JPS61500249A - 異種重合体タンパク質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ６、前記第１発現ベクターが前記ホルモンの第１のサブユニットをコードしてい る請求の範囲第５項記載の細胞。

７、　さらに、第２の自律性複製発現ベクターが前記ホルモンの第２０サズユニ ツト全コードしている請求の範囲第５項記載の細胞。

８、前記ホルモンの第２のサブユニットが前記第２の−ξクターによシコードさ れている請求の範囲第７項記載の細胞。

９、前記ホルモンの両刃のサブユニットが前記第１発現ベクターによシコードさ れている請求の範囲第７項記載の細胞。

１０、　前記ＩＥ　１ベクターがマウスミドでおる請求の範囲第５項記載の細胞 。

１１、前記細胞が哺乳類細胞である請求の範囲第５項記載の細胞。

１２、前記異種２量体ホルモンのアルファおよびイータサブユニットが前記第１ 発現ベクターによりコードされている請求の“範囲第５項記載の細胞。

１３前記異種２量体ホルモンの前記アルファおよびベータする請求の範囲第１２ 項記載の細胞。

１４、前記異種２量体ホルモンのアルファサブユニットの転写が５ｖ４Ｑ初期プ ロモーターの制御下に行われ、および前記異種２童体ホルモンのベータサブユニ ットの転写がマウスメタロチオネインプロモーターの制御下に行われる請求の範 囲第１２項記載の細胞。

１５、前記第１ベクターが少くとも６９％ウシ乳頭腫ウィルスゲノムの形質転換 領域から成る請求の範囲第１４項記載の細胞。

１６、前記異種２量体ホルモンのアルファサブユニットが前記第１発現ベクター にニジコードされ、および前記異種２量体ホルモンのイータサブユニットが第２ の自律性複製発現ベクターによシコードされている請求の範占第５項記載の細胞 。

１７、前記異種２量体ホルモンのアルファおよびベータサブユニットの転写が５ Ｖ４Ｑ後期プロモーターの制御下にある請求の範囲第１６項記載の細胞。

１８、前記細胞がサル細胞である請求の範囲第１０項記載の細胞。

１９、前記異種２量体のアルファおよびベータサブユニットの転写がマウスメタ ロチオネインプロモーターの制御下にある請求の範囲第１６項記載の細胞。

２０、前記第１および前記第２のベクターが各々ウシ乳頭腫ウィルスゲノムの少 くとも６９チ形質転換領域からなる請求の範囲第１９項記載の細胞。

２１、前記細胞がマウス細胞である請求の範囲第１１項記載の細胞。

２２、　ｈＣＧ、　ＬＨオ！びＦＳＨから成る評より選択されるヒト受製発現イ クター。

２３　前記発現ベクターがマウスミドがら成る請求の範囲第２４、前記発現ベク ターが複製ウィルスから成る請求の範囲第２２項記載の発現ベクター。

２５、フル７７ベータ５ＶＶＰ１（ＡＴＣＣＶＲ２０７７）　Ｔａ１ｌの範囲第 ２４項記載のウィルス。

２６、　フル７７ｓＶｆｆｆＰｘ（ＡＴＣＣＶＲ２０７５）　テ６ル隋求の範囲 第２４項記載のウィルス。

２７、　ヘ−タ５ＶｖＰＩ　（ＡＴＣＣＶＲ２０７５）　テ６ル請求り範囲！２ ４項記載のウィルス。

２８、Ｃ１２７細胞中０ｐＲＦ３７５　（ＡＴＣＣＣＲＬ８４０１）テある請求 の範囲第２３項記載の発現ベクター。

２９．０１２７細胞中のｐＲＦ’３９８　（ＡＴＣＣＣＲＬ８４０１）であ特表 昭６１−５００２４９　（２） ３０．０１２７細Ｅｊｌ中ＣＤ　ｐＲＦ３９８．７　ルア　７　ｔ２　（ＡＴＣ ＣＣＲＬ８４００）である請求の範囲第２３項記載の発現ベクター。

３１、　Ｅ、ｃｏｘｉ　中＋７）ｐｃＬ２８ＸｈｏＬＨＢＰＶ　（ＡＴＣＣ３９ ４７５）　”？’ある請求の範囲第２３項記載の発現（フタ−。

３２、請求の範囲第５項記載の細胞により産生される生物学的に活性なホルモン ３３、　ｈＣＧ、　ＬＨおよびＦ’ＳＨから成る群よシ選択される生物学的に活 性なヒト受精ホルモンの少くとも一部をコードする第１の自律性複製発現ベクタ ーを含む宿主細胞を培養することからなる前記ホルモンの製造方法。

３４、前記ホルモンの第１のサブユニットが前記第１発現（フタ−によりコード されており、前記ホルモンの第２のサブユニットが前記宿主細胞に含まれる第２ の自律性発現（フタ−にょシコードされている請求の範囲第３３項記載の方法。

３５、前記ホルモンの両方のサブユニットが前記第１の発現ベクターによシコー ドされている請求の範囲第３３項記載の方法。

浄書（内容に変更なし） 明細書 異種重合体タンパク質 〔発明の背景技術〕 本発明は異種重合体タンパク質を製造する組換えＤＮＡ技術の使用に関する。

組換えＤＮＡ　技術によシ、細胞、酵母および培養哨乳類細胞のごとき宿生細胞 において種々のポリペプチド鎖が発現されてきた。フイデス・ジエー・シ（Ｆｉ ｄｄｅｓ、Ｊ、Ｃ０）およびグツドマン・エッチ；　エム（Ｇｏｏｄｍａｎ、Ｈ ８Ｍ、）　（１９７９）ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）２８１巻、ｐｇ、３５１− ３５６およびフイデス・ジエー・シー・（Ｆｉａａｅｓ、Ｊ、ｃ、）およびグツ ドマン・エッチ・エム（Ｇｏｏｄｍａｎ　。

ＨｌＭ）（１９８０）ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）　２　ｇ　６巻、　１）ｇ、 ｓ　８４−６８７には各々ヒト絨毛性綜刺激ホルモン（ｈＣＧ）　のアルファお よびベータサブユニットのクローニングについて記載されている。

カナメ（Ｋａｎａｍｅ）　、米国特許第４，３８３，０３６号はヒトリンパ芽球 細胞を実験動物に移殖し、動物から採取して土とり１旦で培養し、蓄積したｈＣ Ｇを培養液から採取するｈＣＧ製造法について記載している。

〔発明の開示〕

一般的に１本発明は多数のサブユニットから成る生物学的に活性な異種重合体タ ンパク質ｔ−ｉつの特徴件し、各々のサブユニットをコードする異種ＤＮＡ含有 自律性複製（すなわち１．宿主細胞の染色体内に同化しない）発現ベクターを持 つ細胞によシ合成される。

良好な実施態様においては、タンパク質は真核細胞によシ合成され、タンパク質 は翻訳後に修飾される（最も良好であるのはグリコジル化によシ）；タンパク質 はホルモンのごとき分泌タンパク質でちシ、最も良好であるのはｈＣＧ　、黄体 形成ホル汚ン（ＬＨ）または卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）　のごとき受精ホルモ ン；または甲状腺ホルモン刺激ホルモン（ＴＳＨ）である。

