JPH04507252A - 抗凝血タンパク質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 抗凝血タンパク質 発明の分野 本発明はＥＰＩ活性を有する新規タンパク質、該タンパク質の製造方法および該 タンパク質を含む治療製剤に関する。

発明の背景 血液凝固は多くの活性化および不活化凝血因子が関係する複雑な過程である。抗 凝血タンパク質は凝血過程の調節に重要であるとして知られており（ビイ、レー ムル（Ｂ、Ｌｊｉｍｍｌｅ）およびジェイ、グリイフィン（Ｊ、Ｇｒ　ｉ　ｆ　 ｆ　１ｎ）Ｃ１ｉｎｉｃｓ　ｉｎ　Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ’１４（１９８５） 、２８１−３４２）、したがって抗凝血剤は様々な疾患たとえば血栓症、心筋梗 塞、播種性血管向凝固等の治療に重要である。

したがって、ヘパリンはアンチトロンビン■およびヘパリンコファクターＨの活 性全増加するために臨床的に使用される。アンチトロンビン■はＸａ因子および トロンビンの阻害に対し使用される。ヒルジンはトロンビンの阻害のために使用 されそしてプロティンＣばＶ因子と■因子の阻害のために使用される。

抗凝血タンパク質はまたガンの治療にも使用される。すなわち、アンチスタチン （ａｎｔｉｓｔａｔｉｎ）は抗転移性を有することがわかっている（ジェイ、エ イチ、ハン（Ｊ。

Ｈ，Ｈａｎ）ら、Ｇｅｎｅ　７５（１９８９）、４７−５７）。

またヘパリンおよびワルファリンも抗転移性を有することがわかっている（シイ 、ジェイ、ガシック（Ｇ、Ｊ、　Ｇａ　ｓ　ｔＣ）ら、Ｉｎｔ、Ｒｅｖ、Ｅｘｐ 、Ｐａｔｈｏｌ、、２９（１９８５）、１７３−２０９）。

凝血は組織因子（ＴＦ）を循環血液へ暴露することにより外因性経路を介して開 始される（ワイ、ネマージン（Ｙ、　Ｎｅｍｅｒｓｏｎ）、Ｂｌｏｏｄ　７１（ １９８８）、１　Ｂ）。

組織因子は因子■／■ａに対するタンパク質コファクターであり組織因子の結合 はその基質因子■および因子Ｘに対すＬ■ａ囚子（ＦＶＩａ）の酵素活性を強化 する。胎盤抗凝血タンパク質はまた組織因子活性を阻害することができ、これは たぶんＴ　Ｆ　／　Ｆ　ＶＩ　ａ−リン脂質相互反応を妨害することによる（ニ ス、コンドウ（Ｓ、Ｋｏｎｄｏ）ら、Ｔｈｒｏｍｂ、Ｒｅｓ、４Ｂ　（１９８７ ）、４４９．−４５９）。

最近、新規抗凝血タンパク質である外因性経路阻害剤（ＥＰＩ）が単離された（ ブロイ（Ｂｒｏｚｅ）ら、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、８４　（１９８７）、１８８６−１８９０）。

モル規模でＥＰＩはＴ　Ｆ　／　Ｆ　ＶＩＥ　ａ誘因凝血の強力な阻害剤である ことがわかった（アール、ニー、グラムツインスキー（Ｒ，Ａ、Ｇｒａｍｚ　１ ｎｓｋｉ）ら、Ｂｌｏｏｄ　７３（１９８９）、９８３−９８９）、ＥＰＩはＸ ａ因子（ＦＸａ）と結合し阻害し、そしてＥＰＩとＦＸａとの複合体がＴ　Ｆ　 ／　Ｆ　ＶＩ［ａを阻害する（ラバポート（Ｒａｐａｐｏｒｔ）。

Ｂｌｏｏｄ　７３　（１９８９）、３５９−３６５）、　多くの腫瘍細胞がＴＦ 活性を表わす（ティ、サカイ（Ｔ、５ａｋａｉ）ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、 ２６４　（１９８９）、９９８０−９９８８）ので抗凝血／抗転移剤として非常 に興味があり、そしてこれはＥＰＩがアンチスタチンのような抗Ｘａ活性を示す ためである。

ＥＰＩはブロイら（前出）によりＨｅｐＧ２肝ガン細胞から回収され（ブロイ、 ヨーロッパ特許第３００９８８号）、そしてタンパク質についての遺伝子をクロ ーンした（ブロイ、ヨーロッパ特許第３１８４５１号）。ＥＰＩの二番目の構造 についての図式を第１図に示し、ＢＰｒのアミノ酸配列を第２図に示し、図中Ｎ 末端アミノ酸Ａｓｐを１番とする。タンパク質は２７６個のアミノ酸残基からな り、そして３つのクニッツ型（Ｋｕｎｉｔｚ　ｔｙｐｅ）の阻害ドメインに加え て、Ａｓｎ１１７、Ａｓｎ１６７およびＡｓｎ２２９に３つの強力なグリコジル 化部位を有する。分子量はこれらの部位のいくつかがグリコジル化されているこ とを示す。さらに、二番目のクニッッドメインがＦＸａと結合し一方一番目のク ニッツドメインがＦ　ＶＩ　ａ　／　Ｔ　Ｆと結合していることがわかっている （ギラルド（Ｇｉｒａｒｄ）ら、Ｎａｔｕｒｅ　３３８（１９８９）。

５１８−５２０）、ＥＰＩはまたＨｅＬａ細胞からも単離され（ＰＣＴ／ＤＫ９ ０１０００１６）、ＨｅＬａ　ＥＰＩはヘパリンと結合することが示された。

ヘパリン結合は注射用物質の薬学動態について重要なファクターである。血小板 因子４（エム、ブロスドミ（Ｍ、Ｐｒｏｓｄｏｍｉ）ら、Ｔｈｒｏｍｂ、Ｒｅｓ 、３９（１９８５）。

