JPH08503071A

JPH08503071A - 化学発光ラベル及びビオチン結合リガンドによる抗体の２サイトイムノアッセイ

Info

Publication number: JPH08503071A
Application number: JP6511617A
Authority: JP
Inventors: ヨハンセン，ニールズ; イプセン，ハンス−ヘンリツク
Original assignee: アー・エル・カー・ラボラトリエネ・アー／エス
Priority date: 1992-11-13
Filing date: 1993-11-15
Publication date: 1996-04-02
Anticipated expiration: 2016-07-30
Also published as: EP0669000A1; HU216876B; AU682478B2; WO1994011734A1; CA2149340A1; NO320170B1; NO951875D0; ES2103559T3; KR950704686A; KR100306433B1; RU2132070C1; FI111194B; JP3194585B2; FI952330L; DK0669000T3; DK137992D0; EP0669000B1; PL309004A1; PL173049B1; NO951875L

Abstract

(57)【要約】標識化合物を使用してサンプル中の抗体を検出する方法であって、ビオチンに結合したリガンド抗原、抗体又はハプテンを、サンプル；常磁性粒子に結合した被検出抗体に対して向性の抗体；及びアビジン又はストレプトアビジンに結合した化学発光アクリジニウム化合物と混合し、固相複合体を形成する段階と；固相を液相から分離する段階と；分離した固相に化学発光複合体が存在するか否かを分析する段階とを含む方法。

Description

【発明の詳細な説明】化学発光ラベル及びビオチン結合リガンドによる抗体の２サイトイムノアッセイ本発明は化学発光標識化合物を使用してサンプル中の抗体を検出する方法に関する。より詳細には本発明は、アフィニティー複合体を常磁性粒子上で捕獲する２サイトイムノアッセイにおける、アビジン又はストレプトアビジンに結合した化学発光アクリジニウムエステル化合物及びビオチンに結合したリガンドの使用に関し、サンプル（例えば生物体液及び組織サンプル、乳汁、食品サンプル、飲料、水又は工業廃液等）中の免疫学的に活性な物質（例えば抗体）を迅速に検出及び／又は定量することが可能である。血清中の免疫グロブリンＥ抗体の検出及び定量方法は、ＣｉｂａＣｏｒｎｉｎｇＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓＣｏｒｐ．ａｎｄＡＬＫＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓにより１９９０年９月に発行された小冊子“ＳｐｅｃｉｆｉｃＩｇＥ，Ｍａｇｉｃ（登録商標）ＬｉｔｅＳＱ（商標）”に開示されている。この方法では、常磁性粒子に共有結合した特異的アレルゲンを血清又は血漿サンプル中のアレルゲン特異的ＩｇＥ抗体と反応させる。最初のインキュベーション期間後に結合しなかった非特異的ＩｇＥを洗い落とした後、化学発光アクリジニウムエステルで標識した抗ＩｇＥモノクローナル抗体を加える。第２のインキュベーション期間後、化学発光反応を開始する試薬を自動注入するＭａｇｉｃＬｉｔｅ（登録商標）Ａｎａｌｙｚｅｒ（カタログ番号４７２７３３又は４７２２７０）で固相結合標識化抗体を測定する。この方法を使用すると、化学発光を開始及び測定する最終段階しか自動化することができない。化学発光アクリジニウムエステル標識化合物は米国特許第４，７４５，１８１号に記載されている。米国特許第４，９４６，９５８号はＮ−スクシンイミジル部分に結合した化学発光アクリジニウムエステルを開示しており、該Ｎ−スクシンイミジル部分を更にタンパク質又はポリペプチドと結合し、免疫学的に反応性の発光試薬を提供することができる。該試薬は、固相抗体、抗原分子及び標識化抗抗体を同時に結合し、固相を分離洗浄し、固相の発光を定量する段階を含み得るイムノアッセイで使用することができる。Ｓｔｒａｓｂｕｒｇｅｒらは、第２のビオチン標識抗体を介してアビジンに結合した化学発光物質で標識され且つマイクロタイタープレートに固定された抗体によりｈＧＨ及びｈＣＧホルモンを捕獲する２サイト化学発光イムノアッセイの使用をＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８４（１９９０），４８１〜４９６頁に開示している。この方法ではタンパクホルモン等の抗原性分析物を血清サンプルから直接定量し、標準曲線と比較することができる。しかしながら、ＩｇＥ等の免疫グロブリンの濃度は患者依存性が高く、特異的ＩｇＥのアッセイを全ＩｇＥの個体患者レベルと比較しなければならないので、Ｓｔｒａｓｂｕｒｇｅｒらにより開示されているアッセイで得られるよりも広いダイナミックレンジを有するアッセイが必要である。ヨーロッパ特許公開第０４２５２１７号は、常磁性粒子に結合した第１の標識化ヌクレオチドプローブと、アビジンーアクリジニウムエステルに結合した第２のビオチン標識化ヌクレオチドプローブとにハイブリダイズした核酸からなる化学発光複合体を形成するハイブリダイゼーションアッセイを開示している。しかしながら、完全に自動化された抗体検出方法を提供するという問題に直面した当業者は、単一の反応容器中で好ましくは周囲反応条件下で実施することが可能な方法を求めることになろう。この文献に提示されているアッセイは、特異的抗体を誘発し得る抗原ではない特異的ヌクレオチド配列の検出を使用しているので根本的に異なる。より詳細にはこのアッセイでは、ハイブリダイゼーションのための高温と、イムノアッセイに必要でも望ましくもないハプテン −オリゴヌクレオチドプローブとを使用することが必要である。血清等の生物体液中の免疫グロブリン（例えば特異的免疫グロブリンＥ）のような免疫学的に活性な分子の定量のためのイムノアッセイは現在までマニュアル（例えばＥＬＩＳＡ）又は半自動で行われている。半自動イムノアッセイ（例えば上記Ｍａｇｉｃ（登録商標）ＬｉｔｅＳＱ（商標）特異的ＩｇＥアッセイ）の典型的な所要時間は約２時間である。更に、市販の特異的ＩｇＥアッセイ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａにより市販されているＣＡＰ，ＲＡＳＴ）及びＭａｇｉｃ（登録商標）ＬｉｔｅＳＱ（商標）特異的ＩｇＥアッセイは別のプロトコルを有する全ＩｇＥリファレンスアッセイを使用するのでデータが不正確である。同一の捕獲及び検出手順を使用するアッセイのみが直接比較可能である。例えば、特異的ＩｇＥの全近接応答曲線は全ＩｇＥ応答曲線に平行でなければならない。その理由は、特異的（又は全？）