JPH08501216A

JPH08501216A - 不斉還元方法

Info

Publication number: JPH08501216A
Application number: JP6506951A
Authority: JP
Inventors: ホルト，ロバート・アントニー; リグビー，スチュアート・リチャード
Original assignee: ゼネカ・リミテッド
Priority date: 1992-08-28
Filing date: 1993-08-20
Publication date: 1996-02-13
Anticipated expiration: 2017-10-15
Also published as: KR100319837B1; ATE144795T1; CA2142444A1; DK0658211T3; FI950892A0; DE69305748T2; AU4729193A; ES2093980T3; DE69305748D1; JP3333206B2; DK0658211T4; FI950892L; EP0658211B2; WO1994005802A1; FI106565B; EP0658211B1; KR950703062A; CA2142444C; US5580764A; EP0658211A1

Abstract

(57)【要約】下記式の化合物；（式中Ｘは水素または-ＳＯ₂ＮＨ₂基である）を酵素的還元系によって対応するアルコールのトランス（４Ｓ，６Ｓ）型に還元する。

Description

【発明の詳細な説明】不斉還元方法本発明は、不斉還元方法に関する。化合物；は局所的に作用するカルボニックアンヒドラーゼ阻害剤であり、緑内障の治療への利用が提唱されているものである。４位の配向性がトランスである、６位のメチル置換化合物（４Ｓ，６Ｓジアステレオマー）が治療上重要であるが、多量のシス異性体（４Ｒ．６Ｓジアステレオマー）を優勢に生成させずに製造することは難しい。我々は式IIの化合物；（式中Ｘは水素または-ＳＯ₂ＮＨ₂基である）を製造する方法を発明した。この化合物は、式Ｉの化合物；から、上記の必要とするトランス（４Ｓ，６Ｓ）異性体及びその誘導体を、対応するシス異性体よりも多量に製造する際における有用な中間体である。これらの物質の合成に関して参考となる化学については、Jones,et al, J.Org .Chem. 1991 56 763-769、Shinkai, J.Heterocyclic Chem. （1992）29,627-639 及び米国特許4,968,814号、4,968,815号、及び本特許出願の優先権主張出願に続いて出版されたBlacklock et al J.Org.Chem. 1993 58 1672-1679に開示されている。ボラン-テトラヒドロフラン複合体のような還元剤を用いて化合物（Ｉ）の還元を行なうと、必要とする（４Ｓ，６Ｓ）トランス型ジアステレオマー（II）が生成物の少量を占めるのに対して、主生成物（＞９０％）として（４Ｒ，６Ｓ）ジアステレオマー（IV）が生成する。 Jones et al, J.Org.Chem. （1991）,56,763-769には、類似のアナログである化合物（Ｖ）を、パン酵母（サッカロミセスセレビシエ：Saccharomyces cere visiae）を用いてエナンチオ選択的に還元する方法が開示されている。この反応によって（Ｒ）-体と（Ｓ）-体のアルコールが１１：８９の比率で生成する。しかしながら、化合物（Ｉ）の還元にパン酵母及びビール酵母を用いた場合、必要でないシス型ジアステレオマーが主生成物（６０から８５％）であった。より広い範囲の微生物（細菌、酵母菌及びカビ類）を調べたところ、ほとんどが必要でないシス型ジアステレオマーを優勢に製造することがわかった。しかしながら、驚くべきことに、我々は酵素的還元によりトランス異性体を優勢に製造することが事実上可能であることを見いだし、化合物（Ｉ）を必要とするトランスのアルコール（II）に還元することができる細菌、カビ類及び酵母菌を含む微生物の種類を同定した。本発明は、式；の化合物（式中Ｘは水素または-ＳＯ₂ＮＨ₂基である）を、酵素的還元系と接触させることによって式；の化合物に変換する方法に関する。