JP2000279192A - ミゾリビンの生産方法 - Google Patents
ミゾリビンの生産方法Info
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- JP2000279192A JP2000279192A JP2000031359A JP2000031359A JP2000279192A JP 2000279192 A JP2000279192 A JP 2000279192A JP 2000031359 A JP2000031359 A JP 2000031359A JP 2000031359 A JP2000031359 A JP 2000031359A JP 2000279192 A JP2000279192 A JP 2000279192A
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
- C12P19/28—N-glycosides
- C12P19/38—Nucleosides
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
- C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
- C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
- C07H19/052—Imidazole radicals
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 微生物学的方法によるミゾリビンの製造方法
の提供。 【解決手段】 本発明はミゾリビンを生産するための発
酵方法に関し、Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属に属する
微生物を培養することを特徴とする。
の提供。 【解決手段】 本発明はミゾリビンを生産するための発
酵方法に関し、Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属に属する
微生物を培養することを特徴とする。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はミゾリビンの生産方
法に関する。特に、本発明はミゾリビンを生産するため
の発酵方法に関し、Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属に属
する微生物を培養することを特徴とする。
法に関する。特に、本発明はミゾリビンを生産するため
の発酵方法に関し、Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属に属
する微生物を培養することを特徴とする。
【０００２】
【従来技術】ミゾリビンはブレジニン（５−ヒドロキシ
−１−β−Ｄ−リボフラノシル−１Ｈ−イミダゾール−
４−カルボキサミド）としても知られ、細胞毒性及び免
疫抑制活性をもつ公知ヌクレオシド抗生物質であり、一
般にＥｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｂｒｅｆｅｌｄｉａ
ｎｕｍにより生産され（米国特許第３，８８８，８４３
号）、３５０μｇ／ｍｌの力価を示すブロスを提供する
と報告されている（Ｍｉｚｕｎｏら，Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，ｖｏｌ．ＸＸＶＩＩ，
Ｎｏ．１０，ｐｐ．７７５−７８２，１９７４）。
−１−β−Ｄ−リボフラノシル−１Ｈ−イミダゾール−
４−カルボキサミド）としても知られ、細胞毒性及び免
疫抑制活性をもつ公知ヌクレオシド抗生物質であり、一
般にＥｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｂｒｅｆｅｌｄｉａ
ｎｕｍにより生産され（米国特許第３，８８８，８４３
号）、３５０μｇ／ｍｌの力価を示すブロスを提供する
と報告されている（Ｍｉｚｕｎｏら，Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，ｖｏｌ．ＸＸＶＩＩ，
Ｎｏ．１０，ｐｐ．７７５−７８２，１９７４）。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明者らの菌株コレ
