PL173049B1

PL173049B1 - Sposób mierzenia stężenia i/lub względnej zawartości swoistej immunoglobuliny w próbce

Info

Publication number: PL173049B1
Application number: PL93315871A
Authority: PL
Inventors: Niels Johansen; Hans-Henrik Ipsen
Original assignee: Alk As
Priority date: 1992-11-13
Filing date: 1993-11-15
Publication date: 1998-01-30
Also published as: FI952330L; NO951875L; JPH08503071A; KR950704686A; DE69310537T2; EP0669000B1; DK137992D0; DK0669000T3; NO951875D0; PL309004A1; NO320170B1; ES2103559T3; JP3194585B2; FI111194B; PL173033B1; DE69310537D1; CA2149340A1; RU2132070C1; KR100306433B1; AU682478B2

Abstract

1 . Sposób mierzenia stezenia i/lub wzglednej zawartosci swoistej immunoglobuliny w próbce, w którym mierzona emisje swiatla oddzielonej fazy stalej skladajacej sie z wychwyconej swoistej immunoglobuliny sprzezonej ze znacznikiem chemiluminescencyjnym porównuje sie z mierzona emisja swiatla uzyskana w równoleglym immunologicznym tescie odniesienia, w którym mierzona jest calkowita zawartosc immunogio- bulin w próbce, do której nalezy wymieniona swoista immunoglobulina, znamienny tym, ze miesza sie z próbka antygen lub hapten jako ligand, dla którego mierzona jest swoista immunoglobulina zwiazany z biotyna lub jej funkcjonalna pochodna, przeciwcialo skierowane przeciw stalej czesci mierzonej immunoglobuliny zwiazane z czastkami paramagnetycznymi oraz chemiluminescencyjny zwiazek akrydynowy zwiazany z awidyna. streptawidyna lub ich funkcjonalna pochodna dla utworzenia pierwszego kompleksu fazy stalej, magnetycznie oddziela sie wymieniona pierwsza faze stala od fazy cieklej, inicjuje sie stosujac nadtlenek wodoru reakcje chemiluminescencyjna i mierzy sie emisje swiatla oddzielonej pierwszej fazy stalej, przy czym miesza sie z próbka przeciwcialo jako ligand skierowane przeciw wymienionej klasie mierzonych immunoglobulin zwiazane z biotyna lub jej funkcjonalna pochodna, przeciwcialo skierowane przeciw stalej czesci mierzonych immu- noglobulin zwiazane z czastkami paramagnetycznymi, oraz chemiluminescencyjny zwiazek akrydynowy zwia- zany z awidyna, streptawidyna lub ich funkcjonalna pochodna dla utworzenia drugiego kompleksu fazy stalej, a nastepnie magnetycznie oddziela sie wymieniona druga faze stala od fazy cieklej, inicjuje sie stosujac nadtlenek wodoru reakcje chemiluminescencyjna i mierzy sie emisje swiatla oddzielonej drugiej fazy stalej, oraz porównuje sie emisje swiatla oddzielonej pierwszej fazy stalej z emisja oddzielonej drugiej fazy stalej. PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jnet epoedb mitrztma stężenia i/lub względnej zawartości swoistej immunogłobuliny w prdbce, zwłaszcza stosowany w teście dwustronnym cUemiluminescencyjnego związku estru akrydynowego sprzężonego z awidyną lub streptawidyną oraz łigandu sprzężonego z biotyną, w ktdrym kompleks powinowactwa jest wychwytywany na cząstkach paramagnetycznych, co umożliwia szybkie ilościowe oznaczenie immunologicznie aktywnych substancji takich, jak immunogłobuline w próbkach takich jak płyny biologiczne oraz prdbki tkanek, mleka, pokarmdw, napojdw, wody lub ściekdw przemysłowych.

bposdb ilościowego oznaczania przeciwciał klasy IgE w surowicy został ujawniony w broszurze Magic® Lite bQ™ dla swoistej lgE. opublikowanej nrzez Ciba Corning Diagnosta Corp. oraz ALK Laboratories we wrześniu 1990 roku. W wymienionym sposobie swoisty alergen kowalentnie związany z cząstkami paramagnetycznymi reaguje z przeciwciałem klasy IgE swoistym dla alergenu w próbce surowicy lub osocza. Po pierwszym _ okresie inkubacji i odpłukaniu nie związanej swoistej IgE dodawane jest przeciwciało monoklonalne znakowane chemiłumincscencyjnym estrem akrydynowym skierowane przeciw IgE. Po drugim okresie inkubacji związane z fazą stałą i znakowane przeciwciało mierzone jest w analizatorze Magic Lite® (_nr k_at. 472733 I_ub nr kat. 472270), ktdry automatycznie dodaje odczynniki inicjujące reakcję cUemiłuminescencyjną. Przy użyciu wymienionej metody zautomatyzowany może być tylko ostatni etap inicjowania i mierzenia chemiluminescencji. CUeIylłuITllnescencyJny znakujący związek estru akrydynowego został opisany w amerykańskim opisie patentowym 4,745, 181.

Opis patentowy amerykański 4,946,958 ujawnia chemiluminescencyjny ester akrydynowy związany z grupą N-sukcynimidylową, ktdra może być dalej związany z białkiem lub polipeptydem dostarczając immunoIogicznit reaktywny odczynnik luminesctncyjny. Wymieniony od_-

P7vnmlk ^y/A ui&yrtyr \nt immnnrJcirTip^rrom UtAr-y/ mrAa AtyjmouroA yyLj iAAV£jV KSJZyz J Z. J TT ννϋνΐν A U.1111 l+ll KZ 1V7 ^A Oijil J X AA) VUVJillV TT UV l V W ll\JVijV0110 wiązanie przeciwciała w fazie stałej, cząsteczki antygenu oraz znakowanego przeciwciała skierowanego przeciw przeciwciału, oddzielanie i płukanie fazy stałej oraz ilościowe oznaczanie lsmineectncji fazy stałej.