また、本発明は第４発現ベクターを含有し、ベクターにより少くとも部分的にコ ードされている生物学的に活性のある異種重合体タンパク質を産生できる細胞を 特徴とする。艮好な実施態様においては、第２の自律性複製発現ベクターがタン パク質の第２の部分をコート９しているか、または少くともタンパク質の２つの サブユニットは単一の発現ベクターによシコードされておシ；タンパク質はｈＣ Ｇまたはヒト黄体形成ホルモン（ＬＨ）でちシ；ベクターは複製するウィルスま たはマウスミドであシ；細胞はサルまたはマウス細胞であシ；異ったｈＣＧまた はＬＨサブユニットの転写が５ｖ４Ｑ後期プロモーターの制御下であり；タンパ ク質のアルファサブユニットの転写が５ｖ４０初期プロモーターの制御下で、ベ ータサブユニットの転写がマウスメタロチオネインプロモーターの制御下であシ 、または両方のサブユニットの転写がマウスメタロチオネインプロモーター制御 下でアシ；および発現ベクターはマウスメタロチオネインプロモーターを含み、 また少くともウシ乳頭腫ウィルス（ＢＰＶ）　ゲノムの形質転換領域の６９％を 含む。

また５本発明は２つの異った異種タンパク質をコードする２は２つの異なったプ ロモーター（最も良好であるのはメタロチオネインプロモーターおよびＢＰ■プ ロモーター）の制御下におる；異ったプロモーターの使用は都合のよい事に有害 な組換えを最小にする。

本明細書で使用した２サブユニツト７はタンパク質の１部分を意味しその部分は 相同または類似しているにせよ天然にはｍＲＮＡが異ったものによりコードされ ている。それ故、例えば工ｇＧ免疫グロブリンのＨａおよびＬ鎖は互いサメユニ ットと考えられる。−万、インシュリンは２つの他から成り立っているが、天然 には両方とも単一のｍＲＮＡによシコードされておシ、翻訳後にのみ２つの鎖へ の切断が天然に起こるのでそれらはサブユニットと考えられない。

術語０発現ベクター０は宿主細胞において発現可能々制御配列の制御下にある異 種構造（ベクターに対して）のＤＮＡ　’ｉ含むクローニングベクターを意味す る。そのようなベクターには複製可能なウィルス、プラスミドおよびファージが 挙げられる。

本発明は形質転換細胞の単一培養によシ生物学的に活性な異種重合体タンパク質 の産生を可能にする。同−細胞中での異種重合体タンパク質の両方のサブユニッ トの産生によシ、別々の培養細胞からのサブユニットヲ組合せ、活性異種重合体 分子に組立てる必要性がなくなる。本来はまた、単一の培養細胞でタンパク質を 産生じ、その培養系において、活性または安定性のだめの翻訳後の條飾（例えば グリコジル化およびタンパク質分解過程）が進行する。

自律性複製発現ベクターの使用は宿主染色体中の制御配列による所望のコード領 域の望ましくない影響を防ぐ。

本発明の他の利点および特徴は以下に記載するその良好な実施施態様および請求 の範囲から明らかになるであろう。

〔発明を実施する為の最良の形態〕 本発明の良好な実施態様の記載の最初に図の簡単な説明を行う。

図１はアルファｈＣＧ　ｃＤＮＡりｏ−ン、ＳＶ４０ウイ＃スＤＮＡの１部およ びプラスミドｐＢＲ３２２の配列を含むプラスミドルアルファ　５ＶＨＶＰ１の 構成の図式的説明である。

図２はイータｈＣＧ　ｃＤＮＡクローン、５ｖ４Ｑ　ＤＮＡ領域および宿主犬憐 菌（Ｅ、ｃｏｘｉ）にアンピシリン耐性を与える領域を含むｐＢＲ３２２の１９ 部からなるプラスミド９ｐ−：一夕５ＶＶＰＩの構成の図式的説明である。

図３はアルファおよびは一タｈＣＧ　ｃＤＮＡクローンがｓｖ４　ＱＤＮＡに挿 入されているシラスミドルアルファベータ５ＶＶＰ１の構成の図式的説明である 。

図４はツラスミ）”　ｐＲＦ　３７５およびｐＲＦ３９８の構成の図式的説明で ある。

図５はプラスミ）’　ＲＦ３９８アルフアｔ２の構成の図式的説明である。

図６はベータｈＣＧ　ｃＤＮＡクローン内の８８ｂｐ　プローブの位置を説明し ている図である。

図７は、ベータＬＨ制限地図および図８で示される構成に使用する切片の説明で ある。

図８は完全成熟に一タＬＨｃＤＮＡクロー／を含有するプラスミｌ’ＬＨ５２０ Ｈ／Ｂの構成の図式的説明である。

図９はウィルスベクターｐアルファＬＨ３ＶＶＰＩの構成の図式的説明である。

図１０はＬＨのベータサブユニットをコードシているＢＰＶ−含有プラスミ）” ｐＣＬ２８ＸｈｏＬＨＢＰＶの構成の図式的説明である。

本発明のクローニングベクターは上記１発明の開示−で列挙した一般構造を持つ 。良好なベクターは図に示した構造を持ち、以下に更に詳しく記載する。

本明細書で使用したすべての技術はマニアテイス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）（コール ド９スプリングハーバ−（Ｃｏ１ａ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ）ラボラトリ −（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ））　（参考文献として含まれている）に詳細に記載 されている。

ＲＮＡは以下に記載する方法により胎盤組織から抽出された。

組織の均質化はフェノール：　ｌ　！１１Ｍ　ＥＤＴＡ含有１００ｍＭ酢酸ナト リウム（ｐＨ５，５）の１：１混合物を６０°に加熱し２０分間実施した。氷上 で１０分間冷却後、相を遠心分離によシ分離する。熱フェノール抽出を更に２回 繰返し、続いて２回クロロホルムによシ抽出する。

ＲＮＡ　は最終水相から２．５容量のエタノールを添加する事により沈殿せしめ る。

ポリＡ　＋　ｍＲＮＡ　ｔ−濃縮するため、胎盤ＲＮＡ　’１ｉ−１０ｍＭ　） リス−ＨＣｄで緩衝化した（ｐＨ７，ｓ）　０．５Ｍ　Ｎａ（Ｊに溶解してオリ ゴ（ａＴ）−セルロースに通し、同一の溶液で洗浄する。１０ｍＭ　−）リス− ＨＣＩ（ｐＨ７，５）、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．０５％ＳＤＳでポリＡ＋ｍＲＮ Ａ１溶出し、２度エタノールで沈殿せしめる。

典型的な最初の収量は組織ｇ当！５１．５−２．０ｍ９の５ＲＮＡであシ、その 約２チがポリＡ　＋　ｍＲＮＡである。

胎盤ｍＲＮＡの逆転写、　ＥＣｏｘｌＤＮＡ　＄リメラーゼエ（ラージフラグメ ント）を用いる第２の鎖合成、ＳＩヌクレアーゼ処理および末端デオキシヌクレ オチジル　トランスフェラーゼによるホモポリマー尾形成（ａＣ）により胎盤ｃ ＤＮＡライブラリーを構成する；すべてのそのような過程は通常の技術により実 施できる。