クションでＧＮ−８３と命名し、１９９８年９月２４日
付けでＤｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ
Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ（ＤＳＭＺ）に寄託
（受託番号ＤＳＭ１２６１５）したＥｕｐｅｎｉｃｉｌ
ｌｉｕｍ ｊａｖａｎｉｃｕｍの発酵を想定する微生物
学的方法によりミゾリビンを製造できることが今般判明
した。
クションでＧＮ−８３と命名し、１９９８年９月２４日
付けでＤｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ
Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ（ＤＳＭＺ）に寄託
（受託番号ＤＳＭ１２６１５）したＥｕｐｅｎｉｃｉｌ
ｌｉｕｍ ｊａｖａｎｉｃｕｍの発酵を想定する微生物
学的方法によりミゾリビンを製造できることが今般判明
した。
【０００４】
【課題を解決するための手段】生産生物はＡｕｒａｎｇ
ａｂａｄ（インド）で採取した土壌サンプルから単離
し、Ｊ．Ｉ．Ｐｉｔにより“Ｔｈｅ Ｇｅｎｕｓ Ｐｅ
ｎｉｃｉｌｌｉｕｍ”，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓ
ｓ，Ｌｏｎｄｏｎ １９７９に提案されている基準に従
って分類した。
ａｂａｄ（インド）で採取した土壌サンプルから単離
し、Ｊ．Ｉ．Ｐｉｔにより“Ｔｈｅ Ｇｅｎｕｓ Ｐｅ
ｎｉｃｉｌｌｉｕｍ”，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓ
ｓ，Ｌｏｎｄｏｎ １９７９に提案されている基準に従
って分類した。
【０００５】微生物、コロニー及び形態の特徴を以下に
説明する。麦芽エキス寒天（ＭＥＡ）上の増殖過程を２
５℃で７日間インキュベーション後に評価した。
説明する。麦芽エキス寒天（ＭＥＡ）上の増殖過程を２
５℃で７日間インキュベーション後に評価した。
【０００６】コロニーは４３ｍｍの平均直径をもち、均
質で毛羽だったベルベット様の縁の白い表面をもち、４
〜５ｍｍのクラウンを示し、中心は一様に黄色である。
多くの場合に、白色菌糸体を含むセクターの出現と、白
色セクターに存在する浸出液の不在が観察された。
質で毛羽だったベルベット様の縁の白い表面をもち、４
〜５ｍｍのクラウンを示し、中心は一様に黄色である。
多くの場合に、白色菌糸体を含むセクターの出現と、白
色セクターに存在する浸出液の不在が観察された。
【０００７】コロニーの裏面はクリームイエローであ
り、セクターは暗色の着色を示す。拡散性色素は認めら
れない。
り、セクターは暗色の着色を示す。拡散性色素は認めら
れない。
【０００８】１５日間インキュベーション後に培養基質
ＭＥＡ上のみで分化した閉子器が成熟する。閉子器は球
形を示し、１００〜２００μｍの寸法をもち、クリーム
イエローであり、均質な菌糸下層を形成する。
ＭＥＡ上のみで分化した閉子器が成熟する。閉子器は球
形を示し、１００〜２００μｍの寸法をもち、クリーム
イエローであり、均質な菌糸下層を形成する。
【０００９】子嚢果に含まれる子嚢胞子は曲線状であ
り、３．０〜３．５μｍの寸法をもつ。子嚢胞子は明白
な表面刻紋も溝も示さない。
り、３．０〜３．５μｍの寸法をもつ。子嚢胞子は明白
な表面刻紋も溝も示さない。
【００１０】Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｊａｖａｎ
ｉｃｕｍにおいて、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属に属する
とみなされる非晶質生殖構造の分化はＭＥＡ基質上のみ
で１５日間培養後に開始する。
ｉｃｕｍにおいて、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属に属する
とみなされる非晶質生殖構造の分化はＭＥＡ基質上のみ
で１５日間培養後に開始する。
【００１１】数的に少ない分生子柄は気中菌糸にそれ自
体形成され、３０μｍを越える可変長をもつ柄を分化す
る。
体形成され、３０μｍを越える可変長をもつ柄を分化す
る。
【００１２】箒状体は単層であり、分生子柄頭当たり少
数（３〜６）の瓶様分生子をもつ。分生子の頂部の分生
子連鎖は可変長をもつ。
