JPH08501215A - 抗生物質ｇｅ２２７０因子ａの生産を選択的に増加させる方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 プラノビスポラ・ロセア ＡＴＣＣ ５３７７３又はその抗生物質ＧＥ２２７０生産性突然変異株又は変異株の発酵培地に、ビタミンＢ₁₂又はビタミンＢ₁₂と同様な活性を有するビタミンＢ₁₂の類似体を添加することから成る、ＧＥ２２７０の因子Ａの選択的生産及び全抗生物質収率を増加させる方法。

Description

【発明の詳細な説明】 抗生物質ＧＥ２２７０因子Ａの生産を選択的に増加させる方法 抗生物質ＧＥ２２７０は、プラノビスポラ・ロセア（Ｐｌａｎｏｂｉｓｐｏｒ ａ ｒｏｓｅａ） ＡＴＣＣ５３７７３の培養物から単離されたチアゾリルペプ チド物質である。 グラム陽性菌及びいくらかのグラム陰性菌に対して主として活性であるこの物 質は、それを得る方法及び対応する製薬学的組成物と共にヨーロッパ特許公開第 ３５９０６２号に述べられている。 抗生物質ＧＥ２２７０は、既に単離されそして特徴付けされている密接に関連 した成分Ａ、Ｂ１、Ｂ２、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ２ａ、Ｄ１、Ｄ２、Ｅ及びＴの複合物 （ｃｏｍｐｌｅｘ）として微生物により生産される。 主要な量で得られる成分でありそして生物学的活性に最も関係のある成分であ る因子Ａ（Ｆａｃｔｏｒ Ａ）は、その単離及び使用と共に前記のヨーロッパ特 許出願第３５９０６２号に記載されている（Ｅ．Ｓｅｌｖａ ｅｔ ａｌ．，“ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ＧＥ２２７０ Ａ：Ａ Ｎｏｖｅｌ Ｉｎｈｉｂｉｔｏ ｒ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｉ．Ｉ ｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ”．Ｔｈｅ Ｊ ｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．４４ Ｎｏ．７，６９ ３ − ７０１，１９９１； Ｊ．Ｋｅｔｔｅｎｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ，“Ａｎ ｔｉｂｉｏｔｉｃ ＧＥ２２７０ Ａ：Ａ Ｎｏｖｅｌ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｉ Ｉ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｅｌｕｃｉｄａｔｉｏｎ”．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．４４ Ｎｏ．７，７０２−７１５， １９９１）参照）。 因子Ａは、抗生物質ＧＥ２２７０因子Ａ１、Ａ２、Ａ３（加水分解による）及 びＨ（還元剤、例えばＮａＢＨ₄による処理による）の製造のための出発物質と して利用される。 因子Ｂ１、Ｂ２、Ｃ１、Ｃ２、Ｄ１、Ｄ２、Ｅ及びＴ並びにそれらの単離方法 及びそれらの使用はヨーロッパ特許出願公開第４５１４８６号に記載されている 。因子Ｃ２ａ及びその単離方法はヨーロッパ特許出願公開第５２９４１０号（米 国特許出願第０７／９３１０８４号に相当する）に記載されている。 ＧＥ２２７０因子Ａからの抗生物質ＧＥ２２７０因子Ａ１、Ａ２、Ａ３及びＥ の製造は、ヨーロッパ特許出願公開第４０６７４５号に記載されている。Ｅ．Ｓ ｅｌｖａ ｅｔ ａｌ．