ＩｇＥアッセイに必要なダイナミックレンジは２ディケードであり、全ＩｇＥアッセイに必要なダイナミックレンジは２〜７ディケードであり、既存のイムノアッセイでは全範囲に亙って濃度を測定することができないからである。従って従来は、特異的免疫グロブリンアッセイと全免疫グロブリンアッセイで試薬が異なる場合には異なるプロトコルを使用することが必要であった。安全な実験室手順に関心が高まっていることから、生物体液（例えばヒト血清、血漿、血液、乳汁、尿又は唾液等）中で抗体等の物質を完全に自動的に検出し、危険な流体との接触の危険を最小限にする方法が必要になっている。また、診断法における実験室試験の使用が増加しているため、所要時間が短く、好ましくは数分間しか要さない方法が必要になっている。従って、本発明の目的は安全、迅速且つ完全に自動化可能な、サンプル中の抗体の検出方法を提供することである。この目的は、ａ）ビオチン又はその機能的誘導体に結合したリガンド抗原、抗体又はハプテン；常磁性粒子に結合した被検出抗体に対して向性の抗体；及びアビジン、ストレプトアビジン又はその機能的誘導体に結合した化学発光アクリジニウム化合物をサンプルと混合し、固相結合複合体を形成し、ｂ）固相を液相から磁気的に分離し、ｃ）化学発光反応を開始し、分離した固相に化学発光複合体が存在するか否かを分析し、化学発光の存在が検出された場合には前記サンプル中に前記抗体が存在すると判断することを特徴とする本発明の方法により達せられる。本発明の方法は上記段階（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）により実施することができるが、標識用化合物を別段階で加えたほうが好ましく、該方法は好ましくは、ｉ）ビオチン又はその機能的誘導体に結合したリガンド抗原、抗体又はハプテンを、常磁性粒子に結合した被検出抗体に対して向性の抗体及びサンプルと混合し、第１の固相複合体を形成する段階と、ｉｉ）アビジン、ストレプトアビジン又はその機能的誘導体に共有結合した化学発光アクリジニウム化合物を加え、第２の固相複合体を形成する段階と、ｉｉｉ）固相を液相から磁気的に分離する段階と、ｉｖ）化学発光反応を開始し、分離した固相に化学発光複合体が存在するか否かを分析する段階とに従って実施される。本発明の特定の目的は、同一プロトコルを使用する真にパラレルなリファレンスイムノアッセイをリファレンスとして使用して、免疫グロブリン等の特異的抗体を定量するための完全に自動化可能なイムノアッセイを提供することである。真にパラレルなリファレンスイムノアッセイを使用して特異的抗体を定量するという目的は、液体サンプル中の特異的抗体の濃度及び／又は相対含有量を測定する方法により達せられ、該方法によると、化学発光ラベルに結合した捕獲特異的抗体を含む分離固相の発光測定値と、前記特異的抗体が属する抗体クラスのサンプル中総含有量を測定する真にパラレルなリファレンスイムノアッセイで得られた発光測定値とを比較する。特異的抗体の定量は好ましくは、ａ）ビオチン又はその機能的誘導体に結合した被測定特異的抗体に対して向性のリガンド抗原又はハプテン；常磁性粒子に結合した被測定抗体の不変部に対して向性の抗体；及びアビジン、ストレプトアビジン又はその機能的誘導体に結合した化学発光アクリジニウム化合物をサンプルと混合し、固相複合体を形成し、ｂ）固相を液相から磁気的に分離し、ｃ）化学発光反応を開始し、発光を測定することにより、化学発光ラベルに結合した捕獲特異的抗体を含む分離固相の発光を得る方法により達せられ、前記特異的抗体が属する抗体クラスのリファレンスイムノアッセイは、ａ）ビオチン又はその機能的誘導体に結合した前記被測定抗体クラスに対して向性のリガンド抗体；常磁性粒子に結合した被測定抗体クラスの不変部に対して向性の抗体；及びアビジン、ストレプトアビジン又はその機能的誘導体に結合した化学発光アクリジニウム化合物をサンプルと混合し、固相複合体を形成する段階と、ｂ）固相を液相から磁気的に分離する段階と、ｃ）化学発光反応を開始し、発光を測定する段階とを含む。別の好適方法は、ｉ）ビオチン又はその機能的誘導体に結合した被測定特異的抗体に対して向性のリガンド抗原又はハプテンを、常磁性粒子に結合した被測定抗体の不変部に対して向性の抗体及びサンプルと混合し、第１の固相複合体を形成し、ｉｉ）アビジン、ストレプトアビジン又はその機能的誘導体に共有結合した化学発光アクリジニウム化合物を加え、第２の固相複合体を形成し、ｉｉｉ）固相を液相から磁気的に分離し、ｉｖ）化学発光反応を開始し、発光を測定することにより、化学発光ラベルに結合した捕獲特異的抗体を含む分離固相の発光を得る方法であり、前記特異的抗体が属する抗体クラスのリファレンスイムノアッセイは、ｉ）ビオチン又はその機能的誘導体に結合した前記被測定抗体クラスに対して向性のリガンド抗体を、常磁性粒子に結合した被測定抗体クラスの不変部に対して向性の抗体及びサンプルと混合し、第１の固相複合体を形成する段階と、ｉｉ）アビジン、ストレプトアビジン又はその機能的誘導体に共有結合した化学発光アクリジニウム化合物を加え、第２の固相複合体を形成する段階と、ｉｉｉ）固相を液相から磁気的に分離する段階と、ｉｖ）化学発光反応を開始し、発光を測定する段階とを含む。サンプル中の被測定特異的抗体は好ましくは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ及びそのアイソタイプからなる群から選択される特異的免疫グロブリンであり、前記抗体の可変部に対して向性のリガンド抗原、抗体又はハプテンは好ましくはアレルゲンであり、抗体のクラスは好ましくは全ＩｇＡ、全ＩｇＤ、全ＩｇＥ、全ＩｇＧ、全ＩｇＭ及びそのアイソタイプからなる群から選択される免疫グロブリンクラスであり、リガンド抗原、抗体又はハプテンは前記免疫グロブリンクラスに対して向性の抗体である。より好ましくは、特異的免疫グロブリンは特異的ＩｇＥであり、抗体クラスは全ＩｇＥである。常磁性粒子に結合した被測定抗体に対して向性の抗体は好ましくは、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（組換え抗体、抗体フラグメントを含む）からなる群から選択され、好ましくはモノクローナルマウス抗免疫グロブリンである。本発明の利点を以下に述べる。 −全試薬を１つの反応容器で同時に混合することができるので、汚染の危険、過誤及び操作段階を最小限にし、イムノアッセイの所要時間を大幅に短縮し、プロセスの自動化を著しく助長すると共に、精度を改善する（実施例６参照）。 −同一プロトコルを使用する真にパラレルな完全抗体アッセイを参照して例えば血清サンプル中の特異的抗体の定量を実施することができる（実施例３参照）。 −高い能力及び感度が得られるため、非常に低濃度の免疫グロブリン及び低濃度の特異免疫グロブリンを容易に検出することができる（実施例１、２及び７参照）。