５４１−５４７）および１つのクニッッドメインを有するアプロチニン（エイチ 、フリッツ（Ｈ，Ｆｒ１ｔｚ）ら、Ｄｒｕｇ　Ｒｅｓ、３３．４７９　９４）は たぶんヘパリン結合特性のために短かい半減期を有する。したがって、抗凝血剤 のヘパリン結合能力の低下は有利なように思われる。さらに、医療用途にＥＰＩ より小さい分子を使用することは有利であろう。

本発明によれば、驚（べきことにある種のＥＰＩ［似物質が分子の一部を欠失し ているとはいえＥＰＩ活性ならびに抗Ｘａ活性を保持することが見出された。さ らに、これらの類似物質は十分な長さのＥＰＩよりヘパリンに対しより低い親和 性を示し、これにより天然分子より治療薬として一層有用になる。ＥＰＩ類似物 質はさらに天然ＥＰＩと比較してより長い半減期を有し、これにより医療用途に 対する有効成分の量が一層低下するであろう。

発明の概要 最初の見地において、本発明は天然ＥＰＩのアミノ酸残基１つ以上を欠失した新 規ＥＰＩ類似物質に関する。

第二の見地において、本発明は生理学的条件（ｐＨ、イオン濃度）下でＥＰＩ活 性を有するがしかしヘパリン結合能力がないかまたは低いＥＰＩ類似物質の新規 一群に関する。

本明細書において用語“低ヘパリン結合能力”とは、生理学的ｐＨおよびイオン 濃度で天然ＥＰＩの結合能力の約５０％、さらに好ましくは約２５％、最も好ま しくは約１０％未満の結合能力を意味するものである。

新規ＥＰＩ似物質の好ましい一群は、天然ＥＰＩのヘパリン結合ドメインが欠失 しているかまたは前記ドメインにおけるアミノ酸残基１つ以上を欠失しその結果 ヘパリン結合能力を失なうかまたはほとんど低下させることにより非官能性ヘパ リン結合ドメインを有することを特徴とするものである。

ヘパリン結合ドメインにおけるアミノ酸残基１つ以上を別のアミノ酸残基で置換 することによっても同様な効果が得られる。

本発明の詳細な記載 ＥＰＩ活性を保持するために本発明による類似物質は、少な（とも一番目と二番 目のクニッツドメインを含むＮ末端配列を有するべきである。すなわち、本発明 によるＥＰ　［似物質は少なくとも天然ＥＰｒのアミノ酸番号２５〜アミノ酸番 号１４８のアミノ酸配列を含むべきである（第１図および第２図参照）。

本発明者らによれば、アミノ酸残基番号１６２〜アミノ酸残基番号２７５の配列 をＥＰＩ分子から欠失させるとヘパリン結合能力が失なわれることが示されてい る。それゆえヘパリン結合ドメインはＥＰＩ分子のこの部分に位置するものと結 論される。ヘパリン結合ドメインは陽性に帯電したアミノ酸残基に豊富であるＥ ＰＩ分子のＣ末端付近のＡｒｇ２４６〜Ｌｙｓ２６５の領域から少なくともなる と考えられる。

本発明による好ましいＥＰＩ類似物質は天然アミノ酸においてアミノ酸残基１４ ８〜Ｃ末端Ｍｅｔ２７６を欠失させたものである。

さらに特に、Ａｒｇ２４６〜Ｌｙｓ２７５の配列における１つ以上のアミノ酸残 基を欠失させる。

本発明によるＥＰＩＩ！似物質の例は次のようである：（Ａｓｐｌ−Ｔｈｒ２５ ５）　ＥＰＩ （Ａｓｐｌ−１１ｅ２５３）　ＥＰＩ （Ａｓｐｌ−Ｌｙｓ２４９）　−ＥＰｒ（Ａｓｐｌ−Ｓｅｔ２４Ｂ）　ｆ！ＰＩ （Ａｓｐｌ−Ｌｙｓ２４０）　−ＥＰＩ（Ａｓｐｌ−Ｇ１ｕ２３４）　−ＥＰＩ （Ａｓｐｌ−Ｔｒｐ１８Ｂ）　−ＥＰＩ（Ａｓｐｌ−Ａｓｎ１６４）　−ＥＰＩ （Ａｓｐｌ−Ｔｈｒ１６１）　ＥＰＩ （Ａｓｐｌ−Ａｓｎ１６４）　−ＥＰＩ（Ａｓｐｌ−Ｇ１ｕ１４８）　−ＥＰＩ Ｓｅｔ　−（Ａｓｐｌ−Ｔｈｒ２５５）　−ｆ！ＰＩＳｅｔ　−（Ａｓｐｌ−１ １ｅ２５３）　−ＥＰｒＳｅｔ　−（Ａｓｐｌ−Ｌｙｓ２４９＞　−ＥＰＩＳｅ ｒ　−（Ａｓｐｌ−Ｓｅｔ２４Ｂ）　−ＥＰＩＳｅｔ　−（Ａｓｐｌ−Ｌｙｓ２ ４０）　−ＥＰＩＳｅｔ　（Ａｓｐｌ　Ｇ１ｕ２３４）　−ＥＰＩ（Ａｓｐｌ− Ｔｈｒ２５５）　−（Ｇ１ｕ２６２−Ｍｅｔ２７６）　−ＥＰＩ（Ａｓｐｌ−１ １ｅ２５３）　−（Ｇｌｕ２６２−Ｍｅｔ２７６）　−ＥＰＩ（Ａｓｐｌ　−５ ｅｒ２４８）　−（Ｇ１ｕ２６２−Ｍｅｔ２７６）　−ＥＰＩ（Ａｓｐｌ−Ｇ１ ｕ２４５）　（Ｇ１ｕ２６２　Ｍｅむ２７６）　−ＥＰＩＳｅｔ−（Ａｓｐｌ− Ｔｈｒ２５５）　（１１ｅ２６６−Ｍｅｔ２７６）　−ＥＰＩＳｅｔ　−（Ａｓ ｐｌ−１１ｅ２５３）　−（１１ｅ２６６−Ｍｅｔ２７６）　−ＥＰＩＳｅｒ　 −（Ａｓｐｌ　−５ｅｒ２４８）　−（１１ｅ２６６−Ｍｅｔ２７６）　−ＥＰ ＩＳｅｒ　−（Ａｓｐｌ−Ｇｌｎ２４５）　（Ｉｌｅ２６６　Ｍｅｔ２７６）　 −ＥＰＩＳｅｔ　−（Ａｓｐｌ−Ｔｈｒ２５５）　−（Ｖａ１２６４−Ｍｅｔ２ ７６）　−ＥＰＩＳｅｔ　−（Ａｓｐｌ−１１ｅ２５３）　−（Ｖａ１２６４− Ｍｅｔ２７６）　−ＨＰＩＳｅｔ−（Ａｓｐｌ−Ｓｅｒ２４８）　（Ｖａ１２６ ４−Ｍｅｔ２７６）　−ＥＰＩＳｅｔ−（Ａｓｐｌ−Ｇ１ｕ２４５）　（Ｖａ１ ２６４−Ｍｅｔ２７６）　−ＥＰＩＳｅｒ　−（Ａｓｐｌ−Ｔｈｒ２５５）　− （Ｇ１ｕ２６２−Ｍｅｔ２７６）　−ＥＰＩＳｅｔ　−（Ａｓｐｌ−１１ｅ２５ ３）　−（Ｇ１ｕ２６２−Ｍｅｔ２７６）　−ＥＰＩＳｅｔ−（Ａｓｐｌ−５ｅ ｒ２４８）　（Ｇ１ｕ２６２−Ｍｅｔ２７６）　−ＥＰＩＳｅｔ　−（Ａｓｐｌ −Ｇ１ｕ２４５）　−（Ｇ１ｕ２６２−Ｍｅｔ２７６）　−ＥＰＩＥＰＩ分子に おいて記載した欠失に加えて、天然ＥＰＩの特定アミノ酸残基を別の天然産生ア ミノ酸残基で置換してもよい。ＥＰＩ類似物質はまたＮ末端残基としてＳｅｒ残 基を有利に含む。シグナル配列を使用する場合開裂のための認識部位として成熟 タンパク質におけるＮ末端Ｓｅｔを要求することが必要である。すなわち、ＥＰ Ｉ分子におけるＮ末端をＳｅｒで置き換えるかまたは追加のＳｅｔを本来のＮ末 端残基に隣接して挿入してもよい、またＡｓｎ１６７およびＡｓ　ｎ２３８にお ける潜在的グリコジル化部位を別のアミノ酸残基で置換してグリコジル化を避け るようにしてもよい。