典型的な調製においてはｍＲＮＡは単一鎖（ｓｓ）ｃＤＮＡへ２０−３０％変換 し；第２の鎖合成後７０％が８１ヌクレアーゼによる消化に抵抗し；および１０ から２５塩基長のａＣ”尾′　を得る。これらのｃＤＮＡ分子はＰｓｔＩで前も って消化し、４０１尾０を添加したプラスミドｐＢＲ３２２のＤＮＡ　フラグメ ントとアニール化する。これらの組換えプラスミ）＃ｔＥ、ｃｏ１１の形質転換 に使用し、ｃＤＮＡライブラリーを得る（形質転換細胞はテトラサイクリン抵抗 性に基づいて選択する）。

ヒトアルファｈＣＧクローンの同定のため、マウスアルファ甲状腺刺激ホルモン （ＴＳＨ）クローンの２１９　ｂｐ　フラグメントをハイプリグイゼーシコンプ ロープとして使用する。このプローブはヒトクローンに対し７７％の配列相同性 を持っている。

それをニックトランスレーションによシ放射性標識し、相同性ノ程度を考慮した 東件下ｃＤＮＡライブラリーとハイブリダイズする。強くハイブリダイズしたク ローンを制限地図作製によシ分析し、アルファｈＣＧの完全コード配列を含有す るクローンをＤＮＡ配列決定によシ立証する。

図１を参照すると、プラスミドアル７７９７０Ｈ／Ｂを構成するため、アルファ ｈＣＧ　７ラグメント含有ｃＤＮＡクローン２！１−ＮｃＯ工で消化する。Ｎｃ ｏＩ部位（翻訳開始のシグナルを与えるＡＴＧコドンのちょうど５′側）、は合 成りｉｎｄ　ｌ　リンカ−が連結され満たされている。同様に、クローンの３′ 非翻訳／領域の天然のＨｌｎａ　Ｉ部位は切断されＥ、ｃｏｌｉ　ＤＮＡポリメ ラーゼクレノー（Ｋｌｅｎｏｗ）によシ満たされ、その後金成りａｍＨＩ　リン カ−に連結されている。このフラグメントをシラスミド”Ｉ）ＢＲ３２２へその ）ｉｔｎａ　ｍおよびＢａ　ｍＨＩ部位の間にクローン化し、プラスミドアルフ ァ５７４　Ｈ／Ｂ　を発生させる。このプラスミドをＢａｍＨ工で消化し、アル カリホスファターゼで処理し、ポリアクリルアミ）’ケルカラ’ｌｌｔ’！サレ タＳＶ４０　ＤＮＡ　（Ｄ　３９６　ｂｐ　Ｓａｕ　３Ａ７ラグメン）（０，０ ７から０，１４地図単位）を連結する。連結混合物をＥ、ｃｏｌｉ　’ｆｒニア ／ピシリン抵抗性に形質転換するのに用い所望のツラスミド、アルファ９７０　 Ｈ／Ｂ′を形質転換体の中からヌクレアーゼによる消化によシフラッシュ（ｆｌ ｕｓｈ）末端を作製し、Ｅｃｏ　Ｒニリンカーに連結し、Ｅｃ　ｏＲＩで消化し 、生じる図１全参照すると、Ｑ２７　ｔ−工匹Ｒ工で完全に、旦匹主凹で部分的 に消化し；０７２から０．９４地図単位の７ラグメ／トヲ単１１ｉＬ、ＥｃｏＲ ＩおよびＨｌｎｄ　ｍで消化し、アルカリホスファターゼで処理したアルファ９ ７０Ｈ／Ｂ中へクローン化する。連結混合物ｉＥ、ｃｏｌｉの形質転換に使用し 、所望のプラスミド、アルファＳＶＬをＥｃｏＲＩで消化し、　ＥｃｏＲ工末端 全末端、０から０．７２地図単位に拡がシ、複製のＳＶ４０起源および無傷の初 期領域を含むＳ、Ｖ　４０　フラグメントを連結し、プラスミドｐアルファ５Ｖ ＨＶＰＩを発生させ、それはＥ　、ｃｏｌｉ形質転換体から単離される。

プラスミド１ｐ（−夕５ＶＶＰ１の構成ベータｈＣＧをコードする５　７９　ｂ ｐ　ｃＤＮＡクローンはコールドスプリングハーバ−ラボラトリ−（ＣＯＩ＋ｌ 　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　）、コールドブプリングハ ーバ−、ニューヨーク（Ｃｏ１ａ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ、Ｙｏ ｒＫ）のジＥ−７−シーーフイデス（Ｊｏｈｎ　Ｃ，Ｆｉｄｄｅｓ）　（フイデ スら（１９８０）ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）　２８巻、ｐｇ、６８４．−６８ ７）から得た。Ｔは各々の末端に合成りａｍＨニリンカーが連結したフラグメン トである。

−ゼで満たし、Ｅｃ　ｏＲＩ部位がシグナルイプチビコード配列のＡＴＧコドン の３′に対し約１０ｂｐ　になるように合成Ｅｃ　ｏＲＩリンカ−を連結する。

ＢａｍＨＩ部位はコード配列の末端を形成するナンセンスコドンの３′に対し約 ６０　ｂｐの所でちる。図２ｔ−参照すると、この５５６ｂｐＥ凹ＲＩ−と旦− Ｈ工７ラグメントを単離し、ｐＢＲ３２２に（旦ｃ　ｏＲＩおよびＢａｍＨＩ部 位の間に）クローン化し、シラスミドｐベータ５５６　Ｒ／Ｂ　を得る。

ブラスミ１．”　ｐＳＶＨＲを構成するためには（図２）、ＳＶ４　ＱＤＮＡ　 をＨ１コｄｉで部分消化して直線状分子を得、ヌクレアーゼＳ１で消化してフラ ッシュ末端となし、合成以四阻リンカ−を連結し、旦匹Ｒ工およびＢａｍＨ工で 消化する。複製のｓｖ４　Ｑ起源および初期領域を含む０９４から０．１４地図 単位の７ラグメント１に旦ｅＯＲニーＢｌす−１断片としてｐＢＲ３２２中にク ローン化する。

さらに図２を参照すると、プラスミドルイータ５５６　Ｒ／ＢのＥｃｏＲＩ部位 はＥｃ　ｏＲＩメチラーゼによシ触媒される反応によジメチル化され、続いて、 そのプ２スミ）”ｔＬｌｅＩにより切断する。ＥｃｏＲＩ　！ＪンカーＩＳＩ処 理狛１７ラツシユ末端に連結し、ＦＣＯＲ工により消化、続いてＢｉｍＨ工によ る消化によシ活性化する。

二辺Ｒ工部位からＢａｍＨ工部位へのｐＳＶＨＲの５Ｖ４０７ラグメントを単離 し、ｐ”−夕５５６　Ｒ／Ｂ　消化フラグメントを含む反応混合液中で連結する 。連結に続いて、混合物？：旦ａｌＩで消化し、ｐＢＲ３２２の旦逓ＲＩ　匹Ｉ 　）から旦ジ声工の断片が再び挿入されたプラスミドを除去する。Ｅ　Ｃｏ１１ を消化連結混合物で形質転換し、ｐ×−夕５ＶＶＰＩを同定し単離する。

シラスミドルアルファベータ５ｖｖｐｔ　の構成図３を参照すると、ｐＢＲ３２ ２の独特なＥｃｏＲＩ部位を−挿入し、続いてＳ１ヌクレアーゼによる消化によ ！５ＰＢＲ３２２からｐＢＲ３２２／に’Ｐｎを誘導する。

