JPH082796B2 - 高脂血症治療剤 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、ヒト尿由来ヒト単球−マクロファージコロ
ニー刺激因子（以下ヒトＭ−CSFとする。）を有効成分
とする高脂血症治療剤に関する。

［技術の背景及び従来の技術］ 高脂血症はコレステロール，中性脂肪，リン脂質等の
うち一つ又はそれ以上のものが正常値以上に増加する疾
患である。日本人の場合血液100ml当り総コレステロー
ル値が220mg以上、中性脂肪が130mg以上、又はリン脂質
が250mg以上に該当する場合を高脂血症としている。高
脂血症それ自体は重篤な疾患ではないが、放置する事に
よって動脈硬化を起こし狭心症，心筋梗塞の誘引とな
り、臨床上重大な問題となる。現在高脂血症及び動脈硬
化症の治療には数多くの薬剤があるが臨床的にはプロブ
コール製剤（渡辺彰他、動脈硬化,11巻,3号,597ページ,
1983年）及び蛋白分解酵素であるエラスターゼ（吉村正
蔵、動脈硬化,3巻,223ページ,1975年）が主に用いられ
ている。これらの薬剤の作用はコレステロールを血管壁
に付着しにくくしたり、血管壁に付いたコレステロール
を洗い流すものであるが、その効果には一定の限界があ
り、現在高脂血症及び動脈硬化症を根治治療する薬剤は
無い。

造血因子の一種であるコロニー刺激因子中に単球−マ
クロファージ系幹細胞に作用する因子（Ｍ−CSF）があ
り、その蛋白質及び遺伝子構造について明らかにされて
いる（特開昭64−22899号公報）。このヒトＭ−CSFは成
熟ヒト単球−マクロファージにも作用しその機能活性化
及び各種サイトカインの産生を促進すること（Motoyosh
i K.et al.,Exp.Hematol.,17:68−71（1989））、また
臨床的に顆粒球減少症（Motoyoshi K.,et al.,Exp.Hema
tol.14:1069−1075（1986））や骨髄移植（Masaoka T.,
et al.,Bone Marrow Transplantation.3:121−127（198
8））に対する有用性が明らかにされ、医薬としての期
待が大きい。このヒトＭ−CSFは既に臨床試験の上で、
その安全性が確認されている（Motoyoshi K.,et al.,Im
munobiology,172;205−212,（1986））。

しかし、ヒトＭ−CSFの高脂血症及び動脈硬化症治療
済への利用可能性については未検討のまま置かれてい
た。

［発明の目的及び要約］ 高脂血症は血液中のコレステロール，中性脂肪，又は
リン脂質が正常値より高い疾患であり、放置すると動脈
硬化を起こし心筋梗塞，狭心症等を誘発する事が明らか
となっている。したがって優れた高脂血症及び動脈硬化
治療剤により動脈硬化を防止することが心筋梗塞，狭心
症を予防する上で極めて重要である。本発明は高脂血症
患者及び高脂血症モデル動物に対してヒトＭ−CSFの高
脂血症及び動脈硬化治療剤としての検討をおこなった結
果、ヒトＭ−CSFは高脂血症及び動脈硬化症において最
も重要な血中コレステロール量及び中性脂肪量を顕著に
減少させる作用を有していることを見いだし本発明を完
成した。

本発明はヒトＭ−CSFを有効成分とする高脂血症治療
剤である。また本発明のヒトＭ−CSFはヒト尿由来のも
のである。

［本発明の具体的説明］ 本発明に関わるヒト尿由来のヒトＭ−CSFは、健常者
の尿より公知の方法（特開昭63−198700号公報、特開昭
63−250400号公報、特開昭64−22899号公報）によって
精製したものを凍結乾燥して調整した。例えば63−1987
00号公報記載の方法で次の等り調製した。すなわち、健
康人の尿1000LをpH8.5に調整後、沈澱物を濾過除去し、
分子量50,000ダルトンの限外濾過膜（アミコン社、H10
×50）で濃縮と脱塩を行なつた。次にpHを7.0に調整し
密閉容器中で60℃で10時間加熱殺菌した。殺菌後、遠心
分離（5000×g30分間）して沈澱物を除去した後、0.02M
リン酸緩衝液（pH7.2）で平衡化したDEAE−セルロース
と混合し、吸着させたDEAE−セルロースを0.05M食塩添
加0.02Mリン酸緩衝液（pH7.2）で洗浄した後、0.25M食
塩添加0.02Mリン酸緩衝液（pH7.2）で溶出させた。溶出
液を限外濾過膜（アミコン社H10P10）で濃縮して、Seph
acryl S−30（フアルマシア社、直径20cm×高さ80cm）
を用い、1M硫安添加緩衝液（pH7.2）でゲル濾過した。
ゲル濾過での分子量範囲70,000〜150,000ダルトン画分
を上記1M硫安添加緩衝液で平衡化したPhenyl−Sepharos
e4Bカラム（フアルマシア社製直径10×長さ20cm）に吸
着させ、次いで0.5M硫安添加緩衝液（pH7.2）で溶出さ
せた。溶出液を限外濾過膜（アミコン社製H1P10）で濃
縮して、TSK−G3000SW（東ソー製、直径2.5×60cm）で
高速液体クロマトグラフィーにかけ、相対溶出量（Ve/V
o）1.2〜1.5の画分を得た。この画分を再度濃縮し、Hi
−Pore214TP（バイダツク社、経2.2×長さ25cm）の逆相
カラムで0.1％トリフルオロ酢酸を含む、アセトニトリ
ル０−100％（pH2.0）の直線濃度勾配による高速液体ク
ロマトグラフイーにかけヒトＭ−CSF画分を集め、凍結
乾燥しヒト尿由来のヒトＭ−CSF4mgを得た。得られたヒ
ト尿由来のヒトＭ−CSFの理化学的性質は次の通りであ
る。

