JPH08500833A - 凝血性蛋白質に特異的な抗体、未変性蛋白質を単離するためのそれらの利用、その蛋白質の蛋白質分解性開裂産物を含まない凝血性組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 制限的蛋白質分解のための標的配列を含む小ペプチドに基づく抗体選択手法を利用する、血液凝固因子に対するＣａ²⁺−依存的抗体の作成のための方法。該凝血性蛋白質の未変性種と開裂種との間を実質的に識別するこれらの抗体により、未変性の凝血性蛋白質の単離のための新規の手法が提供される。副作用もしくは効力の低下に通常関連する開裂産物が存在しないことにより、これらの未変性蛋白質は、凝血性疾患の治療のための治療学的組成物中の改善された試薬として作用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称：凝血性蛋白質に特異的な抗体、未変性蛋白質を単離するためのそれ らの利用、その蛋白質の蛋白質分解性開裂産物を含まない凝血性組成物 発明の分野 本発明は、凝血性疾患の治療のための精製済み血液凝固因子を含む治療学的組 成物の調製法に関する。該組成物は、未変性分子種と開裂を受けた分子種との間 を識別する抗体、より具体的にはモノクローナル抗体を利用する親和性クロマト グラフィーにより取得される。このような抗体を取得するために複数の方法が開 示され、このような抗体により、活性化種もしくは分解種に相当する開裂産物を 含まない未変性ポリペプチドとしての、因子ＩＸ、因子ＶＩＩ、プロテインＣ、 もしくはプロテインＳを初めとするビタミンＫ−依存的血液凝固蛋白質の単離が 可能になる。 発明の背景 血液凝固系の蛋白質の先天性もしくは後天性欠損症により凝血性疾患の発症の 主要原因が与えられる。この系の内のたった一つの構成成分が欠損もしくは不足 していても、出血もしくは血栓症という主要な臨床兆候をもたらすという様式で 、凝血促進経路と抗凝血経路との間の微妙なバランスが十分妨げられる可能性が ある。最も一般的な出血性疾患の内の一つは血友病Ａであり、これは凝固因子Ｖ ＩＩＩの欠損もしくは機能不全に起因する。発症の頻度はより劣るものの同様に 重篤な出血性疾患 には、凝血性蛋白質である因子ＩＸ（血友病Ｂ）、因子ＶＩＩ、もしくは因子Ｘ の欠損症がある。一方で、血栓症は、凝固経路の拮抗物質として作用するある系 の主要構成成分であるプロテインＣもしくはプロテインＳの部分的（異型接合性 もしくは後天性）欠損症の結果としてさえも発症することがある（凝血性疾患に ついての総説に関しては、Ａ．Ｌ．ＢｌｏｏｍおよびＤ．Ｐ．Ｔｈｏｍａｓ（Ｅ ｄｓ．）、Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ、２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ−Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ、Ｅｄｉｎｂｕ ｒｇｈ、１９８７、ｐｐ３９３−４３６および４５２−４６４、を参照せよ）。 補充療法はインビボでの凝血バランスを回復させるのに強力かつ有効な手段であ ると考えられている。例えば、因子ＩＸを含む濃縮物は、因子ＩＸの欠損症を患 う患者の出血を抑制するのに用いる際には命綱的存在となるかなり貴重な血液産 物であることがわかっている。 市販品として入手することが可能な因子ＩＸの濃縮物（いわゆるプロトロンビ ン複合体濃縮物）は通常、他の血漿蛋白質から因子ＩＸを分離するためのイオン 交換樹脂を用いて調製する。しかしながら、この技術によっては密接に関連する 他の多数の凝血性蛋白質をも含む因子ＩＸ調製物が得られる。これらの凝血性蛋 白質には因子ＶＩＩ、因子Ｘ、因子ＩＩ、プロテインＣ、およびプロテインＳが 含まれ、これらすべてのものはビタミンＫ−依存的蛋白質の部類に属する。用語 「ビタミンＫ−依存的」は、これらの蛋白質がビタミンＫ−依存的過程における 生合成中にカルボキシル化されるグルタミン酸残基を含むという事実を意味する 。カルボキシル化はこれらの蛋白質に、Ｃａ²⁺−依存的凝血過程内におけるこれ らの蛋白質の生物学的活性に必須である独特なＣａ²⁺−結合部位 を提供する。これらののものと他のものとの構造的類似性のために（Ｂ．Ｆｕｒ ｉｅおよびＢ．Ｃ．Ｆｕｒｉｅ、Ｃｅｌｌ ｖｏｌ ５３、１９８８、ｐｐ５０ ５−５１８、を参照せよ）、ビタミンＫ−依存的蛋白質は容易に共精製される。 したがって大半の因子ＩＸ濃縮物も、因子ＶＩＩ、プロテインＣ、およびプロテ インＳのような他の凝血性蛋白質を含み、そして必然的に同一の濃縮物がこれら の蛋白質の欠損症の治療に一様に用いられてきた。しかしながら、プロテインＣ およびプロテインＳのような抗凝血性蛋白質を含む組成物での出血性疾患の治療 は実際にははなはだ好ましくなく、主要な混入物質として因子ＩＸ、因子ＶＩＩ 、もしくは他の凝血促進性構成成分を含む組成物での血栓塞栓症の治療にしても 同様である。したがって、ある特別な凝血性蛋白質の欠損症を癒すための理想的 な治療学的組成物は、未変性の立体配座をとるその単一構成成分のみからできて おり、他には溶媒を除く何物をも含まないが、時としては不活性担体を含むこと があるというものであるべきである。その結果、所望される純度を達成するのに 必要な精製手法が次第に複雑になってきている。 高度でより複雑な精製法が導入されるにつれ、標的種の所望されない蛋白質分 解という新規の問題に直面するようになった。限定的蛋白質分解は数々の生物学 的な系の調節における主要メカニズムとなっている（Ｈ．Ｎｅｕｒａｔｈおよび Ｋ．Ａ．Ｗａｌｓｈ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ｖｏｌ ７３、１９７６、ｐｐ３８２５−３８３２、を参照せよ）。このような生物学 的な系の典型的な例には、補体系、線維素溶解系、および血液凝固系がある。こ れらの生物学的カスケード系は、未変性で不活性な前駆体蛋白質の、一つもしく は複数の 特異的ペプチド結合の蛋白質分解による活性酵素もしくは補因子への遂次変換を 必要とする。一方で、これらの過程を局所的な制御の下で維持し、そして蛋白質 分解による標的蛋白質の不活性化を誘導するためのフィードバック機構が存在す る。したがって、凝固カスケードの構成成分は生物学的活性を持たない前駆体形 態で血漿中に存在する。補充療法に関しては、もはや未変性の状態ではない凝固 蛋白質の存在はやっかいなものであり、それは開裂種がインビボにおいて凝血に ついての天然の局所的制御を迂回することができるためである。天然の機構は生 理学的条件下において効果的に蛋白質分解を制御しているものの、凝血性蛋白質 がそれらの天然の源から単離される場合にはこれらの機構を維持することはもは や不可能となる。このようなプロテアーゼ−感受性配列はこれらの蛋白質の三次 構造内に露出されているため、これらは天然の制御機構を失っている非生理学的 環境内においては蛋白質分解のための接触可能な標的をたやすく提供してしまう 。したがって、精製中に部分的蛋白質分解を完全に回避することは事実上不可能 である。攻撃を受けやすいこれらの蛋白質の無制御状態での蛋白質分解はヒト血 漿もしくはその分画のような天然の源からの精製のみに限定されるばかりでなく 、同一蛋白質を、インビトロにおいて形質転換させた細胞株から、あるいはイン ビボにおいて遺伝形質転換性動物の、牛乳を初めとする生物学的液体から組換え ＤＮＡ技術により取得する場合には同一の出来事が生じる可能性がある。 治療用製品中の開裂種の存在は明らかに所望されないものであり、それは、活 性化された蛋白質の存在が凝血系のトロンボゲン形成反応を引き起こすことがあ る一方で、活性化されてない蛋白質の存在は、修正す べき反応を競合的に阻害することができる至適条件以下の生物学的活性を有する 産物を誘導してしまうためである。プロトロンビン複合体濃縮物は事実上全ての ビタミンＫ−依存的凝固因子の活性種を含み、そしてこれは１９７０年代以降血 栓塞栓合併症の発症の作因であることが立証されている（Ｇ．