W publikacji zamieszczonej w Methods in Enzymology, 184 (1990), str. 481-496 btrasburgeri inni ujawniają użycie dwustronnego cUemilsminescencyjnego testu immunologicznego, w ktdrym hormony hGH oraz hCG są wychwytywane przez przeciwciała immobilizowane na płytkach mikrotitracyjnecU oraz znakowane czynnikiem cUemiluminescencyjnem -sprzężonym z awidyną poprzez znakowane biotyną drugie przeciwciało. Wykrywane składniki antygenowe takie, jak hormony białkowe, mogą być badane bezpośrednio z próbek surowicy i porównywane z krzywymi standardowymi. Stężenie immunoglobulin takich, jak IgE jest jednak niezwykle zależne od pacjenta, a bądąnie swoistych IgE musi być pordwnywąne z poziomem całkowitych IgE u danego pacjenta, a zatem wymaga testu o większym zakresie dynamicznym niz ten uzyskiwalny w teście ujawnionym przez btrasburgera i innych.

Dotychczas testy immunologiczne do ilościowego oznaczania immunologicznie aktywnych cząsteczek takich, jak immunoglobuliny (np. swoistej immunoglobuliny E) w płynach biologicznych takich, jak surowica, były testami wykonywanymi manualnie, np. enzymatyczny test immunoabeorpcyjny (ELISA), Iub pdłąstomątycznie. A typowy czas trwania testu wykonywanego pdłąutomatycznie, takiego jak Magie® Lite bQ™ dla swoistych IgE, o ktdrym mowa powyżej wynosi około dwdch godzin.

Ponadto, handlowe testy dla oznaczania swoistych IgE (CAP, RAbT doetąncząny przez PUąπuacią, Uppsala) oraz test Magic® Lite bQ™ dla swoistych IgE wykorzystują test odniesienia dla całkowitej IgE, o nie identycznym protokole, co powoduje otrzymanie nieprecyzyjnych danych. Tylko testy wykorzystujące te same procedury wychwytywania i wykrywania są

173 049 bezpośrednio porównywalne. Na przykład, wszystkie krzywe odpowiedzi dla swoistych IgE muszą być równoległe do krzywych odpowiedzi dla całkowitej IgE. Jest tak dlatego, że wymagany zakres dynamiczny dla badania IgE swoistych lub całkowitych wynosi 2 dekady, wymagany zakres dynamiczny dla badania całkowitej IgE wynosi 2 do 7 dekad, a istniejące testy immunologiczne nie pozwalają na przeprowadzenie pomiarów stężenia powyżej całkowitego zakresu. Tak więc dotychczas do badania swoistych i całkowitej IgE konieczne było wykorzystywanie różnych protokołów z użyciem różnych odczynników.

Dlatego celem niniejszego wynalazku jest opracowanie sposobu mierzenia stężenia i/lub względnej zawartości swoistej immunoglobuliny w próbce, który to sposób jest bezpieczny, szybki i w pełni zautomatyzowany.

Szczególnym celem wynalazku jest dostarczenie w pełni zautomatyzowanego testu immunologicznego do ilościowego oznaczania swoistej immunoglobuiiny, w którym jako test odniesienia używany jest faktycznie równoległy immunologiczny test odniesienia wykorzystujący identyczny protokół badania.

Cel ilościowego oznaczenia swoistych przeciwciał z użyciem faktycznie równoległego immunologicznego testu odniesienia jest osiągany za pomocą sposobu oznaczania stężenia i/lub względnej zawartości swoistej immunoglobuliny w płynnej próbce, w którym mierzoną emisję światła oddzielonej fazy stałej składającej się z wychwyconej swoistej immunoglobuliny sprzężonej ze znacznikiem chemiluminescencyjnym porównuje się z mierzoną emisją światła uzyskaną w równoległym immunologicznym teście odniesienia, w którym mierzona jest całkowita zawartość klasy przeciwciał w próbce, do której należy wymieniona swoista immunoglobulina, przy czym wymieniony sposób charakteryzuje się tym, że miesza się z próbką antygen lub hapten jako ligand, dla którego mierzona jest swoista immunoglobulina związany z biotyną lub jej funkcjonalną pochodną, przeciwciało skierowane przeciw stałej części mierzonej immunoglobuliny związane z cząstkami paramagnetycznymi oraz chemiluminescencyjny związek akrydynowy związany z awidyną, streptawidyną lub ich funkcjonalną pochodną dla utworzenia pierwszego kompleksu fazy stałej, magnetycznie oddziela się wymienioną pierwszą fazę stałą od fazy ciekłej, inicjuje się stosując nadtlenek wodoru reakcję chemiluminescencyjną i mierzy się emisję światła z oddzielonej pierwszej fazy stałej, po czym miesza się z próbką przeciwciało jako ligand skierowane przeciw wymienionej klasie mierzonych immunoglobulin związane z biotyną hub jej funkcjonalną pochodną, przeciwciało skierowane przeciw stałej części klasy mierzonych immunoglobulin związane z cząstkami paramagnetycznymi, oraz chemiluminescencyjny związek akrydynowy związany z awidyną, streptawidyną lub ich funkcjonalną pochodną dla utworzenia drugiego kompleksu fazy stałej, a następnie magnetycznie oddziela się wymienioną drugą fazę stałą od fazy ciekłej, inicjuje się stosując nadtlenek wodoru reakcję chemiluminescencyjną i mierzy się emisję światła oddzielonej drugiej fazy stałej, oraz porównuje się emisję światła oddzielonej pierwszej fazy stałej z emisją oddzielonej drugiej fazy stałej.

