは２種以上を混合して用いることが
できる。

【００１２】上記抽出処理において、菌体と溶剤の比率
は特に限定されないが、抽出効率及び操作性の観点か
ら、菌体１ｇ（湿重量）あたり溶剤１０〜２０ｍｌが好
ましい。また、抽出時間は溶剤の種類や抽出温度等によ
って異なるが、１０分〜２４時間が好ましい。抽出中は
液を静置するか、または攪拌しながら放置する。抽出操
作は同一試料に対して複数回繰り返すのが好ましい。

【００１３】次に、上記菌体抽出物に対するカラムクロ
マトグラフィーについて述べる。カラムクロマトグラフ
ィーの充填剤としては、ＯＤＳ（オクタデシルジメチル
クロロシランのようなオクタデシルシラン類）を用い、
充填量は特に限定されないが、チャージする菌体抽出物
に対して重量比で１０〜５００倍量を充填するのが好ま
しい。

【００１４】菌体抽出物をカラムにチャージする際は、
まずＯＤＳに吸着させる。この時のＯＤＳの量は特に限
定されないが、吸着させる菌体抽出物に対して重量比で
０．５〜２０倍量が好ましい。その後、少量の溶剤に懸
濁しカラムにチャージする。カラムクロマトグラフィー
の溶出溶媒は特に限定されないが、極性が、メタノー
ル：アセトニトリル＝１：１混合溶剤を８５％含む水溶
液からメタノールの間にあるものが好ましい。

【００１５】次に、溶剤による再結晶化について述べ
る。再結晶化に用いる溶剤としては、本発明における炎
症抑制物質が溶ける溶剤であれば特に限定されないが、
例えばメタノール、エタノール等が好ましい。再結晶の
方法としては、例えば、熱を加えて少量の溶剤に当該物
質を含有するＯＤＳ溶出画分を溶かし、溶剤を徐々に冷
やして再結晶化させてもよいし、当該物質の溶解性の高
い溶剤に当該物質を含有するＯＤＳ溶出画分を溶かし、
そこに当該物質の溶解性の低い溶剤を徐々に加えて再結
晶化させてもよい。

【００１６】本発明により得られる炎症抑制物質を製剤
化するには、通常はこれを製剤用担体とともに製剤組成
物の形態とする。担体としては、剤型に応じた薬剤を調
整するのに通常使用されるものが用いられ、例えば充填
剤、崩壊剤、増量剤、結合剤、着色剤、矯味矯臭剤、ｐ
Ｈ調整剤、可溶化剤、懸濁化剤、緩衝剤、安定化剤、保
存剤、付質剤、表面活性化剤、滑沢剤、賦形剤等が挙げ
られる。また適当な溶剤を選定することにより、得られ
る炎症抑制物質をそのままの形態で外用液剤として使用
することもできる。

【００１７】本発明により得られる炎症抑制物質から製
剤化される炎症抑制剤の投与単位形態としては、上記外
用液剤のほか、例えば錠剤、丸剤、飲用液剤、散剤、懸
濁剤、乳剤、顆粒剤、エキス剤、細粒剤、シロップ剤、
浸剤、煎剤、点眼剤、トローチ剤、パップ剤、リニメン
ト剤、ローション剤、眼軟膏剤、硬膏剤、カプセル剤、
坐剤、注射剤（液剤、懸濁剤等）、貼付剤、軟膏剤等が
挙げられる。上記炎症抑制剤中に含有すべき炎症抑制物
質の量は、特に限定されず広範囲に適宜選択されるが、
炎症抑制剤中に０．０１〜５０重量％が好ましい。

【００１８】本発明における炎症抑制物質より得られる
炎症抑制剤は、その使用に際し各種形態に応じた方法で
投与される。例えば、上記のごとき外用液剤の場合に
は、これを皮膚ないしは粘膜等の所要部位に直接塗布
し、錠剤、丸剤、飲用液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤及び
カプセル剤の場合には経口投与され、注射剤の場合には
静脈内、筋肉内、皮内、皮下又は腹腔内投与され、坐剤
の場合には直腸内投与され、また貼付剤、軟膏剤の場合
には貼付または塗布される。

【００１９】炎症抑制剤の投与量は、使用目的、症状等
により適宜選択されるが、通常１日あたり本発明におけ
る炎症抑制物質として０．００１〜５０ｍｇ／ｋｇ程度
である。また、上記製剤組成物を３〜４回／日に分けて
投与することももちろん差し支えない。