これに適した系は、適当な酸化還元酵素及び、酵素の補因子の還元型である。酵素的還元系は、適当な微生物の全細胞または破壊された細胞を用いることもできる。 “選択的に”という語によって、トランス（４Ｓ，６Ｓ）異性体がシス（４Ｒ，６Ｓ）異性体より多く製造されることを意味する。好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％の生産物がトランス異性体である。反応は好ましくはｐＨ８以下、より好ましくはｐＨ６以下で行なう。我々は、反応の立体特異性が酸性条件下において改善されること、及びｐＨ２から５で反応させることが好ましいことを見いだした。酵素的還元系を含有する微生物は、意外にもこのような条件に耐性を有している。適当な酸化還元酵素はスクリーニングの方法で見いだすことができる。適当な還元酵素の例としては、ラクトバチルスプランタルム（Lactobacillus planta rum） NCIMB 40027、ピチアハプロフィラ（Pichia haplophia） CBS 2008、カンジダユーティリス（Candida utilis） NCYC 322、ラクトバチルスブフネリ（Lactobacillus buchneri） NCIMB 8818、アスペルギルスフラブスオリゼー（Aspergillus flavus oryzae） IMI 51983あるいは特にニューロスポラクラッサ（Neurospora crassa） IMI 19419から得られるものがある。一般に、パン酵母及びビール酵母では必要としないシスの生成物が得られる。補因子としては例えば、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、ＦＡＤＨ、ＤＭＮＨ及び／またはＰＱＱあるいは微生物において前述の酵素と共に存在する補因子のいずれでも良い。好ましくは継続的に補因子を還元する為の手段もまた存在するのが良い。非常に好適には、酵素及び補因子を適当な微生物の破壊された細胞または好ましくは全細胞として供給することができ、その細胞には、例えば炭水化物−特にグルコース、フルクトースまたはスクロースのような糖基質−、グリセロールあるいは乳酸のような適当な基質を供給することができる。そのような細胞は一般に基質を利用して補因子を還元する手段を有している。反応は、ｐＨがｐＨ２からｐＨ６、好ましくはｐＨ３からｐＨ５の、好ましくは水性溶媒中で、２０℃から４０℃の温度で好適に行なわれ、反応体の濃度は好適には５ｇ／リットルから１０ｇ／リットルである。基質、例えばグルコースは好適には５ｇ／リットルから５０ｇ／リットルの濃度で存在し、他の栄養素としては例えは酵母抽出物が存在しても良い。実施例１テトラヒドロフラン-ボラン複合体を用いたケトン（Ｉ）（Ｘ＝Ｈ）の還元オーブンで乾燥した２５０ｍｌの丸底フラスコにケトン（Ｉ）（５００ｍｇ）を入れ、ヘッドスペースを乾燥窒素で満たした。フラスコに２５ｍｌの無水テトラヒドロフランを添加し、溶液を氷上で撹拌して温度を５℃まで下げた。温度を５℃に維持したまま、テトラヒドロフラン-ボラン複合体（１．０モル、３ｍｌ）を１５分間で滴下した。テトラヒドロフラン-ボラン複合体の添加後、室温に戻しながら混合液を更に３０分間撹拌した。残ったテトラヒドロフラン-ボランをメタノール（２５ｍｌ）でクエンチ（quench）し、３０分間撹拌した後更に５０ｍｌのメタノールを添加した。溶媒を減圧下で除去して生成物を回収した。生成物は、Nova-Pak C₁₈カラム（内径３．９ｍｍ×３００ｍｍ）を用い、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析した。生成物及び出発物質は２０ｍＭのリン酸水溶液とアセトニトリルを含有する溶媒勾配を用い、以下の条件で溶出させた：０から１０分リン酸水溶液（２０ｍＭ）９２．５％：アセトニトリル７．５％；１０から２５分アセトニトリルの濃度を直線的に２７．５％まで増し、リン酸水溶液を７２．５％まで減らした。溶媒の流速は１．０ｍｌ／分であった。アルコールは１６分（シス）及び１７分（トランス）で溶出し、一方ケトンは２４分で溶出した。