W korzystnym przykładzie realizacji sposobu opisanego powyżej miesza się z próbką antygen lub hapten jako ligand związany z biotyną lubjej funkcjonalną pochodną i przeciwciało związane z cząstkami paramagnetycznymi dla utworzenia kompleksu fazy stałej, i dodaje się chemiluminescencyjny związek akrydynowy związany z awidyną, streptawidyną lub ich funkcjonalną pochodną dla utworzenia wymienionego pierwszego kompleksu fazy stałej, po czym miesza się z próbką przeciwciało jako ligand związany z biotyną lub jej funkcjonalną pochodną i przeciwciało związane z cząstkami, paramagnetycznymi dla utworzenia kompleksu fazy stałej, a następnie dodaje się chemiluminescencyjny związek akrydynowy związany kowalentnie z awidyną, streptawidyną lub ich funkcjonalną.pochodną dla utworzenia wymienionego drugiego kompleksu fazy stałej.

Korzystnie jest, gdy mierzoną w próbce swoistą immunoglobulinę wybiera się z grupy składającej się z IgA, IgD, IgE, IgG, IgM oraz ich izotypów, a antygen, przeciwciało lub hapten jako ligand skierowany przeciw zmiennej części swoistej immunoglobuliny jest alergenem, oraz korzystnie, gdy swoista immunoglobulina w próbce należy do klasy immunoglobulin wybranej z grupy składającej się z całkowitej IgA, całkowitej IgD, całkowitej IgE, całkowitej IgG,

173 049 całkowitej IgM oraz ich izotypów, a antygen, przeciwciało lub hapten jako ligand jest przeciwciałem skierowanym przeciwko wymienionej klasie immunoglobulin.

Korzystnie jest, gdy swoistą immunoglobuliną jest swoista IgE, a klasą immunoglobulin iRCt ratknwitn TcrP j— ^o

Korzystnie jest, gdy pizeciwciaio skierowane przeciw mierzonej swoistej immunoglobulinie związane z cząstkami paramagnetycznymi wybiera się z grupy składającej się z przeciwciał poliklonalnych, monoklonalnych, łącznie z przeciwciałami rekombinacyjnymi i przeciwciałami fragmentayzowanymi, korzystnie, gdy jest to monoklonalne mysie przeciwciało anty-immunoglobulinowe.

Korzystnie, chemiluminescencyjnym związkiem akrydynowym jest ester dwumetyloakrydynowy N-hydroksysukcynimidu związany z awidyną, streptawidyną lub ich funkcjonalną pochodną.

Zaletą takiego rozwiązania jest to, że wszystkie odczynniki mogą być mieszane równocześnie w jednym naczyniu reakcyjnym, co minimalizuje ryzyko zanieczyszczenia, błędy i liczbę etapów procedury, zmniejsza znacznie czas trwania testu immunologicznego i w znacznym cłArKnm πΐοίττίΐη nntnmnfx ,απη, o. τ-χτ-λ/-»λοπ o nt-ru tirm /4 αΙζΙπ/Ιπαι?/ i 4o < 1 rinni ott io owjjmu uiuiłriu z_»<xvjy iyiwvou, t*. m ν,ρ/χ u. vr x vx uvi\.iuuiiuov, x Z--Vz liOOC/iU w u· υ,ϋΐΐα^- czenie swoistych immunoglobulin w np. próbce surowicy, może być przeprowadzone w odniesieniu do faktycznie równoległego badania całkowitej zawartości przeciwciał z użyciem identycznego protokołu, a także, że osiągnięta większa wydajność i czułość .ułatwia możliwość wykrycia nawet bardzo niskich stężeń immunoglobulin oraz niskich stężeń swoistych immunoglobulin.

W szczególności wynalazek może być zastosowany do ilościowego oznaczania swoistych IgE w próbce. Gdy próbka jest płynem, np. surowicą lub osoczem, może być dodana bezpośrednio do naczynia reakcyjnego zawierającego korzystnie monoklonalne mysie przeciwciało antyIgE związane z zawieszonymi cząstkami paramagnetycznymi i swoisty alergen (ligand) związany z biotyną w środowisku wodnym. Dlatego korzystnie jest, gdy biotyną jest w postaci estru N-hydroksysukcynimidylowego amidokapronianu biotyny (Sigma nr kat. B2643). Gdy próbka nie jest płynna, np. jest to próba tkanki, korzystnie jest, gdy jest ona homogenizowana i n tif r\ł-irr\ia τιn, r-r·*. T) »·αη1ζ/Ίη τ-νττ »-zx r Trr l_j .π ^\-»·ΛΐΛ/->α /-»!/»··/·»·/>»-»/%*-*»

Z»dvviCoz^Miia. w wuurijm. iw w i v«jvujcł o wuroizj igij w piuuuu, aiUi i uiunuklonalnyiii piz.eciwciałem anty-IgE w środowisku wodnym powoduje utworzenie koniugaru. Znakujący związek chemiluminescencyjny, korzystnie, gdy jest to ester akrydynowy sprzężony ze streptawidyną (Sigma, nr kat. S4762) (DMAE-awidyna) dodawany jest do naczynia reakcyjnego i zachodzi reakcja wiązania między DMAE-awidyną i biotyną związaną z koniugatem i nie skoniugowaną biotyną związaną z alergenem. Znacznik związany z koniugatem oddzielany jest od nie związanego, znakowanego DMAE przeciwciała za pomocą magnetycznego oddzielenia mieszaniny reakcyjnej i zlania supematantu. Chemiluminescencja oddzielonego koniugatu jest mierzona w sposób opisany przez Pazzagli M. i wsp. (wyd.) Studies and applicationi ty Biotom & Medicine, Jpurn^ of Btolomineseence anć Chemiluminesrence di-), i-<n-u, i9e9.