Ｃ．Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．、Ｂｌｏｏｄ ｖｏｌ４９、１９７７、ｐｐ１５９−１７０；Ｊ． Ｍ．Ｌｕｓｈｅｒ、Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ｖｏｌ ２８、ｓｕｐｐｌ ６、１９９１、ｐｐ３−５）。論理的には、凝固系の開始段 階に関与し、そしてそのことによりそのカスケード機構で最も増幅されるそれら の種は、特に生理学的凝血バランスを妨害する可能性が最も高いものとして考え るべきである。実際のところ、精製した活性化済み凝固因子を利用するインビボ での研究により、活性化された因子ＩＸ（Ｓ．Ｇｉｔｅｌ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒ ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ｖｏｌ ７４、１９７７、ｐｐ３ ０２８−３０３２）、および活性化された因子ＶＩＩ（Ｋ．Ｍｅｒｔｅｎｓ ｅ ｔ ａｌ．、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ ｖｏｌ ６４、１９９０ 、ｐｐ１３８−１４４）が、極端に低い用量においてさえもトロンボゲンとなる ことが同定された。この研究はインビボでの阻害に対して比較的耐性である活性 化形態についての特別な重要性を提議している可能性がある。活性化されたビタ ミンＫ−依存的凝固因子の大半のものは、血液の血漿中の多量なプロテアーゼ阻 害剤によるほとんど即時的な阻害反応に供されている。しかしながら、因子ＩＸ ａはゆっくりにのみ阻害される一方で、因子ＶＩＩａおよび活性化されたプロテ インＣは最高２時間までのインビボでの半減期を有する（Ｋ．Ｍｅｒｔｅｎｓ ｅｔ ａｌ．、Ｔｈｒｏ ｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ ｖｏｌ ６４、１９９０、ｐｐ１３８−１４４ ；Ｐ．Ｃ．Ｃｏｍｐ、Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、１９９０、ｐｐ１２９０−１３０３）。したがって患者にビ タミンＫ−依存的凝血性蛋白質を注入する際には、痕跡量の活性化形態さえもが 、生理学的制御を迂回するに十分な程長時間患者の循環系内に残存することがあ ることを明記しておくべきである。そのため、それらの蛋白質の中でもプロテイ ンＣならびに因子ＶＩＩおよびＩＸは、活性化されることを回避すべきもの、す なわちそれらの未変性チモーゲンについて選択された手法を利用して精製すべき ものである。一方で、該蛋白質の不活性化をもたらす他の開裂が生じることがあ り、これによりそれらの治療効果が低減される。例えば、因子ＩＸは酵素である トロンビンもしくはエラスターゼにより不活性化されることがあり、そしてその 開裂産物はもはや因子ＩＸａ活性を有する形態へと変換される可能性を保てなく なる（Ａ．Ｔａｋａｋｉ ｅｔ ａｌ． Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ． ｖｏ ｌ ７２、１９８３、ｐｐ１７０６−１７１５；Ｗ．Ｋｉｓｉｅｌ ｅｔ ａｌ ．、Ｂｌｏｏｄｖｏｌ ６６、１９８５、ｐｐ１３０２−１３０８）。それに類 似して、抗凝血性のプロテインＳはトロンビンにより容易に開裂を受けて、もは や抗凝血性活性を持たない産物になる（総説については、Ｍ．Ｈｅｓｓｉｎｇ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ． ｖｏｌ ２７７、１９９１、ｐｐ５８１−５９２、を参 照せよ）。したがって、これらの因子の治療用濃縮物の副作用を低減させそして 効力を改善するには、開裂を受けた未変性でない種の発生を回避することがかな り重要であることが明白である。 未変性のチモーゲン種とそれらの開裂誘導体との間の構造的な違いを より良く認識するための、これらの蛋白質の制限的蛋白質分解に関連する分子レ ベルでの出来事が現在ではより詳細に記載されている。制限的蛋白質分解が凝血 系に関与する数々のビタミンＫ−依存的蛋白質において生じるので、表Ｉは、そ のような蛋白質分解の標的配列の概要を表している。それらの配列には以下に示 すものがある。 （ａ）ヒトの因子ＶＩＩ：未変性のチモーゲンは４０６のアミノ酸からなる一 本鎖の糖蛋白質であり、これが残基１５２と１５３との間の単結合の開裂により 因子ＶＩＩａへ変換する（表Ｉを参照せよ）。この標的配列は、トロンビン、な らびに因子ＩＸａ、Ｘａ、およびＸＩＩａを初めとする数々の酵素による開裂が 可能であり、これによりジスルフィド結合により互いに結び合わされる２本のポ リペプチド鎖からなる活性種がもたらされる。この因子ＶＩＩａは、因子Ｘおよ び因子ＩＸを初めとする数々の標的物質を活性化することによりトロンボゲン形 成反応の ｐａｐｏｒｔ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ｖｏｌ ７４ ；１９７７、ｐｐ５２６０−５２６４）。 （ｂ）ヒトの因子ＩＸ：未変性のチモーゲンは４１５のアミノ酸からなる一本 鎖の糖蛋白質であり、これが２段階で因子ＸＩａもしくは因子ＶＩＩａにより因 子ＩＸａへと変換する。第一段階は残基１４５と１４６との間の開裂を必要とし 、これにより残基１−１４５からなる軽鎖と残基１４６−４１５からなる重鎖を 含む一本鎖の不活性中間体（因子ＩＸαと称される）の形成がもたらされる。第 二段階においては、因子ＩＸαの重鎖が残基１８０と１８１との間でさらに開裂 し、３５残基分（１４６−１８０）の活性化ペプチドおよび活性酵素（因子ＩＸ ａβ）がも たらされると共に残基１８１−４１５の重鎖が残存する。後述の開裂は最終的な 因子ＩＸａ活性を引き出すために必要である一方、前述の１４５−１４６結合の 開裂は因子ＸＩａもしくは因子ＶＩＩａによる因子ＩＸの活性化における必須段 階であるように思われる（Ｒ．Ｗ．Ｃｏｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．（Ｅｄｓ）、Ｈ ｅｍｏｓｔａｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ 、Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃ ｏｔｔ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、１９８７、ｐｐ２９−３８におけるＵ．Ｈ ｅｄｎｅｒおよびＥ．Ｗ．Ｄａｖｉｅ；Ｍ．Ｊ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈ ｅｔ ａｌ ．、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ． ｖｏｌ ７５、１９８５、ｐｐ４−１０） 。したがって、因子ＩＸαは、１８０−１８１の位置における開裂およびそれに 付随するトロンボゲンである因子ＩＸａ種の形成に関しては、未変性の因子ＩＸ であるチモーゲンと比較してもより攻撃を受けやすくなっている。この蛋白質分 解活性に加え、トロンビンもしくはエラスターゼによる開裂の結果として不活性 化が生じることもある。この蛋白質分解的不活性化は残基３２７と３２８との間 、および残基３３８と３３９との間の開裂を必要とし、因子ＩＸの凝血促進活性 種へは最早や変換できない誘導体がもたらされる（表Ｉを参照せよ）。 （ｃ）ヒトのプロテインＣ：未変性のチモーゲンは残基１−１５５の軽鎖およ び残基１５８−４１９の重鎖でできている４１９のアミノ酸からなる一本鎖糖蛋 白質である。このチモーゲンは残基１６９と１７０との間の重鎖中の単一開裂に より活性化される。活性化された種は強力な抗凝血性物質であり、この物質はプ ロテインＳと称するビタミンＫ−依存的補因子の存在を必要とする様式で因子Ｖ ａおよびＶＩＩＩａを不活性化する。 （ｄ）ヒトのプロテインＳ：未変性種は６３５のアミノ酸からなる一本鎖の糖 蛋白質である。この蛋白質のＮ−末端部分は残基４９−５０および７０−７１の 間に２つのトロンビン感受性結合を含む。トロンビンによるプロテンＳの開裂の 後でも、Ｎ−末端断片は依然としてジスルフィド結合を介してこの分子に結合し ている。しかしながら、トロンビン−感受性領域内で開裂されていないプロテイ ンＳのみが活性化されたプロテインＣについての補因子としての活性を示す。し たがって、先天性もしくは後天性のプロテインＳ欠損症の有効な治療のための組 成物中に、未変性でかつ未開裂のプロテインＳを提供することが好ましい。 結論として、未変性蛋白質を含む源からの未開裂な未変性種の選択を可能にす る調製方法、ならびに表Ｉにまとめてある、標的ペプチド結合での開裂により産 生される蛋白質分解性誘導体についての特別な必要性が存在する。 表Ｉ：ビタミンＫ−依存的蛋白質中の主要開裂部位およびそれらを含む合成ペプ チド¹ 1（Ｒ．Ｗ．Ｃｏｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．．（Ｅｄｓ）、Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ 、Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｐｈｉｌａ ｄｅｌｐｈｉａ、１９８７、ｐｐ２４２−２６７、におけるＥ．Ｗ．Ｄａｖｉｅ ｅｔ ａｌ．、を参照せよ） 従来の技術の記載 モノクローナル抗体技術の発達は、血漿からの微量蛋白質をほぼ均一状態にま で精製することについての可能性を急進的に変化させてきた。モノクローナル抗 体は、それらが個々の血漿蛋白質に対して完全な特異性を示すというような様式 において調製および選択することができる。血漿蛋白質に特異的なモノクローナ ル抗体を不活性マトリックス上に固定化させる場合には、このマトリックスはそ の血漿蛋白質を含む混合物から特異的にその血漿蛋白質を吸収するであろう。そ のマトリックスの洗浄後、その血漿蛋白質を、純粋もしくは実質的に純粋な形態 においてかなり緩和な条件下で溶出させることができる。この研究法により免疫 −親和性クロマトグラフィーによるヒト血漿からの純粋な因子ＩＸの単離が可能 となった［Ａ．Ｈ．Ｇｏｏｄａｌｌ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｔｉｄｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｆｌｕｉｄｓ （Ｐｅｅｔｅｒｓ、Ｅｄ．） ｖｏｌ ３０；Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、１９８２、ｐｐ ４０３−４０７；Ｋ．Ｍｅｒｔｅｎｓ ｅｔ ａｌ．、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅ ｍｏｓｔａｓｉｓ ｖｏｌ５０；１９８３、ｐ２４９；Ｋ．Ｍｅｒｔｅｎｓ、Ｐ ｈ．Ｄ． ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ（学位論文）、Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒ ｓｉｔｙ ｏｆ Ｌｅｉｄｅｎ（ライデン州立大学）、１９８５、ｐｐ８３−９ ８］。それに続いて、類似する方法の免疫−親和性クロマトグラフィ ーが他のビタミンＫ−依存的凝血性蛋白質の精製について実行可能となった。 幾つかの事例においては、抗体はＣａ²⁺−イオンの存在下においてはそれらの 標的であるビタミンＫ−依存的蛋白質に特異的に結合できるという、より限定さ れた特異性が達成されている。これらの条件下では、Ｃａ²⁺−イオンと、ビタミ ンＫ−依存的蛋白質に特有なカルボキシル化されたグルタミン酸残基との相互作 用により、その標的蛋白質は生物学的に活性な立体配座をとっている。精製法に 適用する場合、このような抗体により、因子ＩＸ（Ｈ．Ａ．Ｌｉｅｂｍａｎ ｅ ｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ｖｏｌ ８２、 １９８５、ｐｐ３８７９−３８８３；Ｋ．Ｊ．Ｓｍｉｔｈ、Ｂｌｏｏｄ ｖｏｌ ７２、１９８８、ｐｐ１２６９−１２７７）、ならびにプロテインＣ（Ｄ．Ｊ． Ｓｔｅａｒｎｓ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．ｖｏｌ ２６３、１ ９８８、ｐｐ８２６−８３２）について記載されるように、Ｃａ²⁺−結合剤であ るＥＤＴＡによる緩和な条件下での標的蛋白質の溶出が可能となる。 しかしながら、それらの高い選択性にもかかわらず、これらの方法では未変性 なものと、活性化されているもしくは分解されている凝固因子との間を識別する ことは不可能であり、そしてその結果、開裂産物は、所望される未変成で活性化 されていない標的産物と一緒に精製される。そのうえＣａ²⁺−依存的である抗体 は、Ｃａ²⁺−イオンを血漿もしくはその分画を初めとする大半の原材料に添加す る場合には必ずビタミンＫ−依存的標的蛋白質の蛋白質分解性開裂を引き起こす Ｃａ²⁺−依存的凝固系の引き金も同時に引いてしまうことになるという不利な点 を有して いる。少量の活性化凝固因子でさえも播種性静脈内凝血および血栓塞栓症の作因 としての関連性が示されていることが証明されているため、このことは最終的治 療用産物の適応性についての主要な欠点となっている。 発明の要約 本発明は、凝固因子ＩＸおよびプロテインＳを例とするもののような凝血性蛋 白質の未変性の（活性化もしくは分解用の）開裂部位を含む特定のエピトープに 特異的なＣａ²⁺−依存的単一特異的抗体（ポリクローナルもしくはモノクローナ ルのいずれか）の産生および選択のための方法、ならびに未変性で未開裂のポリ ペプチドとしてのこれらの蛋白質の単離のための方法に関する。この方法の手法 は、標的蛋白質の一次配列の破壊はその蛋白質内に数々の変化を引き起こし、そ の内の一つが開裂部位自体の露出であるという概念に基づいている。本発明は、 未変性の開裂部位を含むエピトープに対する抗体がそのエピトープの未変性形態 および開裂形態について異なる親和性を有し、そのためにクロマトグラフィー法 に応用した際の分離を可能することができるということを示している。種々の源 からの精製法に適用可能にする目的で、本発明に記載される抗体は、単離すべき 凝血因子内に存在する制限的蛋白質分解のための標的を提供する配列に特異的で あるばかりでなく、Ｃａ²⁺−依存的でもある。この方法は、適切な特異性を有す る抗体の選択、固体支持体上へのそれらの固定化、およびその後に原材料と固定 化抗体とを接触させて該蛋白質を結合させることを必要とする。適切な溶液での 洗浄および溶出の後、標的蛋白質は活性化されていない未変性の状態においてか なり精製された形態で回収されるが、これが、凝血性疾患の治療のための治療学 的組成物中において利用するための具体的な目的となる物質で ある。 本発明の方法は、未変性の未開裂標的蛋白質について特異的な選択性を達成す るという点において、免疫−親和性クロマトグラフィーの分野における主要な技 術躍進となっている。これは、後に改善された治療学的血液産物へと製剤化して 行くことができる未変性の凝血性蛋白質を取得するための方法を考慮に入れてあ る。これらの産物は、重篤な出血もしくは凝血という事態に直面した患者の治療 のためにこれまでに使用することが可能であったものと比較するとより安全でそ してより有効な試薬を提供する。 本発明の他の目的および利点は、以下に示す本発明のより詳細な記述から明ら かになるであろう。 好ましい態様の詳細な記述 本発明は、凝血性蛋白質を含む混合物からの、蛋白質分解性開裂に感受性を示 す該蛋白質の単離のための、そして該混合物を、該凝血性蛋白質の未変性種と開 裂種との間を本質的に識別するＣａ²⁺−依存的抗体を使用する免疫親和性クロマ トグラフィーに供することを含む方法を提供する。 