上記のようにして得られたサンプルで行なった分析によって、双方のアルコールの収率は８９％であり、シス：トランスの比率は９：１であることが示された。実施例２細菌の全細胞を用いたケトン（Ｉ）（Ｘ＝Ｈ）の還元ラクトバチルスプランタルムＬ．プランタルムＮＣＩＭＢ４００２７の細胞をオキソイドＭＲＳ培地（Unipath Ltd., Basingstoke,Englandから調製粉末として得たもの）中で成長させた。それぞれ１．５リットルの培地を含有する２リットルのコニカルフラスコ８個にＬ．プランタルムＮＣＩＭＢ４００２７を接種し、２８℃で２４時間ロータリーシェイカーによりインキュベートした。細胞は遠心分離で回収し、ｐＨ７．０の１００ｍＭリン酸ナトリウム／カリウム緩衝液中に再懸濁して洗浄した。細胞を再度達心分離した後、５００ｍｌのリン酸ナトリウム／カリウム緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ７．０）中に３３ｇ／リットルの濃度になるように再懸濁して１リットルのコニカルフラスコに入れた。ケトン（Ｉ）１．２５ｇをアセトン２．５ｍｌに溶解して、２５ｇのグルコースと共に細胞懸濁液に添加した。混合液を２８℃で２４時間、ロータリーシェイカーでインキュベートした。細胞を遠心分離により除き、上清を５００ｍｌのジクロロメタンで抽出した。水層に硫酸ナトリウムを飽和させ、５００ｍｌのジクロロメタンで再度抽出した。ジクロロメタン抽出物を合わせて無水硫酸マグネシウムで水分を除き、溶媒をロータリーエバポレーターで除き、アルコールの混合物と未反応のケトン（Ｉ）を得た。アルコールは市販されているシリカゲル（Merck Kieselgel 60）（70-230 mesh AS TM）により、エチルアセテート：ヘキサン（体積比８７．５：１２．５）を溶出液としてフラッシュクロマトグラフィーを行なって精製し、３４９ｍｇのトランス型アルコール（II）及び４１ｍｇのシス型アルコール（IV）を実施例１の方法によって確認した。実施例３ニューロスポラクラッサ菌の菌糸体を用いたケトン（Ｉ）（Ｘ＝Ｈ）の還元ニューロスポラクラッサＩＭＩ１９４１９を以下の成分（ｇ／リットル）を含有する鉱酸塩培地で成長させた。グルコース、２０；酵母抽出物、２；リン酸水素２カリウム、１．９；リン酸２水素ナトリウム、１．５６；硫酸アンモニウム、１．８；硫酸マグネシウム７水和物、０．１；塩化第２鉄、０．００１；炭酸カルシウム、０．００２；硫酸亜鉛７水和物、０．０００１；硫酸マンガン４水和物、０．０００１。１リットルの培地を含有する２リットルのコニカルフラスコにニューロスポラクラッサの胞子を接種し、２８℃で４８時間オービタルシェイカー（orbital shaker）によりインキュベートした。菌糸体をWhatmang rade 113フィルターペーパーで濾過して回収し、水で洗浄した。菌糸体を９．３７ｍｌのリン酸ナトリウム／カリウム緩衝液（ｐＨ７．０または８．０、１００ｍＭ）中に２０ｇ乾燥重量／リットルの濃度になるように再懸濁させ、１５ｍｌのスクリューキャップバイアルに移した。バイアルにグルコース（５０％水溶液０．５ｍｌ）及びケトン（Ｉ）６５ｍｇをアセトン（０．１３ｍｌ）に溶解した溶液を添加した。バイアルを密閉し、２８℃で２１時間振とうしながらインキュベートした。細胞フリーの上清のＨＰＬＣ（実施例１に記載したもの）による分析から、ｐＨ７．０及びｐＨ８．０のいずれにおいてもケトンからアルコールへの定量的な変換が生じていることが示された。ｐＨ７．０においてトランス型アルコール（II）：シス型アルコール（IV）の比率は９４：６であり、一方、ｐＨ８．０においては８９：１１であった。実施例４酵母菌ピチアハプロフィラＣＢＳ２００８の全細胞を用いたケトン（Ｉ）（Ｘ＝Ｈ）の還元ピチアハプロフィラＣＢＳ２００８の細胞を試験例３に記載した鉱酸塩、グルコース、酵母抽出物培地で成長させた。４００ｍｌの培地を含有する２リットルのバフルドコニカルフラスコに酵母菌を接種し、２８℃で４８時間オービタルシェイカーによりインキュベートした。培養から遠心分離によって細胞を回収し、１００ｍＭのクエン酸塩／リン酸塩緩衝液、ｐＨ５．０に再懸濁して洗浄した。