Jako gOnirntenieuży wanyj est wykgnany ównoczośnia_j nównologfy leot iinmuiioloriczn y .Iw całkrwitej IsE, różnitey si, tylko tym, że k orr.ystnie jest, abż)ńko hgsnd hZywene netopoilistonaIne przeciwciało anty-IgE związane z biotyną.

Wszóz wólKug iewnklazhu zestżnid wyjaśmony ky^;d01anowo ne nawikaanik do 'sunku, na Eto tym fig. 1 ϊ fig. 2 ^.k^ują odpewiednto wyniki b baocma Gemowiby IgE, i IgE swpńgtych nio doinam oratreao. fis. g υhaed)tawia \wkres aozszum 01' Dosńwhiwia mierzknia

X X * X X nałkowί-ei asE , ιϊ§. 0 - wykree iOóhZuno dla ppaoweania sposobew IIswIelenle agEswoίstaa (!) zUkum yratensa, ą 0ig. ' i wyniki mtów, któae nio k^ołwierdhp<ą kογιΙζ.,-' miydey stężeiitym galkoN-hy dgE o ewuis ta, -,Ε dlo Uhlcum ρ^ο.

Ds/ew')^

W sposobie według wynalazku mierzy się stężenie immunoglobuliny, którą jest swoista immkoogtonuiine, hwoisśa Ig.E, tgD' dgE, SjG , 'M z ich tootyuami, Uorzekieio, gdy jest to zwojują^E, luą hkasa ihwzlżeontobhiirl, korzystaże wybrarn spgśród grapy ^O^ładaj^c^nj

173 049 się z całkowitej IgA, całkowitej IgD, całkowitej IgE, całkowitej IgG, całkowitej IgM i ich izotypów, korzystnie całkowita IgE.

Przez próbkę, rozumie się każdą próbkę płynną lub przeprowadzoną w stan płynny, w tym roztwory, emulsje, próbki rozproszone i zawiesiny.

Antygenem, przeciwciałem lub haptenem jako ligandem związanym z biotyną może być każda immunologicznie aktywna substancja taka, jak alergen, przeciwciała takie, jak przeciwciała poliklonalne, przeciwciała monoklonalne, łącznie z przeciwciałami rekombinacyjnymi lub fragmentaryzowanymi, korzystnie alergen i/lub poliklonalna anty-immunoglobulina taka, jak np. poliklonalna surowica kozia anty-ludzka dostarczana przez Ventrex Laboratories, Inc. Portland, Maine, Nr kat. 77660. Korzystnie, gdy w immunologicznym teście odniesienia wymienione przeciwciało jest skierowane przeciw stałej części mierzonej klasy immunoglobulin, tj. przeciwciałem skierowanym przeciw immunoglobulmom klasy IgE.

Przez płyn biologiczny rozumie się każdą próbkę kliniczną taką, jak krew, osocze, surowicę, mocz lub ślinę, która zawiera również każdy płyn biologiczny wydalany, wydzielany lub transportowany wewnątrz organizmu.

Przez cząstki paramagnetyczne (πητ) rozumie się cząstki, któie mogą być rozproszone lub zawieszone w środowisku płynnym. We wszystkich przykładach użyto cząstek BioMag (cząstek tlenku żelaza pokrytych grupami zakończonymi grupami aminowymi) sprzedawanych przez wiodącą firmę Magnetics Inc. Cambridge, Massachusetts. Przeciwciała sprzężone z PMP są korzystnie skierowane przeciw stałej części mierzonych immunoglobulin i mogą to być przeciwciała poliklonalne lub monoklonalne, łącznie z przeciwciałami rekombinacyjnymi lub fragmentaryzowanymi, korzystnie gdy jest to przeciwciało monoklonalne MAb A 56971 A3(920325) dostarczane przez BioInvent Internationa! AB, Lund, Szwecja.

Korzystnie jest, gdy chemiluminsecencyjnym związkiem akrydynowymjest ester dwumetyloakrydynowy N-hydroksysukcynimidu, związany kowalentnie z awidyną lub streptawidyną (DMAE-awidyna). Awidyną i DMAE są sprzężone według sposobów Weeks'a i wsp., Clin. Chem. 29/8, 1474-1479 (1983). W sposobie według wynalazku mogą być użyte inne luminescencyjne związki znakujące, które mogą być związane z awidyną lub streptawidyną, na przykład, luminol, lucigenina lub lofiiia.