数（３〜６）の瓶様分生子をもつ。分生子の頂部の分生
子連鎖は可変長をもつ。
【００１３】コロニーが成熟するにつれて、分生子柄の
数と分生子連鎖長はコロニーの所定のセクターで増加す
る傾向がある。コロニーが１カ月齢の場合にＭＥＡ上に
分生子柄が存在すると、コロニーの所定領域は薄緑色が
かる。分生子は球形であり、平滑な壁をもち、１．５〜
２．５μｍの寸法をもつ。
数と分生子連鎖長はコロニーの所定のセクターで増加す
る傾向がある。コロニーが１カ月齢の場合にＭＥＡ上に
分生子柄が存在すると、コロニーの所定領域は薄緑色が
かる。分生子は球形であり、平滑な壁をもち、１．５〜
２．５μｍの寸法をもつ。
【００１４】
【発明の実施の形態】本発明はミゾリビンを生産するた
めの発酵方法を提供し、該方法は炭素と窒素の同化源を
含む栄養液体培地でＥｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｊａ
ｖａｎｉｃｕｍ菌株の存在下に好気条件で発酵を実施す
ることを特徴とする。本発明の方法は２３℃〜３３℃の
温度で３〜７日間実施すると有利である。更に、付加無
機粉末組成物の存在下に発酵を実施すると有利な場合が
ある。
めの発酵方法を提供し、該方法は炭素と窒素の同化源を
含む栄養液体培地でＥｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｊａ
ｖａｎｉｃｕｍ菌株の存在下に好気条件で発酵を実施す
ることを特徴とする。本発明の方法は２３℃〜３３℃の
温度で３〜７日間実施すると有利である。更に、付加無
機粉末組成物の存在下に発酵を実施すると有利な場合が
ある。
【００１５】更に、本発明は発酵ブロスから生産される
につれてミゾリビンを精製及び／又は医薬的に許容可能
なその組成物を製造する段階を含む。
につれてミゾリビンを精製及び／又は医薬的に許容可能
なその組成物を製造する段階を含む。
【００１６】発酵は２３℃〜３３℃、好ましくは２５℃
〜２９℃の温度で３〜７日間、好ましくは４〜６日間液
相で撹拌下に実施する。
〜２９℃の温度で３〜７日間、好ましくは４〜６日間液
相で撹拌下に実施する。
【００１７】菌株を予備培養した後、通気ファーメンタ
ーに接種して多量のミゾリビンを得ることが好ましい。
ーに接種して多量のミゾリビンを得ることが好ましい。
【００１８】Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｊａｖａｎ
ｉｃｕｍの増殖に使用する培地は炭素、窒素及び好まし
くは無機塩源から構成される。炭素源としては例えば澱
粉、デキストロース、デキストリン、グルコース、フル
クトース、グリセリン、サッカロース、マンニトール、
マンノース等が挙げられ、窒素源としては例えば麦芽エ
キス、コーンスティープリカー、カゼインの酵素水解
物、大豆粉、乾燥酵母、ペプトン、大豆ペプトン、肉エ
キス、硝酸塩、アミノ酸、カゼイン等が挙げられる。硝
酸アンモニウムや硫酸アンモニウム等のアンモニウム塩
を使用しても良好な結果が得られる。生産に使用する無
機塩は培地によって異なり、ナトリウム、カリウム、マ
グネシウム、硫酸、塩化物、硝酸イオン等を提供する可
溶性無機塩を使用することができる。このような塩とし
ては、例えば第一リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、
第一硫酸カリウム、硝酸ナトリウムが挙げられる。炭酸
カルシウムを加えても有用である。
ｉｃｕｍの増殖に使用する培地は炭素、窒素及び好まし
くは無機塩源から構成される。炭素源としては例えば澱
粉、デキストロース、デキストリン、グルコース、フル
クトース、グリセリン、サッカロース、マンニトール、
マンノース等が挙げられ、窒素源としては例えば麦芽エ
キス、コーンスティープリカー、カゼインの酵素水解
物、大豆粉、乾燥酵母、ペプトン、大豆ペプトン、肉エ
キス、硝酸塩、アミノ酸、カゼイン等が挙げられる。硝
酸アンモニウムや硫酸アンモニウム等のアンモニウム塩
を使用しても良好な結果が得られる。生産に使用する無
機塩は培地によって異なり、ナトリウム、カリウム、マ
グネシウム、硫酸、塩化物、硝酸イオン等を提供する可
溶性無機塩を使用することができる。このような塩とし
ては、例えば第一リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、