， “Ｎａｔｕｒａｌ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ Ｒｅ ｌａｔｅｄ ｔｏ ＧＥ２２７０ Ａ．： Ｉ ｓｏｌａｔｉｏｎ，Ｓｔｒｕｃ ｔｕｒｅ Ｅｌｕｃｉｄａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈａｒ ａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ”，３１ｓｔ ＩＣＡＡＣ，Ｓｅｐｔ．２９−Ｏｃｔ ．２，１９９１，Ｃｈｉｃａｇｏ．参照。この論文では、因子Ｃ２はＣ２ｂと同 一のものであるとされている。 複合物ＧＥ２２７０の成分の構造は表Ｉ記載されている。 最近の抗生物質処理に対する耐性及び抵抗の発生が増加していることにより、 新規な抗生物質に対する要求は依然として高い。一定の物理化学的挙動（例えば 安定性）及び生物学的挙動（例えば薬動力学）を執るよく規定されそして標準化 された組成を有する単一の単離された形態の抗生物質が特に望ましい。 ＥＰ−Ａ−３５９０６２に記載の最近の発酵法では、因子Ａが一般に７０％よ り少ない（ＨＰＬＣによる）複合物混合物が得られ、全抗生物質生産性は一般に ３００ｐｐｍより低い。本発明に従えば、ＧＥ２２７０抗生物質複合物の生産に 使用される発酵培地に、ビタミンＢ₁₂（シアノコバラミン）又はシアノ基が他の リガンドにより代替されているビタミンＢ₁₂と同様な活性を有するビタミンＢ₁₂ の類似体を添加すると、全抗生物質複合物収率と因子Ａの生産の選択性の両方が 高められることが見いだされた。 ビタミンＢ₁₂と同様な活性を有するビタミンＢ₁₂の類似体の例は、例えば、ヒ ドロキソコバラミン、５′−デオキシアデノシルコバラミン、メチルコバラミン 及び本“ＴＨＥ ＶＩＴＡＭＩＮＳ”， Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｐｈｙｓｉｏｌ ｏｇｙ，Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ”、ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｗ．Ｅ ．Ｓｅｂｒｅｌｌ ａｎｄ Ｒ．Ｓ．Ｈａｒｒｉｓ、Ｖｏｌ．ＩＩ，ｐｇ．１８ １、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ−Ｌｏｎｄｏｎ，１９６ ８．に記載のものである。 ビタミンＢ₁₂の効果による抗生物質の生産の改良は、モネンシン、ホーチマイ シン、ゲンタマイシン、チュアンキシンマイシン（ｃｈｕａｎｇｘｉｎｍｙｃｉ ｎ）、ＳＦ−２３１２、へプテム酸（ｈｅｐｔｅｍｉ ｃ ａｃｉｄ）骨格を有する抗生物質（チエナマイシン，ＰＳ−５等）、エルサ マイシン（ｅｌｓａｍｉｃｉｎ）及びレイナマイシン（ｌｅｉｎａｍｙｃｉｎ） について文献に報告されている。 しかしながら、全抗生物質収率の増加と複合物の成分の１つの高度に選択性の 生産を示す同時的二重の効果が観察されたことはないと思われる。 ミクロモノスポラ・プルプレア（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｐｕｒｐｕ ｒｅａ） のゲンタマイシン生産株に関して詳細な検討がロシア人の著者によりな された（Ｔ．Ｐ．Ｋｒａｓｎｏｖａ ｅｔ ａｌ．：“Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ Ａｃｔｉｖｅ Ｓｔｒａｉｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｍｏ ｎｏｓｐｏｌａ ｐｕｒｐｕｒｅａ ａｎｄ ｉｔｓ Ｌｏｗ Ａｃｔｉｖｅ Ｍｕｔａｎｔ ｉｎ Ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓ ｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｔａｍｙｃｉｎ”．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ２４，Ｎｏ． ５，３２３−３２８，１９７９；Ｒｉｎｇｄｏｇ Ａｂｓｔｒａｃｔ ３１０４ ４Ｕ）。それらの結果は下記の如く要約することができる。 （ａ）発酵培地へのコバルトの添加は、ビタミンＢ₁₂の生合成を刺激しそして 抗生物質複合物の組成に影響を与える。 （ｂ）コバルト添加の効果について提唱された機構は、コバルトイオンが、メ チル基の供給源（ｓｏｕｒｃｅ）であるメチオニンの合成に必要な内因性Ｂ₁₂の 合成を刺激するということである。 Ｇ２２７０に関して本発明者により行われた実験では、ＣｏＣｌ₂添加では中 程度の効果しか見られず、因子Ａの選択性は僅かに影響を受けそして全体的ＧＥ ２２７０合成は僅かに増加して３００ｐｐｍのオーダ ーの値になったにすぎない。 本発明に従う所望の効果を達成するために発酵培地に加えられるべきビタミン Ｂ₁₂又はその類似体の量は、普通は生産菌株及び使用される培養培地の組成に依 存して変わる。簡単な実験室規模の試験で、発酵培地に添加されるべきビタミン Ｂ₁₂又はその類似体の適切な量を当業者は決定することができる。 通常の発酵条件下では、有効量は一般に０．０００５ｐｐｍ乃至５ｐｐｍの範 囲にある。５ｐｐｍより多い量を用いることができるが、上記の範囲の上限の値 で達成することができる効果より何ら実質的に高められない。ビタミンＢ₁₂の好 ましい添加は、０．００５ｐｐｍ乃至１ｐｐｍの範囲にある。 ビタミンＢ₁₂は、遊離化合物として（例えば、結晶性ビタミンＢ₁₂）、又は濃 厚物として、又は発酵培地に添加することができるより複雑な物質の成分として 添加することができる。該物質は、抗生物質ＧＥ２２７０の生産に必要な発酵条 件に対して許容されうるものであるべきであり、即ち、それは上記の菌株に対し て毒性ではないものであるべきでありそしてその生育及び生産性に負の影響を与 えないものであるべきである。 好ましくは、この物質は、微生物によりその生育のために必須の元素の有効な 供給源としても利用されることができる、即ち、それは炭素、窒素及び／又は無 機塩類の供給源としても利用することができる。例えば、ビタミンＢ₁₂活性は、 標準魚粉及び脱脂魚粉に含まれている。故に、発酵培地への適当な量の魚粉の添 加は、同化可能な窒素源として作用し、同時に本発明の効果を達成するのに必要 な量のビタミンＢ₁₂を提供することができる。 本発明の方法に使用される発酵培地及び培養プロセス条件は、上記のＥＰ−Ａ −３５９０６２に既に実質的に述べられている。プラノビスポラ・ロセア ＡＴ ＣＣ ５０７７３又はその抗生物質ＧＥ２２７０生産性突然変異株（ｍｕｌａｎ ｔ）又は変異株（ｖａｒｌａｎｔ）が、抗生物質ＧＥ２２７０生産性微生物とし て使用される。該変異株又は突然変異株は、例えば、上記ＥＰ−Ａ ３５９０６ ２に示されたような種々の公知の突然変異源による処理により得ることができる 。 要約すると、本発明は、炭素、窒素及び無機塩類の同化可能な供給源（ｓｏｕ ｒｃｅｓ）の存在下で液内（ｓｕｂｍｅｒｇｅｄ）好気性条件下に菌株プラノビ スポラ・ロセア ＡＴＣＣ ５０７７３又はその抗生物質ＧＥ２２７０生産性突 然変異株又は変異株を培養することにより、主要な（ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔ） 因子Ａの含有量を選択的に高めた抗生物質ＧＥ２２７０複合物を高収率で生産す る発酵方法であって、ビタミンＢ_l2又はシアノ基が他のリガンドにより置換され ているビタミンＢ₁₂と同様な活性を有するＢ₁₂の類似体を発酵培地に添加するこ とを特徴とする方法から成る。 