さらに図３ｆ：参照すると、５ｖ４Ｑ　ＤＮＡをＡｖａｉｌで消化する。生じる フラグメントの波形末端をクレノーＤＮＡ　ポリメラーゼで満たし、フラッシュ 末端を形成し、混合物をポリアクリルアミドゲル上で分画する。複製の起源およ び独特なＫｐｎ　Ｉ部位含有の６８２塩基対フラグメン）（０，６４から０．７ ７地図単位）をゲルから単離し、合成ジニリリンカーを連結し、Ｈｉｎａ［およ びＫｐｎ工で消化する。

生じるフラグメント＠ｐＢＲ３２２／Ｋｐｎに連結する。ｓｖ４０ＢａｍＨＩで 切断し、細菌アルカリホスファターゼで処理する。

さらに図３を参照すると、ｐベータＳ’ＶＶＰＩ／Ｂは以下のごとく構成されて いる：ｐベータ５ＶＶＰＩ　（図２）　七ＥｃｏＲ工で切断し、続いて連結によ ５ｐＢＲ３１２配列を除去する。次いでこのＤＮＡ　％−ジ狂４ＨＩで切断し、 ＰＢＲ３２２の且駐４ＨＩ部位へクローン化する。

ｍラレｆｃｉ　ラ、ｘ、　ミｙ、ｐイーＩ　５ＶＶＰＩ／Ｂ：ｆｔＨｌｎｄｌ［ オよびＢａ　ｍＨ工で消化し、１００３塩基対のＨ１ｎ＋Ｊ−ＢａｍＨエフラグ メ／トをｐ２６６に連オ吉し、シラスミドルベータＶＰＩ　２６６を得、そこに おいてはウィルスＶＰ１　転写のごとくそのＲＮ庵写がスツライスされるように ベータｃ　ＤＮＡは５ｖ４Ｑ後期プロモーターの下流に位置している。

処理されたもの）として挿入される。この連結物にょるＥ、Ｃｏｘｉ形質転換体 を制限地図作製によシスクリーニングし、アルファｈＣＧ　ｃＤＮＡが正しい方 向でＶＦ６　と置き俟わりＶＰＩと置き換ったベータｈＣＧ　ｃＤＮＡの下流に ｄく所望の構造を持つプラスミドを単離する。

１つのそのような単離されたプラスミ）”；ｐアルファベータＶＰ１　’ｋｐア ルファベータＳＭＶＰＩ　の構成を完成するために使要な構造を持つシラスミド ルアルファベータ５ＶＶＰＩ　を単離する。

このプラスミドはｈＣＧのアルファおよびベータサブユニットの両方をコードす るＤＮＡを含み、宿主哨乳類細胞において、両方のサブユニットを発現する事が 出来、生物学的に機能するグリコモル化異種２量体ｈＣＧ　が産生される（グリ コジル化は翻訳後に起こる）。

プラスミドｐＲＦ　３７５およびｐＲＦ３９８の構成図４を参照すると、プラス ミドＣＬ２８　（プラスミド、ＴＹＭＭ’Ｑと同一；Ｈａｍｅｒら（１９８３） 　Ｊ、Ｍｏ１．Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｇｅｎ、１　。

２７３−２８８）は、ネズミメタロチオネイン　プロモーター、特表昭６１−５ ００２４９　（５） で切断される。この部位に５′末端に約１０から３０　ｂｐの非翻訳領域および ３′末端に約２２０および６０　ｂｐの非翻訳領域を含むアルファｈＣＧまたは ベータｈＣＧ両方のｃＤＮＡクローンを挿入する。これらのクローンは遺伝子工 学によりその末端に合成りａｍＨＩリンカ−が添加されている。

得られるプラスミ）’　ｐＲＦ３０２　（アルファ）およびｐＲ１’３９４（ベ ータ）　ｆｃＢａｍＨＩおよびジュエ制限酵素で消化し５ｖ４０ＤＮＡ　配列を 放出させる。

完全ＢＰＶゲノムおよびいくつかのｐＢＲ３２２配列を含むプラスミ）＃ｐＢ２ −υＥ匹丑ＨＩおよび５ａｌＩで消化し、ＢａｍＨＩ／５ａ１１末端を持つＢＰ Ｖゲノムを得る；このフラグメントをメタロチオネイン−ｈＣＧ配列を含むｐＲ Ｆ’３０２（アルファ）およびｐＲＦ３９４（は−タ）内に連結する。

Ｅ、εｏｌｉの形質転換に続いて、プラスミ）”Ｉ）ＲＦ３７５およびｐＲＦ３ ９Ｂ　ｋ同定し単離する。これらはマウスメタロチオネインプロモーターの制御 下各々アルファｈＣＧまたはベータｈＣＧ図５を参照すると、ブラスミ）＃ｐア ルファｔ２はアルファｈＣＧ５７４　Ｈ１ｎｄ１７　ラグｙｌ：ｙトにプラ、ｘ 、　ミ）”ｐＶＢｔ２（Ｖ、Ｂ。

Ｒｅｄｄｙら、ＰＮＡＳ　７９，２０６４−２０６７．１９８２）にクローン化 して誘導される。ＳＶ４０　初期ツロモーター〇慴Ｊ御下にあるアルファｈＣＧ 　ｃＤＮＡ　ｆ含有するｐアルファ上２　をＥｃ　ｏＲ工で消化する。平滑末端 連結による合成りａｍＨＩ　ＩＪンカーの添加に先立って５′突出物をＳｌヌク レアーゼ消化により除去する。

シラスミドＲＦ’３９８（図４　）　’ｆｃ　ＢａｍＨＩ　で消化し、細菌アル カリホスファターゼで処理する。ｐアルファ上２の１７３５塩このプラスミドは それ故マウスメタロチオネインプロモーター制御下の転写単位中にベータｈＣＧ 　ｃＤＮＡを持ち、５ｖ４０　初期プロモーター制御下の転写単位中にアルファ ｈｃＧ　ｃＤＮＡ　ｆＲＮＡは５から１０グラムの凍結腺ｔ４Ｍチオシアン酸グ アニジン、１Ｍ２−メルカプトエタノール、０．０５Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５ ，０）および０．００１Ｍ　ＥＤＴＡｉ含む２０ｍ１の溶液中で均質化する事に よりヒト下垂体から調製される。ホモジネートｄ当シ１ｇのＣｓＣ７！’ｔ”添 加し、懸濁液ｔ”　２０００　ｒｐｍで１５分間遠心分離する。上澄み液を注意 深く１５ｍ１のＣ６Ｃ１溶液床（１，２５ｉ／の１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５） 、６２，５マイクロリツトルの０．４Ｍ　ＥＤＴＡおよび３９．８．９のＣｓＣ ７１を最終容量３５ゴに含有する〕に層積し、ＢｅｃＫｍａｎ超遠心機のＴ１７ ０ローター中で２０℃にて１８−２４時間４５０００　ｒｐｍで遠心分離する。

勾配中に薄皮として見る事が出来るＲＮＡ　’ｊｉ注射器により除去し、希釈し 、２容量のエタノールの添加によシ沈殿させる。

３度溶解および再沈殿を繰返した後、ＲＮＡ　ベレット′ｆ！：Ｈ２ｏにＨＣｌ （ｐＨ７，５）および０．５Ｍ　ＮａＣｌの溶液を作製する。前記の胎盤ＲＮＡ 　の場合のごとく、オリゴｄＴ−セルロースｆ：２度通し調製試料のポリＡ　＋ ｍＲＮＡ　を濃縮する。