用語「凝血性蛋白質」は本明細書中においては広範な意味において用いられ、 そして因子ＩＸおよびＶＩＩのような血液凝固因子のみを含むのではなく、凝固 回路の拮抗剤として作用する系の構成成分であるプロテインＣおよびＳのような ビタミンＫ−依存的蛋白質をも含む。さらに本発明はいずれかの哺乳類のもので あることができるいずれかの起源の凝血性蛋白質の単離を包含するが、これをヒ ト起源の凝血性蛋白質の単離に適用することが好ましい。 本発明に従って用いられる抗体はポリクローナル抗体であることができるが、 モノクローナル抗体を用いることが好ましい。この抗体はＣａ²⁺−依存的であり そして該凝血性蛋白質中の未変性な蛋白質分解性開裂部位を含む該凝血性蛋白質 のエピトープに特異的であることが好ましい。本発明はまた、そのような抗体す なわち蛋白質分解性開裂に感受性を示す凝血性蛋白質に特異的なＣａ²⁺−依存的 抗体（該抗体は該凝血性蛋白質の未変性種と開裂種との間を実質的に識別する） をも含む。 本発明の特に好ましい一連の最初の態様においては、抗体は、因子ＩＸに特異 的であり、そして因子ＩＸのアミノ酸残基１３９−１５４に相当するアミノ酸配 列ＱＴＳＫＬＴＲＡＥＴＶＦＰＤＶＤ（配列番号１）を有するオリゴペプド、あ るいは因子ＩＸのアミノ酸残基１７３−１８８に相当するアミノ酸配列ＱＳＦＮ ＤＦＴＲＶＶＧＧＥＤＡＫ（配列番号２）を有するオリゴペプチド、あるいは因 子ＩＸのアミノ酸残基３２０−３３５に相当するアミノ酸配列ＡＬＶＬＱＹＬＲ ＶＰＬＶＤＲＡＴ（配列番号３）を有するオリゴペプチド、あるいは因子ＩＸの アミノ酸残基３３５−３４２に相当するアミノ酸配列ＴＣＬＲＳＴＫＦ（配列番 号４）を有するオリゴペプチドのいずれかとの反応性を示す。 本発明の特に好ましい他の態様に従うと、抗体は因子ＶＩＩに特異的であり、 そして因子ＶＩＩのアミノ酸残基１４７−１５８に相当するアミノ酸配列ＳＫＰ ＱＧＲＩＶＧＧＫＶ（配列番号５）を有するオリゴペプチドとの反応性を示す。 本発明の特に好ましい更に別の態様に従うと、抗体はプロテインＣに特異的で あり、そしてプロテインＣのアミノ酸残基１６０−１７９に相当するアミノ酸配 列ＥＤＱＥＤＱＶＤＰＲＬＩＤＧＫＭＴＲＲＧ（配列 番号６）を有するオリゴペプチドとの反応性を示す。 本発明の特に好ましい別の一連の態様においては、抗体はプロテインＳに特異 的であり、そしてプロテインＳのアミノ酸残基４０−５９に相当するアミノ酸配 列ＦＹＰＫＹＬＶＣＬＲＳＦＱＴＧＬＦＴＡＡ（配列番号７）を有するオリゴペ プチド、あるいはプロテインＳのアミノ酸残基６２−７９に相当するアミノ酸配 列ＳＴＮＡＹＰＤＬＲＳＣＶＮＡＩＰＤＱ（配列番号８）を有する オリゴペプ チドとの反応性を示す。 本発明はまた、蛋白質分解性開裂に感受性である凝血性蛋白質に特異的な抗体 を調製するための（該抗体は該凝血性蛋白質の未変性種と開裂種との間を実質的 に識別する）、そして該凝血性蛋白質の特異的抗体を、該凝血性蛋白質特異的抗 体を誘導するために適切な方法で免疫化した動物から、もしくは該凝血性蛋白質 特異的抗体を産生する細胞培養物から単離し、そして該凝血性蛋白質の未変性種 と開裂種との間を実質的に認識する抗体を選択するために該抗体をスクリーニン グする段階を含んでなる方法をも提供する。 本発明に従うと、該スクリーニングは、該凝血性蛋白質中の未変性な蛋白質分 解性開裂部位を含む該凝血性蛋白質のエピトープのアミノ酸配列を含むオリゴペ プチドを用いて実施することが好ましい。該オリゴヌクレオチドは、ＱＴＳＫＬ ＴＲＡＥＴＶＦＰＤＶＤ（配列番号１）、ＱＳＦＮＤＦＴＲＶＶＧＧＥＤＡＫ（ 配列番号２）、ＡＬＶＬＱＹＬＲＶＰＬＶＤＲＡＴ（配列番号３）、ＴＣＬＲＳ ＴＫＦ（配列番号４）、ＳＫＰＱＧＲＩＶＧＧＫＶ（配列番号５）、ＥＤＱＥＤ ＱＶＤＰＲＬＩＤＧＫＭＴＲＲＧ（配列番号６）、ＦＹＰＫＹＬＶＣＬＲＳＦＱ ＴＧＬＦＴＡＡ（配列番号７）、およびＳＴＮＡＹＰＤＬＲＳＣＶＮＡＩＰＤ Ｑ（配列番号８）からなる群から選択されることが好ましい。本発明はこのよう なオリゴペプチドをも含む。 未変成な（活性化もしくは分解用）開裂部位（一つもしくは複数）を有する凝 固因子に特異的なモノクローナル抗体の調製法および特性決定法は、以下に示す スクリーニング法により理解することができる。 １．標的ペプチド結合から数えて、開裂配列の少なくとも一部分である残基−２ ０から＋２０まで、好ましくは残基−１０から＋１０までを含むペプチドの特定 。 ２．標準的な酵素免疫アッセイ、放射性免疫アッセイ、免疫ブロッティング、も しくは適切な技術を用いる、Ｃａ²⁺−イオンの非存在下における、もともとの抗 原（未変性蛋白質として少なくとも部分的に存在する）に結合する抗体の合成に ついてのハイブリドーマの培養上清のスクリーニング。 ３．関連する活性化および／または分解用開裂部位を含む特定されたペプチドを 用いる陽性上清の再スクリーニング。これらのペプチドは、もともとの抗体から 、もしくは組換えＤＮＡ技術を介して得られるものを初めとする他の源のいずれ かからの断片としてペプチド合成により取得することができる。特別な事例にお いては、これらのペプチドは適切な担体分子と結合させることができる。 ４．適切な細胞株の選択および増殖、ならびに適切な親和性クロマトグラフィー 法で選択した抗体の適用。 本発明はまた、蛋白質分解性開裂に感受性である凝血性蛋白質の治療学的有効 量ならびに薬剤学的に許容されるそのための担体を含んでなり、該凝血性蛋白質 がその蛋白質分解性開裂産物を実質的に含まない薬剤学 的組成物をも提供する。より具体的には、該組成物は、凝血性蛋白質を含む混合 物から該混合物を、該凝血生蛋白質の未変性種と開裂種との間を実質的に識別す る抗体を用いる免疫親和性クロマトグラフィーに供することにより取得される凝 血性蛋白質を含む。該凝血性蛋白質は、因子ＩＸ、因子ＶＩＩ、プロテインＣ、 およびプロテインＳを初めとするビタミンＫ−依存的蛋白質の部類から選択され ることが好ましい。 本発明はまた、因子ＩＸ、因子ＶＩＩ、プロテインＣ、およびプロテインＳを 初めとするビタミンＫ−依存的蛋白質の部類から選択される凝血性蛋白質をも含 み、該蛋白質は、その蛋白質分解性開裂産物を実質的に含まない。 本発明は、因子ＩＸおよびプロテインＳについて実施例においてさらに詳しく 説明されるが、当業者により理解されるであろう他の凝血性蛋白質にも同様にこ れを適用することができる。 これらの実施例は、本発明の態様を実施し、そしてこれらの態様を、未開裂の 標的配列を含む未変性蛋白種に実質的に特異的なＣａ²⁺−依存的モノクローナル 抗体の産生を達成する目的で使用するという様式の詳細を提供する。未変性種に 対する特異性とは、未変性エピトープについての親和性は開裂を受けたエピトー プについてのものとは実質的に異なることを意味する。このことは、この抗体は 開裂種と比較してより高いもしくはより低い親和性のいずれかで未変性種に結合 することを意味し、この違いによりクロマトグラフィー法におけるこれらの種の 分離が可能になる。したがってこれらの抗体は未変性の凝血性蛋白質の単離のた めの新規の手法を提供する。実施例Ｉは因子ＩＸの一次活性化開裂部位に対する モノクローナル抗体の産生および選択に適用させた際の本発明の 典型的な例であるが、一例では、この実施例Ｉにおいて与えられる記述、ならび に未変性な因子ＩＸの単離のためのそれらの抗体の適用法は、プロテインＳ、因 子ＶＩＩ、およびプロテインＣを初めとする他の凝血生蛋白質に適応することが 可能であると解釈される。当業者が当技術分野の領域内において改変を行った場 合は、これらは本発明の範囲内に含まれるものとして考慮される。別に特定され ていない限り、本明細書内において用いられる全ての技術的および科学的用語は 、本発明にふさわしい、通常の当業者により一般的に理解されるものと同一の意 味を有する。