第一硫酸カリウム、硝酸ナトリウムが挙げられる。炭酸
カルシウムを加えても有用である。
【００１９】発酵は種々の容量のファーメンターでフラ
スコ中で実施することができる。
スコ中で実施することができる。
【００２０】分析方法 クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ） Ｂｅｃｋｍａｎクロマトグラフィー装置システム：−１
２６ポンプ、−１６８デテクター、−５０７ｅオートサ
ンプラー。
２６ポンプ、−１６８デテクター、−５０７ｅオートサ
ンプラー。
【００２１】注入ループの容量は５０μｌとした。５μ
ｍ ＬＩＣＨＲＯＳＯＲＢを充填したステンレス鋼カラ
ム（１５ｃｍ×６．０ｍｍ内径）を室温で使用した。移
動相は７０ｍＭ第一リン酸カリウム（ｐＨ２．５）−ア
セトニトリル（３０：７０）を流速１．０ｍｌ／分で流
した。カラム流出液を２８０ｎｍで０．０５０の吸光度
感度で監視した。
ｍ ＬＩＣＨＲＯＳＯＲＢを充填したステンレス鋼カラ
ム（１５ｃｍ×６．０ｍｍ内径）を室温で使用した。移
動相は７０ｍＭ第一リン酸カリウム（ｐＨ２．５）−ア
セトニトリル（３０：７０）を流速１．０ｍｌ／分で流
した。カラム流出液を２８０ｎｍで０．０５０の吸光度
感度で監視した。
【００２２】試料調製 遠心（３０００ｒｐｍで１０分間）後に、透明上清の適
当に希釈した５０μｌアリコートをＨＰＬＣシステムに
注入した。
当に希釈した５０μｌアリコートをＨＰＬＣシステムに
注入した。
【００２３】定量 水中濃度１００μｇ／ｍｌのミゾリビンストック溶液を
調製した。ミゾリビン標準溶液を使用し、２５〜１００
μｇ／ｍｌの濃度で培養ブロス試料を試験した。
調製した。ミゾリビン標準溶液を使用し、２５〜１００
μｇ／ｍｌの濃度で培養ブロス試料を試験した。
【００２４】有機相を場合により乾燥し、同一溶剤又は
混合溶剤（例えば、ブタノール／酢酸／水）に再懸濁
し、濃縮後にミゾリビンを含む粗沈殿が得られる。
混合溶剤（例えば、ブタノール／酢酸／水）に再懸濁
し、濃縮後にミゾリビンを含む粗沈殿が得られる。
【００２５】発酵後の粗生成物の精製は、例えば水と有
機溶剤（例えばアセトン、酢酸、メタノール、ブタノー
ル、クロロホルム）の混合物を溶離剤として使用するク
ロマトグラフィーカラムを使用して実施することができ
る。
機溶剤（例えばアセトン、酢酸、メタノール、ブタノー
ル、クロロホルム）の混合物を溶離剤として使用するク
ロマトグラフィーカラムを使用して実施することができ
る。
【００２６】実施例１ 菌株増殖 以下の組成（ＭＥＡ：麦芽エキス寒天）： 麦芽エキス（Ｄｉｆｃｏ） ２０．０ｇ／ｌ ペプトン（Ｄｉｆｃｏ） １．０ｇ／ｌ デキストロース（Ｒｏｑｕｅｔｔｅ） ２０．０ｇ／ｌ 寒天（Ｄｉｆｃｏ） ２０．０ｇ／ｌ 蒸留水 １０００ｍｌ をもつ寒天傾斜培地でＥｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｊ
ａｖａｎｉｃｕｍ菌株を保存した。
ａｖａｎｉｃｕｍ菌株を保存した。
【００２７】傾斜培地を２６℃で１５〜１８日間インキ
ュベートした。
ュベートした。
【００２８】蒸留水５ｍｌで表面を掻き取ることにより
増殖細胞の約３分の１を除去し、胞子懸濁液を得た。
増殖細胞の約３分の１を除去し、胞子懸濁液を得た。
【００２９】予備培養 上記菌株増殖により得られた懸濁液を予備培養液として
振盪フラスコに接種した。
振盪フラスコに接種した。
【００３０】振盪フラスコ中の培地は以下の組成： カゼインの酵素水解物（Ｄｉｆｃｏ） ３ｇ／ｌ コーンスティープリカー（Ｒｏｑｕｅｔｔｅ） １ｇ／ｌ デキストロース（Ｒｏｑｕｅｔｔｅ） ２０ｇ／ｌ 蒸留水 １０００ｍｌ とした。１２１℃で２０分間滅菌した。
【００３１】各々２個のバッフルをもつ５００ｍｌ容フ
ラスコに上記培地１００ｍｌを分配した。フラスコを２
５０ｒｐｍの回転振盪器で２６℃で２４時間インキュベ
ートした。
ラスコに上記培地１００ｍｌを分配した。フラスコを２
５０ｒｐｍの回転振盪器で２６℃で２４時間インキュベ
ートした。
【００３２】３個のバッフルをもつ２リットル容フラス
コに上記培地７５０ｍｌを入れ、第１回予備培養液の２
％に等しい量を接種することにより第２回目の予備培養
を実施した。フラスコを２００ｒｐｍの回転振盪器で２
６℃で約４８時間インキュベートした。
コに上記培地７５０ｍｌを入れ、第１回予備培養液の２
％に等しい量を接種することにより第２回目の予備培養