ヒト下垂＃ＣＤＮＡライブラリーは第２の＠ｃＤＮＡ合成に次いでラージフラグ メントＥ、Ｃｏ１１　ＤＮＡポリメラーゼエおよび鳥類骨髄芽球症ウィルス逆転 写酵素の両方を用いる事を除いて胎盤ポリＡ　＋ｍＲＮＡのために記載したごと くしてポリＡ　＋ｍＲＮＡから構成される。第１にクレノーを使用する。反応は フェノール抽出によシ停止される。遠心分離抽出物の水相′に５ゴカ２ムのＢｉ ｏＧｅＩＡ　−５ｍにかける。高分子量物質含有分画をツールし、濃縮し、２容 量のエタノールで沈殿後乾燥し、逆転写のため、１００ｍＭ）リス−ＨＣｌ　（ ｐＨ８，３）、１０ｍＭ　ＭｇＣ６２゜１４０ｍＭ　ＫＣｌ、２０ｍＭ　２−メ ルカプトエタノール、１ｍＭの４つのデオキリボヌクレオサイト９三リン酸の各 々を含む溶液に溶解する。逆転写酵素はｃＤＮＡマイクロダラム当り約２０単位 加える。２重［ｃＤＮＡｆｄ前記のごとくヌクレアーゼＳ１で処理し、尾を付け 、クローン化する。

ａｌ当り２５マイクログラムのテトラサイクリン含有栄養寒天プレート上で増殖 シタコロニーをニトロセルロースフィルターに移す。その場所でＱ、　５　Ｍ　 ＮａＯＨ処理にょシコロニー細胞を溶解し、ｌ、　５　Ｍ　ＮａＣＪ含有０．５ Ｍ）リス−ＨＣ１（ｐＨ７，４）で中和する。遊離したＤＮＡは真空オーブン中 で２時間８０℃にて焼いてフィルターに固定する。成熟ｈＣＧベータ鎖のアミノ 酸１６から４５に対応し、ベータＬＨポリーブチどの領域に普通な３０アミノ酸 の内２９を持つ３２ｐ標識ベータｈＣＧクローン８８塩基対フラグメントへのハ イブリダイゼーションによりフィルターをスクリーニングする（図６）。５０％ ホルムアミド０．７５　Ｍ　ＮａＣｊ？、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム（ｐ Ｈ７，０）、２．５％硫酸デキストラン、０．１％ポリビニルピロリド９ン、ｄ 当りｏ、　ｉ　ｒｑのウシ血清アルブミンおよび３２ｐ標識８８　ｂｐベベーｈ ＣＧフラグメントのフィルター当ｔ）ｌ　Ｑ　５ｃｐｍで３２°にて一夜ハイブ リグイゼーシコンを実施する。オートラジオグラフィーの前に３７′Ｃにて０． １５　Ｍ　ＮａＣ４０，０１５Ｍクエン酸ナトリウム中で数回フィルターを洗浄 する。１つの陽性な単離クロ゛−ノＬＨ１２（図７）を更に使用する。ＬＨ１２ は３６５塩基対長であシ、ツリーベータシグナル配列の１５のアミノ酸に加えて 成熟ベータＬＨポリイプチト９の１０５のアミノｄｋコードシている配列を含む 。そのヌクレオチド配列は火元されている。

完全成熟ベータＬＨはＬＨ１２によクローンされないのでＬＨ１２のＮ（！０Ｉ −Ｐｖｕ　ｌ［７ラグメント（図７）　＋　３２ｐ標識・・イブリダイゼーシコ ンゾロープとして使用してヒト下垂体ｃＤＮＡライブラリーの更なるスクリーニ ングを実施しだ。クローンＬＨ６（図７）がこのスクリーニングによシ単離され た。ＬＨ５はベータＬＨの完全３′末端を含み１ｍＲＮＡのポリＡ１１尾”の２ ７Ａ残基にわたるｍＲＮＡ　Ｔ＋非翻訳部分に対応する・超酸も含有する。

５′方向へＬＨ１２により更に伸びたクローンはＭｕされなかった。完全、結合 成熟ベータＬＨコード領域のＤＮＡ　配列は報告されているタン・ぐり質配列デ ータからのベータＬＨのアミノ酸配列において２つの相違を示した：４２番目ガ メチオニンであシ５５番目はノリンである。またｃＤＮＡ配列に基づくと成熟は 一タＬＨは１２１のアミノ酸配列んでいる。

無傷のシグナルペプチドコード領域および完全成熟ベータＬＨ配列金含むクロー ンは図７で説明した制限フラグメントを用い、図８に示したごとくして構成され る。１０４　ｂｐ　ＥｃｏＲＩ−ＤａｅＩフラグメントをツラスミドベータ５７ ９Ｈがら単離し、且１μ消化によシＬＨ１２ツラスミドから単離した１　８１　 ｂｐのＩＭｅＩフラグメントに連結する。１５℃にて一夜の連結に伏いて、連結 混合物を４四ＲＩおよびｈ匹工で消化し、７％ポリアクリルアミドゲルにより分 画し、所望の２５６　ｂｐフラグメントを単離する。このフラグメントは２０ア ミノＱシグナルベツチドをコードする配列を提供するような様式では一タｈＣＧ シグナル配列がシリ−ベータＬＨのそれと融合している。

２５６　ｂｐ旦臼Ｒエージ」エフラグメント全Ｅｃ　ｏＲＩおよび乃駐工で消化 したｐＢＲ３２２中にクローン化しプラスミドＬＨベータ２６０を得る。図８に 示した１　４６　ｂｐ　ＥｃｏＲニー昼＝■７ラグメントｔｚリアクリルアミド ゲルから単離し以下に記載する後の構成に使用する。

ＬＨ６Ｈ６プラスミド８）をジニ３ａで消化し、３９０　ｂｐフラグメントをポ リアクリルアミドゲル電気泳動により単離する。

このフラグメントはＨｌｎｃＩで消化し、ＢａＩｎＨニリンカー全連結し、Ｂａ ｍＨＩで消化し、プラスミドｐＡＰＰのＢａｍＨＩ　部位へクローン化する。ｐ ＡＰＰはｐＢＲ３２２０担工による消化５′突出部分ｙａＮＴＰおよびＥ、ａｏ ｘｉのラージフラグメン）　ＤＮＡ１リメラーゼエで満たし、ヱヨ■で消化しＰ ｖｕ　ｌ［部位をなくすため連結してプラスミドを閉じる。３４０　ｂｐ　Ｂａ ｍＨエフラグメ７　トノｐＡＰＰ　Ｃ）　ＢａｍＨＩ　部位への連結により単離 されたプラスミド’ＬＨ６Ｂ　を以ユＲＩおよび心ｒＪにより消化し、細菌アル カリホスファターゼ処理を行う。このフラグメントは前記のＬＨベベー２６０の １４５　ｂｐの旦四Ｒニー黒徂工７ラダメントの混合物と連話し、図８に示しｉ プラスミドＬＨ１２がら２４１ｂｐの、μ：Ｊ−Ｐｖｕｌフラグメントを得る。