グリコジル化部位がＥＰＩ活性にとって必ずしも必要なものではないということ は今までわかっていなかった。ＥＰＩタンパク質の大きなフラグメントはＥＰＩ 活性にとって、すなわちＴ　Ｆ　／　Ｆ　ＶＩ　ａのＦＸａ依存性阻害にとって 必ずしも必要なものではないということも知られていなかった。ＥＰＩにおける １個のアミノ酸を別のアミノ酸残基（Ａｒｇ１９９−＞Ｌｅｕ１９９）（ジラル ドら、Ｎａｔｕｒｅ　３３８（１９８９）、５１８−５２０）により活性に影響 を与えることな（置換することができるということはこれまで知られていた。し かしながら、このような変化はタンパク質の構造を著しくは変化させない。これ と対照的に本発明による欠失は、ヘパリンに対する変化した親和性により説明さ れるように、天然分子とは別の特性を有する新規分子を生じる。

本発明ＥＰＩ−類似物質はよく知られた組換えＤＮＡ技術により作られる。

天然ＥＰＩに対する遺伝子はクローン化され配列化される（ウォンら、Ｊ、Ｂｉ ｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６３　（１９８８）。

６００１−６００４）、所望ＥＰＩ−類似物質をコードするＤＮＡ配列はよく知 られた方法にしたがって同種組換えのための所望のアミノ酸配列をコードする合 成オリゴヌクレオチドを用いた特定部位の突然変異誘発によりＥＰＩ　ｃＤＮＡ を変えることにより構築される。

本発明によるＥＰ　１類似物質をコードするＤＮＡ配列はまた確立された標準的 方法、たとえばニス、エル、ビューケージ（Ｓ、Ｌ、Ｂ　ｅ　ａ　ｕ　ｃ　ａ　 ｇ　ｅ　）およびエム、エイチ、カルーサーズ（Ｍ、Ｈ，Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ） 、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　２２．１９８１．ｐ、１８５９− １８６９により記載されたホスホアミダイト法、またはマツセス（Ｍａｔｔｈｅ ｓ）ら、ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａ１３．１９８４．ｐ、８０１−８０５により記載 された方法により合成されうる。ホスホアミダイト法によれば、オリゴヌクレオ チドはたとえば自動ＤＮＡ合成機で合成され、精製、アニール、連結されそして 適当なベクター中でクローン化される。

別の見地において、本発明は、本発明ＥＰＩ類似物質をコードするＤＮＡ配列か らなる組換え体発現ベクターに関する。

発現ベクターは組換えＤＮＡ技術を受けるのに都合の良いベクターであればいず れでもよく、そしてベクターの選択はしばしばこれが導入されるべき宿主細胞に よるであろう。すなわち、ベクターは自律的に複製するベクター、すなわち染色 体外存在物として存在するベクターであり、その複製は染色体複製物すなわちプ ラスミドによるものである。これに代わり、ベクターは、宿主細胞へ導入された とき宿主細胞ゲノムへ組込まれこれが組込まれている染色体と一緒に複製するも のでもよい。