Przygotowanie przeciwciał biotynylowanych

Biotynylowane anty-IgE oraz Phleum pratense

Poliklonalna surowica kozia anty-ludzka (Ventrex Laboratories, Inc. MA, Stany Zjednoczone) jest oczyszczana w chromatografii powinowactwa na aktywowanej bromocyjanem sefarozie 4B (Pharmacia, Uppsala, Szwecja) ze szpiczakową IgE (OEM concepts, Stany Zjednoczone), jako ligandem. Anty-IgE jest biotynylowane przy stosunku molowym biotyny do anty-I gE=41:1.

pl biotyny (ester N-hydroksysukcynimidylowy amidokapronianu biotyny) (Sigma) o stężeniu 25 mg/ml w dwumetyloformamidzie (Merck) jest dodawane do 0,4 ml anty-IgE o stężeniu 4,5 mg/ml w 0,1 M NaHC0>3 (Merck). Odczynniki są inkubowane w mieszadle o ruchu pionowym przez 2 godziny w temperaturze 25°C. Dodawane jest 0,9 ml roztworu lizyny (Sigma) o stężeniu 20 mg/ml NaHC03. Roztwór jest przesączany, a biotynylowane przeciwciało jest oczyszczane chromatograficznie na sicie superdex 75 Hiload 16,/60 (Pharmacia, Uppsala, Szwecja). Pulowane frakcje są rozcieńczane w buforowanym roztworze soli fizjologicznej PBS o pH 7,2, zawierającym 0,1% albuminy surowicy ludzkiej (Sigma) i 0,1% NaN3 (Sigma).

Ekstrakt Phleum pratense (ALK Laboratories A/S, H0rsholm, Dania) jest biotynylowany w stosunku molarnym 10:1. 0,65 ml roztworu biotyny o stężeniu 10 mg/ml jest dodawane do 0,43 ml ekstraktu Phleum pratense o stężeniu 10 mg/ml w 0,1 M NaHCO3. Odczynniki są inkubowane przez 2 godziny w 25°C w mieszadle o ruchu pionowym, po inkubacji dodawane jest 40 pl roztworu lizyny (Sigma) o stężeniu 50 mg/ml. Roztwór jest sączony, a biotynylowane przeciwciało jest oczyszczane z nadmiaru biotyny w chromatografii ekskluzyjnej na sicie superdex 75 Hiload 16,/60 (Pharmacia). Pulowane są frakcje zawierające alergen. Biotynylowany ekstrakt Phleum pratense jest rozcieńczany za pomocą PBS o pH 7,2, zawierającego 0,1% albuminy surowicy ludzkiej (Sigma) oraz 0,1% NaN3 (Sigma).

173 049

Przygotowanie znacznika estru streptawidynowo-akrydynowego

Streptawidynę skoniugowano z DMAE-NHS [metosiarczan 2',6'-dimetylo-4'-(Nsukcynimidyloksykarbonylo)fenylo- 10-metyloakrydynio-9-karboksylowy z wykorzystaniem cnncnLAu; S τιιοτ> OQ/C 1ΛΎΛ_1,4*7Ο Λ1Οδ2Λ rr τ r wico x »> oj.» j vxiAii. v.xXjlwxjlł. i t α~τ/.χ yA yu.-/y.

Przygotowanie znacznika estru streptawidynowo-akrydynowego

0,96 mg estru dwumetyloakrydynowcgo N-hydroksysukcynimidu DMAE (Ciba Corning Diagnostics Corp., Medfield, MA, Stany Zjednoczone) rozpuszcza się w 1,92 ml dwumetyloformamidu. 250 μΐ tego roztworu pobiera się pipetą do 2,5 ml streptawidyny (Sigma) o stężeniu 1 mg/ml 0,1 M dwuwodorofosforanu sodowego w 0,15 M NaCl o pH 8,15.

Powietrze powyżej roztworu w naczyniu jest wymieniane z azotem (AGA). Odczynniki są inkubowane przez, 30 min. w 25°C z mieszaniem, po inkubacji dodaje się 2250 μl lizyny o stężeniu 10 mg/ml 0,1 M dwuwodorofosforanu sodowego (Merck) w 0,15 M NaCl (Merck) o pH 8,15. Aby usunąć nie związany DMAE roztwór jest nakładany na kolumnę PD-10 (Pharmacia, Uppsala, Szwecja). Eluat jest zbierany i oczyszczany metodą ultrafiltracji z użyciem filtra celulozowego Minitan-S 10.000 NMWL (Millipore). Filtracja jest wykonywana z 1,5 1 buforo„.„-w-----------i- ddc ~ o ___z~~e j,~z +~.i. ~ ne i :

wouęgu lUŁiwuiu a un nĄjvivgivzuicj, ί v pn / ,2,. 1 cuz óU^Łana jg&l umcj mm nu 1 dodaje się 25 ml PBS o pH 7,2 zawierającego 0,5% albuminy surowicy ludzkiej (Sigma) oraz 0,1% NaN₃ (Sigma).

Wynalazek zostanie opisany szczegółowo w następujących przykładach.

Immobilizacja przeciwciała na cząstkach paramagnetycznych.