本発明の好適態様は、サンプル（例えば血清又は唾液）中の抗体、例えば特異的免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ及びそのアイソタイプ）の検出のためのイムノアッセイである。特に、本発明はサンプル中の特異的ＩｇＥの検出及び定量のためのアッセイで使用することができる。サンプルが液体、例えば血清又は血漿である場合には、好ましくは懸濁常磁性粒子に結合したモノクローナルマウス抗ＩｇＥ抗体とビオチンに結合した特異的アレルゲン（リガンド）とを水性媒体中に含む反応容器にサンプルを直接加えることができる。ビオチンは好ましくはビオチンアミドカプロエートＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｂ２６４３）である。サンプルが非液体（例えば組織サンプル）である場合には、均質化して水性液体に懸濁するのが好ましい。サンプル中の特異的ＩｇＥ、アレルゲン及びモノクローナル抗ＩｇＥ抗体が水性媒体中で同時に反応する結果、共役体が形成される。化学発光標識用化合物、好ましくはストレプトアビジンに結合したアクリジニウムエステル（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｓ４７６２）（アビジン−ＤＭＡＥ）を反応容器に加え、共役体に結合したビオチン及び共役しなかったアレルゲン結合ビオチンとアビジン−ＤＭＡＥとの結合反応を生じる。反応混合物を磁気的に分離し、上清をデカントすることにより、共役体に結合したラベルを結合しなかったＤＭＡＥ標識化抗体から分離する。分離した共役体の化学発光は、Ｐａｚｚａｇｌｉ，Ｍ．ら（編），Ｓｔｕｄｉｅｓａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｉｎ “Ｂｉｏｌｏｇｙ＆Ｍｅｄｉｃｉｎｅ”，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅａｎｄＣｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓｅ４（１），１−６４６，１９８９に記載されているように測定する。リファレンスとして、好ましくはビオチンに結合したポリクローナル抗ＩｇＥ抗体をリガンドとして使用する点のみが異なる真にパラレルな全ＩｇＥイムノアッセイを同時に実施する。図１は本発明の特異的ＩｇＥアッセイとパラレルな全ＩｇＥリファレンスアッセイを併記した説明図である。図中、（１）は被検出特異的ＩｇＥ抗体を示し、（２）はビオチンに結合した特異的アレルゲンであり、（３）は常磁性粒子に結合したモノクローナルマウス抗ＩｇＥであり、（４）はアビジン−アクリジニウムエステルであり、（５）は（１）、（２）、（３）及び（４）の間で形成された固相標識化複合体を示し、任意インキュベーション、分離及び任意洗浄段階を含み、（６）は化学発光反応を開始し、発光を測定する最終段階を示す。図１の全ＩｇＥリファレンスアッセイにおいて、（７）はＩｇＥ（ＷＨＯ７５／５０２ＩＵ／ｍｌ）を示し、（８）はビオチンに結合したポリクローナル抗ＩｇＥであり、（９）は懸濁常磁性粒子に結合したモノクローナルマウス抗ＩｇＥであり、（１０）はアビジン−アクリジニウムエステルであり、（１１）は（７）、（８）、（９）及び（１０）の間で形成された固相標識化複合体を示し、任意インキュベーション、分離及び任意洗浄段階を含み、（１２）は化学発光反応を開始し、発光を測定する最終段階である。より詳細には、本発明の方法を使用するイムノアッセイは、ＣｉｂａＣｏｒｎｉｎｇＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓＣｏｒｐ．（Ｍｅｄｆｉｅｌｄ，Ｍａｓｓ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．）製品ＡＣＳ：１８０完全自動アナライザーで実施することができる。本発明の一好適態様において、検出すべき免疫学的に活性な物質は例えばペニシリン又はその誘導体（例えばベンジルペニシリン、ペニシロイル等）に対する抗体であり、ビオチンに結合したリガンドはハプテン（例えばペニシリン又はその誘導体）である。定義本発明の方法において、検出すべき抗体は特異的免疫グロブリン、好ましくは特異的ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ及びそのアイソタイプであり、より好ましくは特異的ＩｇＥ、又は、例えば好ましくは全ＩｇＡ、全ＩｇＤ、全ＩｇＥ、全ＩｇＧ、全ＩｇＭ及びそのアイソタイプからなる群から選択される免疫グロブリン等の抗体クラス、最適には全ＩｇＥである。サンプルなる用語は、液体又は液化サンプルを意味し、溶液、エマルジョン、分散液及び懸濁液を含む。ビオチンに結合したリガンド抗原、抗体又はハプテンは任意の免疫学的に活性な物質であり、例えばアレルゲン、抗体、例えばポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（組換え抗体又は抗体フラグメントを含む）であり、好ましくはアレルゲン及び／又はポリクローナル抗免疫グロブリン（例えばＶｅｎｔｒｅｘＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｐｏｒｔｌａｎｄ，Ｍａｉｎｅ）からカタログ番号７７６６０で市販されているヤギ抗ヒトポリクローナル血清）である。リファレンスイムノアッセイにおいて、前記抗体は好ましくは測定すべき抗体クラスの不変部に対して向性、即ちＩｇＥ抗体に対して向性の抗体である。生物体液なる用語は、血液、血漿、血清、尿又は唾液等の任意の臨床サンプルを意味し、更に、生物体内で排泄、分泌又は輸送される任意の生物体液を含む。常磁性粒子（ＰＭＰ）なる用語は、液体媒体に分散又は懸濁可能な粒子を意味する。全実施例でＭａｇｎｅｔｉｃｓＩｎｃ．（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）から市販されているＢｉｏＭａｇ粒子（アミン末端基で被覆された酸化鉄粒子）を使用した。ＰＭＰに結合した抗体は好ましくは検出又は測定すべき抗体の不変部に対して向性であり、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体（組換え抗体又は抗体フラグメントを含む）でもよく、好ましくはＢｉｏＩｎｖｅｎｔＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＡＢ（Ｌｕｎｄ，Ｓｗｅｄｅｎ）から市販されているモノクローナル抗体ＭＡｂＡ５６９７−１Ａ３（９２０３２５）である。化学発光アクリジニウム化合物は好ましくはアビジン又はストレプトアビジンに共有結合したＮ−ヒドロキシスクシンイミドジメチルアクリジニウムエステル（アビジン−ＤＭＡＥ）である。