上記のように、本発明に従って利用される発酵方法は、抗生物質ＧＥ２２７０ 複合物を生産するための技術水準に述べられた方法と実質的に同じである。プラ ノビスポラ・ロセア の凍結培養物サンプルを使用して栄養培地（ｖｅｇｅｔａｔ ｉｖｅ ｍｅｄｉｕｍ）を入れたフラスコ又は容器に接種する。次いで、培養物 を所望の生育を達成するに十分な時間２６℃乃至３７℃の温度で振とうしながら インキュベーションする。２８℃乃至３０℃の温度で、６０−７５時間のインキ ュベーション時間は、一般に満足な生育のために十分である。この期間の後、得 られた培 養物のアリコートを、適当な量のビタミンＢ₁₂又はその類似体を添加された発酵 培地の入っているフラスコ又は容器に移す。ビタミＢ₁₂が複合物質の成分として 又は好ましくは発酵培地の栄養素物質（ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｍａｔｅｒｉａｌｓ ）の成分として添加されるならば、該物質はそのビタミンＢ₁₂の含有率に関係し て添加されるべきである。本発明の効果を得るのに必要な添加量は、種々の異な る濃度の選ばれた物質を発酵培地に加える一連の培養実験を行うことにより、又 は溶媒（例えば、ベンジルアルコール、フェノール又はブタノール）抽出及び抽 出物のクロマトグラフィー分離／分析により該物質のビタミンＢ₁₂の含有率を決 定することにより決めることができる。 しかしながら、或る場合には、或る濃度値以上では、いくらかの物質はＧＥ２ ２７０複合物を生産する微生物に対して一般的抑制効果を示すので、発酵ブロス （ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｂｒｏｔｈ）に加えることができる物質の量には 限界がある。 例えば、１ｇ／リットル乃至１５ｇ／リットルの添加量で全ＧＥ２２７０複合 物生産性の増加及び因子Ａの選択的生産の増加の両方を促進する或る種の魚粉［ アグラス タイプ（Ａｇｒａｓ ｔｙｐｅ）９９．９］は、２０ｇ／リットルの 濃度では、微生物の増殖及び抗生物質の生産を実質的に抑制することが観察され た。このような効果は、脱脂した魚粉アグラス タイプ９９．９の添加では観察 されなかった。 標準発酵培地及び適当な量のビタミンＢ₁₂の入っているフラスコ又は容器を、 上記の培養物の接種の後、抗生物質ＧＥ２２７０複合物の最大収率を達成するた めの十分に長い期間振とう又は撹拌しながら、２４℃乃至３７℃、好ましくは、 ２８℃乃至３０℃の温度に保つ。この期間は、 感受性の微生物［例えば、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔ ｉｌｉｓ ）又はストレプトマイセス・オーレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）］に対す るペーパーディスク又は寒天拡散アッセイ（ｐａｐｅｒ ｄｉｓｃ ｏｒ ａｇ ａｒ ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ ａｓｓａｙｓ）のようなバイオアッセイ、当業界で 普通に使用されるＴＬＣ又はＨＰＬＣ法（ＥＰ−Ａ−３５９０６２参照）を包含 する分析法により発酵の進行を監視することにより本質的に決定される。 一般に、本発明に従って使用される条件下に抗生物質ＧＥ２２７０の最大収率 を達成するのに十分な発酵期間は３日乃至７日の範囲である。 本発明の方法を実施するために利用される標準前培養（ｐｒｅ−ｃｕｌｔｕｒ ｅ）及び発酵培地の組成は、当業界で普通に使用される栄養素物質を含有する。 