ベクターにおいて、本発明のＥＰＩ類似物質をコードするＤＮＡ配列は適当なプ ロモーター配列と操作可能に接続されるべきである。プロモーターは選択する宿 主細胞における転写活性を示しそして宿主細胞と相同かまたは非相同のいずれか のタンパク質をコードする遺伝子から由来するいずれかのＤＮＡ配列である。哺 乳動物細胞における本発明ＥＰＩ類似物質をコードするＤＮＡの転写を指向する ための適当なプロモーターの例は、Ｓ■４０プロモーター（スブラマニ（Ｓｕｂ ｒａｍａｎｉ）ら、Ｍｏ！、Ｃｅ１ｌ、Ｂｉｏｌ、１．１９８１、ｐ、８５４− ８６４Ｌ　ＭＴ−１（メタロチオネイン遺伝子）プロモーター（パルミター（Ｐ ａ　１ｍｉ　ｔ　ｅ　ｒ）ら、５ｃｉｅｎｃｅ　２２２．１９８３．ｐ、８０９ −８１４）、アデノウィルス２主要後期プロモーターまたはＣＭＶ（サイトメガ ロウィルスＩＥ１）プロモーター（ヘニンハウゼン　Ｈｅｎｎｉｎｇｈａｕｓｅ ｎ）ら、ＥＭＢＯＪ、５（１９８６）、１３６７−７１）である。酵母宿主細胞 中で使用される適当なプロモーターには、酵母解糖遺伝子（ヒッツェマン（Ｈｉ ｔｚｅｍａｎ）ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ。

２５５．１９８０．ｐ、１２０７３−１２０８０；アルバー（Ａｌｂｅｒ）およ びカワサキ（Ｋａｗａｓａｋｉ）、Ｊ。

Ｍｏ１．Ａｐｐｌ、Ｇｅｎ、１．１９８２．Ｐ、４１９−４３４）またはアルコ ールデヒドロゲナーゼ遺伝子（ヤング（Ｙｏｕｎｇ）ら、Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎ ｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ　ｆｏｒ　Ｃｈｅｍ ｉｃａｌｓ（ホーレンダ−Ｈｏ　１１ａｅｎｄｅｒら著）、ブレナムプレス　ニ ューヨーク、１９８２）、またはＰＴｌｌ（米国特許第４．５９９．３１１号） またはＡＤＨ２−４Ｃ（ラッセルら、Ｎａｔｕｒｅ　３０４，１９８３．Ｐ、６ ５２−６５４）プロモーターである。糸状菌宿主細胞に使用される適当なプロモ ーターは、たとえばＡＤＨ３プロモーター（マツフナイト（ＭｃＫｎｉｇｈｔ） ら、Ｔｈｅ　ＥＭＢＯＪ。

４．１９８５．ｐ、２０９３−２０９９）またはｔｉｐＡプロモーターである。

分泌を確実にするために、ＥＰＩＩＩ似物質をコードするＤＮＡ配列の５′に適 当なシグナル配列を挿入する。適当なシグナル配列はｔ−ＰＡシグナル配列であ る（フリズナー（Ｆｒｉｅｚｎｅｒ）ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６１　（ １９８６）、６９７２−８５）。

本発明のＥＰＩ類似物質をコードするＤＮＡ配列はまた適当なターミネータ−た とえばヒト成長ホルモンターミネータ−（バルミタ−（Ｐａ　１ｍｉ　ｔ　ｅ　 ｒ）ら、前出）または（真菌宿主に対し）ＴＰＩＩ（アルバーおよびカワサキ、 前出）またはＡＤＨ３（マツフナイトら、前出）プロモーターと操作可能に接続 すべきである。ベクターはたとえばポリアデニル化シグナル（たとえばＳＶ４０ またはアデノウィルス５Ｅｌｂ？ｉｌ域）、転写エンハンサ−配列（たとえばＳ Ｖ４０エンハンサ−）および翻訳エンハンサ−配列（たとえばアデノウィルスＶ Ａ　ＲＮＡをコードするもの）のようなものをさらに含んでもよい。

本発明の組換え体発現ベクターはさらに当該宿主細胞においてベクターを複製し うるようにするＤＮＡ配列を含んでいてよい。このような配列（宿主細胞が哺乳 動物細胞である場合）の例は複製のＳＶ４０オリジンである。ベクターはまた選 択可能なマーカーたとえばその生成物が宿主細胞における欠点を補う遺伝子、た とえばジヒドロフオレートレダクターゼ（ＤＨＦＲ）をコードする遺伝子または たとえばネオマイシン、ヒグロマイシンまたはメソトレキサートのような薬品に 対する耐性を与えるものを含んでもよい。

本発明のＥＰＩｌｉ似物質をコードするＤＮＡ配列、プロモーターおよびターミ ネータ−をそれぞれ連結するために使用される手法およびこれらを複製に必要な 情報を含む適当なベクターへ挿入する手段は当業者によく知られている（たとえ ば、サムプルツク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、前出）・別の見地において、本発明 は上述の組換体発現ベクターを含む細胞に関する。宿主細胞はＥＰＩ類似物質を 産生しうるいずれかの細胞であり、好ましくは白血球細胞特に哺乳動物細胞であ る。適当な哺乳動物細胞列の例は、ＣＯ３（ＡＴＣＣＣＲＬ　１６５０および１ ６５１）、ＢＨＫ　（ＡＴＣＣＣＲＬ　１６３２．ＡＴＣＣＣＣＬＩＯ）または ＣＨＯ（ＡＴＣＣＣＣＬ　６１）細胞列である。哺乳動物細胞のトランスフェク ションおよび細胞中で起こされるＤＮＡ配列の発現はたとえばカウフマン（Ｋａ ｕｆｍａｎ）およびシャープ（Ｓｈａｒｐ）、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、１５９． １９８２、ｐ、６０１−６２１　Ｈサウザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）およびベルブ （Ｂｅｒｇ）、Ｊ、Ｍｏ　Ｉ、Ａｐｐ　１．Ｇｅｎｅｔ、１．１９８２．Ｐ、３ ２７−３４１　；Ｏイタ−（Ｌ。

ｙｔｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、ＵＳＡ　７９，１ ９８２．ｐ、４２２−４２６；ウィグラー（Ｗｉｇｌｅｒ）　ら、Ｃｅ１ｌ　１ ４，１９７８．Ｐ、７２５；コルサ０（Ｃｏｒｓａｒｏ）およびバーソン（Ｐｅ ａｒｓｏｎ）、Ｓｏｍａｔｉｃ　Ｃｅ１ｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ７．１９８１．ｐ 、６０３；グラハム（Ｇｒａｈａｍ）およびファンデルニブ（ｖａｎ　ｄｅｒ　 Ｅｂ）、Ｖｉｒｏ　ｔ。