【００２０】

【実施例】以下に本発明を実施例につき説明する。（実施例１）理化学研究所から購入した放線菌Ｓ．ノビ
リス（ＪＣＭ４２７４）を、酵母エキス０．２％添加澱
粉・アンモニウム培地２５０ｍｌ中で約４８時間振とう
培養（前々培養）し、続いて同培地１２Ｌに前々培養菌
液２４０ｍｌを接種し、約２４時間通気攪拌し培養（種
培養）した。さらに、澱粉・アンモニウム培地（蒸留水
１００ｍｌ中に可溶性澱粉１ｇ、リン酸水素二カリウム
０．０５ｇ、塩化アンモニウム０．０５ｇを含有）７０
０Ｌに種培養した全量を接種し、約３０℃で１〜１０日
間通気攪拌し培養した。この培養液を濾過し、湿重量で
約９００ｇの放線菌Ｓ．ノビリスの菌体を得た。

【００２１】上記菌体１００ｇ（湿重量）にジクロロメ
タン１Ｌを加えて３０分間超音波を照射した後、さらに
ジクロロメタン４Ｌを加えて室温で１時間攪拌した。濾
過後、抽出液をエバポレーターを用いて乾固させ、菌体
抽出物８ｇを得た。

【００２２】次に上記菌体抽出物８ｇを、ＯＤＳ（オク
タデシルジメチルクロロシラン）２５ｇに吸着させ、少
量の溶剤（アセトニトリル：メタノール：水＝７：７：
６）に懸濁したものを、ＯＤＳカラム（直径３２ｍｍ、
長さ７６０ｍｍ、充填ＯＤＳ担体量２７５ｇ、カラム内
溶剤アセトニトリル：メタノール：水＝７：７：６）に
チャージし、溶出した。溶出溶媒は、アセトニトリル：
メタノール：水＝７：７：６を１Ｌ、アセトニトリル：
メタノール：水＝８：８：４を１．２Ｌ、アセトニトリ
ル：メタノール：水＝９：９：２を２００ｍｌ、アセト
ニトリル：メタノール：水＝１９：１９：２を２０ｍｌ
×５０本、メタノールを５００ｍｌの順に流した。

【００２３】次に、上記アセトニトリル：メタノール：
水＝１９：１９：２の溶出溶媒による溶出画分のうち、
５〜１５本目の画分を合わせてエバポレータを用いて乾
固させることにより、１０６ｍｇの溶出物を得た。これ
を適当量のメタノールに溶解後、水を少量添加し、４℃
で１日放置し結晶化させた。この操作を数回繰り返し、
炎症抑制物質５０ｍｇを得た。

【００２４】（試験例１）III 型アレルギー反応に対す
る作用ｉ）ウサギ抗オボアルブミン（ovalbumin ）血清の調製江田らの方法（日薬理誌,66:237,1970）に準じて、以下
の手法でウサギ抗オボアルブミン血清を調製した。すな
わち、生理食塩水に溶解したオボアルブミン（Ｓｉｇｍ
ａ社製）の２ｍｇ／ｍｌ溶液と完全フロイントアジュバ
ント（Ｄｉｆｃｏ社製）との等量混合乳化液よりなる抗
原液を調製した。この抗原液の０．５ｍｌずつを体重約
３ｋｇのニュージーランド産ホワイト種の雄性家兎の左
右でん筋内に１週間毎に４回注射した。最終注射の７日
後に頸動脈から採血し、血清のみを分離取得し、ウサギ
抗オボアルブミン血清とした。この抗血清のラット４時
間異種受身皮膚アナフィラキシー（４時間 heterologo
usＰＣＡ）反応の力価は１：３２であった。

【００２５】ii）ラット４時間異種ＰＣＡ反応（III 型
アレルギー性皮膚反応）に対する作用実施例１で得られた炎症抑制物質を０．４ｍｇ／ｍｌに
なるように、５重量％アラビアゴム水溶液にジメチルス
ルホキサイドを５重量％添加してなる溶液に懸濁した。
なお、対照実験用として、インドメタシンを１．０ｍｇ
／ｍｌとなるように、上記ジメチルスルホキサイド含有
アラビアゴム水溶液に懸濁した。このようにして得た懸
濁液を供試液とした。また、コントロールとして、上記
炎症抑制物質を含まないジメチルスルホキサイド含有ア
ラビアゴム水溶液を供試液とした。被験動物としては体
重１２０〜２００ｇのウイスター雄性ラットを用いた。