本明細書において記載されるものに類似するもしくはそれに等価な 方法および材料はいずれも本発明の実施および検査の際に使用することができる ものの、好ましい方法および材料をここに記載する。 実施例１ 未変性なヒトの因子ＩＸに特異的なＣａ²⁺−依存的モノクローナル抗体の調製お よび選択 未変性なヒトの因子ＩＸについての実質的な特異性を有するＣａ²⁺−依存的モ ノクローナル抗体の選択のために、因子ＩＸの一次活性化部位であるＱ¹³⁹−Ｄ^{1 54} を含むペプチドＮｏ．１（表Ｉを参照せよ）を標準的な方法により合成した。 選択された抗−因子ＩＸ陽性培養物の免疫化、融合、およびサブクローニングは 、抗原として常法により精製された因 Ｃ．Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ ｖｏｌ ２５６；１９７５、ｐｐ４９５ −４９７）に従って実施した。ハイブリドーマ細胞上清の一次スクリーニングは 固相酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用して実施した。この目的の ために、精製した因子ＩＸをマイクロタイタ ープレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ ＧｍｂＨ、Ｐｌｏｃｋｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａ ｎｙ）の各ウエルに、４℃において一晩、５０ｍＭのＮａＨＣＯ₃ ｐＨ９．５ 中において０．５μｇ／ｍｌの濃度でコートした。このプレートを５０ｍＭのＴ ｒｉｓ−ＨＣｌ、１５４ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％のＴ ｗｅｅｎ−２０、ｐＨ８．０で洗浄し、そしてその後Ｃａ²⁺−イオンの非存在下 において培養物上清と共にインンキュベートした。結合した抗体は、基質として テトラメチルベンジジンを用いて、パーオキシダーゼに結合させたヤギ抗−マウ ス抗体により検出した。二次スクリーニングのために、陽性を示す上清を因子Ｉ Ｘコーティングの代わりにウシのアルブミン担体（５μｇ／ｍｌ）に対して結合 させたペプチドＮｏ．１を用いることを除いては同一のＥＬＩＳＡ法を用いて再 スクリーニングを行った。２つの陽性細胞株（ＣＬＢ−ＦＩＸ Ｄ４およびＣＬ Ｂ−ＦＩＸ ９と表示される）が取得され、これらは因子ＩＸと、一次活性化部 位を含む合成ペプチドＮｏ．１との両方と反応性を示した。産生された免疫グロ ブリンを、常法を用いるイオン交換クロマトグラフィーおよびゲル濾過により精 製した。 モノクローナル抗体ＣＬＢ−ＦＩＸ Ｄ４およびＣＬＢ−ＦＩＸ ９のサブタ イプ決定を行い、そしてマウスＭＡｂイソタイプ決定用キット（Ｈｏｌｌａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｌｅｉｄｅｎ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄ ｓ）を用いてこれらがカッパー軽鎖を有するＩｇＧ１サブクラスに属することを 同定した。これら２つのモノクローナル抗体については、先に記載したＥＬＩＳ Ａ技術を利用して、未変性の因子ＩＸならびに開裂種である因子ＩＸαおよび因 子ＩＸａβに関するそれらの親和性についてのさらに詳しい特徴決定を行った（ Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｖｏｌ １３１、１９９ ０、ｐｐ２１３−２２２）。両方の抗体について、抗体と未変性な因子ＩＸとの 間の複合体についての解離係数は１．２ｎＭであることが解り、一方で因子ＩＸ ａβについての親和性は無視できるほどの量（１０μＭを上回る解離係数）であ るものと思われた。ＣＬＢ−ＦＩＸ Ｄ４およびＣＬＢ−ＦＩＸ ９の両抗体は 、未変性種と比較して実質的により高い親和性で開裂種のＩＸαに結合した（各 々０．３および０．６ｎＭの解離係数）。これらの所見により、これらの抗体の エピトープ内における開裂によって少なくとも２倍もしくは４倍の変化がそれら の親和性にもたらされることが示された。モノクローナル抗体ＣＬＢ−ＦＩＸ Ｄ４を、因子ＩＸの凝固活性におけるその効果についてさらに詳しく調査した。 固定量の因子ＩＸ（１μｇ）を、３７℃において３０分間、異なる量の抗体ＣＬ Ｂ−ＦＩＸ Ｄ４（０−５０μｇ）と共にインキュベートした。次に残存活性を 一段階式凝固アッセイにおいて測定した（Ｊ．Ｊ．Ｖｅｌｔｋａｍｐ ｅｔ ａ ｌ．、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｄｉａｔｈ．Ｈａｅｍｏｒｒｈ．ｖｏｌ １９；１９６８ 、ｐｐ２７９−２０３）。１０倍モル過剰の抗体の存在下においては、因子ＩＸ 活性はその９０％を上回るものが阻害され、したがって抗体ＣＬＢ−ＦＩＸ Ｄ ４のエピトープ内における開裂は因子ＩＸ活性化における律速段階であることが 証明された。免疫吸着体は、精製したＣＬＢ−ＦＩＸ Ｄ４およびＣＬＢ−ＦＩ Ｘ ９のＩｇＧを標準的な方法に従ってＣＮＢｒで活性化させたセファロース（ ５ｍｇ／ｍｌのセファロース；Ｐｈａｒｍａｃｉａ社、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅ ｄｅｎ）に結合させることにより調製した。この免疫吸着体を以下に記載される 親和性クロマトグラフィーにおける利 用のためにカラム内に詰め、そして２０ｍＭのクエン酸三ナトリウム、１５４ｍ ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのベンズアミド−ＨＣｌ、ｐＨ７．４からなる緩衝液で 平衡化させた。 実施例２ プロトロンビン複合体濃縮物からの未変性の因子ＩＸの精製 通常の技術（Ｊ．Ｈｅｙｓｔｅｋ ｅｔ ａｌ．、Ｖｏｘ Ｓａｎｇ．ｖｏｌ ２５；１９７３、ｐｐ１１３−１２３）により原材料として調製されたプロト ロンビン複合体濃縮物からの未変性な因子ＩＸの単離のための免疫吸着体として 利用するために、固定化したＣＬＢ−ＦＩＸＤ４のＩｇＧの評定を行った。３５ ０ｍｌのプロトロンビン複合体濃縮物に対して、０．１Ｍのクエン酸三ナトリウ ム、０．７７ＭのＮａＣｌ、および０．０５Ｍのベンズアミジン−ＨＣｌ、ｐＨ ７．４、を含む９０ｍｌの緩衝液を添加した。この混合物を、２０ｍＭのクエン 酸三ナトリウム、１５４ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのベンズアミジン−ＨＣｌ、 ｐＨ７．４、中で平衡化させた２０ｍｌのＣＬＢ−ＦＩＸ Ｄ４−Ｓｅｐｈａｒ ｏｓｅを含むカラムにかけた（直系２．５ｃｍ、流速２５ｃｍ／時間）。次に全 ての未結合蛋白質が除去されるまでこのカラムを同一の緩衝液で洗浄した。この 時点において緩衝液を溶出用緩衝液（平衡化用緩衝液中の２ＭのＫＳＣＮ）に替 えた。各分画を回収し、そして確立されている方法により蛋白質および因子ＩＸ の凝血活性についてのアッセイを行った（Ｍ．Ｍ．Ｂｒａｄｆｏｒｄ、Ａｎａｌ ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． ｖｏｌ．７２；１９７６、ｐｐ２４８−２５４；Ｊ．Ｊ．Ｖ ｅｌｔｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｄｉａｔｈ．Ｈａｅｍｏｒｒｈ ． ｖｏｌ １９；１９６８、ｐｐ２７９−２０３）。この溶出液中には因 子ＩＸの活性の内の６７％が回収され、比活性は３５６Ｕ／ｍｇであった。分光 光度法（Ｋ．Ｍｅｒｔｅｎｓ ｅｔ ａｌ．、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔａ ｓｉｓ ｖｏｌ ５４；１９８５、ｐｐ６５４−６６０）を利用してアッセイし たところ、この溶出液には検出可能な因子ＩＸａ活性は含まれていなかった（す なわち、＜５ｐＭ）。そのうえ、標準的な方法を用いて因子ＩＩ、因子Ｘ、およ び痕跡量のマウスＩｇＧの存在について活性化されていない因子ＩＸの産物を調 査した。