6,5 g cząstek paramagnetycznych (Ciba Corning Diagnostics Corp., MA, Stany Zjednoczone) jest płukane trzy razy w 650 ml metanolu (Merck) wykorzystując rozdział magnetyczny. Płukanie 650 ml 0,01 M buforu octanowego o pH 5,5 jest wykonywane dwukrotnie. Cząstki są aktywowane w 6,25% roztworze aldehydu glutarowego (Merck) w 0,01 M buforze octanowym o pK 5,5 przez 3 godziny w 25°C. Cząstki są płukane trzy razy w 650 ml 0,01 M bufora octanowego o pH 5,5. Cząstki są sprzęgane z 1083 mg przeciwciała monoklonalnego anty-IgE (ALK Laboratories, Hprsholm, Dania) swoistego dla domeny Fc IgE, przez 24 godziny w 25°C. Cząstki są płukane dwukrotnie w 0,01 M buforze octanowym o pH 5,5. Blokowanie nadmiaru grap aktywnych jest wykonywane za pomocą 200 ml 10% surowicy IgE (ALK Laboratories, H0rsholm. Dania) przez 24 godziny w 25°C. Cząstki są płukane w 650 ml 0,01 M buforu octanowego (Merck), po czym następują 3 płukania w 650 ml 1 M NaCl (Merck). Cząstki są płukane 3 razy w 0,01 M buforze fosforanowym. Cząstki są ponownie zawieszane w 650 ml PBS o pH 7,2 z dodatkiem 0,1% wag./obj. albuminy surowicy bydlęcej (Sigma), 0,001% gamma globuliny bydlęcej (Sigma) i poddawane działaniu ciepła przez 18 godzin w 50°C. Cząstki są płukane 3 razy w 650 ml PBS o pH 7,2 z dodatkiem 0,1% wag./obj. albuminy surowicy bydlęcej (Sigma), 0,001% gamma globuliny bydlęcej (Sigma). Cząstki są poddawane działaniu ciepła przez 7 dni w 37°C. Cząstki są płukane dwukrotnie w 0,01 M buforze fosforanowym. Cząstki są rozcieńczane do 0,5 g na 1 [ml] w PBS o pH 7,2 z 0,5% dodatkiem albuminy surowicy ludzkiej (Sigma).

Przykład 1. Ilościowe oznaczanie antygenu (całkowita IgE)

Określenie całkowitych immunoglobulin IgE, zgodnie z wynalazkiem, zostało przeprowadzone na analizatorze typu ACS: 180 firmy Ciba Corning opisanym w Clinical Chemistry 36/9, 1598-1602 (1990) z wykorzystaniem następującego protokołu:

μΐ próbki i 50 μ] biotynylcwanych anty-IgE jest odmierzone do kuwety przez dozownik. Kuweta dochodzi do pierwszego dozownika odczynników R1, gdzie 100 μΐ cząstek paramagnetycznych z immobilizowanym przeciwciałem monoklonalnym anty-IgE (ALK Laboratories, A/S, H0rsholm, Dania) swoistych dla domeny Fc IgE jest dozowane łącznie z 200 μl znacznika estru streptawidynowo-akrydynowego (ALK Laboratories, A/S, H0rsholm, Dania). Kuweta przesuwa się wzdłuż prowadnicy w kierunku magnesów i stanowiska płukania. Dwukrotnie jest wykonywane płukanie za pomocą 750 μΐ wody dejonizowanej. Po zakończeniu cyklu płukania cząstki są ponownie zawieszane w 300 μl H2O2 o stężeniu 0,5 g/l w 0,1 M HNO3. Kuweta wchodzi do komory luminometru, a przed fotopowielaczem dodawane jest 300 μl 25 mM roztworu NaOH i mierzona jest ilość emitowanych fotonów światła, która jest wyrażana jako względne jednostki światła (RLU). Ilość RLU jest bezpośrednio proporcjo173 049 nalna do ilości lgE w próbce. Czas od odmierzenia przez dozownik próbki do pierwszego wyniku wynosi 15 min, a nowe wyniki następują co 20 sekund. Wyniki są wyrażone w postaci stosunku rt tt badane/RLU tła, gdzie RLU tła jest reakcją chemiluminescencji obserwowaną w braku całkowiiej lgE.

Wykorzystując powyżej opisany protokół badano dziewięć standardów całkowitej lgE, kalibrowanych w zestawie Magic Lite dla całkowitej łgE (ALK Laboratories, A/S, Horsholm, Dania) wobec standardu WHO 2nd lRP nr 75/502 dla lgE surowicy ludzkiej i wykazano, że można wykryć 0,1 j.m./ml całkowitej lgE surowiczej (określanej przez tło x 10 odchyleń standardowych), patrz fig. 1.

Przykład 2. llościowe oznaczanie swoistej immunoglobuliny (swoista lgE)

Zgodnie z wynalazkiem oznaczenie immunoglobulin lgE swoistych dla Phleum pratense (lgE swoista dla tymotki) zostało przeprowadzone na analizatorze typu ACS: 180 firmy Ciba Corning opisanym w Clinical Chemistry 36/9,1598-1602 (1990), z wykorzystaniem następującego protokołu:

gl próbki i 50 gl biotynylowanego ekstraktu Phleum pratense zostało odmierzone do kuwety przez dozownik próbki. Kuweta dochodzi do pierwszego dozownika odczynników R1, gdzie 100 gl cząstek paramagnetycznych z immobilizowanym przeciwciałem monoklonalnym anty-lgE (ALK Laboratories A/S, H0rsholm, Dania) swoistym dla domeny Fc lgE jest dozowane łącznie z 200 gl znacznika estru streptawidynowo-akrydynowego (ALKLaboratories A/S, H0rsholm, Dania). Kuweta przesuwa się wzdłuż prowadnicy w kierunku magnesów i stanowiska płukania. Płukanie za pomocą 750 gl wody dejonizowanej wykonywane jest dwukrotnie. Po zakończeniu cyklu płukania cząstki są ponownie zawieszane w 300 gl H2O2 o stężeniu 0,5 g/l 0,1 M HNO3. Kuweta wchodzi do komory luminometru, a przed fotopowielaczem dodawane jest 300 gl 25 mM roztworu NaOH i mierzona jest ilość emitowanych fotonów światła, która jest wyrażana jako względne jednostki światła (RLU). llość RLU jest bezpośrednio proporcjonalna do ilości lgE w próbce. Czas od odmierzenia przez dozownik próbki do pierwszego wyniku wynosi 15 min, a nowe wyniki następują co 20 sekund. Wyniki są wyrażone w postaci stosunku RLU badane/RLU tła, gdzie RLU tła jest reakcją chemiluminescencji obserwowaną przy braku całkowitej lgE.