細胞を次に６ｇ乾燥重量／リットルの濃度になるようにクエン酸塩／リン酸塩緩衝液、ｐＨ５．０中に再懸濁させ、１０ｍｌを２０ｍｌのスクリューキャップバイアルに移した。バイアルにグルコース（５０％水溶液０．２ｍｌ）及びアセトン２５μｌに溶解したケトン（Ｉ）１４．５ｍｇを添加した。混合液を２８ ℃て２２時間オービタルシェイカーでインキュベートし、細胞を遠心分離で除き、上清を実施例１に記載したＨＰＬＣによって分析した。回収した上清には未反応のケトンはなく、シス型アルコール（IV）０．６５ｍｇ及びトランス型アルコール（II）１２．１３ｍｇが含まれていた。実施例５以下の表に示す微生物それぞれを用いて、細胞をリン酸Ｎａ／Ｋ緩衝液（ｐＨ７）（１００ｍＭ）に懸濁させる以外は実施例４と同様に行なった。細胞の濃度は１０-３０ｇ乾燥重量／リットルとした。用いたケトンからの変換率及び全還元生成物中のトランス異性体の百分率を表１に示す。実施例６ケトン（Ｉ）（Ｘ＝Ｈ）のラセミ化のｐＨ依存性ケトン（Ｉ）の５０ｗ／ｗ％アセトン溶液を調製した（（６Ｓ）ケトンのエナンチオマー過剰率は９８．０％であった）。別々のバイアルに以下の水性緩衝液（生物変換条件に近くする為にグルコース５０ｍｇを添加したもの）２ｍｌを入れた-酢酸ナトリウム（０．１Ｍ）、ｐＨ４．３；クエン酸ナトリウム（０．１Ｍ）、ｐＨ５．０；リン酸カリウム（０．１Ｍ）、ｐＨ６．５；ホウ酸ナトリウム（０．０５Ｍ）、ｐＨ９．０。緩衝液に１０ｍｇのケトン（Ｉ）を（アセトン溶液として）添加し、バイアルに蓋をして２８℃で振とうしながら維持した。とびとびに、バイアルからエチルアセテートで抽出（１ｍｌで２回）し、分離した有機溶媒層から無水硫酸ナトリウムで水分を除き、乾燥窒素気流中で溶媒を除去してケトンを回収した。回収されたケトンの光学的純度は、Chiralcel O.D.カラム（内径０．４６ｍｍ×２５０ｍｍ）を用い、ヘキサン：エタノール（９：１）を溶出液とし、溶出液の流速１ｍｌ／分とし、２４０ｎｍのＵＶ吸収の検出を行なう高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって決定した。（Ｒ）-型エナンチオマーは２２．５分で溶出し、一方（Ｓ）-型エナンチオマーは２４．２分で溶出した。個々のバイアルはそれぞれの時点で抽出した。結果を表２に示す。実施例７ｐＨ４に維持したニューロスポラクラッサ菌の菌糸体を用いたケトン（Ｉ）（Ｘ＝Ｈ）の還元ニューロスポラクラッサＩＭＩ１９４１９をBraun Biostat ED 発酵槽（操作容量１５リットル）で成長させた。培地には以下の成分（ｇ／リットル）を含有させた。グルコース、４０；酵母抽出物、２；硫酸マグネシウム７水和物、１．２；硫酸２カリウム、０．２１；リン酸２水素カリウム、０．６９；リン酸、１．７；塩化第２鉄、０．０５；炭酸カルシウム、０．０７；硫酸亜鉛７水和物、０．００３５；硫酸マンガン４水和物、０．００３５；消泡剤ポリプロピレングリコール、２。接種前に溶液をｐＨ６．５にする為に水酸化アンモニウムを用いた。予め試験例３に記載した培地及び成長条件で２４時間成長させた培養４００ｍｌを発酵槽に接種した。発酵中、次のパラメーターを記載の値に調節した。温度、２８℃：ｐＨ、６．５；気流、７．５リットル／分；撹拌機の速度、４００ｒｐｍ。培養はこれらの条件で３０時間、菌糸体濃度が８．２ｇ乾燥重量／リットルになるまで成長させた。この時点で温度を３４℃まで上げ、撹拌機の速度は溶解酸素の蒸気圧力（tension）が飽和の４０％を維持するように自動的に調節し、培養をｐＨ４．０にする為に２モルの塩酸を発酵槽に添加した。ケトン（Ｉ）１０７ｇをアセトン３００ｍｌに溶解した。ケトンのアセトン溶液を少量（１５-３０ｍｌ）ずつ１３時間以上にわたって発酵槽に添加した。ケトンの添加速度は、定常状態のケトン濃度が０．２ｇ／リットル以下であるように調節した。これは実施例１に記載したＨＰＬＣ法を用いて監視した。ケトンが完全に変換した後、培養液を発酵槽から取り出し、Whatman 113フィルターペーパーで濾過した。水性の濾液を０．５倍量のエチルアセテートで２回抽出した。溶媒から無水硫酸ナトリウムを用いて水分を除き、その後真空蒸留で溶媒を除いて９０．