アビジンとＤＭＡＥの結合はＷｅｅｋｓら，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．２９／８，１４７４−１４７９（１９８３）の方法に従って実施される。アビジン又はストレプトアビジンに結合可能な他の発光標識化合物（例えばルミノール、ルシゲニン又はロフィン）も本発明で使用し得る。ビオチン化抗体の調製ビオチン化抗ＩｇＥ及びチモシー（Ｐｈｌｅｕｍｐｒａｔｅｎｓｅ）：ミエローマＩｇＥ（ＯＥＭｃｏｎｃｅｐｔ，ＵＳＡ）をリガンドとして使用してＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）上でアフィニティークロマトグラフィーによりヤギ抗ヒトポリクローナル血清（ＶｅｎｔｒｅｘＬａｂｏｒａｂｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．ＭＡ，ＵＳＡ）を精製した。抗ＩｇＥをビオチン：抗ＩｇＥモル比＝４１：１でビオチン化した。ジメチルホルムアミド（Ｍｅｒｃｋ）中２５ｍｇ／ｍｌのビオチン（ビオチンアミドカプロエートＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｓｉｇｍａ））９ μｌを０．１ＭＮａＨＣＯ₃（Ｍｅｒｃｋ）中４．５ｍｇ／ｍｌの抗ＩｇＥ０．４ｍｌに加えた。試薬を「エンドオーバーエンド」混合機で２５℃で２時間インキュベートした。リジン（Ｓｉｇｍａ）の２０ｍｇ／ｍｌＮａＨＣＯ₃溶液０．９ｍｌを加えた。溶液を濾過し、ビオチン化抗体をｓｕｐｅｒｄｅｘ７５Ｈｉｌｏａｄ１６／６０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）上でサイズクロマトグラフィーにより精製した。プールしたフラクションを、０．１％ヒト血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）、０．１％ＮａＮ₃（Ｓｉｇｍａ）を含有するリン酸緩衝液ＰＢＳ（ｐＨ７．２）で希釈した。チモシー抽出物（ＡＬＫＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓＡ／Ｓ，Ｈｏｒｓｈｏｌｍ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を１０：１のモル比でビオチン化し、１０ｍｇ／ｍｌビオチンの０．６５ｍｌを０．１ＭＮａＨＣＯ₃中１０ｍｇ／ｍｌチモシー０．４３ｍｌに加えた。試薬を「エンドオーバーエンド」混合機で２５℃で２時間インキュベートし、インキュベーション後、５０ｍｇ／ｍｌリジン（Ｓｉｇｍａ）溶液４０μｌを加えた。溶液を濾過し、ビオチン化抗体をｓｕｐｅｒｄｅｘ７５Ｈｉｌｏａｄ１６／６０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上でサイズ排除クロマトグラフィーにより過剰のビオチンから精製した。アレルゲンを含有するフラクションをプールした。０．１％ヒト血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）及び０．１％ＮａＮ₃（Ｓｉｇｍａ）を含有するＰＢＳ（ｐＨ７．２）でビオチン化チモシーを希釈した。ストレプトアビジン−アクリジニウムエステルラベルの調製：Ｗｅｅｋｓら，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．２９／８，１４７４−１４７９（１９８３）の方法を使用してストレプトアビジンをＤＭＡＥ−ＮＨＳ［２’，６’−ジメチル−４’−（Ｎ−スクシンイミジルオキシカルボニル）フェニル−１０−メチルアクリジニウム−９−カルボキシレートメトスルフェート］と共役した。ストレプトアビジン−アクリジニウムエステルラベルの調製：Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドジメチルアクリジニウムエステルＤＭＡＥ（ＣｉｂａＣｏｒｎｉｎｇＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓＣｏｒｐ．，Ｍｅｄｆｉｅｌｄ，ＭＡ，ＵＳＡ）０．９６ｍｇをジメチルホルムアミド１．９２ｍｌで希釈した。この溶液２５０μｌを０．１Ｍリン酸二水素ナトリウム、０．１５ＭＮａＣｌ（ｐＨ８．１５）中の１ｍｇ／ｍｌストレプトアビジン（Ｓｉｇｍａ）２．５ｍｌにピペットで移した。バイアル中の溶液の上方の空気を窒素（ＡＧＡ）と交換した。試薬を３０分間２５℃で撹拌下にインキュベートし、インキュベーション後、１０ｍｇ／ｍｌリジン、０．１Ｍリン酸二水素ナトリウム（Ｍｅｒｃｋ）、０．１５ＭＮａＣｌ（Ｍｅｒｃｋ）（ｐＨ８．１５）２２５０μｌを加えた。結合しなかったＤＭＡＥを除去するために、溶液をＰＤ−１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）に充填した。溶出液を集め、セルロースＭｉｎｉｔａｎ−Ｓ濾紙１０．０００ＮＭＷＬ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して限外濾過により精製した。濾過はリン酸緩衝液ＰＢＳ（ｐＨ７．２）１．５リットルで実施した。濾渣を２５ｍｌまで濃縮し、０．５％ＨＳＡ（Ｓｉｇｍａ）及び０．１％ＮａＮ₃（Ｓｉｇｍａ）を含有するＰＢＳ（ｐＨ７．２）２５ｍｌを加えた。以下、実施例により本発明を詳細に説明する。常磁性粒子への抗体の固定：磁気分離を使用して常磁性粒子（ＣｉｂａＣｏｒｎｉｎｇＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓＣｏｒｐ．，ＭＡ，ＵＳＡ）６．５ｇをメタノール（Ｍｅｒｃｋ）６５０ｍｌで３回洗浄した。０．０１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）６５０ｍｌで２回洗浄した。粒子を６．２５％グルタルアルデヒド（Ｍｅｒｃｋ）、０．０１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）で２５℃で３時間活性化した。粒子を０．０１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）６５０ｍｌで３回洗浄した。粒子をＩｇＥＦｃドメインに対して特異的なモノクローナル抗Ｉｇｏｌｍ，Ｄｅｎｍａｒｋ）１０８３ｍｇと２５℃で２４時間結合した。粒子を０．０１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）で２回洗浄した。１０％ＩｇＥをストリップした血清（Ａｅｎｍａｒｋ）２００ｍｌで過剰の活性基を２５℃で２４時間ブロックした。粒子を０．０１Ｍリン酸緩衝液（Ｍｅｒｃｋ）６５０ｍｌで洗浄した後、１ＭＮａＣｌ（Ｍｅｒｃｋ）６５０ｍｌで３回洗浄した。粒子を０．０１Ｍリン酸緩衝液で３回洗浄した。０．