Wykorzystując powyżej opisany protokół zbadano dziesięć standardów lgE swoistych dla Phleum pratense, kalibrowanych w zestawie Magic Lite SQ dla swoistych lgE (ALK Laboratories A/S, H0rsholm, Dania) wobec próbek klinicznie scharakteryzowanych pacjentów z alergią na Phleum pratense i wyrażono w postaci j.s./ml (jednostki standaryzowane - j.s.) i wykazano, że w teście Magic Lite SQ dla swoistych lgE można zmierzyć między 1,43 a 800 j.s./ml lgE swoistej dla Phleum pratense, patrz fig. 2.

Przykład 3. llościowe oznaczanie swoistej lgE wobec wzorca WHO dla całkowitej lgE.

llościowe oznaczenie swoistych immunoglobulin klasy lgE w próbkach surowicy wykonano w odniesieniu do całkowitej zawartości immunoglobuliny klasy lgE dla swoistej immunoglobuliny klasy lgE z użyciem identycznego protokołu badania, jak opisano odpowiednio w przykładach 1 i 2.

Trzydzieści pięć próbek pacjentów badano na lgE swoiste dla Phleum pratense równocześnie z 10 standardami lgE swoistej dla Phleum pratense, kalibrowanych w zestawie Magie Lite SQ dla swoistych lgE (ALK Laboratories, A/S, H0rsholm, Dania) wobec próbek klinicznie scharakteryzowanych pacjentów uczulonych na Phleum pratense i wyrażono jako j.s./ml (protokół opisano w przykładzie 2).

Dziewięć standardów WHO 2nd lRP Nr 75/502 (Krajowa Rada standardów biologicznych) badano w tej samej serii wobec całkowitej lgE (protokół opisano w przykładzie 1).

Figura 3 przedstawia porównanie dwóch krzywych odpowiedzi na dawkę w badaniu odpowiednio całkowitej lgE i lgE swoistych dla Phleum pratense. Test linii równoległej nie wykazał istotnych różnic w nachyleniu między dwiema krzywymi odpowiedzi na dawkę, co wskazuje, że swoista lgE w próbkach pacjentów mogła być kalibrowana wobec standardu WHO dla całkowitej lgE i wyrażane jako j.m./ml.

173 049

Figura 4 przedstawia porównanie wyników z 35 próbek surowic pacjentów kalibrowanych wobec standardów WHO dla całkowitej IgE (wyrażane jako j.m./ml) lub standardów dla IgE swoistej dla Phleum prat^c^^nse (wyrażane jako j.m./ml) i wykazuje bardzo dobrą korelację między nanej próbki obliczono wykorzystując interpolację ironio fóanrkcA niP7n \u-v* »» ·*·*ύ / _x -----wielomianem sklejanym trzeciego stopnia po zlogarytmowaniu względem transformacji logarytmicznej odpowiednio stosunku sygnału/tła i stężenia (dawki).

Obliczono z wykresu regresji liniowej, że jednaj.s. (jednostkastandaryzowana) odpowiada 0,14 jednostki międzynarodowej (j.m.).

W podsumowaniu IgE swoista dla alergenu może być mierzona wykorzystując przykład wykonania według wynalazku i kalibrowana bezpośrednio z badania całkowitej IgE kalibrowanej krzywej standardowej WHO dla IgE.

Przykład 4. Porównanie metod dla całkowitej IgE

Trzydzieści trzy próbki pacjentów mierzono na zawartość całkowitej IgE surowiczej za pomocą zestawu Magic Lite dla całkowitej IgE (ALK Laboratories A/S, HOrsholm, Dania). Badanie przeprowadzono zgodnie z instrukcją producenta. W tych samych próbkach mierzono

--y.....τ_·τ» --------: a. .—---\ on ~~w τ

CdlKUWlLą ±gJ2. W buiuwiuy w αιι<ΐιχζ.αννιζ/θ ην-ο. ιυν z>gvuniv ł, piuiutwium vp13anjj.11 w ριζ^ινια.dzie 1.

Figura 5 przedstawia wykres rozrzutu dla porównania metod mierzenia całkowitej IgE surowiczej. Stwierdzono, że współczynnik korelacji wynosi r = 0,90.

Przykład 5. Porównanie metod dla swoistej IgE

Trzydzieści pięć próbek pacjentów mierzono na zawartość IgE swoistej dla Phleum pratense za pomocą zestawu Magic Lite dla swoistej IgE (ALK Laboratories A/S, H0rsholm, Dania). Badanie przeprowadzono zgodnie z instrukcją producenta. W tych samych próbkach mierzono IgE swoiste dla Phleum pratense w analizatorze ACS: 180, zgodnie z protokołem opisanym w przykładzie 2.

Figura 6 przedstawia wykres rozrzutu dla porównania metod mierzenia IgE swoistej dla Phleum pratense. Stwierdzono korelację o współczynniku r = 0,80.