この結果により、この産物中では存在可能性なこれらの混入物の残存量 は極めて低いことが示された（表ＩＩを参照せよ）。 同一の手法を抗体ＣＬＢ−ＦＩＸ Ｄ４について先に記載したものと同一の条 件下において固定化させた抗体ＣＬＢ−ＦＩＸ ９を用いることにより実施した ところ、類似する結果が得られた。ＫＳＣＮに加えて、ＬｉＣｌおよびＮａＮＯ₃ のような他のカオトロピック塩も、純粋で未変性な因子ＩＸを効率よく回収す るための溶出用緩衝液中に用いることができた。 これらの結果は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｋ．Ｗｅｂｅｒ およびＭ．Ｏｓｂｏｒｎ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ｖｏｌ２４４；１９６９ 、ｐｐ４４０６−４４１２）、ならびに因子ＩＩ、ＩＸ、Ｘ、プロテインＣ、お よびプロテインＳに対する適切な抗体を利用するウエスタンブロット分析（Ｈ． Ｔｏｗｂｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ｖｏｌ ７６；１９７９、ｐｐ ４３５０−４３５５）により証明された。素 通り分画の分析により、大量のビタミンＫ−依存的蛋白質、因子１１、Ｘ、プロ テインＣおよびＳの存在が示された。因子ＩＸに対するポリクローナル抗体を 用いることにより、因子ＩＸの活性化産物を示す多量の二本鎖種を、見かけ上未 結合である一本鎖種の幾つかのものと同様に可視化させることができた。それと は対照的に、溶出分画は活性化されていない未変性の因子ＩＸ種を独占的に含ん でいた。混入物質は全く検出されなかったため、表ＩＩにおいて示される分析が 定量的に行われたことが実証された。したがって抗体ＣＬＢ−ＦＩＸ Ｄ４もし くはＣＬＢ−ＦＩＸ ９を利用する親和性クロマトグラフィーにより、プロトロ ンビン複合体濃縮物からの活性化されていない因子ＩＸの特異的な単離のための 有効な方法が提供される。 表ＩＩ：プロトロンビン複合体濃縮物（ＰＣＣ）からの未変性な因子 ＩＸの精製 実施例３ 部分的に開裂させた因子ＩＸ種の混合物からの未変性な因子ＩＸの選択的精製法 抗体ＣＬＶ−ＦＩＸ Ｄ４を利用する親和性クロマトグラフィーにより他の凝 血性蛋白質からの見かけ上活性化されていない因子ＩＸの特異的な分離が可能と なるため（実施例１を参照せよ）、因子ＩＸの多様な開裂産物についての選択性 を、特に因子ＩＸａβおよびその蛋白質分解 −感受性前駆体である因子ＩＸαに関してより詳細に評定した。 ＣＬＢ−ＦＩＸ Ｄ４−親和性クロマトグラフィーに供するための３つの混合 物を調製したが、各混合物は、以下に示す一つの特異的な因子ＩＸの活性化産物 をかなりの割合で含んでいた。 （１）因子ＩＸａβ：実施例Ｉの方法により取得された精製済み因子ＩＸを、 精製されたヒトの因子ＩＸａと共にインキュベートすることにより活性化させた 。後者はセライトにより活性化させたヒト血漿（Ｄ．Ｌ．Ｔａｎｋｅｒｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ．、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．ｖｏｌ ２５；１９８２、ｐｐ３０７ −３１７）から、ヒトの因子ＸＩ［Ｊ．Ｃ．Ｍ．Ｍｅｉｊｅｒｓ、Ｐｈ．Ｄ．ｄ ｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ（学位論文）、Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏ ｆ Ｕｔｒｅｃｈｔ （ユトレヒト州立大学）、１９８８、ｐｐ９３−１０８］ に対するモノクローナル抗体を用いる免疫−親和性クロマトグラフィーにより調 製した。因子ＩＸ（２４５μｇ／ｍｌ）は、ＣａＣｌ₂（２ｍＭ）を含む５０ｍ ＭのＴｒｉｓ、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４、中で、因子ＩＸａ（１６μ ｇ／ｍｌ）と共にインキュベートした。３７℃における２時間のインキュベーシ ョンの後、この反応をＥＤＴＡ（最終濃度１０ｍＭ）の添加により終結させ、そ してこの混合物を以下に記載するＣＬＢ−ＦＩＸ Ｄ４−クロマトグラフィーに 供した。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびウエスタンブロット分 析により判定したところ、この段階においては約９０％の因子ＩＸが因子ＩＸａ βに変換されていた。 （２）因子ＩＸα：因子ＩＸαの調製のために、因子ＩＸを、ＣａＣｌ₂をイ ンキュベーションの間ＭｎＣｌ₂（６．８ｍＭ）に代えること を除いては因子ＩＸａβについて先に記載したものと同一の条件下において因子 ＸＩａと共にインキュベートした。これらの条件下においては因子ＩＸαが主要 な開裂産物として蓄積することが見いだされた一方で、実質的な因子ＩＸａの形 成は全く検出されなかった。３７℃における２時間のインキュベーションの後、 ＥＤＴＡを１０ｍＭの最終濃度になるように添加し、そしてこの混合物をＣＬＶ −ＦＩＸ Ｄ４−クロマトグラフィーに供した。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ ル電気泳動およびウエスタンブロット分析により、約７０％の蛋白質が１４５− １４６の位置における単一開裂により２本鎖の因子ＩＸαに変換していたことが 示された（表Ｉを参照せよ）。 （３）因子ＩＸ：対照として、同量の精製済み因子ＩＸを、ＣＬＢ−ＦＩＸ Ｄ４−クロマトグラフィーに供する前に因子ＩＸａの非存在下においてインキュ ベートした。 次にこれらの混合物（２．４ｍｌ）を抗−因子ＩＸ ＣＬＢ−ＦＩＸ Ｄ４ ＩｇＧカラム（容積３ｍｌ；直系１ｃｍ、流速１０ｍｌ／時間）にかけた。この カラムを、実施例Ｉにおいて記載されるように洗浄および溶出させた。素通り分 画および溶出分画における蛋白質含有量ならびに因子ＩＸおよび因子ＩＸａの活 性を、実施例Ｉにおけるものと同一の方法を使用して決定した。表ＩＩＩはこれ らの実験をまとめてあり、そして因子ＩＸａβは抗−因子ＩＸモノクローナル抗 体カラムに結合しない一方で、残りの活性化されていない未変性の因子ＩＸは溶 出液中に回収されたことが示されている。中間体開裂産物である因子ＩＸαは親 和性カラムから溶出されなかったという所見により、因子ＩＸと、残基１４５− １４６の間の一次活性化部位において開裂される種との間を実質 的に識別するモノクローナル抗体を、未変性の因子ＩＸを特異的に単離するため のクロマトグラフィーによる方法において利用することができるという概念が支 持される。 本文において示される証拠により、本明細書において利用される全ての基準に よっても、本質的に他の血漿蛋白質を含まず、また同時に完全に未変性の状態で もあり、そして活性化された種もしくは活性化中間体を含まない因子ＩＸの単離 のための、未変性開裂部位を含むエピトープに特異的なＣａ²⁺−依存的モノクロ ーナル抗体の利用が初めて示される。この因子ＩＸ産物はトロンボゲン形成性混 入物質を全く含まないため、この産物により、血友病Ｂに苦しむ患者の補充療法 において利用するためにこれまでに知られていた因子ＩＸの調製物に関する重要 な改善法が提供される。 表ＩＩＩ：開裂を受けた因子ＩＸ種を含む混合物からの未変性な因子ＩＸの選択 的精製法 −因子ＩＸａβ⁽¹⁾および因子ＩＸα⁽²⁾の存在のために未変性な因子ＩＸは測定 不可能である。⁽³⁾ ２ＭのＫＳＣＮ含有性緩衝液中に溶出される蛋白質を意味する数；因子ＩＸ αを示す溶出されない蛋白質は次に３ＭのＫＳＣＮを含む同一 の緩衝液中に溶出させることができた。 実施例４ 未変性なヒトのプロテインＳに特異的なモノクローナル抗体の調製および選択 未変性のヒトのプロテインＳを特異的に識別するＣａ²⁺−依存的モノクローナ ル抗体の選択のために、プロテインＳの一次開裂部位Ｆ⁴⁰−Ａ⁵⁹を含むペプチド Ｎｏ．