を実施した。フラスコを２００ｒｐｍの回転振盪器で２
６℃で約４８時間インキュベートした。
【００３３】発酵 第２回予備培養液の約２％を使用し、以下の組成： 硫酸アンモニウム（Ｍｅｒｃｋ） １０ｇ／ｌ 硝酸アンモニウム（Ｍｅｒｃｋ） １０ｇ／ｌ 第一リン酸カリウム（Ｍｅｒｃｋ） ２ｇ／ｌ 硫酸マグネシウム・７水和物（Ｍｅｒｃｋ） ０．２ｇ／ｌ コーンスティープリカー（Ｒｏｑｕｅｔｔｅ） ２０ｇ／ｌ デキストロース（Ｒｏｑｕｅｔｔｅ） ５０ｇ／ｌ 水道水 １０００ｍｌ をもつ栄養培地１５リットルを入れたジャーファーメン
ターに接種した。
ターに接種した。
【００３４】発酵材料を２６℃〜２８℃で１ｖ／ｖ／分
の通気下に６００ｒｐｍで撹拌しながら９６時間好気条
件でインキュベートした。
の通気下に６００ｒｐｍで撹拌しながら９６時間好気条
件でインキュベートした。
【００３５】培養ブロス濾液でＨＰＬＣによりミゾリビ
ンの生産を定期的に試験した。
ンの生産を定期的に試験した。
【００３６】４〜５日後に６００〜７００μｇ／ｍｌの
最高力価が記録された。
最高力価が記録された。
【００３７】実施例２ 菌株増殖 以下の組成： 麦芽エキス（Ｄｉｆｃｏ） ２０．０ｇ／ｌ 第一リン酸カリウム １．０ｇ／ｌ デキストロース（Ｒｏｑｕｅｔｔｅ） ２０．０ｇ／ｌ 硫酸マグネシウム・７水和物（Ｍｅｒｃｋ） ０．２ｇ／ｌ コーンスティープリカー（Ｒｏｑｕｅｔｔｅ） ２０．０ｇ／ｌ 寒天（Ｄｉｆｃｏ） ２０．０ｇ／ｌ 蒸留水 １０００ｍｌ をもつ寒天傾斜培地でＥｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｊ
ａｖａｎｉｃｕｍ菌株を保存した。
ａｖａｎｉｃｕｍ菌株を保存した。
【００３８】傾斜培地を２６℃で１５〜２０日間インキ
ュベートした。
ュベートした。
【００３９】蒸留水５ｍｌで表面を掻き取ることにより
増殖細胞の約３分の１を除去し、胞子懸濁液を得た。
増殖細胞の約３分の１を除去し、胞子懸濁液を得た。
【００４０】予備培養 以下の組成： カゼインの酵素水解物 ２ｇ／ｌ 大豆ペプトン ５ｇ／ｌ デキストロース １０ｇ／ｌ 蒸留水 １０００ｍｌ をもつ栄養培地を入れた振盪フラスコに、上記菌株増殖
により得られた胞子懸濁液を接種した。１２１℃で２０
分間滅菌した。
により得られた胞子懸濁液を接種した。１２１℃で２０
分間滅菌した。
【００４１】各々２個のバッフルをもつ５００ｍｌ容フ
ラスコに上記培地１００ｍｌを分配した。
ラスコに上記培地１００ｍｌを分配した。
【００４２】フラスコを２５０ｒｐｍの回転振盪器で２
６℃で約４０時間インキュベートした。
６℃で約４０時間インキュベートした。
【００４３】実施例１と同様に第２回予備培養液を調製
し、インキュベートした。
し、インキュベートした。
【００４４】発酵 増殖後、以下の組成： 硫酸アンモニウム ５ｇ／ｌ 硝酸ナトリウム １０ｇ／ｌ 第一リン酸カリウム ２ｇ／ｌ 硫酸マグネシウム・７水和物 ０．２ｇ／ｌ 大豆ペプトン ２０ｇ／ｌ サッカロース ６０ｇ／ｌ 水道水 １０００ｍｌ をもつ栄養培地を入れた１５リットル容ジャーファーメ
ンターに予備培養液を接種した。
ンターに予備培養液を接種した。
【００４５】発酵材料を実施例１と同一条件でインキュ
ベートし、ＨＰＬＣによりミゾリビンの生産を試験した
処、４日後に７５０〜８００μｇ／ｍｌの力価を示し
た。
ベートし、ＨＰＬＣによりミゾリビンの生産を試験した
処、４日後に７５０〜８００μｇ／ｍｌの力価を示し
た。
【００４６】実施例３ 抽出 ｐＨ５．６をもち、７００μｇ／ｍｌのミゾリビンを含
む（実施例１から得られた）培養ブロス５０リットルを
Ｗａｔｈｍａｎ（登録商標）濾紙で濾過し、透明濾液４
０リットルを得た。
む（実施例１から得られた）培養ブロス５０リットルを
Ｗａｔｈｍａｎ（登録商標）濾紙で濾過し、透明濾液４
０リットルを得た。
【００４７】流速３３０ｍｌ／分でＸＡＤ １１８０
（ＲＯＨＭ ＆ ＨＡＡＳ）８リットルを使用して濾液
をカラム（φ１２ｃｍ）に通し、ブロスを脱色した後、
４２０ｎｍの吸光度を読み取った。次に、樹脂を上記と
同一流速で水２０リットルで洗浄した。得られた脱色液
（ｐＨ＝５．８）６０リットルに２０％ＮａＯＨを加え
てｐＨ＝９．０に調整した。液体を流速５００ｍｌ／分
で３０リットルＲｅｌｉｔｅ ２ＡＳ（ＲＥＳＩＮＤＩ
ＯＮ Ｓ．Ｒ．Ｌ．）（ＯＨ−形態）カラム（φ２０ｃ
ｍ）に通し、ミゾリビンを吸着させた。