１％ｗ／ｖウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）、０．００１％ウシγグロブリン（Ｓｉｇｍａ）を含有するＰＢＳ（ｐＨ７．２）６５０ｍｌに粒子を再懸濁し、１８時間５０℃で熱処理した。０．１％ｗ／ｖウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）、０．００１％ウシγグロブリン（Ｓｉｇｍａ）を含有するＰＢＳ（ｐＨ７．２）６５０ｍｌで粒子を３回洗浄した。粒子を３７℃で７日間熱処理した。粒子を０．０１Ｍリン酸緩衝液で２回洗浄した。０．５％ヒト血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）を含有するＰＢＳ（ｐＨ７．２）で粒子を０．５ｇ／ｌまで希釈した。実施例１抗原（全ＩｇＥ）の検出及び定量ＣｌｉｎｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，３６／９，１５９８−１６０２（１９９０）に記載されているＣｉｂａＣｏｒｎｉｎｇＡＣＳ：１８０ＢｅｎｃｈｔｏｐＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙアナライザーで以下のプロトコルを使用して本発明による全ＩｇＥ抗体の定量を実施した。サンプル５０μｌ及びビオチン化抗ＩｇＥ５０μｌをサンプルプローブによりキュベットに分配した。キュベットが第１の試薬プローブＲ１に達したら、ＩｇＥＦｃドメインに対して特異的なモノクローナル抗ＩｇＥ抗体（ＡＬｍ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を固定した常磁性粒子１００μｌをストレプトアビジン− アクリジニウムエステルラベル（Ａｌｍ，Ｄｅｎｍａｒｋ）２００μｌと共に分配した。キュベットは磁石及び洗浄ステーションまで行路を降下した。脱イオン水７５０μｌで２回洗浄した。洗浄サイクルの完了後、粒子を０．１ＭＨＮＯ₃中０．５ｇ／ｌＨ₂Ｏ₂ ３００μｌに再懸濁した。キュベットが光度計チャンバーに入ったら、フォトマルチプライヤーの前で２５ｍＭＮａＯＨ溶液３００μｌを加え、発光の光子を測定及び定量し、相対光単位（ＲＵＬ）として表した。ＲＵＬの量はサンプル中のＩｇＥの量に正比例する。サンプル分配から最初の測定までの時間は１５分間とし、２０秒毎に測定した。結果をＲＵＬ実験／ＲＵＬバックグラウンド（ここでＲＵＬバックグラウンドは全ＩｇＥの不在下で観察された化学発光反応である）として表した。ＭａｇｉｃＬｉｔｅＴｏｔａｌＩｇＥＫｉｔｈｏｌｍ，Ｄｅｎｍａｒｋ）でヒト血清ＩｇＥのＷＨＯ２ｎｄＩＲＰＮｏ．７５／５０２に対して較正した９個の全ＩｇＥ標準を上記プロトコルでアッセイした処、全血清ＩｇＥ０．１ＩＵ／ｍｌ（バックグラウンド×１０標準偏差により決定）を検出できることが判明した（図２参照）。実施例２特異的抗体（特異的ＩｇＥ）の検出及び定量ＣｌｉｎｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，３６／９，１５９８−１６０２（１９９０）に記載されているＣｉｂａＣｏｒｎｉｎｇＡＣＳ：１８０ＢｅｎｃｈｔｏｐＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙアナライザーで以下のプロトコルを使用して本発明によるチモシー特異的ＩｇＥ抗体（チモシー特異的ＩｇＥ）の定量を実施した。サンプル５０μｌ及びビオチン化チモシー５０μｌをサンプルプローブによりキュベットに分配した。キュベットが第１の試薬プローブＲ１に達したら、ＩｇＥＦｃドメインに対して特異的なモノクローナル抗ＩｇＥ抗体（ＡＬｍ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を固定した常磁性粒子１００μｌをストレプトアビジン− アクリジニウムエステルラベル（Ａｌｍ，Ｄｅｎｍａｒｋ）２００μｌと共に分配した。キュベットは磁石及び洗浄ステーションまで行路を降下した。脱イオン水７５０μｌで２回洗浄した。洗浄サイクルの完了後、粒子を０．１ＭＨＮＯ₃中０．５ｇ／ｌＨ₂Ｏ₂ ３００ μｌに再懸濁した。キュベットが光度計チャンバーに入ったら、フォトマルチプライヤーの前で２５ｍＭＮａＯＨ溶液３００μｌを加え、発光の光子を測定及び定量し、相対光単位（ＲＵＬ）として表した。ＲＵＬの量はサンプル中のＩｇＥの量に正比例する。サンプル分配から最初の測定までの時間は１５分間とし、２０秒毎に測定した。結果をＲＵＬ実験／ＲＵＬバックグラウンド（ここでＲＵＬバックグラウンドは全ＩｇＥの不在下で観察された化学発光反応である）として表した。臨床的に特徴付けられたチモシーアレルギー患者サンプルに対してＭａｇｉｃＬｉｔｅＳＱＳｐｅｃｉｆｉｃＩｇＥＫｉｔ（ＡＬＫＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓたチモシー特異的ＩｇＥ標準を上記プロトコルに従ってアッセイした処、１．４３〜８００標準単位（ＳＵ）／ｍｌのチモシー特異的ＩｇＥをＭａｇｉｃＬｉｔｅＳＱＳｐｅｃｉｆｉｃＩｇＥアッセイで検出できることが判明した（図３参照）。実施例３ＷＨＯ全ＩｇＥリファレンスに対する特異的ＩｇＥの定量夫々実施例１及び２に記載したと同一のアッセイプロトコルを使用して全ＩｇＥ抗体又は特異的ＩｇＥ抗体について血清サンプル中の特異的ＩｇＥ抗体の定量を実施した。臨床的に特徴付けられたチモシーアレルギー患者サンプルに対してＭａｇｉｃＬｉｔｅＳＱＳｐｅｃｉｆｉｃＩｇＥＫｉｔ（ＡＬＫＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓた１０個のチモシー特異的ＩｇＥ標準と共に３５人の患者サンプルのチモシー特異的ＩｇＥをアッセイし、ＳＵ／ｍ１として表した（実施例２に記載のプロトコル）。ＩｇＥＷＨＯ２ｎｄＩＲＰＮｏ．７５／５０２（国立生物学標準委員会）の９個の標準を全ＩｇＥに対して同一アッセイでアッセイした（実施例１に記載のプロトコル）。図４は夫々全ＩｇＥアッセイ及びチモシー特異的ＩｇＥアッセイの２種の用量反応曲線を比較したものである。平行線試験によると、２種の用量反応曲線の傾きはさほど変わらないことが判明したので、患者サンプル中の特異的ＩｇＥをＷＨＯ全ＩｇＥ標準に対して較正し、ＩＵ／ｍｌで表すことができると考えられる。図５は、ＷＨＯ全ＩｇＥ標準（ＩＵ／ｍｌで表す）又はチモシー特異的ＩｇＥ標準（ＳＵ／ｍｌで表す）に対して較正した３５人の患者サンプルからの結果を比較したものであり、２種の単位間に非常に良好な相関を示している。夫々シグナル／バックグラウンド及び濃度（用量）の対数−対数変換後に三次を含まないスプライン補間を用いて未知サンプルの濃度（用量）を計算した。線形回帰線から、１ＳＵ（標準化単位）は０．１４国際単位（ＩＵ）に対応すると計算された。