ｇｙ　５２．１９７３．ｐ、４５６；およびノイマン（Ｎｅｕｍａｎ）ら、ＥＭ ＢＯＪ、１，１９８２．ｐ、８４１−８４５に記載されている。

これに代わって、真菌細胞（酵母細胞を含む）は本発明の宿主細胞として使用さ れうる。適当な酵母細胞の例としては、サツカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙ ｃｅｓ）属またはシゾサツカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ Ｓ）属の細胞、特に枯草菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓ　１ａ ｅ）の菌株である。他の真菌細胞の例は、糸状菌たとえばアスペルギルス（Ａｓ ｐｅｒｇｉ　ｌ　１ｕｓ）属またはノイロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属、 特にアスペルギルス　オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）また はアスペルギルス　ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）の菌株であ る。タンパク質の発現に対するアスペルギルス属の使用は、たとえばヨーロッパ 特許第２７２．２７７号に記載されている。

さらに別の見地において、本発明は本発明によるＥＰＩｉ似物質売物質する方法 に関し、該方法はＥＰ１類似物質の発現を導びく条件下で適当な普通培地上で上 述のように細胞を培養し、培地からポリペプチドを回収することからなる方法で ある。細胞の培養に使用する培地は、哺乳動物細胞の増殖に適する通常の培地た とえば適当な補足物を含む血清含有または血清不含有培地である。適当な培地は 商業的供給者から入手可能であるかまたは公表された作り方にしたがって調製さ れうる（たとえば、アメリカンタイプカルチュアコレクションのカタログ）。

ＥＰ　Ｉｌｉ［催物質は好ましくは増殖培地へ分泌されそして常法によりたとえ ば宿主細胞を培地から遠心分離または濾過により分離し、上澄液のタンパク質豊 富成分を沈でんさせるかもしくは塩たとえば硫酸アンモニウムを用いて濾過し、 続いて様々なりロフトグラフィ法たとえばイオン交換クロマトグラフィ、アフィ ニティクロマトグラフィ等により精製することにより培地から回収される。

新規ＥＰＩ類似物質は抗凝血疾患またはガンを患らっている患者の治療に使用さ れる。

したがって本発明はまた、適当な量のＥＰＩ類似物質と適当な助剤および添加剤 とを一緒に含む抗凝血疾患またはガンを患らう患者の治療用薬剤製剤に関する。

薬剤製剤は適当な安定剤および保存剤と一緒の緩衝化水溶液である。溶液は加熱 処理されるかまたは注射ペン用のアンプルまたはカープル（ｃａｒｐｏｕｌ）に 含まれてもよい。

これに代わって、安定した溶液をフリーズドライしてアンプルに含ませるか、ま たは１つのチャンバーにフリーズドライ物質そして他のチャンバーに溶媒を入れ た２つのチャンバーの注射システムとしてもよい。

図面の簡単な説明 本発明をさらに図面を参照しながら記載するが、図中第１図は、ＥＰＩのアミノ 酸配列および二次元構造を示し、第２図は、天然ＥＰＩのアミノ酸配列を示し、 第３図は、ｔ−ＰＡシグナル、ヒトサイトメガロウィルスＩＥ１遺伝子プロモー ターおよびヒト成長ホルモン遺伝子ポリアデニル化シグナルを含むプラスミドｐ ＪＲ７７を示し、第４図は、ＥＰＩ遺伝子を含むｐＣＭＶＥＰ　Ｉ　ｈＧＨを示 し、第５図は、５ｅｔ−（Ｔｈｒ８８−Ｔｈｒ１６１）−ＥＰＩをコードするＤ ＮＡ配列を含むプラスミドｐＥＰ１ｂｌを示し、 第６図は、５ｅｒ−（Ｇｌｕ１５−Ｔｈｒ１６１）−ＥＰＩをコードするＤＮＡ 配列を含むプラスミドＰＥＰ　１　ａ　ｂを示し、 第７図は、ｔ−ＰＡシグナル配列により先行された５ｅｔ−（Ｔｈｒ８８−Ｔｈ ｒ１６１）−ＥＰＩに対するＤＮＡ配列を示し、 第８図は、ｔ−ＦＡシグナル配列により先行された５ｅｔ（ＣＩｕ１５−Ｔｈｒ １６１）−ＥＰＩに対するＤＮＡ配列第９図は、（Ａｓ　ｐ　１−Ｔｈｒ　１６ １）　−ＥＰ　ＩをコードするＤＮＡ配列を含むプラスミドＰＥＰＩａｂ２を示 し、第１０図は、ＥＰＩシグナルにより先行された（Ａｓｐｌ−’Ｉ’ｈｒ１６ １）−ＥＰＩに対するＤＮＡ配列を示ス。

本発明をさらに以下の実施例に記載するが、これにより何ら請求の範囲に記載し た本発明の範囲または精神を制限するものではない。

実験部 ＥＰＩ活性の分析：サンドセット（Ｓａｎｄｓｅｔ）ら（Ｔｈｒｏｍｂ、Ｒｅｓ 、４７　（１９８９）、３８９−４００）の方法の後で変更されたクロモゲンミ クロプレート分析においてＥＰＩを測定した。熱処理した血漿プールを標準物と して使用した。この標準物をＥＰＩ活性ＩＵ／ｌ１ｌｌを含むようにセットした 。標準物とサンプルを緩衝液Ａ（０，０５Ｍトリス１０．ＬＭ　ＮａＣｌ１０． ＩＭ　Ｎａ−クエン酸１０゜０２％　Ｎ　ａ　Ｎｓ　／ｐＨ８，０）であって２ μｇ／ｓｌポリブレンおよび０．２％ウシ血清アルブミンを含むもので希釈した 。