（ＲＯＨＭ ＆ ＨＡＡＳ）８リットルを使用して濾液
をカラム（φ１２ｃｍ）に通し、ブロスを脱色した後、
４２０ｎｍの吸光度を読み取った。次に、樹脂を上記と
同一流速で水２０リットルで洗浄した。得られた脱色液
（ｐＨ＝５．８）６０リットルに２０％ＮａＯＨを加え
てｐＨ＝９．０に調整した。液体を流速５００ｍｌ／分
で３０リットルＲｅｌｉｔｅ ２ＡＳ（ＲＥＳＩＮＤＩ
ＯＮ Ｓ．Ｒ．Ｌ．）（ＯＨ−形態）カラム（φ２０ｃ
ｍ）に通し、ミゾリビンを吸着させた。
【００４８】樹脂を脱イオン水１２０リットルで洗浄し
た後、２％酢酸で溶離し、１０リットルフラクションを
集めた。
た後、２％酢酸で溶離し、１０リットルフラクションを
集めた。
【００４９】ＨＰＬＣ試験で活性であったフラクション
を集め、減圧濃縮し、油状残渣２２０ｇを得た。
を集め、減圧濃縮し、油状残渣２２０ｇを得た。
【００５０】この残渣をメタノール４００ｍｌ及びアセ
トン１リットルと混合し、４℃で５時間放置して沈殿さ
せた。沈殿をアセトンで洗浄し、減圧乾燥し、粗ミゾリ
ビン１５０ｇを得た（純度１５％）。得られた粉末をブ
タノール：酢酸：水（１０：１：２）混合溶剤に懸濁
し、同一混合溶剤を充填したシリカゲル６０カラム（φ
７ｃｍ）で精製した。
トン１リットルと混合し、４℃で５時間放置して沈殿さ
せた。沈殿をアセトンで洗浄し、減圧乾燥し、粗ミゾリ
ビン１５０ｇを得た（純度１５％）。得られた粉末をブ
タノール：酢酸：水（１０：１：２）混合溶剤に懸濁
し、同一混合溶剤を充填したシリカゲル６０カラム（φ
７ｃｍ）で精製した。
【００５１】５００ｍｌフラクションを集め、油状残渣
（純度４４％）３３ｇが得られるまで最高濃度フラクシ
ョンを減圧濃縮した後、メタノール３０ｍｌに再懸濁
し、アセトン９０ｍｌで沈殿させた。
（純度４４％）３３ｇが得られるまで最高濃度フラクシ
ョンを減圧濃縮した後、メタノール３０ｍｌに再懸濁
し、アセトン９０ｍｌで沈殿させた。
【００５２】沈殿を減圧下にアセトンで洗浄して得られ
た灰色粉末２８ｇをメタノールに懸濁し、クロロホル
ム：メタノール：酢酸（３０：１：１）混合溶剤を充填
した１リットルシリカゲル６０カラム（φ４ｃｍ）に通
し、１：７：７混合物が得られるまで勾配溶離した。５
００ｍｌフラクションを集め、最高濃度フラクションを
減圧濃縮し、油状残渣（純度８５％）１４．５ｇを得、
等容量のアセトンを加え、一晩５℃で放置した。無色ミ
ゾリビン結晶が得られた（１１ｇ）。
た灰色粉末２８ｇをメタノールに懸濁し、クロロホル
ム：メタノール：酢酸（３０：１：１）混合溶剤を充填
した１リットルシリカゲル６０カラム（φ４ｃｍ）に通
し、１：７：７混合物が得られるまで勾配溶離した。５
００ｍｌフラクションを集め、最高濃度フラクションを
減圧濃縮し、油状残渣（純度８５％）１４．５ｇを得、
等容量のアセトンを加え、一晩５℃で放置した。無色ミ
ゾリビン結晶が得られた（１１ｇ）。
【００５３】実施例４ 抽出 ミゾリビン７００μｇ／ｍｌを含む（実施例１から得ら
れたままの）培養ブロス（ｐＨ＝５．６）５０リットル
をＤｉｃａｌｉｔｅ（ＤＩＣＡＬＩＴＥ ＥＵＲＯＰＥ
ＳＵＤ）で減圧濾過した。
れたままの）培養ブロス（ｐＨ＝５．６）５０リットル
をＤｉｃａｌｉｔｅ（ＤＩＣＡＬＩＴＥ ＥＵＲＯＰＥ
ＳＵＤ）で減圧濾過した。
【００５４】透明濾液４０リットルに２０％Ｈ２ＳＯ４
を加えてｐＨ４．５に調整した後、０．０５Ｍ酢酸緩衝
液（ｐＨ４．５）２０リットルを充填した５リットルＣ
ＭＳＥＰＨＡＲＯＳＥ ＦＡＳＴ ＦＬＯＷカラム（φ
１２ｃｍ）に通した。濾液を流速８３ｍｌ／分で吸着さ
せた後、０．０５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）５リット
ルで洗浄し、０．０５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）２５
リットルを更に０．０５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）２
５リットル及び０．５Ｍ ＮａＣｌと混合して勾配溶離
した。
を加えてｐＨ４．５に調整した後、０．０５Ｍ酢酸緩衝
液（ｐＨ４．５）２０リットルを充填した５リットルＣ
ＭＳＥＰＨＡＲＯＳＥ ＦＡＳＴ ＦＬＯＷカラム（φ
１２ｃｍ）に通した。濾液を流速８３ｍｌ／分で吸着さ