９ｇのアルコールを得た。生成したアルコールの４種のジアステレオマーの相対濃度は２つの別個のＨＰＬＣ法を用いて決定した。１番目はキラルな固定相、Chiralcel 0.D.（内径４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）；溶出液、ヘキサン：エタノール（９：１）；溶出液の流速、１．０ｍｌ／分；２５０ｎｍのＵＶ吸収による検出を用いて行なった。保持時間は以下の通りであった：（４Ｓ，６Ｓ）及び（４Ｒ，６Ｒ）のトランス型アルコールは１６．０分て共に溶出；（４Ｒ，６Ｓ）シス型アルコール、１６．８分：（４Ｓ，６Ｒ）シス型アルコール、１９．０分。２番目の方法では、Dale,Dull and Mosher, J.Org.Chem.34,（9）,2543-2549 （1969）の方法に従って、アルコールを（Ｓ）-α-メトキシ-α-（トリフルオロメチル）フェニルアセチルクロライドと反応させて誘導体を生成させた。誘導体はZorbaxシリカカラム（内径４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）；溶出液、ヘキサン：エチルアセテート（９：１）；溶出液の流速、２．０ml/minute；２６０ｎｍのＵＶ吸収による検出を用いて分離させた。保持時間は以下の通りであった：（４Ｒ，６Ｒ）トランス型アルコール、２０．１分；（４Ｓ，６Ｓ）トランス型アルコール及び（４Ｓ，６Ｒ）シス型アルコールは共に溶出、２２．５分；（４Ｒ，６Ｓ）シス型アルコール、２３．７分。クロマトグラフィー分析の結果を表３に示す。ＩＭＩ - インターナショナル・マイコロジカル・インスティテュート、ＴＷ９３ＱＲ連合王国サレー、キュー、フェリーレーン（International Mycological Institute, Ferry Lane, Kew, Surrey United Kingdom TW9 3QR）ＮＣＩＭＢ - ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・アンド・マリーン・バクテリア・リミテッド、ＡＢ２１ＲＹ連合王国アバディーン、セントマチャール・ドライブ２３（National Collection of Industrial and Marine Bacteria Ltd 23 St Machar Drive, Aberdeen United Kingdom AB2 1RY）ＡＴＣＣ - アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、アメリカ合衆国メリーランド州２０８５２、ロックビル、パークローンドライブ１２３０１（American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive Rockville, Maryland 20852 United States of America）ＣＢＳ - セントラール・ビュロー・フォール・シンメルクルチャーズ、オランダ国エージーバールン３４７０、オーステルストラート１（Centraal Bureau voor Schimmelcultures, Oosterstraat 1 3470 A G Baarn, Netherlands）ＩＦＯ -発酵研究所、日本国大阪府大阪市淀川区十三本町２丁目１７番８５号（Institute for Fermentation, 17-85 Juso-honmachi 2-chome Yodogawa-ku, Osaka 532, Japan）ＮＲＲＬ - アグリカルチュラル・リサーチ・サービス・カルチャー・コレクション、アメリカ合衆国イリノイ州６１６０４、ペオリア、ノースユニバーシティーストリート１８１５（Agricultural Research Service Culture Collection 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604 USA）ＮＣＹＣ - ナショナル・コレクション・オブ・イースト・カルチャーズ、ザ・フード・リサーチ・インスティテュート、ＮＲ４７ＵＡ連合王国、ノルウィッチ、コルネイレーン（National Collection of Yeast Cultures, The Food Research Institute, Colney Lane, Norwich, United Kingdom NR4 7UA）