ＦＶｌ［ａ　／Ｔ　Ｆ／　Ｆ　Ｘ／　Ｃａ　Ｃ１ｚ組合せ剤試薬は、緩衝液Ａに おいて調製され、そして１．　６ｎｇ／ｍｌ　ＦＶＩａ　（ノボ−ノルディスク ａ／ｓ）、６０倍に希釈したヒト組織ファクター（ハヨルト（Ｈｊｏｒｔ）、５ ｃａｎｄ、Ｊ、Ｃ１ｉｎ、Ｌａｂ、Ｉｎｖｅｓｔ、９　（１９５７）、５０ｎｇ ／ｍｌ　ＦＸ（シグマ）および１８ｍＭ　ＣａＣ１ｇを含有する。分析は３７℃ にてミクロプレートストリップ中で行なった。サンプルおよび標準物の５０μｌ をピペットでストリップへ入れ組合せ剤試薬１００＃１を各凹所へ添加した。イ ンキュベーション１０分後、ＦＸ（３，２μｇ／ｍ１）２５μｌを各凹所へ加え 、さらに１０分間後ＦＸａについてのクロモゲン基質（Ｓ２２２２）２５μ夏を 基質添加後１０分してから添加した。

１．０Ｍクエン酸ｐＨ３，０５０μＩを加えることにより反応を停止した。４０ ５ｎｍでミクロプレートを読んだ。

抗Ｘａ活性に対する分析：ヘパリンセファロース上で精製されたＨ　ｅ　Ｌ　ａ 　Ｅ　Ｐ　Ｉ　（ＰＣＴ／囲９０１０００１６）を標準物として使用した。この 標準物にはＥＰｒ分析において測定されたＥＰＩ単位の量に相当するＸａ阻害単 位の量が割当てられた。サンプルおよび標準物を５０ｓＭ）リス１０．２％ウシ 血清アルブミンｐＨ７，３中で希釈した。希釈したサンプルおよび標準物１００ μｌを１００μｌ　ＦＸａ（スタブ（Ｓｔａｇｏ）、１４ｎｇ／ｍｌ）とともに ３７“Ｃで３０分間インキュベートした。

Ｓ２２２２　（２ｍｇ／ｓ＋１）　２５　、！／　Ｉを３７°Ｃでさらに２時間 後添加した。分析をＥＰＩ分析のように停止しそして読み取った。

アプライドバイオシステムＤＮＡ合成機を用いてホスホロアミダイト法により合 成オリゴヌクレオチドを合成した。

プライマーを標識化するためのＭ１３配列化プライマーおよびγ−（”Ｐ）　− ＡＴＰ　（５０００Ｃｉ／ミリモル、１０ｍＣ１／ｍｌ）がアマ−ジャム（Ａｍ ｅ　ｒ　ｓ　ｈａｍ）から得られた。

制限エンドヌクレアーゼおよびＴ４　ＤＮＡリガーゼをニューイングランドラボ ズから得られた。修飾したＴ７　ＤＮＡ−ポリマーゼ（セクエナーゼ（Ｓｅｑｕ ｅｎａｓｅ））がユナイテッド　ステープ　バイオケミカルズ（ＵｎｉｔｅｄＳ ｔａｔｅｓ　Ｂｉｏｃｈｅ’ｍ１ｃａｌｓ）から得られた。

成りＮＡフラグメントに対するクローニングベクターとして得た。

ヒトサイトメガロウィルスＩＥＩ遺伝子プロモーターおよびヒト成長ホルモン遺 伝子ポリアデニル化シグナルを含むｐＪＲ７７を意味する哺乳動物発現ベクター （第３図）はＣＯ３−７細胞における様々なＥＰＩ関連タンパク質の発現のため に使用された。

ＸＬ−１ブルー（ストラタジーン）大腸菌に１２の誘導体を、プラスミド形質転 換のための細菌性受容器としておよびプラスミドＤＮＡの増殖および調製用の宿 主として使用された。

ミドリザル腎細胞系ＣＯ３−７（ＡＴＣＣ＃　ＣＲＬ１６５１）は、ダルベツコ 変性イーグル培地（ＤＭＥＭ）（ジブコ０４１−１９６５）＋５０ｕｇ／ａ＋ｌ ゲンタマイシン＋１１０μｇＺＩＩＩＩピルベート＋１０％胎児仔牛血清（Ｆｅ ２）またはＤＭＥＭ＋５０μｇ／−１ゲンタマイシン＋１１０μｇ／ｌｌＩピル ベート＋１％　ＩＴＳ”　（インシュリン、トランスフェリン、血清アルブミン ）において増殖した。

制限エンドヌクレアーゼおよび他の酵素は、製造上の忠告にしたがって使用され た。標準組換え体ＤＮＡ技術を記載のように実施した（マニイアティスら、Ｍｏ ｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ、コールドスプリング　ハーバ−ラボラトリイ、 １９８２）。

ＤＮＡ配列を、鋳型として二本鎖プラスミドＤＮＡおよび５ｉｐ−標識化プライ マーおよびセクエナーゼを用いてチェインターミネーター法（サンガー（Ｓａｎ ｇｅｒ）ら、Ｐｒ。

ｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、７４　（１９７７）、５４６３−６７）によ りＤＮＡ配列を測定した。

プラスミドＤＮＡをリン酸カルシウム共沈化によりＣＯ３−７細胞へ導入した（ グラハムおよびファンデルニブ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　５２　（１９７３）、４５ ６−４５７）。

７Ｘ１０’細胞を５ｍｌ　ＤＭＥＭｆＦＣ３中２０ｃｓｅ”皿に播種した。次の 日に各皿へ０．５沈でん物中プラスミドＤＮＡ　２０μｇおよび１０−Ｍニリン 酸クロロキニン５０μｌを加えた。細胞を沈でん物とともに一晩インキユベーシ ョンした０次の日新しい培地ＤＭＥＭ＋ＩＴＳ”を加えた。インキュベーション してから２日後培地を採取しそしてＥＰＩ−活性および抗Ｘａ活性に対し分析し た。