せた後、０．０５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）５リット
ルで洗浄し、０．０５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）２５
リットルを更に０．０５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）２
５リットル及び０．５Ｍ ＮａＣｌと混合して勾配溶離
した。
【００５５】１リットルフラクションを集め、最高濃度
フラクションを減圧濃縮し、灰色粉末（純度５５％）４
５ｇを得た。
フラクションを減圧濃縮し、灰色粉末（純度５５％）４
５ｇを得た。
【００５６】粉末をメタノールに懸濁し、クロロホルム
／メタノール／酢酸（１：７：７）の混合溶剤を充填し
た１リットルシリカゲル６０カラム（φ４ｃｍ）で精製
した。
／メタノール／酢酸（１：７：７）の混合溶剤を充填し
た１リットルシリカゲル６０カラム（φ４ｃｍ）で精製
した。
【００５７】５００ｍｌフラクションを集め、ミゾリビ
ンの無色結晶（純度９７％）１８ｇが得られるまで最高
濃度フラクションを減圧濃縮した。
ンの無色結晶（純度９７％）１８ｇが得られるまで最高
濃度フラクションを減圧濃縮した。
【００５８】実施例５ 抽出 ミゾリビン７００μｇ／ｍｌを含む（実施例１から得ら
れたままの）培養ブロス（ｐＨ＝５．６）５０リットル
をＤｉｃａｌｉｔｅ（ＤＩＣＡＬＩＴＥ ＥＵＲＯＰＥ
ＳＵＤ）で減圧濾過した。
れたままの）培養ブロス（ｐＨ＝５．６）５０リットル
をＤｉｃａｌｉｔｅ（ＤＩＣＡＬＩＴＥ ＥＵＲＯＰＥ
ＳＵＤ）で減圧濾過した。
【００５９】透明濾液４０リットルをスルホンポリエー
テル膜で限外濾過精製した。２０％ＮａＯＨを加えて液
体をｐＨ＝９．０に調整した。
テル膜で限外濾過精製した。２０％ＮａＯＨを加えて液
体をｐＨ＝９．０に調整した。
【００６０】液体を５００ｍｌ／分で３０リットルＲｅ
ｌｉｔｅ（ＲＥＳＩＮＤＩＯＮ Ｓ．Ｒ．Ｌ）に通し、
ミゾリビンを吸着させた。
ｌｉｔｅ（ＲＥＳＩＮＤＩＯＮ Ｓ．Ｒ．Ｌ）に通し、
ミゾリビンを吸着させた。
【００６１】樹脂を脱イオン水１２０リットルで洗浄し
た後、２％酢酸で溶離し、１０リットルフラクションを
集めた。
た後、２％酢酸で溶離し、１０リットルフラクションを
集めた。
【００６２】ＨＰＬＣ試験で活性であったフラクション
を集め、減圧濃縮し、油状物１５０ｇを得た。
を集め、減圧濃縮し、油状物１５０ｇを得た。
【００６３】この残渣をメタノール１５０ｍｌ及びアセ
トン３００ｍｌと混合し、５時間４℃で放置して沈殿さ
せた。沈殿をアセトンで洗浄し、減圧乾燥すると、粗ミ
ゾリビン１１０ｇ（純度２０％）が得られた。得られた
粉末をブタノール：酢酸：水（１０：１：２）混合溶剤
に懸濁し、同一混合溶剤を充填したシリカゲル６０カラ
ム（φ７ｃｍ）で精製した。
トン３００ｍｌと混合し、５時間４℃で放置して沈殿さ
せた。沈殿をアセトンで洗浄し、減圧乾燥すると、粗ミ
ゾリビン１１０ｇ（純度２０％）が得られた。得られた
粉末をブタノール：酢酸：水（１０：１：２）混合溶剤
に懸濁し、同一混合溶剤を充填したシリカゲル６０カラ
ム（φ７ｃｍ）で精製した。
【００６４】５００ｍｌフラクションを集め、油状残渣
（純度５５％）３０ｇが得られるまで最高濃度フラクシ
ョンを減圧濃縮した後、メタノール１０ｍｌに再懸濁
し、最後にアセトン３０ｍｌで沈殿させた。
（純度５５％）３０ｇが得られるまで最高濃度フラクシ
ョンを減圧濃縮した後、メタノール１０ｍｌに再懸濁
し、最後にアセトン３０ｍｌで沈殿させた。
【００６５】沈殿をアセトンで減圧洗浄し、一晩減圧放
置した。
置した。
【００６６】無色ミゾリビン結晶が得られた（１３
ｇ）。
ｇ）。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 マリーナ・ニケーレ イタリー国、ミラノ、20020・バンツアゲ ツロ、ビコロ・サンタ・コロナ、３ (72)発明者 エルメス・パガーニ イタリー国、ミラノ、20099・セスト・サ ン・ジヨバンニ、ビア・リソルジメント、 300
Claims (6)
- 【請求項１】 ミゾリビンを生産するための発酵方法で
あって、炭素と窒素の同化源を含む栄養液体培地でＥｕ
ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｊａｖａｎｉｃｕｍ菌株の存
在下に好気条件で発酵を実施することを特徴とする前記