ａ） 分子量 同一のサブユニツトから成るホモ２量体であつて、ド
デシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動
で測定した分子量が70,000〜90,000ダルトンであり、還
元剤で解離させて生物活性を消失させたサブユニツトに
ついてドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル
電気泳動で測定した分子量は35,000〜45,000ダルトンで
ある。

ｂ） サブユニツトのアミノ酸配列 ホモ２量体を構成するサブユニツト蛋白質は、次に示
す214乃至238個のアミノ酸配列を有し、122番目及び140
番目のアスパラギンはそれぞれアスパラギン（Asn）−
ｘ−スレオニン（Thr）／セリン（Ser）で表される典型
的なＮ−グリコシド結合部位を有する。ここでｘは任意
のアミノ酸を示す。

Glu−Glu−Val−Ser−Glu−Tyr−Cys−Ser−His−Met−
Ile−Gly−Ser−Gly−His−Leu−Gln−Ser−Leu−Gln−
Arg−Leu−Ile−Asp−Ser−Gln−Met−Glu−Thr−Ser−
Cys−Gln−Ile−Thr−Phe−Glu−Phe−Val−Asp−Gln−
Glu−Gln−Leu−Lys−Asp−Pro−Val−Cys−Tyr−Leu−
Lys−Lys−Ala−Phe−Leu−Leu−Val−Gln−Asp−Ile−
Met−Glu−Asp−Thr−Met−Arg−Phe−Arg−Asp−Asn−
Thr−Pro−Asn−Ala−Ile−Ala−Ile−Val−Gln−Leu−
Gln−Glu−Leu−Ser−Leu−Arg−Leu−Lys−Ser−Cys−
Phe−Thr−Lys−Asp−Tyr−Glu−Glu−His−Asp−Lys−
Ala−Cys−Val−Arg−Thr−Phe−Tyr−Glu−Thr−Pro−
Leu−Gln−Leu−Leu−Glu−Lys−Val−Lys−Asn−Val−
Phe−Asn−Glu−Thr−Lys−Asn−Leu−Leu−Asp−Lys−
Asp−Trp−Asn−Ile−Phe−Ser−Lys−Asn−Cys−Asn−
Asn−Ser−Phe−Ala−Glu−Cys−Ser−Ser−Gln−Asp−
Val−Val−Thr−Lys−Pro−Asp−Cys−Asn−Cys−Leu−
Tyr−Pro−Lys−Ala−Ile−Pro−Ser−Ser−Asp−Pro−
Ala−Ser−Val−Ser−Pro−His−Gln−Pro−Leu−Ala−
Pro−Ser−Met−Ala−Pro−Val−Ala−Gly−Leu−Thr−
Trp−Glu−Asp−Ser−Glu−Gly−Thr−Glu−Gly−Ser−
Ser−Leu−Leu−Pro−Gly−Glu−Gln−Pro−Leu−His−
Thr−Val−Asp−Pro−Gly−Ser−Ala−Lys−Gln−Arg−
Pro−Pro−Arg−Ser−Thr−Cys−Gln−Ser−Phe−Glu−
Pro−Pro−Glu−Thr−Pro−Val−Val−Lys− ｃ） 等電点 ポリアクリルアミドゲル等電点電気泳動法及びシユク
ロース密度勾配等電点泳動法で測定した等電点（pI）は
3.1〜3.7である。

ｄ） 円二色性スペクトル 円二色性分散計による遠紫外線CDスペクトルは波長20
8nm及び222nmにそれぞれ極小ピークがありα−ヘリツク
ス構造を含んでいる。

ｅ） 熱安定性 60±0.5℃で60分間加熱しても生物活性は失なわれな
い。

ｆ） 赤外線吸収スペクトル 波数1680cm^-1、1200cm^-1及び1130cm^-1に強度吸収、波
数1540cm^-1、1430cm^-1および1070cm^-1に中度吸収を示す
赤外線吸収スペクトラムを有する。