連結混合物をアンピシリン耐性にＥ、ｃＯｌｉ　２形質転換するために使用する 。プラスミドＬＨ５２０Ｈ／Ｂが形質転換体から発見された。Ｌｌ’（５２０Ｈ ／Ｂはハイブリッドシグナルペプチド配列を含む完全ベータＬＨコート’配列全 含有している。

ｐアル７７　ＬＨ５ｖｖｐｉ　）構成 このツリーベータＬＨクローンｙｓＶ−４０基−ベクター中で発現させるため（ 前記のプリーアルファおよびプリーベータｈＣＧり臣ツで行ったごとく）ツリー ベータコード配列のＡＴＧの非常に近（ＥｃｏＲＩ部位を置くのが望ましい。こ の事はＬＨ５２０Ｈ／ＢＩ　ＨｇａＩで消化し、５′突出部分を充てんし。

旦ｃｏＲＩ　リンカ−を連結し、幽■＋Ｒ工およびＢａｎＨＩで消化し、単離し た４　９６　ｂｐ　ＥｃｏＲニー＆す＋ＨＩフラグメントをＥｃｏＲＩおよびＢ ａｍＨＩで消化し細菌アルカリホスファターゼ処理したｐＢＲ３２２中にクロー ニングする事にょシ達成される。この連結混合物で形質転換したＥ、ｃｏｌｉか ら単離されたクラスミドｐＬＨ４９６Ｒ／Ｂｔ発現されるべき４９６ｂｐフラグ メントの源として使用する。

町にその構成およびｈＣＧの両刃のサブユニットの発現における使用：こつぃて 記載した（図３）プラスミドｐアルファベータＶＰ　ｌ　ｆ　Ｅｃ　ｏＲＩおよ びＢａｒｎＨＩで消化し、これらの両刃の酵素で消化しであるプラスミドｐＬＨ ４９６Ｒ／Ｂｌ含む反応混旦Δ工ユ形質転換体から同定する。図９に示したごと ぐ、無４の５ｖ４Ｑウィルス初期領域Ｑアルファ５ｖａｖｐｔ（図１）がで切断 し、再結合する事によりウィルスアルファＬＨ８ＶＶＰ１７％生成する。このウ ィルスは通常の（ＦＳＨおよびＴＳｔ（同様にＬＨおよびｈＣＧ）アルファサブ ユニットのためのクローン化ｃＤＮＡおよび５ｖ４０　後期プロモーター制御下 の特定のベータＬＨサズユニットを含んでいる。クローン化ｃＤＮＡは通常のア ルファ挿入物がウィルスＶＰＩ　タンパク質コード配列に置き換わり、ベー几Ｈ 挿入物がウィルスＶＰ２　コード配列に置き涙るようにして位置される。

を含む）のＢＰＶに基づく発現系への挿入ＬＨ５２０Ｈ／Ｂ（図８）を且叫旦■ およびジｔｍＨＩで消化し、ンカーを連結しＳａｘ工で消化し、］）ＢＲ３２２ の５ａｘＩ部位へクローニングする。生じるプラスミド（ＬＨ５３０５ａ１）　 を図ｔ　Ｏに記載したプラスミドＣＬ２８のマウスメタロチオネインへ挿入する たやのＬＨｃＤＮＡクローン源として使用する。

０Ｌ２Ｂ’ｔ　Ｂｇｌｌで消化し、ヌクレアーゼＳ１で処理し、ＸｈｏＩ　ＩＪ ンカーを連結し、Ｅ、ｃｏｌｉ　ｆ反応混合物で形質転換してブラスミ）”ＣＬ ２８Ｘｈｏ’ｉ得る。このプラスミ）”（Ｉ：　ＢａｍＨＩおよび互ａｘ工で消 化し、　ＢａｍＨＩおよび５ａｘＩで消化したプラスミドｐＢ２−２（図４）と 連結し、グラスミドＣＬ２８Ｘｈｏ　ＢＰＶを得る。５ａＩＩ消化物の５′突出 部分はＸｈｏＩ消化物のそれと相補的であるので、後者のＬＨ挿入物ｋｃＬ２８ Ｘｈｏ　ＢＰＶのＸｈＯ工部位にＳａｘエフラグメントとして連結する。バンク グラウンドヲ除くためＸｈｏＩによる消化に伏いてＥ、ｃｏｌｉｉ形質転換し、 所望のマウスメタロチオネインプロモーターの制御下にあるＢＰＶに基づくプラ スミド干に（ハイズリラド）フリーベーｐＬＨ挿入物ヲ含’Ｌ＋’　７７　スミ ｉ’　１＝　’ＣＬ　２　ａ　Ｘ　’ｈ　ＯＬＨＢ　Ｖ　Ｐカ単離異種重合体タ ンパク質産生のための真核細胞へのウィルス−含有ベクターの取フ込みは一般的 に以下のごとくして達成される。第１にもしウィルスＤＮＡおよびホモポリマー タンパク質コードＤＮＡ　がＥ、ｃｏｌｉ中などに維持されるプラスミド内に取 り込まれているならば、グラスミド配列（例えはｐＢＲ３２２配列）を除去し、 生じるＤＮＡ　ｉ連結してウィルス領域および異種重合体タンパク質コード配列 または配列類全包含する環状ＤＮＡ　？！−形成する。この環状ＤＮＡは一般的 にウィルスが複製するのに必要なすべての遺伝的情報を含んでいす、他の必要表 記列（例えば被膜タンパク質をコードしている配列）が異種重合体タンパク質− コード配列または配列類によＶ置侠されている。プラスミドＤＮＡが除かれた環 状ＤＮＡはその大きさが天然のウィルスに十分近くなければならず、それにより 適当な宿主哺乳類細胞中に入り、複製する事が可能となる。

晩発感染のだめのウィルス貯蔵をするため環状ＤＮＡ　２宿主細胞のトランスフ ェクトに使用する。ウィルスを産生ずるの、・こ必要なりＮＡ　のいくつかが失 われている為、ウィルス複製の失われた機能を十分にコードするヘルパーウィル スＤＮＡ　と件にトランスフェクションに行う。

トランスフェクトされた宿主細胞を増殖させ複製ウィルスにより溶解するまでイ ンキュベートする。生じる複製ウィルス貯蔵゛吻（ヘルパーウィルスを含む）を 異種重合体タンパク質の産生のための宿主細胞の感染に使用する。新しいバッチ の宿主細胞の感染に再び用いるのに一般的に必要であるのでウィルス貯蔵品全維 持し、各々の培養細胞の感染によりタンパク質産生宿主細胞は一般的には最後に はウィルスにより溶解される。

上に記載した特定の組供えＤＮＡ配列を以下のごとく宿主細胞のトランスフェク ションおよびその後の感染に使用する。

上記のｓｖ４□−含有プラスミドからｐＢＲ３２２配列を除去してトランスフェ クト用ウィルスＤＮＡ　ｑ産生ずる。ｐアルファ５ＶＨＶＰＩおよびｐアルファ ベータ５ｖｖｐｉ　の場合この事はＢａｍＨＩによる消化、伏いてのフラグラン ド゛が環化し、（他の生成物中）アルファ５ＶＨＶＰＩ　およびアルファベータ ５ＶＶＰＩを与えるような条件下連結する。ｐベータ５ｖｖｐｉ　の場合は。