方法。 - 【請求項２】 菌株を予備培養する請求項１に記載の方
法。 - 【請求項３】 ２３℃〜３３℃の温度で３〜７日間実施
する請求項１又は２に記載の方法。 - 【請求項４】 ２５℃〜２９℃の温度で４〜６日間実施
する請求項３に記載の方法。 - 【請求項５】 付加無機塩の存在下に発酵を実施する請
求項１から４のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項６】 ミゾリビンの精製及び／又は医薬的に許
容可能なその組成物の製造を含む請求項１から５のいず
れか一項に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP99103099.0 | 1999-02-17 | ||
| EP99103099A EP1029927B1 (en) | 1999-02-17 | 1999-02-17 | Process for producing mizoribine by Eupenicillium javanicum |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000279192A true JP2000279192A (ja) | 2000-10-10 |
| JP4443708B2 JP4443708B2 (ja) | 2010-03-31 |
Family
ID=8237570
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000031359A Expired - Fee Related JP4443708B2 (ja) | 1999-02-17 | 2000-02-09 | ミゾリビンの生産方法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1029927B1 (ja) |
| JP (1) | JP4443708B2 (ja) |
| KR (1) | KR100574189B1 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113789269B (zh) * | 2021-09-13 | 2023-05-23 | 福建省微生物研究所 | 一种发酵产咪唑立宾的正青霉菌株及其应用 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB1363622A (en) * | 1973-05-17 | 1974-08-14 | Toyo Jozo Kk | Immuno-suppressive agent bredinin |
| US3888843A (en) * | 1973-06-12 | 1975-06-10 | Toyo Jozo Kk | 4-carbamoyl-1-' -d-ribofuranosylimidazolium-5-olate |
| JPH09194497A (ja) * | 1996-01-12 | 1997-07-29 | Banyu Pharmaceut Co Ltd | 抗菌性物質ｂｅ−５３５９４類及びその製造法 |
-
1999
- 1999-02-17 EP EP99103099A patent/EP1029927B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2000
- 2000-02-09 JP JP2000031359A patent/JP4443708B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2000-02-16 KR KR1020000007296A patent/KR100574189B1/ko not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1029927A1 (en) | 2000-08-23 |
| KR20000058067A (ko) | 2000-09-25 |
| JP4443708B2 (ja) | 2010-03-31 |
| EP1029927B1 (en) | 2002-10-23 |
| KR100574189B1 (ko) | 2006-04-27 |
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