この様な物理化学的性質を示すヒトＭ−CSFは通常、
静脈内，動脈内，筋肉内，皮下，腹腔内などの非経口投
与により投与することができる。投与用の製剤として
は、注射剤，注入剤などが挙げられ、これら製剤はそれ
自体公知の方法によって調製することができる。例え
ば、ヒトＭ−CSFを適当な緩衝液に加えて、無菌過
し、ガラスバイアル中に無菌的に充填して密封し、必要
に応じて凍結乾燥して製剤を調製することができる。

ヒトＭ−CSFはガラス，プラスチック，無菌過膜等
に吸着する性質を有しているが、この吸着は界面活性
剤，ヒト血清アルブミン及びゼラチンなどの高分子物質
の任意の単一又は複数を用いることにより防ぐことがで
き、同時にこれら高分子物質と共に製剤化することによ
りその安定性も著しく向上する。それぞれの使用濃度は
製剤当り界面活性剤の場合10μg/ml以上、ヒト血清アル
ブミン及びゼラチンの場合は、1mg/ml以上が望ましい。

ヒトＭ−CSFの投与量は動脈硬化を併発するか否かに
かかわらず、患者の年齢症状によって変動し得るが、通
常0.4μｇ〜16μg/kg・体重／日、好ましくは1.6μｇ〜
８μg/kg・体重／日である。

以上の方法で得られたヒトＭ−CSFを使用した本発明
の実施例を次に示す。

実施例１ 高脂血症患者に対するヒトＭ−CSFのコレステロール低
下作用 （１） 本発明の高脂血症治療剤（以下、本剤と言う）
の調製法 pH7.2の20mMリン酸緩衝液に、前記のとおり調製され
たヒトＭ−CSF及び表１に示す各濃度の安定剤を添加
し、ヒトＭ−CSFの濃度として100μg/mlのものに調製し
た。ニトロセルロース系無菌過膜にて無菌過し、ガ
ラスバイアル中に無菌的に1ml充填した。凍結乾燥後密
封し本剤を調製した。

（２） 本剤の安定性 本剤の安定性はヒトＭ−CSF活性をマウス骨髄細胞を
用いた軟寒天法にて測定した。その結果は表１に示す如
く界面活性剤であるツウィーン80では10μg/ml以上、ヒ
ト血清アルブミン及びゼラチンでは1mg/ml以上の濃度で
調製した本剤の生物活性は、試験開始時（製造直後）の
70％以上維持されており安定とされた。

（３） 本剤の高脂血症患者に対するコレステロール低
下作用 高脂血症患者２名にアルブミン5mg/ml添加して調製し
た本剤を1.6μg/kg・体重／日にて14日間点滴静注し
た。血清中のコレステロール量は本剤投与時から７日間
間隔にて測定し、本剤のコレステロール低下作用につい
て検討した。

図１の示す如く本剤を投与することにより、１名の高
脂血症患者の血清コレステロール量は本剤投与前の395m
g/mlから170mg/mlに顕著に減少し正常値となった。また
図２に示す如く、他の１名の患者の場合においても血清
コレステロール量が280mg/mlから195mg/mlに著しく減少
した。両図において、横軸は週で表した期間を、縦軸は
血清総コレステロール量（mg/ml）を示す。この結果か
ら本薬剤が高脂血症更には、高脂血症に起因する動脈硬
化治療剤として有用であることが明らかとなった。

実施例２ 高脂血症モデル動物の血清コレステロール低下に及ぼす
作用 実施例１において、安定剤としてツウィーン80を20μ
g/ml濃度とした以外は緩衝液にて実施例１と同様に本剤
を用い高脂血症モデル動物のコレステロール及び中性脂
肪量低下に及ぼす本剤の効果を検討した。

一群５匹からなるSprague−Dawley系ラットを高脂肪
食にて１カ月予備飼育した後本剤を16μg/kg・体重（CS
F投与量13.3μg/kg・体重）にて連続７日間静脈内投与
し血清中のコレステロール量及び中性脂肪量の変化を対
照群と比較検討した。対照群には本剤の調製時に用いた
緩衝液を投与した。

表２に示す如く本剤の投与により血清コレステロール
量及び中性脂肪量が顕著に減少することが認められ本剤
が高脂血症及びそれに起因する動脈硬化治療剤として有
用であることが明らかとなった。

［発明の効果］ （１） 異常に高い血清コレステロール量及び中性脂肪
量を顕著に減少させ、かつ副作用のない薬剤を提供し得
る。

（２） 高脂血症を治療し、動脈硬化を改善・予防し、
かつ副作用のない薬剤を提供し得る。

【図面の簡単な説明】

図１は、ある高脂血症患者の血清コレステロール量と投
与期間の関係を示したグラフであり、図２は他の高脂血
症患者の血清コレステロール量と投与期間の関係を示し
たグラフである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ヒト尿由来ヒト単球−マクロファージコロ
   ニー刺激因子を有効成分とする高中性脂肪血症治療剤。