しかしながら、或る種の栄養素物質が好ましい。 好ましい炭素源は、グルコース、マンノース、ガラクトース、デンプン、コー ンミール及び同様なものである。好ましい窒素源は、アンモニア、硝酸塩、大豆 ミール、ペプトン、加水分解カゼイン、肉エキス、酵母エキス、トリプトン、ア ミノ酸及び同様なものである。培養培地に導入することができる無機塩類として は、ナトリウムイオン、カリウムイオン、鉄イオン、亜鉛イオン、コバルトイオ ン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、アンモニウムイオン、塩化物イオ ン、炭酸イオン、硫酸イオン、リン酸イオン、硝酸イオン及び同様なイオンを生 じることができる慣用の可溶性塩がある。 例えば、標準発酵培地（ビタミンＢ₁₂又はその類似体の添加を考慮しないで） は、可溶性デンプン、加水分解カゼイン、酵母エキス、肉エキス、大豆ミール、 グルコース及び炭酸カルシウムを含有することができ る。ビタミンＢ₁₂が複合物質の成分として補充される場合には、上記した栄養素 成分に他の物質を添加することができる。魚粉、動物器官抽出物、ビタミンＢ₁₂ 微生物生産からの粗抽出物（ｒａｗ ｅｘｔｒａｃｔｓ）は、ビタミンＢ₁₂を含 有する該複合物質の代表的な例である。 発酵培地に硫酸アンモニウムを添加すると、発酵ブロスの因子Ａ生産の選択性 及び総合的効力に対する特定の効果が観察された。硫酸アンモニウムの好ましい 濃度は０．５ｇ／ｌ乃至１．５ｇ／ｌの範囲にある。 発酵を止めるとき、本発明の一般的条件下に得られる抗生物質ＧＥ２２７０複 合物は、８０％より多くの（ＨＰＬＣ）因子Ａを含有する。最も好ましい条件下 に発酵プロセスを行うことにより、発酵ブロス中３５０〜５００ｐｐｍのオーダ ーの全抗生物質ＧＥ２２７０複合物の最終濃度が得られ、その際因子Ａの割合は 約９０％（ＨＰＬＣ）である。 抗生物質生成物は、従来開示された方法に従って発酵ブロスから回収され、精 製されうる（ＥＰ−Ａ−３５９０６２参照）。特に、粗製ＧＥ２２７０が９０％ 以上の割合で因子Ａを含有する場合には、有機溶媒又は有機溶媒の混合物からの 再結晶により直接それを精製して、総量で５％未満の他の因子を含有する生成物 を得ることができる。 下記の実施例は本発明の方法を行うためのいくつかの代表的な方法を述べる。実施例１ 発酵方法 １．１）微生物 使用する微生物は実用在庫品（ｗｏｒｋｉｎｇ ｓｔｏｃｋｓ）として使用す るために−８０℃に保たれた凍結培養ブロス中に貯蔵されてい るプラノビスポラ・ロセア（Ｐｌａｎｏｂｉｓｐｏｒａ ｒｏｓｅａ）ＡＴＣＣ ５３７７３又はそのＧＥ２２７０生産性突然変異株又は変異株である。 貯蔵培地は下記の組成を有する 可溶性デンプン ２０ ｇ／リットル ポリペプトン ５ ｇ／リットル 酵母エキス ３ ｇ／リットル 肉エキス ２ ｇ／リットル 大豆ミール ２ ｇ／リットル ＣａＣＯ₃ １ ｇ／リットル １．２） 発酵条件 上記の培地と同じ培地を入れたフラスコに上記の凍結培養物５ｍｌを接種する ことにより、５００ｍｌのエルレンマイヤーフラスコ中に前培養物（ｐｒｅ−ｃ ｕｌｔｕｒｅｓ）を調製する。 接種したフラスコを、振とうさせながら（２００ｒｐｍ）２８℃で７２時間イ ンキューベーションし、次いで培養ブロスの４ｍｌのアリコートを、選ばれた量 のビタミンＢ₁₂又はその類似体を添加された下記の培地の入っているフラスコに 移す。 可溶性デンプン ３５ ｇ／リットル 加水分解カゼイン ５ ｇ／リットル 酵母エキス ８ ｇ／リットル 肉エキス ３．５ ｇ／リットル 大豆ミール ３．５ ｇ／リットル グルコース １０ ｇ／リットル ＣａＣＯ₃ ２ ｇ／リットル この培地は蒸留水で調製され、ｐＨは滅菌（１２２℃で３０分間）の前に７． ２に補正される。