要約すると、本発明の態様を使用してアレルゲン特異的ＩｇＥを計算することができ、ＷＨＯＩｇＥ較正標準曲線の全ＩｇＥアッセイから直接較正することができる。実施例４全ＩｇＥ法比較ＭａｇｉｃＬｉｔｅＴｏｔａｌＩｇＥキット（Ａｈｏｌｍ，Ｄｅｎｍａｒｋ）で３３人の患者のサンプルの全血清ＩｇＥを測定した。アッセイは製造業者の指示に従って実施した。実施例１に記載したプロトコルに従ってＡＣＳ：１８０で同一サンプルの全血清ＩｇＥを測定した。図６は全血清ＩｇＥを測定するための方法を比較する撒布図である。ｒ＝０．９０で相関が確認された。実施例５特異的ＩｇＥ法比較ＭａｇｉｃＬｉｔｅＳＱＳｐｅｃｉｆｉｃＩｇＥキット（ＡＬＫＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓＡ／Ｓ，ンプルのチモシー特異的ＩｇＥを測定した。アッセイは製造業者の指示に従って実施した。同一サンプルのチモシー特異的ＩｇＥを実施例２に記載のプロトコルに従ってＡＣＳ：１８０で測定した。図７はチモシー特異的ＩｇＥを測定するための方法を比較する撒布図である。ｒ＝０．８０で相関が確認された。実施例６アッセイ精度の比較実施例１に記載のプロトコルを使用したＡＣＳ全ＩｇＥの同一アッセイ内不正確度をＭａｇｉｃＬｉｔｅＴｏｔａｌＩｇＥの不正確度と比較した。患者サンプルを実施例４に記載したアッセイで３回反復実験した。Ｋｒｏｕｗｅｒ及びＲａｂｉｎｏｗｉｔｚ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０，２９０（１９８４）に従って同一アッセイ内の変動係数のプール値（ＣＶｐｗｒ）を計算した。以下の結果を得た。 Magic Lite ACS %CVpwr 4．69 2．75 Min%CV 0．80 0．70 Max%CV 11．70 8．40 結果から明らかなように、操作段階を自動化及び最小限にすることにより、分析精度を著しく改善することかできる（Ｆ検定によるとＦ＝１．７１，ｐ＝０．０４９）。実施例７患者サンプル中の全及び特異的ＩｇＥの比較：実施例２に記載したプロトコルに従ってＡＣＳ：１８０でチモシー特異的ＩｇＥについて測定し、実施例３に記載したように全ＩｇＥリファレンス（ＷＨＯ７５／５０２）に対して較正したサンプルを、更に実施例１に記載したように全ＩｇＥについて分析した。特異的ＩｇＥと全ＩｇＥの測定値の比を各サンプルで計算し、％比として表した（特異的ＩＵ／完全ＩＵ＊１００）。以下の結果を得た。実施例７（続き）結果から明らかなように、チモシー特異的ＩｇＥアッセイは全ＩｇＥからチモシー特異的ＩｇＥを０．０５％まで測定することができた。チモシー特異的ＩｇＥの相対量が低いのは、サンプル中に他のアレルゲン特異性が存在することを示す。１人の患者サンプルでは全ＩｇＥの４４％までがチモシーに対して特異的であることが判明した。図８から明らかなように、全ＩｇＥ濃度とチモシー特異的ＩｇＥ濃度との間に相関は認められなかった。実施例８常磁性粒子及びアビジンーアクリジニウムエステルラベルを使用した血清全ＩｇＡ抗体の定量下記プロトコルを使用して全ＩｇＡ抗体の定量をアッセイした。患者サンプル又はカリブレーター２５μｌをピペットで１２×７５ｍｍ試験管に移した。０．１％ナトリウムアジド、０．０１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０及び０．１％ヒト血清アルブミンを含有する０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中のビオチン化ポリクローナル抗ＩｇＡ抗体ＤＡＫＯＥ４８４（ＤＡＫＯ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ製品）５０μｌを各試験管に加え、周囲温度で１５分間反応させた。常磁性粒子のスラリー４００μＬにポリクローナル抗ＩｇＡ抗体ＤＡＫＯＡ２６２（ＤＡＫＯ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ製品）を固定して各試験管に加え、５分間インキュベートした。この２回目のインキュベーション後、上記と同一緩衝液で希釈したストレプトアビジン−アクリジニウムエステルラベル５０μｌを各試験管に加え、周囲温度で更に５分間インキュベートした。常磁性粒子を磁気ベースセパレーターにより液体から分離し、分離した粒子を上記洗浄用緩衝液と共に渦形成後、０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含有する０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で２回洗浄した。最後に試験管の内容を光度計で測定し、４２６ｎｍでの発光を計量し、相対光単位（ＲＬＵ）として表した。ヒト血清ＩｇＡＤＡＫＯＸ９０８（ＤＡＫＯ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ製品）についてＷＨＯＮｏ．６７／８６に対して較正した全ＩｇＡ標準を上記プロトコルに従ってアッセイした。標準：濃度（μg/ml） RLU 0 370937 0.02 417000 0.23 557563 2.32 1252260 23.2 1872357 発明の趣旨及び範囲内で多数の変形が可能であることは当業者に自明である。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９４年１１月２４日【補正内容】本発明の方法は上記段階（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）により実施することができるが、標識用化合物を別段階で加えたほうが好ましく、該方法は好ましくは、ｉ）ビオチン又はその機能的誘導体に結合したリガンド抗原、抗体又はハプテンを、常磁性粒子に結合した被検出抗体に対して向性の抗体及びサンプルと混合し、第１の固相複合体を形成する段階と、ｉｉ）アビジン、ストレプトアビジン又はその機能的誘導体に共有結合した化学発光アクリジニウム化合物を加え、第２の固相複合体を形成する段階と、ｉｉｉ）固相を液相から磁気的に分離する段階と、ｉｖ）化学発光反応を開始し、分離した固相に化学発光複合体が存在するか否かを分析する段階とに従って実施される。本発明の特定の目的は、同一プロトコルを使用する真にパラレルなリファレンスイムノアッセイをリファレンスとして使用して、免疫グロブリン等の特異的抗体を定量するための完全に自動化可能なイムノアッセイを提供することである。