７（表Ｉを参照せよ）を、標準的な方法により合成した。選択されてきた 抗−プロテインＳ陽性培養物の免疫化、融合、およびサブクローニングは、抗原 として常法により精製されたプロ １９８３、ｐｐ８３７−８４６）を利用して実施した。抗−プロテインＳモノク ローナル抗体産生性細胞株の一次スクリーニングは、主に実施例１において記載 されるように、Ｃａ²⁺−イオンの非存在下において抗−プロテインＳ特異的ＥＬ ＩＳＡ系を使用して実施した。二次スクリーニングのためには、陽性を示す上清 を、プロテインＳコーティングの代わりにペプチドＮｏ．７を用いる以外は同一 のＥＬＩＳＡ法を使用して再スクリーニングした。プロテインＳと、開裂部位Ｆ⁴⁰ −Ａ⁵⁹を含む合成ペプチドＮｏ．７との両方についての反応性を示す２つの陽 性細胞株（ＣＬＢ−ＰＳ ４１およびＣＬＢ−ＰＳ ５２と表示される）を取得 した。 これらのモノクローナル抗体については、開裂を受けたプロテインＳ種の混合 物内の未変性なプロテインＳについてのそれらの選択性に関するさらに詳しい特 徴決定を行った。この目的のために、精製したプロテインＳは、プロテインＳ（ １４０μｇ／ｍｌ）を５０ｍＭのＴｒｉｓ、 １５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４中においてトロンビン（０．７５μｇ／ｍｌ ）と共にインキュベートすることによりその開裂形態へと変換させた。ＳＤＳ− ポリアクリルアミドゲル電気泳動により判定したところ、３７℃における１時間 のインキュベーションの間にプロテインＳはその２本鎖の誘導体へと変換されて いた。しかしながら、最初の固定化抗体として抗体ＣＬＢ−ＰＳ ４１もしくは ＣＬＢ−ＰＳ ５２を利用するＥＬＩＳＡ分析（実施例１を参照せよ）により、 観察される蛋白質分解の程度に比例してプロテインＳの識別作用が失われてゆく ことが明らかにされた。これらの所見により、これらの抗体のエピトープ内にお ける開裂によりプロテイインＳについてのそれらの親和性の実質的な変化がもた らされることが示される。開裂を受けたプロテインＳ種に対して抗体ＣＬＢ−Ｐ Ｓ ４１およびＣＬＢ−ＰＳ ５２の結合が生じないということは、それらのエ ピトープがペプチドＮｏ．７により示される一次開裂部位Ｆ⁴⁰−Ａ⁵⁹に存在する ということに何ら矛盾するところがない。産生される免疫グロブリンを精製し、 そして免疫吸着体は、実施例１において記載されるように５ｍｇの精製済みＣＬ Ｂ−ＰＳ ４１およびＣＬＢ−ＰＳ ５２のＩｇＧを０．３ｇのＣＮＢｒで活性 化させたセファロースに結合させることにより調製した。この免疫吸着体をカラ ム内に詰め、そして以下に記載する親和性クロマトグラフィーにおいて使用する ための、２０ｍＭのクエン酸三ナトリウム、１５４ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭの ベンズアミジン−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、からなる緩衝液で平衡化させた。 実施例５ ヒト血漿からの未変性なプロテインＳの精製 クエン酸処理済みのヒト血漿（１００ｍｌ）を抗−プロテインＳ ＣＬＢ−Ｐ Ｓ ５２ ＩｇＧカラム（カラム容積３ｍｌ；直系１ｃｍ；流速１０ｍｌ／時間 ）にかけた。全ての未結合蛋白質が除去されるまでこのカラムを平衡化用緩衝液 で洗浄した。この時点において緩衝液を解離用緩衝液（平衡化用緩衝液中の３Ｍ のＫＳＣＮ）に替えた。蛋白質含有量、ＳＤＳ−アクリルアミドゲル電気泳動お よびウエスタンブロット分析による組成決定、ならびに活性化させたプロテイン ＣについてのプロテインＳ補因子（Ｐ．Ｃ．ＣｏｍｐおよびＣ．Ｔ．Ｅｓｍｏｎ 、 ＮｅｗＥｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ． ｖｏｌ ３１１、１９８４、ｐｐ１５２５ −１５２８）の分析のために各分画を回収した。溶出により、血漿中においては プロテインＳとの複合体の状態で存在していることが知られている（Ｂ．Ｄａｈ ｌｂａｃｋおよびＪ． Ｓｔｅｎｆｌｏ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ ｖｏｌ ７８、１９８１、ｐｐ．２５１２−２５１６） Ｃ４ｂ− 結合性蛋白質と称する構成成分として同定できる高分子量種を生じた。しかしな がら、未変性なプロテインＳはこれらの分画中には全く検出されず、このことに より未変性なプロテインＳはＣＬＢ−ＰＳ ５２モノクローナル抗体カラムに結 合したままになっていることが示された。緩衝液を平衡化用緩衝液に戻し、そし て次にプロテインＳを同一緩衝液中の６Ｍグアミジン−ＨＣｌを使用して溶出さ せた。プロテインＳについてのアッセイにより、溶出されたプロテインＳ産物は 完全な生物学的活性を示すことが証明された。還元条件もしくは非還元条件下に おける電気泳動およびウエスタンブロット分析により、この最終産物は検出可能 なＣ４ｂ−結合性蛋白質もしくは他の混入物質をいずれも含まず、そして全て一 本鎖で未変性なプロテインＳか らできていることが明らかにされた。 本文において提供される証拠により、未変性のプロテインＳと、残基４９−５ ０の間の一次トロンビン開裂活性化部位で開裂を受ける種との間を実質的に識別 するモノクローナル抗体により、完全に未開裂な未変性の状態においてプロテイ ンＳを単離することが可能になったことが初めて示される。免疫親和性クロマト グラフィー法に適用させると開裂を受けた不活性化種をいずれも含まないプロテ インＳ産物が取得され、そしてこのこと自体が当該技術分野においてこれまでに 知られているプロテインＳの調製法に関する主要な改善法を提供する。このこと により、先天性もしくは後天性プロテインＳ欠損症に起因する血栓症に苦しむ患 者の効率の良い治療が可能になるはずである。 本明細書中に記載される実施例および態様は説明を目的とするのみのものであ り、そしてそれらの観点における種々の変法もしくは改変が当業者に思い浮かぶ であろうが、それらは本出願の精神および領域ならびに添付される特許請求の範 囲の範囲内に含まれるものである。 配 列 表 配列番号：１ 配列の長さ：１６ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 配列番号：２ 配列の長さ：１６ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 卜ポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 配列番号：３ 配列の長さ：１６ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 卜ポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 配列番号：４ 配列の長さ：８ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 配列番号：５ 配列の長さ：１２ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 配列番号：６ 配列の長さ：２０ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 配列番号：７ 配列の長さ：２０ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 配列番号：８ 配列の長さ：１８ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 7/06 14/00 16/36 Ｃ１２Ｎ 15/02 Ｃ１２Ｐ 21/08 9358−4Ｂ // Ａ６１Ｋ 39/395 Ｄ 9284−4Ｃ Ｇ０１Ｎ 30/48 Ｒ 7363−2Ｊ 30/88 Ｊ 7363−2Ｊ 33/53 Ｌ 8310−2Ｊ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．