各培地は発泡防止剤としてホダーグ（Ｈｏｄａｇ） ＡＦＭ− ５、０．０３％を含む。 発酵は、振とうさせながら２８℃〜３００℃で７日間行い、その間発酵された ブロスを抗生物質の生産について監視する。 １．３） ビタミンＢ₁₂の添加 １．３．１） ビタミンＢ₁₂又はその類似体を２５ｍｇ／ｍｌの出発濃度で蒸 留水に溶解し、水で希釈する。溶液をろ過により滅菌し、選ばれた濃度で上記の 発酵培地に加える。 １．３．２） 魚粉（アグラスタイプ９９．９及び脱脂したアグラスタイプ９ ９．９）を選ばれた量で上記培地の入っている発酵フラスコに添加する。 １．４） 抗生物質生産のＨＰＬＣ分析 発酵ブロス１容量をアセトニトリル２容量で、室温で約２０分間撹拌すること により抽出し、得られる懸濁液を３．０００ｒｐｍで５分間遠心分離する。 得られる溶液を、希釈比１：３としてＨＰＬＣ分析に使用する。 ＨＰＬＣの条件： 機器 ：ＵＶ２５４検出器を有するＨＰ１０８２ カラム ：ブラウンリー （Ｂｒｏｗｎｌｅｅ）ＲＰ−１８ ５μ ２２ｃｍ プレカラム ：ブラウンリー ＲＰ−１８ ５μ １．５ｃｍ 溶離剤相Ａ ：ＮａＨ₂ＰＯ₄ ２０ｍＭ−ＣＨ₃ＣＮ ９０：１０ 溶離剤相Ｂ ：ＮａＨ₂ＰＯ₄ ２０ｍＭ−ＣＨ₃ＣＮ ３０：７０ 勾配のタイプ ：線形 勾配時間 ：４５％Ｂから７５％Ｂまで２０分 流速 ：１．５ｍｌ／分 注入 ：３０μｌ 上記の条件下に、６．２０分乃至１３．６７分の保持時間（Ｒｔ）間隔内に 入るＨＰＬＣクロマトグラフィープロフィルのすべてのピークは、ＧＥ２２７０ 複合物の因子に関係がある。因子Ａは１１．６５分のＲｔ値を示す。実施例２ ビタミンＢ₁₂又はその類似体の添加の効果 ２．１） 下記の表１は、発酵培地への種々の濃度でのビタミンＢ₁₂の添加の 効果を示す２つの実験を報告する。評価はＨＰＬＣ法により行う。 ２．２） 下記の表２は、発酵培地への種々の濃度でのメチルコバラミンの添 加の効果を示す。 ２．３） 下記の表３は、発酵培地への種々の量の魚粉の添加の効果を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．炭素、窒素及び無機塩類の同化可能な供給源の存在下で液内好気性条件下 に菌株プラノビスポラ・ロセア ＡＴＣＣ ５３７７３又はその抗生物質ＧＥ２ ２７０生産性突然変異株又は変異株を培養することにより、主要な因子Ａの含有 量を選択的に高めた抗生物質ＧＥ２２７０複合物を高収率で生産する発酵方法で あって、ビタミンＢ₁₂又はシアノ基が他のリガンドにより置換されているビタミ ンＢ₁₂と同様な活性を有するＢ₁₂の類似体を発酵培地に添加することを特徴とす る方法。 ２．発酵培地に添加されるビタミンＢ₁₂又はその類似体の量が０．０００５ｐ ｐｍ乃至１ｐｐｍの範囲にある請求の範囲第１の方法。 ３．ビタミンＢ₁₂又はその類似体が、ビタミンＢ₁₂、ヒドロキソコバラミン、 ５′−デオキシアデノシルコバラミン及びメチルコバラミンから選ばれる請求の 範囲１又は２の方法。 ４．ビタミンＢ₁₂を、抗生物質ＧＥ２２７０の生産のために必要な発酵条件に 対して許容され得る複合物質の成分として添加する請求の範囲１及び２のいずれ かの方法。 ５．複合物質が魚粉又は脱脂された魚粉である請求の範囲４の方法。 ６．発酵培地に添加される魚粉又は脱脂された魚粉の量が１ｇ／リットル乃至 １５ｇ／リットルの範囲にある請求の範囲５の方法。 ７．魚粉がアグラスタイプ９９．９又は脱脂アグラスタイプ９９．９である請 求の範囲６の方法。 ８．硫酸アンモニウムを、好ましくは０．５ｇ／リットル乃至１．５ｇ／リッ トルの範囲の濃度で、発酵培地に添加する請求の範囲１乃至７のいずれかの方法 。