真にパラレルなリファレンスイムノアッセイを使用して特異的抗体を定量するという目的は、液体サンプル中の特異的抗体の濃度及び／又は相対含有量を測定する方法により達せられ、該方法によると、化学発光ラベルに結合した捕獲特異的抗体を含む分離固相の発光測定値と、前記特異的抗体が属する抗体クラスのサンプル中総含有量を測定するパラレルなリファレンスイムノアッセイで得られた発光測定値とを比較し、該方法は、ａ）ビオチン又はその機能的誘導体に結合した被測定特異的抗体に対して向性のリガンド抗原又はハプテン；常磁性粒子に結合した被測定抗体の不変部に対して向性の抗体；及びアビジン、ストレプトアビジン又はその機能的誘導体に結合した化学発光アクリジニウム化合物をサンプルと混合し、第１の固相複合体を形成する段階と、ｂ）前記第１の固相を液相から磁気的に分離する段階と、ｃ）化学発光反応を開始し、分離した第１の固相の発光を測定する段階と、ｄ）ビオチン又はその機能的誘導体に結合した被測定特異的抗体クラスに対して向性のリガンド抗体；常磁性粒子に結合した被測定抗体クラスの不変部に対して向性の抗体；及びアビジン、ストレプトアビジン又はその機能的誘導体に結合した化学発光アクリジニウム化合物をサンプルと混合し、第２の固相複合体を形成する段階と、ｅ）前記第２の固相を液相から磁気的に分離する段階と、ｆ）化学発光反応を開始し、分離した第２の固相発光を測定する段階と、ｇ）第１の分離固相の発光を第２の分離固相の発光と比較する段階とを含む。上記方法の好適態様において段階ａ）は、ｉ）ビオチン又はその機能的誘導体に結合したリガンド抗原又はハプテンを、常磁性粒子に結合した抗体及びサンプルと混合し、固相複合体を形成し、ｉｉ）アビジン、ストレプトアビジン又はその機能的誘導体に結合した化学発光アクリジニウム化合物を加え、前記第１の固相複合体を形成することにより実施され、段階ｄ）は、ｉ）ビオチン又はその機能的誘導体に結合したリガンド抗体を、常磁性粒子に結合した抗体及びサンプルと混合し、固相複合体を形成し、ｉｉ）アビジン、ストレプトアビジン又はその機能的誘導体に共有結合した化学発光アクリジニウム化合物を加え、前記第２の固相複合体を形成することにより実施される。サンプル中の被測定特異的抗体は好ましくは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ及びそのアイソタイプからなる群から選択される特定免疫グロブリンであり、前記抗体の可変部に対して向性のリガンド抗原、抗体又はハプテンは好ましくはアレルゲンであり、抗体クラスは好ましくは全ＩｇＡ、全ＩｇＤ、全ＩｇＥ、全ＩｇＧ、全ＩｇＭ及びそのアイソタイプからなる群から選択される免疫グロブリンクラスであり、リガンド抗原、抗体又はハプテンは前記免疫グロブリンクラスに対して向性の抗体である。より好ましくは、特異的免疫グロブリンは特異的ＩｇＥであり、抗体クラスは全ＩｇＥである。４．特異的免疫グロブリンが特異的ＩｇＥである請求項３に記載の方法。５．サンプル中の抗体が全ＩｇＡ、全ＩｇＤ、全ＩｇＥ、全ＩｇＧ、全ＩｇＭ及びそのアイソタイプからなる群から選択される免疫グロブリンクラスであり、リガンド抗原、抗体又はハプテンが前記免疫グロブリンクラスに対して向性の抗体である請求項１又は２に記載の方法。６．免疫グロブリンクラスが全ＩｇＥである請求項５に記載の方法。７．常磁性粒子に結合した被測定抗体に対して向性の抗体が、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（組換え抗体、抗体フラグメントを含む）からなる群から選択され、好ましくはモノクローナルマウス抗免疫グロブリンである請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。８．化学発光アクリジニウム化合物がアビジン、ストレプトアビジン又はその機能的誘導体に共有結合したＮ−ヒドロキシスクシンイミドジメチルアクリジニウムエステルである請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。９．サンプル中の特異的抗体の濃度及び／又は相対含有量の測定方法であって、化学発光ラベルに結合した捕獲特異的抗体を含む分離固相の発光測定値と、該特異的抗体が属する抗体クラスのサンプル中総含有量を測定する真にパラレルなリファレンスイムノアッセイで得られた発光の測定値とを比較し、ａ）ビオチン又はその機能的誘導体に結合した被測定特異的抗体に対して向性のリガンド抗原又はハプテン；常磁性粒子に結合した被測定抗体の不変部に対して向性の抗体；及びアビジン、ストレプトアビジン又はその機能的誘導体に結合した化学発光アクリジニウム化合物をサンプルと混合し、第１の固相複合体を形成する段階と、ｂ）前記第１の固相を液相から磁気的に分離する段階と、ｃ）化学発光反応を開始し、分離した第１の固相発光を測定する段階と、ｄ）ビオチン又はその機能的誘導体に結合した被測定特異的抗体クラスに対して向性のリガンド抗体；常磁性粒子に結合した被測定抗体クラスの不変部に対して向性の抗体；及びアビジン、ストレプトアビジン又はその機能的誘導体に結合した化学発光アクリジニウム化合物をサンプルと混合し、第２の固相複合体を形成する段階と、ｅ）前記第２の固相を液相から磁気的に分離する段階と、ｆ）化学発光反応を開始し、分離した第２の固相の発光を測定する段階と、ｇ）第１の分離固相の発光を第２の分離固相の発光と比較する段階とを含む方法。１０．段階ａ）が、ｉ）ビオチン又はその機能的誘導体に結合したリガンド抗原又はハプテンを、常磁性粒子に結合した抗体及びサンプルと混合し、固相複合体を形成し、ｉｉ）アビジン、ストレプトアビジン又はその機能的誘導体に結合した化学発光アクリジニウム化合物を加え、前記第１の固相複合体を形成することにより実施され、段階ｄ）が、ｉ）ビオチン又はその機能的誘導体に結合したリガンド抗体を、常磁性粒子に結合した抗体及びサンプルと混合し、固相複合体を形成し、ｉｉ）アビジン、ストレプトアビジン又はその機能的誘導体に共有結合した化学発光アクリジニウム化合物を加え、前記第２の固相複合体を形成することにより実施される請求項９に記載の方法。１１．サンプル中の被測定特異的抗体がＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ及びそのアイソタイプからなる群から選択される特異的免疫グロブリンであり、前記抗体の可変部に対して向性のリガンド抗原、抗体又はハプテンがアレルゲンであり、抗体クラスが全ＩｇＡ、全ＩｇＤ、全ＩｇＥ、全ＩｇＧ、全ＩｇＭ及びそのアイソタイプからなる群から選択される免疫グロブリンクラスであり、リガンド抗原、抗体又はハプテンが前記免疫グロブリンクラスに対して向性の抗体である請求項９又は１０に記載の方法。１２．特異的免疫グロブリンが特異的ＩｇＥであり、抗体クラスが全ＩｇＥである請求項１１に記載の方法。１３．常磁性粒子に結合した被測定抗体に対して向性の抗体が、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（組換え抗体、抗体フラグメントを含む）からなる群から選択され、好ましくはモノクローナルマウス抗免疫グロブリンである請求項９又は１０に記載の方法。１４．