旦二ＲＩにより消化し続いての再結合により５Ｖ−４Ｑ後期プロモーターおよび ＶＰＩスプライス領域がベータｈＣＧ　ｃＤＮＡ挿入物に並置され、同時にｐＢ Ｒ３２２配列全除去しベータ５ＶＰｌ’１形成する。同時にｐｔｓＡ５８Ｂａｍ （ｔｓＡ５８ｓＶ４０ウィルスＤＮＡｉＴ）ＢＲ３２２ＢａｍＨ工部位にクロー ニングしたもの）を旦■声工で切断し、連結して自己連結環を得る。類似の方法 がＬＨベクター（Ｃ使用される。別々のウィルス貯蔵物を以下に記載するごとく 調製する。

前記のごとく切断し連結したＤＮＡ　ｉエタノール沈殿させ。

滅菌水に溶解する。約１μＳ　のｐｔｓＡ５８Ｂａｍ　ＤＮＡ　（ヘルパーウィ ルス）および１０μｓ　の組換えＤＮＡ　（アルファおよび／またはベータｈＣ ＧまたはＬＨをコードしている）全滅菌試験管中で（昆合し２ｍ１（ＤＴＢＳ　 ｄ衝Ｑ（：）−・キムラ（Ｇ、Ｋｉｍｕｒａ）およびアール・ダルベツコ（Ｒ， Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）　１９７２　、ピロロシー−デキストラン溶液を混合し、Ｔ −７５フラスコ中２度１０ｍ１のＴＢＳで洗浄したコンフルエントになったサル ＣＶ−１細胞の単層に添加する。細胞は時々振とうさせながら３７℃にて１−２ 時間放置し、ＴＢＳで２度洗浄後、５％ウシ胎児血清含有ＤＭＥＭ　１０ｍ１ｋ 与え、１０−１５日間４０℃にて放置する。完全に細胞が溶解後、培地全試験管 に移し、５度凍結融磨し。

３０００　ｒｐｍで５分間遠心分離する。得られる上澄み液を新しいｃｖ−１細 胞の感染のためのウィルス貯蔵物とする。

感染を行なうため、ＣＶ−１細胞’ｚＴ−１５０フラスコ中でコンフルエントに なるまで増殖させる。１πｌのウィルス貯蔵物の１つ（上記のごとくして作製し た）をフラスコに添加し、細胞を４０℃にて５日間インキュベートする。

混合感染のためにＣＶ−Ｉ　Ｔｈｅ−１５０フラスコ中コンフルエントになるま で増殖させる。アルファ５ＶＨＶＰＩ　およびは−タ５ｖｐ１　ウィルスＶＸ： Ｘの比で混合し、１πｌの混合ウィルスを４０℃におけるＣＶ−１細胞の感染に 使用する。

マウｘ細ａのトランスフェクション 混合感染を使用して異種２量体ｈＣＧ　２産生するために、５μｇの各々ＢＰＶ プラスミド〔即ち、ｐＲＦ３７５（アルファｈＣＧ）およびｐＲＦ３９８（＜− 夕ｈＣＧ））ｙ混合し、担体としてｌＯμｇのサケ精子ＤＮＡ　’ｉ金含有る２ 　５０　ｍＭ　ＣａＣｅ２溶ｆ’ｉ　０．５　ｍｌに添加する。この混合液ｋ　 ０．５　ｍｌの２８０　ｍＭ　Ｎａ（４，５０ｍＭ　−ｚ−ｓスおよび１．５　 ｍＮＡ　リン酸ナトリウム中ＩＣぶくぶくと通す。リン駿カルシウム沈殿が室温 で３０−４０分の間形成される。

トランスフェクションに先立つ２４時間前に、５×１０５細胞のマウスＣ１２７ 細胞（）＃クターディーンハマー、ロ立ガン研究所（Ｄｒ、Ｄｅａｎ　Ｈａｍｅ ｒ、　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ）Ｎ工Ｈメリーラ ンド州、ベセスダ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　、ＭＤ）から入手可能）ｋｌｏｏ＊ｍ皿 またはＴ−７５フラスコに置く。外来性ＤＮＡ　を添加する直前に、細胞に新鮮 培地（ダルベツコ改良培地、１０裂ウシ胎児血清）を与える。１πｌ；（１）ｌ ）ン酸カルシウム沈殿物を各々の皿（１０ｍ／りに添加し、細胞を３７℃にて６ −８時間インキュベートする。

培地全吸引除去し、５ｍ／！０２０％グルセロールを含むリン酸塩緩衝液、　１ ）Ｈ７，０（ＰＢＳ）　に室温で２分間置換する。細胞をＰＢＳ　で洗浄し、１ ０ゴの培地を与え、３７℃にてインキュベートする。２０−２４時間後、培地を 交換し、続いての細胞への給餌を３−４日毎に実施する。７−２１日後、分析の ため細胞クローンをより大きなフラスコ（で移す。

単一トランスフェクションを用いて異種２量体ｈＣＧ　を産生するには上記の２ つの１ラスミドヲ混合感染に用いた喝合と同様の方法で１２スミドＲＦ３９８ア ルフアｔｚ　ｔ−使用する。

異種２量体ＬＨ作製にはｈＣＧ　の場合において上に記載したコトく、−７２， ＜ミＦＰＲＦ’３７５　お！びｐｃＬ２８ＸｈｏＬＨＢＰＶ　ｔ［合する。

アルファーコード細胞の不在下、は−タｈＣＧまたはベータＬＨ−コードイクタ ーのみを含む培養細胞はほとんどベータサブユニツ）ｆ産生しないが、一方アル ファおよびベーターコード配列を含む細胞は異種２量体のみならず遊離のベータ サブユニットも同様に産生ずるという興味らる捩察がなされた。この事は単一の 細胞培養における両方のサブユニットの産生け、ベータサブユニットを安定化す るアルファサブユニットの存在をいくぶん許容する更なる利点を持つという概念 の支持を与える。

供託 上に記載した以下のものがアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクショ７　（ Ａｍｅｒｉｃａｎ　’Ｉ’：ｌ’ｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ ）。

メリーランド州、ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ　ＭＤ）に供託された：フル ７７ベ−タ　５ＶＶＰ１、ＡＴＣＣＶＲ２０７７，７＃７７　５ＶＨＶＰ１、　 ＡＴＣＣＶＲ２０７５゜ベータ　５ｖｖｐ１．ＡＴＣＣＶＲ２０７５、Ｃ１２７ 細胞中のｐＲＦ　３７５、ＡＴＣＣＣＲＬ８４０１゜Ｃ１２７細胞中のｐＲＦ’ ３９８、ＡＴＣＣＣＲＬ８４０１、Ｃ１２７細胞中のｐＲＦ’３９８アルファｔ ２、ＡＴＣＣＣＲＬ８４００゜〔用途〕 本発明による形質転換細胞株は生物学的に活性な異種重合体タンパク質の製造に 使用される。例えば本発明に従って作製されたｈＣＧ　はヒト受精に伴う多くの よく知られた医学上の使用がなされる。

〔他の実施態様〕

他の実施態様は以下の請求の範囲に含まれている。

例えば： 他の異種重合体タンパク質（例えば卵胞刺激ホルモンまたは甲状腺刺激ホルモン ）もヒトまたは動物免疫グロブリンまたは免疫応答抗厚同様に産生できる。

異種重合体タンノξり質は１つの細胞またはさらに１つの培養で産生される必要 はない。１つＤ変法は２つの細胞を一緒に培養し、その１つが１つのサブユニッ ト’に産生じ、１己の細胞が他のサプユニツ）ｋ産生ずる；分路されたサブユニ ットは培地中で会合でき異種２量体を形成する。他の変法は、別々の培養系を用 い、各々が異ったサブユニツ）１−産生ずる。その後培養培地を混合し、異種重 合体への会合を可能にする。