【００２６】まず、上記供試液をラットに２ｍｌ／ｋｇ
（炎症抑制物質量として０．８ｍｇ／ｋｇ、インドメタ
シン量として２ｍｇ／ｋｇ）で腹腔内投与した。次い
で、その１８〜２２時間後に上記ウサギ抗オボアルブミ
ン血清を生理食塩水で４倍に希釈してなる注射液０．０
５ｍｌを背部皮内に注射し、ラットを上記抗血清で感作
した。さらにその４時間後、対応する抗原として２ｍｇ
／ｍｌのオボアルブミンを含む０．５重量％エバンスブ
ルー生理食塩水を２．５ｍｌ／ｋｇ静脈内注射して、４
時間異種ＰＣＡ反応を惹起した。

【００２７】こうして皮内反応を惹起した部位の漏出色
素を、Ｈａｒａｄａらの方法（J.Pharm.Pharmacol.,23:
218,1971）に従って抽出定量した。すなわち、抗原注射
の１時間後に動物を屠殺し、４時間異種ＰＣＡ反応部の
皮膚を細切し、これを０．３％（ｗ／ｖ）硫酸ナトリウ
ム水溶液３容とアセトン７容の混合液中に２４時間浸漬
放置し、漏出色素を抽出した。このようにして抽出した
色素を６２０ｎｍで比色定量し、漏出色素量を求め、こ
れをウサギ抗オボアルブミン血清を注射した部位（ｓｉ
ｔｅ）あたりの漏出色素量（μｇ）として表した。なお
試験は５匹のマウスを用いて行い、漏出色素量（ｓｉｔ
ｅ／μｇ）はその平均値で示した。結果を表１に示す。

【００２８】

【表１】

【００２９】結果から明らかなように、インドメタシン
を投与した群では、コントロールと比べて漏出色素量に
差は認められないが、実施例１で得られた炎症抑制物質
を含有する供試液を投与した群では、コントロールと比
べて、ラット４時間異種ＰＣＡ反応部の皮膚に漏出する
色素量が大幅に減少した。すなわち、本発明により得ら
れた炎症抑制物質はアレルギー性炎症抑制活性を有す
る。

【００３０】（試験例２）毒性試験以下の方法で実施例１で得られた炎症抑制物質の毒性を
調べた。まず、炎症抑制物質を、最終濃度が４０ｍｇ／
５ｍｌになるように、上記ジメチルスルホキサイド含有
アラビアゴム水溶液に懸濁し、供試液とした。被験動物
としては体重２５〜３０ｇのＩＣＲ雄性マウスを用い
た。上記供試液をマウスに５ｍｌ／ｋｇ（試験例１の有
効量の５０倍に相当）を腹腔内投与した。その結果、毒
性症状は特に認められず、また供試液投与２週間後の死
亡率は０％であった。生存した被験動物の剖検において
も、何ら異常は認められなかった。この結果からも明ら
かなように、実施例で得られた炎症抑制物質は有効量の
５０倍量で毒性を示さなかった。なお試験は５匹のマウ
スを用いて行った。

【００３１】（比較例１）従来法、すなわち培養液に硫
酸アンモニウムを添加し、その沈殿物からの抽出物を、
ＯＤＳカラムクロマトグラフィー及び再結晶化により炎
症抑制物質を精製する方法で炎症抑制物質を単離し、１
週間あたりに単離できる炎症抑制物質量を、本発明の方
法を用いた場合と比較した。結果を表２に示す。

【００３２】

【表２】

【００３３】上記の結果から、本発明によると、同一時
間あたりに従来法の４倍量の炎症抑制物質を単離するこ
とが可能となった。

【００３４】

【発明の効果】本発明の方法は上述のとおりであり、こ
れによると、活性を損なうことなく、効率的に短時間で
炎症抑制物質を大量に精製できる。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｒ 1:465）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】放線菌ストレプトマイセス・ノビリス（St
reptomyces nobilis）の菌体を溶剤により抽出処理して
得られる菌体抽出物を、ＯＤＳカラムクロマトグラフィ
ー及び溶剤からの再結晶化を用いて精製することを特徴
とする炎症抑制物質の製造方法。