化学発光アクリジニウム化合物がアビジン、ストレプトアビジン又はその機能的誘導体に共有結合したＮ−ヒドロキシスクシンイミドジメチルアクリジニウムエステルである請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．化学発光標識化合物を使用してサンプル中の抗体を検出する方法であって、ａ）ビオチン又はその機能的誘導体に結合したリガンド抗原、抗体又はハプテン；常磁性粒子に結合した被検出抗体に対して向性の抗体；及びアビジン、ストレプトアビジン又はその機能的誘導体に結合した化学発光アクリジニウム化合物をサンプルと混合し、固相結合複合体を形成する段階と、ｂ）固相を液相から磁気的に分離する段階と、ｃ）化学発光反応を開始し、分離した固相に化学発光複合体が存在するか否かを分析し、化学発光の存在が検出された場合には前記サンプル中に前記抗体が存在すると判断する段階とを含む方法。２．ｉ）ビオチン又はその機能的誘導体に結合したリガンド抗原、抗体又はハプテンを、常磁性粒子に結合した被検出抗体に対して向性の抗体及びサンプルと混合し、第１の固相複合体を形成する段階と、ｉｉ）アビジン、ストレプトアビジン又はその機能的誘導体に共有結合した化学発光アクリジニウム化合物を加え、第２の固相複合体を形成する段階と、ｉｉｉ）固相を液相から磁気的に分離する段階と、ｉｖ）化学発光反応を開始し、分離した固相に化学発光複合体が存在するか否かを分析する段階とを含む請求項１に記載の方法。３．サンプル中の抗体がＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ及びそのアイソタイプからなる群から選択される特異的免疫グロブリンであり、リガンド抗原、抗体又はハプテンが特異的アレルゲンである請求項１又は２に記載の方法。４．特異的免疫グロブリンが特異的ＩｇＥである請求項３に記載の方法。５．サンプル中の抗体が全ＩｇＡ、全ＩｇＤ、全ＩｇＥ、全ＩｇＧ、全ＩｇＭ及びそのアイソタイプからなる群から選択される免疫グロブリンクラスであり、リガンド抗原、抗体又はハプテンが前記免疫グロブリンクラスに対して向性の抗体である請求項１又は２に記載の方法。６．免疫グロブリンクラスが全ＩｇＥである請求項５に記載の方法。７．常磁性粒子に結合した被測定抗体に対して向性の抗体が、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（組換え抗体、抗体フラグメントを含む）からなる群から選択され、好ましくはモノクローナルマウス抗免疫グロブリンである請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。８．化学発光アクリジニウム化合物がアビジン、ストレプトアビジン又はその機能的誘導体に共有結合したＮ−ヒドロキシスクシンイミドジメチルアクリジニウムエステルである請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。９．サンプル中の特異的抗体の濃度及び／又は相対含有量の測定方法であって、化学発光ラベルに結合した捕獲特異的抗体を含む分離固相の発光測定値と、該特異的抗体が属する抗体クラスのサンプル中総含有量を測定する真にパラレルなリファレンスイムノアッセイで得られた発光の測定値とを比較する方法。１０．化学発光ラベルに結合した捕獲特異的抗体を含む分離固相の発光が、ａ）ビオチン又はその機能的誘導体に結合した被測定特異的抗体に対して向性のリガンド抗原又はハプテン；常磁性粒子に結合した被測定抗体の不変部に対して向性の抗体；及びアビジン、ストレプトアビジン又はその機能的誘導体に結合した化学発光アクリジニウム化合物をサンプルと混合し、固相複合体を形成し、ｂ）固相を液相から磁気的に分離し、ｃ）化学発光反応を開始し、発光を測定することにより得られ、前記特異的抗体が属する抗体クラスのリファレンスイムノアッセイが、ａ）ビオチン又はその機能的誘導体に結合した前記被測定抗体クラスに対して向性のリガンド抗体；常磁性粒子に結合した被測定抗体クラスの不変部に対して向性の抗体；及びアビジン、ストレプトアビジン又はその機能的誘導体に結合した化学発光アクリジニウム化合物をサンプルと混合し、固相複合体を形成する段階と、ｂ）固相を液相から磁気的に分離する段階と、ｃ）化学発光反応を開始し、発光を測定する段階とを含む請求項９に記載の方法。１１．化学発光ラベルに結合した捕獲特異的抗体を含む分離固相の発光が、ｉ）ビオチン又はその機能的誘導体に結合した被測定特異的抗体に対して向性のリガンド抗原又はハプテンを、常磁性粒子に結合した被測定抗体の不変部に対して向性の抗体及びサンプルと混合し、第１の固相複合体を形成し、ｉｉ）アビジン、ストレプトアビジン又はその機能的誘導体に共有結合した化学発光アクリジニウム化合物を加えて第２の固相複合体を形成し、ｉｉｉ）固相を液相から磁気的に分離し、ｉｖ）化学発光反応を開始し、発光を測定することにより得られ、前記特異的抗体が属する抗体クラスのリファレンスイムノアッセイが、ｉ）ビオチン又はその機能的誘導体に結合した前記被測定抗体クラスに対して向性のリガンド抗体を、常磁性粒子に結合した被測定抗体クラスの不変部に対して向性の抗体及びサンプルと混合し、第１の固相複合体を形成する段階と、ｉｉ）アビジン、ストレプトアビジン又はその機能的誘導体に共有結合した化学発光アクリジニウム化合物を加えて第２の固相複合体を形成する段階と、ｉｉｉ）固相を液相から磁気的に分離する段階と、ｉｖ）化学発光反応を開始し、発光を測定する段階とを含む請求項９に記載の方法。１２．サンプル中の被測定特異的抗体がＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ及びそのアイソタイプからなる群から選択される特異的免疫グロブリンであり、前記抗体の可変部に対して向性のリガンド抗原、抗体又はハプテンが特異的アレルゲンであり、抗体クラスが全ＩｇＡ、全ＩｇＤ、全ＩｇＥ、全ＩｇＧ、全ＩｇＭ及びそのアイソタイプからなる群から選択される免疫グロブリンクラスであり、リガンド抗原、抗体又はハプテンが前記免疫グロブリンクラスに対して向性の抗体である請求項９から１１のいずれか一項に記載の方法。１３．特異的免疫グロブリンが特異的ＩｇＥであり、抗体クラスが全ＩｇＥである請求項１２に記載の方法。１４．常磁性粒子に結合した被測定抗体に対して向性の抗体が、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（組換え抗体、抗体フラグメントを含む）からなる群から選択され、好ましくはモノクローナルマウス抗免疫グロブリンである請求項１０又は１１に記載の方法。１５．化学発光アクリジニウム化合物がアビジン、ストレプトアビジン又はその機能的誘導体に共有結合したＮ−ヒドロキシスクシンイミドジメチルアクリジニウムエステルである請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。