他の宿主細胞、ベクター、プロモーター、形質転換配列およびウィルスもまた使 用できる。用いる宿主細胞は一般には用いるベクターに依存する。例えば、ベク ターが復製ウィルスまたは非複製ウィルスＤＮＡの場合、宿主細胞はこれらのベ クターにより各々感染されまたはトランスフェクトされ得る細胞であはＣＶ−を 細胞）を必要とする。クローニングベクターが原核細胞制御配列を持つプラスミ ドの場合原核宿主細胞（例えばＥ、ｃｏｌｉ）を使用する。クローニングベクタ ーが真核細胞制御配列を持つプラスミドである場合は適当な真核宿主細胞（例え ばマウスＣ１２７細胞）を使用する。

浄書（内容に変更なし］ 第２図 第５図 薯 第９図 第１０図 手続補正型（方式） ％式％ ２、発明の名称 異種重合体タンパク質 ３、補正をする者 事件との関係　出　願　人 住所 氏　名　レッディ、ヴエムリ・ビー　（外３名）４、代理人 住　所　東京都千代田区大手町二丁目２番１号新大手町ピル　２０６号室 ６、補正の対象 国際調交報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ｈＣＧ、ＬＨおよびＦＳＨから選択される生物学的に活性な異種２量体ヒト 受精ホルモンであつて、前記ホルモンはアルフアサブユニツトおよびベータサブ ユニツトから成り、各々前記のサブユニツトは前記サブユニツトをコードしてい る異種のＤＮＡから成る自律性複製発現ベクターを含む細胞により合成されるホ ルモン。 ２．ｈＣＧから成る請求の範囲第１項記載のホルモン。 ３．ＬＨから成る請求の範囲第１項記載のホルモン。 ４．ＦＳＨから成る請求の範囲第１項記載のホルモン。 ５．第１の自律性複製発現ベクターからなる細胞であつて、前記細胞はｈＣＧ、 ＬＨおよびＦＳＨから成る群より選択される生物学的に活性なヒト受精ホルモン を産生出来、前記ホルモンは少くとも部分的に前記第１発現ベクターによりコー ドされている細胞。 ６．前記第１発現ベクターが前記ホルモンの第１のサブユニツトをコードしてい る請求の範囲第５項記載の細胞．７．さらに、第２の自律性複製発現ベクターが 前記ホルモンの第２のサブユニツトをコードしている請求の範囲第５項記載の細 胞。 ８．前記ホルモンの第２のサブユニツトが前記第２のベクターによりコードされ ている請求の範囲第７項記載の細胞。 ９．前記ホルモンの両方のサブユニツトが前記第１発現ベクターにエリコードさ れている請求の範囲第７項記載の細胞。 １０．前記第１ベクターがプラスミドてある請求の範囲第５項記載の細胞。 １１．前記細胞が哺乳類細胞てある請求の範囲第５項記載の細胞。 １２．前記異種２量体ホルモンのアルフアおよびベータサブユニツトが前記第１ 発現ベクターによりコードされている請求の‘範囲第５項記載の細胞。 １３．前記異種２量体ホルモンの前記アルフアおよびベータサブユニツトの転写 がＳＶ４０後期プロモーターの制御下に行われる請求の範囲第１２項記載の細胞 。 １４．前記異種２量体ホルモンのアルフアサブユニツトの転写がＳＶ４０初期プ ロモーターの制御下に行われ、および前記異種２量体ホルモンのベータサブユニ ツトの転写がマウスメタロチオネインプロモーターの制御下に行われる請求の範 囲第１２項記載の細胞。 １５．前記第１ベクターが少くとも６９％ウシ乳頭種ウイルスゲノムの形質転換 領域から成る請求の範囲第１４項記載の細胞。 １６．前記異種２量体ホルモンのアルフアサブユニツトが前記第１発現ベクター によりコードされ、および前記異種２量体ホルモンのベータサブユニツトが第２ の自律性複製発現ベクターによりコードされている請求の範囲第５項記載の細胞 。 １７．前記異種２量体ホルモンのアルフアおよびベータサブユニツトの転写がＳ Ｖ４０後期プロモーターの制御下にある請求の範囲第１６項記載の細胞。 １８．前記細胞がサル細胞である請求の範囲第１０項記載の細胞。 １９．前記異種２量体のアルフアおよびベータサブユニットの転写がマウスメタ ロチオネインプロモーターの制御下にある請求の範囲第１６項記載の細胞。 ２０．前記第１および前記第２のベクターが各各ウシ乳頭種ウイルスゲノムの少 くとも６９％形質転換領域からなる請求の範囲第１９項記載の細胞。 ２１．前記細胞がマウス細胞である請求の範囲第１１項記載の細胞。 ２２．ｈＣＧ、ＬＨおよびＦＳＨから成る群より選択されるヒト受精ホルモンの ２つの異ったサブユニットをコードする自律性複製発現ベクター。 ２３．前記発現ベクターがプラスミドから成る請求の範囲第２２項記載の発現ベ クター。 ２４．前記発現ベクターが複製ウイルスから成る請求の範囲第２２項記載の発現 ベクター。 ２５．フルフアベータＳＶＶＰ１（ＡＴＣＣ　ＶＲ２０７７）である請求の範囲 第２４項記載のウイルス。 ２６．アルフアＳＶＨＶＰ１（ＡＴＣＣ　ＶＲ２０７５）である請求の範囲第２ ４項記載のウイルス。 ２７．ベータＳＶＶＰ１（ＡＴＣＣ　ＶＲ２０７５）である請求の範囲第２４項 記載のウイルス。 ２８．Ｃ１２７細胞中のｐＲＦ３７５（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ８４０１）である請求 の範囲第２３項記載の発現ベクター。 ２９．Ｃ１２７細胞中のｐＲＦ３９８（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ８４０１）である請求 の範囲第２３項記載の発現ベクター。 ３０．Ｃ１２７細胞中のｐＲＦ３９８、アルファｔ２（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ８４０ ０）である請求の範囲第２３項記載の発現ベクター。 ３１．Ｅ．ｃｏｌ１中のｐＣＬ２８ＸｈｏＬＨＢＰ７（ＡＴＣＣ　３９４７５） である請求の範囲第２３項記載の発現ベクター。 ３２．請求の範囲第５項記載の細胞により産生される生物学的に活性なホルモン 。 ３３．ｈＣＧ、ＬＨおよびＦＳＨから成る群より選択される生物学的に活性なヒ ト受精ホルモンの少くとも一部をコードする第１の自律性複製発現ベクターを含 む宿主細胞を培養することからなる前記ホルモンの製造方法。 ３４．前記ホルモンの第１のサブユニットが前記第１発現ベクターによりコード されており、前記ホルモンの第２のサブユニットが前記宿主細胞に含まれる第２ の自律性発現ベクターによりコードされている請求の範囲第３３項記載の方法。 ３５．前記ホルモンの両方のサブユニットが前記第１の発現ベクターに上りコー ドされている請求の範囲第３３項記載の方法。