例Ｉ ＥＰＩおよびＥＰＩ類似物質をコードするＤＮＡ−フラグメントの調製およびＣ Ｏ３−７細胞における一時的発現ＥＰＩ　ｃＤＮＡ配列はウォン（Ｗｕｎ）らに より記載されている（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６３　（１９８８）。

６００１〜６００４）。、公知配列に基づいて、ＥＰＩおよびＥＰＩ類似物質を コードする合成りＮＡ配列を、適当な位置に制限エンドヌクレアーゼ認識部位を サイレント突然変異導入することにより構築した。

ｔＰＡシグナル配列を用いたＥＰＩフラグメントをコードする発現カセット（第 ７図および第８図）および全ＥＰＩタンパク質をコードする発現カセットをアニ ールした相補的合成オリゴヌクレオチドのクローニングベクターｐＢＳ＋へ逐次 挿入することによりアッセンブリーした。ＤＮＡフラグメントのアッセンブリー に続いて記載したようにＤＮＡ配列化により配列を変えた。

最後に発現カセットを発現ベクターｐＪＲ７７へ移すと次の発現プラスミドが得 られた： ｔＰＡシグナルをコードするｐＥＰＩｂｌ−ＥＰＩ類似物質５ｅｔ−（Ｔｈｒ８ Ｂ−Ｔｈｒ１６１）−ＥＰＩｔＰＡシグナルをコードするｐＥＰＩａｂ−ＥＰＩ 類像物質Ｓｅｔ　（Ｇｌｕ１５−Ｔｈｒ１６１）−ＥＰＩ全ＥＰＩタンパク質を コードするｐｃＭＶＥＰＩｈＧＨＣＯ３−７細胞を表１に示すようにトランスフ ェクションした。ＤＭＥＭ＋　ＩＴＳ＋とともにインキュベーション２日後に培 地を採取した。表１にＥＰＩ活性および抗−Ｘａ活性についての分析結果を示す 。

ｐＢｓ＋　０．１９　０．１９ ｐｃＭＶＥＰＩｈＧＨ８，３７，６ ｐＥＰＩｂｌ　０１２８　０．１５ ｐＥＰＩａｂ　４．５　５．６ 表１における結果は、二番目のクニッツドメインだけを含むＥＰＩ−フラグメン ト５ｅｒ−（Ｔｈｒ８８−Ｔｈｒ１６１）−ＥＰＩが何らの活性も有さす、−万 一番目と二番目のクニッッドメインを含むＥＰＩ−フラグメント５ｅｒ−（ＧＩ ｕ１５−Ｔｂｒ１６１）−ＥＰＩはＥＰＩ活性を保持していることを示す。

例２ ＥＰＩプラスミドを用いたＣＯ３Ｉ−ランスフエフシランを例１に記載のように 行ない、培地を４８時間後に採取した。

それぞれヘパリンセファロース３００μＩを有する５本のカラムをパックした。

カラムを２０ｗＭ）リス７１０％グリセロール、ｐＨ７，５（緩衝液Ｂ）で平衡 化した。培養液１’、３ａ＋１を各カラムへ施こした。次いでカラムを緩衝液８ １．５ｍｌで洗浄し、各カラムを、ＮａＣ１の量を増やしながら緩衝液８１．５ ｍｌを用いて溶出した。比較のためにＨｅＬａおよびＨｅｐＧ２細胞からのＥＰ Ｉをヘパリンセファロース上で分別する別の実験からのデータを与える。この実 験では別のＮａＣ１濃度が溶出のために使用された。表２によれば５ｅｒ−（Ｇ １ｕ１５−Ｔｈｒ１６１）−ＥＰＩは生理学的ｐＨおよびイオン濃度にてヘパリ ンと縮合しないことがわかる。

２、ＥＰＩおよびＥＰＩ　ンバク　のヘパ１ン　ムＮＭ：測定なし、　ＮＤ：Ｌ ない 例３ （Ａｓｐｌ−Ｔｈｒ１６１）−ＥＰＩの調製発現プラスミドの構築、形質転換お よびＣＯ５−７細胞における発現を、例１に記載した材料および方法を用いて行 なった。

ｔ−ＰＡシグナルおよびＳｅｒ　−（Ｇ１ｕ１５−Ｔｈｒ１６１）−ＥＰ　Ｉを コードする発現プラスミドｐＥＰＩａｂのＳａ　Ｉ　Ｉ−ＢａｍＨＩ間の配列（ 第６図）を、真正なＥＰＩシグナルおよび（Ａｓｐｌ−Ｔｈｒ１６１）−ＥＰＩ をコードする合成りＮＡ−配列で置き換えた。

得られたプラスミドｐＥＰＩａｂ２を第９図に示し、そしてｐＥＰＩａｂ２の発 現カセットを第１０図に示す。

ｐＥＰＩａｂ２でトランスフェクションしたＣＯ３細胞からの培地を、例２に記 載のようにヘパリン−セファロースへ施こした。ＥＰ　Ｉ　３１．　２　Ｕ／ｍ ｌを含む培養液３．８１をヘパリンカラム０．５ｍｌへ施こした。フロースルー は施こされたＥＰＩ活性の７７％を有しＢ洗浄液は１６％を含有した。

それぞれ０．２５．０．７５および１．５Ｍ　ＮａＣ１での溶出液中にＢＰＩは 検出されなかった。

（Ａｓ　ｐ−Ｔｈ　ｒ　１６　Ｌ）　−ＥＰ　Ｉは１つの強力なＮ−結合グリコ シル化部位（Ａｓｎｌ１７）を有し活性に対するこのグリコジル化の重要性が観 察された。

（Ａｓｐｌ−Ｔｈｒ１６１）−ＥＰｒばＦＸａ−セフ７Ｃ２−スのアフィニティ クロマトグラフィによりＣＯ３培地から精製した。５ＤＳ−ＰＡＧＥにおいて精 製されたタンパク質は２７ｋＤａ付近のグリコジル化バンドとして２２ｋＤａ付 近の非グリコジル化バンドとして表われた。グリコジル化および非グリコジル化 形は非還元５Ｏ３−ＰＡＧＥにおいて分離されそしてゲルから抽出された。両方 の形ともＥＰＩ分析において活性でありそして５ＤＳ−ゲルにおける汚染強度か ら判断するように同じ特異的活性を示した。Ａｓｎ１１７におけるグリコジル化 はしたがアてＥＰＩ活性について明らかに必須というわけではなく活性（Ａｓｐ ｌ−Ｔｈｒ１６１）−ＥＰＩは有効な発現システムにおいて得られ、ここでは哺 乳動物のＮ一連結グリコシル化がたとえば原核細胞中で、または酵母における未 分泌タンパク質として得られない。

Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｉｌｅ　Ｍ＠ｔ　Ｌｙｓｉ　Ａｒｇ 　Ｐｈｅ　Ｐｈｅ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ工ｌｅ　Ｐｈａ　Ｔｙｒｋｒｑ　Ｐｈａ　Ｇ ｌｕ　ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｃｙｓ　ＬＹＢ　Ｌｙｓ　Ｍａｔ　Ｃ ｙｓ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　ＡｓｎＴｙｒ　Ｐｈａ　Ｔｙｒ　Ａｓｎ　Ａｓ ｎ　Ｇｉｎ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｇｉｎ　ＣＹ！１　Ｇ１１ｌ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　 Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　Ｇ撃■ Ｇｌｙ　Ｃ”／８　Ｌａｕ　ＧＩＹ　Ａｋｉｎ　Ｍｅｔ　Ａ１１ｎ　Ａ卸Ｐｈａ 　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　ｃｔｕ　ｃｙｓ　Ｌｙ■ １３０　１３５　Ｌ４０ Ａｓｎ　Ｉｌｅ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　 Ｐｈｅ　Ｇｉｎ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ａｓｈ　Ｔｙｒ　ＧｌｙＬｙｓ　Ｇｌｙ　Ｐ ｈｓ工１ｅ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ工ｌａ　Ｓａｒ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｌａｕ 工１１１　ＬＹＢ　Ｔｈｒ　ＬｙｓＡｒｇ　Ｌｙａ　Ａｒｇ　Ｌｙｇ　Ｌｙｓ　 Ｇｉｎ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｌｙｅ工ｌ＠Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｉｌ 、ａ　ＰｈａＶａｌ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｍｅｔ Ｆｉｇ、　２ Ｆｉｇ、　３ ３■η ３αカ Ｓａｌ！ ｏ００ Ｆｉｇ、　１０　ｃｏｎｔ。

補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成４年２月ｔｒ７日

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. １．生理学的条件下で低いヘパリン結合能力を有するかまたはヘパリンと結合し ないＥＰＩ類似物質。
2. ２．ヘパリン結合ドメインが欠失しているかまたは該ドメインにおける１つ以上 のアミノ酸残基を欠失することによりもしくは該ドメインにおける１つ以上のア ミノ酸残基を別の天然産生アミノ酸残基で置換することにより非官能性になって いる請求の範囲第１項記載のＥＰＩ類似物質。
3. ３．少なくとも天然ＥＰＩの第１および第２番目のクニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）ド メインを含む請求の範囲第１項または第２項に記載のＥＰＩ類似物質。
4. ４．少なくとも天然ＥＰＩのＰｈｅ２５〜Ｇｌｕ１４８のアミノ酸配列を含む請 求の範囲第３項に記載のＥＰＩ類似物質。
5. ５．天然ＥＰＩのＡｓｐ１４９〜Ｃ末端Ｍｅｔ２７６の配列において１つ以上の アミノ酸残基が欠失している請求の範囲第１項〜第４項のいずれか１に記載のＥ ＰＩ類似物質。
6. ６．天然ＥＰＩのＡｒｇ２４６〜Ｌｙｓ２６５の配列において１つ以上のアミノ 酸残基が欠失している請求の範囲第５項に記載のＥＰＩ類似物質。
7. ７．天然ＥＰＩのＡｓｐ１〜Ａｒｇ２４９のアミノ酸配列からなる請求の範囲第 １項記載のＥＰＩ類似物質。
8. ８．天然ＥＰＩのＡｓｐ１〜ＧＩｕ２３５のアミノ酸配列からなる請求の範囲第 １項記載のＥＰＩ類似物質。
9. ９．天然ＥＰＩのＡｓｐ１〜Ｔｈｒ１６１のアミノ酸配列からなる請求の範囲第 １項記載のＥＰＩ類似物質。
10. １０．天然ＥＰＩのＧｌｕ１５〜Ａｒｇ２４９のアミノ酸配列からなる請求の範 囲第１項記載のＥＰＩ類似物質。
11. １１．天然ＥＰＩのＧＩｕ１５〜Ｇｌｎ２３５のアミノ酸配列からなる請求の範 囲第１項記載のＥＰＩ類似物質。
12. １２．天然ＥＰＩのＧｌｕ１５〜Ｔｈｒ１６１のアミノ酸配列からなる請求の範 囲第１項記載のＥＰＩ類似物質。
13. １３．さらにＮ末端アミノ酸残基としてＳｅｒを有する請求の範囲第１項〜第１ ２項のいずれか１に記載のＥＰＩ類似物質。
14. １４．請求の範囲第１項〜第１３項のいずれか１に記載のＥＰＩ類似物質をコー ドするＤＮＡ配列。
15. １５．請求の範囲第１４項記載のＤＮＡ配列を含む発現ベクター。
16. １６．請求の範囲第１５項記載のベクターからなる形質転換もしくはトランスフ ェクションした微生物または細胞系。
17. １７．請求の範囲第１６項記載の微生物または細胞系を適当な培養基中で培養し その後ＥＰＩ類似物質を単離する請求の範囲第１項〜第１６項のいずれか１に記 載のＥＰＩ類似物質の調製方法。
18. １８．請求の範囲第１項〜第１３項のいずれか１に記載のＥＰＩ類似物質および 適当なアジュバントおよび添加剤とを含む抗凝血剤またはガンを有する患者を処 置するための治療方法。