蛋白質分解性開裂に感受性である凝血性蛋白質を該蛋白質を含む混合物から 単離するための方法であって、該混合物を、該凝血性蛋白質の未変性種と開裂種 との間を実質的に識別するＣａ²⁺−依存的抗体を使用する免疫親和性クロマトグ ラフィーに供することを含む方法。 ２．該抗体が、該凝血性蛋白質中の未変性な蛋白質分解性開裂部位を含む該凝血 性蛋白質のエピトープに特異的である、請求の範囲１に記載の方法。 ３．該凝血性蛋白質が、因子ＩＸ、因子ＶＩＩ、プロテインＣ、およびプロテイ ンＳを包含するビタミンＫ−依存的蛋白質の部類から選択される、請求の範囲１ に記載の方法。 ４．該抗体が因子ＩＸに特異的であり、そして因子ＩＸのアミノ酸残基１３９− １５４に相当するアミノ酸配列ＱＴＳＫＬＴＲＡＥＴＶＦＰＤＶＤ（配列番号１ ）を有するオリゴペプチドとの反応性を示す、請求の範囲１に記載の方法。 ５．該抗体が因子ＩＸに特異的であり、そして因子ＩＸのアミノ酸残基１７３− １８８に相当するアミノ酸配列ＱＳＦＮＤＦＴＲＶＶＧＧＥＤＡＫ（配列番号２ ）を有するオリゴペプチドとの反応性を示す、請求の範囲１に記載の方法。 ６．該抗体が因子ＩＸに特異的であり、そして因子ＩＸのアミノ酸残基３２０− ３３５に相当するアミノ酸配列ＡＬＶＬＱＹＬＲＶＰＬＶＤＲＡＴ（配列番号３ ）を有するオリゴペプチドとの反応性を示す、請求の範囲１に記載の方法。 ７．該抗体が因子ＩＸに特異的であり、そして因子ＩＸのアミノ酸残基３３５− ３４２に相当するアミノ酸配列ＴＣＬＲＳＴＫＦ（配列番号４）を有するオリゴ ペプチドとの反応性を示す、請求の範囲１に記載の方法。 ８．該抗体が因子ＶＩＩに特異的であり、そして因子ＶＩＩのアミノ酸残基１４ ７−１５８に相当するアミノ酸配列ＳＫＰＱＧＲＩＶＧＧＫＶ（配列番号５）を 有するオリゴペプチドとの反応性を示す、請求の範囲１に記載の方法。 ９．該抗体がプロテインＣに特異的であり、そしてプロテインＣのアミノ酸残基 １６０−１７９に相当するアミノ酸配列ＥＤＱＥＤＱＶＤＰＲＬＩＤＧＫＭＴＲ ＲＧ（配列番号６）を有するオリゴペプチドとの反応性を示す、請求の範囲１に 記載の方法。 １０．該抗体がプロテインＳに特異的であり、そしてプロテインＳのアミノ酸残 基４０−５９に相当するアミノ酸配列ＦＹＰＫＹＬＶＣＬＲＳＦＱＴＧＬＦＴＡ Ａ（配列番号７）を有するオリゴペプチドとの反応性を示す、請求の範囲１に記 載の方法。 １１．該抗体がプロテインＳに特異的であり、そしてプロテインＳのアミノ酸残 基６２−７９に相当するアミノ酸配列ＳＴＮＡＹＰＤＬＲＳＣＶＮＡＩＰＤＱ（ 配列番号８）を有するオリゴペプチドとの反応性を示す、請求の範囲１に記載の 方法。 １２．蛋白質分解性開裂に感受性である凝血性蛋白質に特異的な抗体であって、 該凝血性蛋白質の未変性種と開裂種との間を実質的に識別するＣａ²⁺−依存的抗 体である抗体。 １３．該抗体が、該凝血性蛋白質の未変性な蛋白質分解性開裂部位を含 む該凝血性蛋白質のエピトープに特異的な、請求の範囲１２に記載の抗体。 １４．該凝血性蛋白質が、因子ＩＸ、因子ＶＩＩ、プロテインＣ、およびプロテ インＳを初めとするビタミンＫ−依存的蛋白質の部類から選択される、請求の範 囲１２に記載の抗体。 １５．該抗体が因子ＩＸに特異的であり、そして因子ＩＸのアミノ酸残基１３９ −１５４に相当するアミノ酸配列ＱＴＳＫＬＴＲＡＥＴＶＦＰＤＶＤ（配列番号 １）を有するオリゴペプチドとの反応性を示す、請求の範囲１２に記載の抗体。 １６．該抗体が因子ＩＸに特異的であり、そして因子ＩＸのアミノ酸残基１７３ −１８８に相当するアミノ酸配列ＱＳＦＮＤＦＴＲＶＶＧＧＥＤＡＫ（配列番号 ２）を有するオリゴペプチドとの反応性を示す、請求の範囲１２に記載の抗体。 １７．該抗体が因子ＩＸに特異的であり、そして因子ＩＸのアミノ酸残基３２０ −３３５に相当するアミノ酸配列ＡＬＶＬＱＹＬＲＶＰＬＶＤＲＡＴ（配列番号 ３）を有するオリゴペプチドとの反応性を示す、請求の範囲１２に記載の抗体。 １８．該抗体が因子ＩＸに特異的であり、そして因子ＩＸのアミノ酸残基３３５ −３４２に相当するアミノ酸配列ＴＣＬＲＳＴＫＦ（配列番号４）を有するオリ ゴペプチドとの反応性を示す、請求の範囲１２に記載の抗体。 １９．該抗体が因子ＶＩＩに特異的であり、そして因子ＶＩＩのアミノ酸残基１ ４７−１５８に相当するアミノ酸配列ＳＫＰＱＧＲＩＶＧＧＫＶ（配列番号５） を有するオリゴペプチドとの反応性を示す、請求の範 囲１２に記載の抗体。 ２０．該抗体がプロテインＣに特異的であり、そしてプロテインＣのアミノ酸残 基１６０−１７９に相当するアミノ酸配列ＥＤＱＥＤＱＶＤＰＲＬＩＤＧＫＭＴ ＲＲＧ（配列番号６）を有するオリゴペプチドとの反応性を示す、請求の範囲１ ２に記載の抗体。 ２１．該抗体がプロテインＳに特異的であり、そしてプロテインＳのアミノ酸残 基４０−５９に相当するアミノ酸配列ＦＹＰＫＹＬＶＣＬＲＳＦＱＴＧＬＦＴＡ Ａ（配列番号７）を有するオリゴペプチドとの反応性を示す、請求の範囲１２に 記載の抗体。 ２２．該抗体がプロテインＳに特異的であり、そしてプロテインＳのアミノ酸残 基６２−７９に相当するアミノ酸配列ＳＴＮＡＹＰＤＬＲＳＣＶＮＡＩＰＤＱ（ 配列番号８）を有するオリゴペプチドとの反応性を示す、請求の範囲１２に記載 の抗体。 ２３．蛋白質分解性開裂に感受性である凝血性蛋白質に特異的な抗体の調製方法 であって、該抗体が該凝血性蛋白質の未変性種と開裂種との間を認識するＣａ²⁺ −依存的抗体であり、そして該凝血性蛋白質特異的抗体を誘導させるための適切 な方法により免疫化した動物からあるいは該凝血性蛋白質特異的抗体を産生する 細胞培養物から該凝血性蛋白質に特異的な抗体を単離し、そして該凝血性蛋白質 の未変性種と開裂種との間を実質的に識別する抗体を選択するために該抗体類を スクリーニングする段階を含む方法。 ２４．該凝血性蛋白質中の未変性な蛋白質分解性開裂部位を含む該凝血性蛋白質 のエピトープのアミノ酸配列を含むオリゴペプチドを用いて該スクリーニングを 実施する、請求の範囲２３に記載の方法。 ２５．該スクリーニングを、ＱＴＳＫＬＴＲＡＥＴＶＦＰＤＶＤ（配列番号１） 、ＱＳＦＮＤＦＴＲＶＶＧＧＥＤＡＫ（配列番号２）、ＡＬＶＬＱＹＬＲＶＰＬ ＶＤＲＡＴ（配列番号３）、ＴＣＬＲＳＴＫＦ（配列番号４）、ＳＫＰＱＧＲＩ ＶＧＧＫＶ（配列番号５）、ＥＤＱＥＤＱＶＤＰＲＬＩＤＧＫＭＴＲＲＧ（配列 番号６）、ＦＹＰＫＹＬＶＣＬＲＳＦＱＴＧＬＦＴＡＡ（配列番号７）、および ＳＴＮＡＹＰＤＬＲＳＣＶＮＡＩＰＤＱ（配列番号８）からなる群より選択され るオリゴペプチドを用いて実施する、請求の範囲２３に記載の方法。 ２６．ＱＴＳＫＬＴＲＡＥＴＶＦＰＤＶＤ（配列番号１）、ＱＳＦＮＤＦＴＲＶ ＶＧＧＥＤＡＫ（配列番号２）、ＡＬＶＬＱＹＬＲＶＰＬＶＤＲＡＴ（配列番号 ３）、ＴＣＬＲＳＴＫＦ（配列番号４）、ＳＫＰＱＧＲＩＶＧＧＫＶ（配列番号 ５）、ＥＤＱＥＤＱＶＤＰＲＬＩＤＧＫＭＴＲＲＧ（配列番号６）、ＦＹＰＫＹ ＬＶＣＬＲＳＦＱＴＧＬＦＴＡＡ（配列番号７）、およびＳＴＮＡＹＰＤＬＲＳ ＣＶＮＡＩＰＤＱ（配列番号８）からなる群より選択されるオリゴペプチド。 ２７．因子ＩＸ、因子ＶＩＩ、プロテインＣ、およびプロテインＳを包含するビ タミンＫ−依存的蛋白質の部類から選択される凝血性蛋白質であって、その蛋白 質分解性開裂産物を実質的に含まない蛋白質。 ２８．蛋白質分解性開裂に感受性である凝血性蛋白質の治療的有効量ならびにそ の薬剤学的に許容される担体を含む医薬組成物であって、該凝血性蛋白質がその 蛋白質分解性開裂産物を実質的に含まない医薬組成物。 ２９．該凝血性蛋白質が、それを含む混合物から、該凝血性蛋白質の未変性種と 開裂種との間を実質的に識別するＣａ²⁺−依存的抗体を使用する免疫親和性クロ マトグラフィーに該混合物を供することにより得られ た請求の範囲２８に記載の医薬組成物。 ３０．該凝血性蛋白質が、因子ＩＸ、因子ＶＩＩ、プロテインＣ、およびプロテ インＳを包含するビタミンＫ−依存的蛋白質の部類から選択される、請求の範囲 ２８に記載の医薬組成物。