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９４年６月１６日【補正内容】差し替え用紙第１１頁の翻訳文：原翻訳文第１４頁第１行〜第１５頁第５行（請求の範囲全文）と差し替える。請求の範囲１下記式の化合物；（式中Ｘは永素または-ＳＯ₂ＮＨ₂基である）をトランス４Ｓ６Ｓ異性体をシス４Ｒ６Ｓ異性休より多く製造する酵素的還元系と接触させることによって、下記式の化合物；に変換する方法。２酵素的還元系が適当な微生物の全細胞または破壊された細胞として提供される請求項１に記載の方法。３生成物の少なくとも９０％が４Ｓ，６Ｓ異性体である請求項１または２に記載の方法。４ｐＨが２から５である請求項１から３のいずれかに記載の方法。５還元酵素がラクトバチルスプランタルム（Lactobacillus plantarum）、ピチアハプロフィラ（Pichia haplophia）、カンジダユーティリス（Candid autilis）、ラクトバチルスブフネリ（Lactobacillus buchneri）・アスペルギルスフラブスオリゼー（Aspergillus flavus oryzae）あるいは特にニューロスボラクラッサ（Neurospora crassa）から得られたものである請求項１から４のいずれかに記載の方法。６酵素系が適当な微生物の全細胞として供給され、また酵素還元系における酵素の補因子の還元ができるように基質が供給されている請求項１から５のいずれかに記載の方法。７基質がグルコース、フルクトース、スクロース、グリセロールまたは乳酸である請求項６に記載の方法。８温度が２０℃から４０℃である請求項１から７のいずれかに記載の方法。９グルコースの濃度が５から５０ｇ／リットルである請求項１から８のいずれかに記載の方法。１０反応体が１リットルあたり５から１０ｇ存在している請求項１から９のいずれかに記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｒ 1:84） (Ｃ１２Ｐ 41/00 Ｃ１２Ｒ 1:72） (Ｃ１２Ｐ 41/00 Ｃ１２Ｒ 1:225） (Ｃ１２Ｐ 41/00 Ｃ１２Ｒ 1:67） (Ｃ１２Ｐ 41/00 Ｃ１２Ｒ 1:645） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１下記式の化合物；（式中Ｘは水素または-ＳＯ₂ＮＨ₂基である）を酵素的還元系と接触させることによって下記式の化合物；に変換する方法。２酵素的還元系が適当な微生物の全細胞または破壊された細胞として提供される請求項１に記載の方法。３生成物の少なくとも９０％が４Ｓ，６Ｓ異性体である請求項１または２に記載の方法。４ｐＨが２から５である請求項１から３のいずれかに記載の方法。５還元酵素がラクトバチルスプランタルム（Lactobacillus plantarum）、ピチアハプロフィラ（Pichia haplophia）、カンジダユーティリス（Candid autilis）、ラクトバチルスブフネリ（Lactobacillus buchneri）、アスペルギルスフラブスオリゼー（Aspergillus flavus oryzae）あるいは特にニューロスボラクラッサ（Neurospora crassa）から得られたものである請求項１から４のいずれかに記載の方法。６酵素系が適当な微生物の全細胞として供給され、また酵素還元系における酵素の補因子の還元ができるように基質が供給されている請求項１から５のいずれかに記載の方法。７基質がグルコース、フルクトース、スクロース、グリセロールまたは乳酸である請求項６に記載の方法。８温度が２０℃から４０℃である請求項１から７のいずれかに記載の方法。９反応体の濃度が５から５０ｇ／リットルである請求項１から８のいずれかに記載の方法。１０グルコースが１リットルあたり５から１０ｇ存在している請求項１から９のいずれかに記載の方法。