Przykład 6. Porównanie dokładności testów

Rozrzut w obrębie serii oznaczenia całkowitej IgE dla analizatora ACS z wykorzystaniem protokołu opisanego w przykładzie 1 porównano z rozrzutem przy badaniu z wykorzystaniem zestawu Magie Lite do oznaczania całkowitej IgE. Próbki pacjentów były badane w trzech powtórzeniach w badaniach opisanych w przykładzie 4. Pulowany współczynnik zmienności w obrębie serii (CVpwr) obliczono według Krouwera i Rabinowitza, Clinical Chemistry, 30, 290 (1984). Uzyskano następujące wyniki:

	Magie Lite	ACS
% CVpwr	4,69	2,75
Min %CV	0,80	0,70
Maks. %CV	11,70	8,40

Jak widać z wyników, automatyzacja i zmniejszenie liczby etapów procedury poprawia dokładność analizy (testem F:F = 1,71, p = 0,049).

Przykład 7. Porównanie całkowitej i swoistej IgE w próbkach pacjentów Próbki, w których mierzono IgE swoiste dla Phleum pratense za pomocą analizatora

ACS: 180 według protokołu opisanego w przykładzie 2 i kalibrowane względem całkowitej IgE odniesienia (WHO 75/502), jak to opisano w przykładzie 3, analizowano także pod względem całkowitej IgE w sposób opisany w przykładzie 1. Stosunek między zmierzoną IgE swoistą a IgE całkowitą obliczno dla każdej próbki i wyrażono jako % stosunek (j.m. swoiste/j.m. całkowite* 100).

173 049

Uzyskano następujące wyniki:

Nr	IgE swoista ™ Λ-τ-.! uia l invmu ^m-vnov	Całkowite TgE j .m /ml	Stosunek %
1	0,973	208,300	0,467
2	0,000	153,330	0,000
3	0,000	25,119	0,000
4	0,000	43,980	0,000
5	0,082	51,997	0,158
6	0,586	30,807	1,902
7	9,130	20,796	43,903
8	2,125	168,771	1,259
O	1 545	321 553	0 480
			w, .
10	0,000	299,105	0,000
11	1,664	248,660	0,669
12	8,553	46,635	18,340
13	19,427	234,858	8,272
14	0,000	178,304	0,000
15	2,380	428,987	0,555
16	4,342	112,457	3,861
17	3,975	173,793	2,287
18	0,220	206,580	0,106
19	0,158	298,630	0,053
20	4,936	17,116	28,839
21	0,376	146,939	0,256
22	4,865	23,521	20,684
23	3,115	281,804	1,105
24	0,017	17,937	0,095
25	3,446	160,651	2,145
26	1,485	167,427	0,887
27	2,763	124,309	2,223
28	3,705	247,679	1,496
29	1,289	196,314	0,657
30	8,967	416,528	2,153
31	0,355	29,784	1,192
32 .	15,173	290,670	5,220
33	2,141	63,847	3,353
34	3,929	96,951	4,053
35	0,154	>620	nie ozn.

Jak widać z wyników test dla IgE swoistej dla Phleum pratense umożliwił pomiar IgE swoistej dla Phleum pratense, gdy stanowiła ona zaledwie 0,05% całkowitej IgE. Niskie względne ilości IgE

173 049 swoistej dla Phleum pratense wskazują, że w próbkach są obecne IgE swoiste dla innych alergenów. W jednej próbce stwierdzono, że do 44% całkowitej IgE było swoistej dla Phleum pratense. Nie stwierdzono korelacji między stężeniem całkowitej IgE a stężeniem IgE swoistej dla Phleum pratense, jak to przed stawiono na fig. 7.

Przykład 8. Określenie całkowitych immunoglobulin klasy IgA w surowicy z użyciem cząstek paramagnetycznych i znacznika estru awidynowo-akrydynowego.

Określenie całkowitych immunoglobulin klasy IgA badano za pomocą następującego protokołu:

pl próbki pacjenta lub standardu odmierzono pipetą do probówki badanej o wymiarach 12 x 75 mm. Do każdej probówki dodano 50 pl biotynylowanego poliklonalnego przeciwciała anty-IgA DAKO E484 (dostarczane przez DAKO, Glostrup, Dania) w 0,05 M buforze fosforanowym o pH 7,4 zawierającym 0,1% azydku sodu, 0,01% Tween®20 oraz 0,1% albuminy surowicy ludzkiej i pozostawiono do przereagowania na 15 minut w temperaturze otoczenia. 400 pl zawiesiny cząstek paramagnetycznych z immobilizowanym poliklonalnym przeciwciałem anty-IgA DAKO A 262 (dostarczane przez DAKO, Glostrup, Dania) dodano do każdej

-« 111 nuvuuavji ~j\j z n 2.C z n iks.

»1»·« -i rv> l-nn 4· pivuvwjvi i mituuuwauu 2 ππιιιχι. x w uvj estru streptawidynowo-akrydynowego rozcieńczonego w tym samym buforze jak opisano wyżej, dodawano do każdej probówki i inkubowano przez dalsze 5 minut w temperaturze otoczenia. Cząstki paramagnetyczne płukano dwukrotnie 0,2 M buforem fosforanowym o pH 7,4 zawierającym 0,l% Tween®20, po oddzieleniu cząstek magnetycznych od płynu za pomocą separatora podstawy magnetycznej i wymieszaniu oddzielonych cząstek z buforem płuczącym, jak to opisano wyżej. Zawartość probówek mierzono ostatecznie w luminometrze, w którym mierzono światło emitowane przy 426 nm i wyrażano jako względne jednostki światła (RLUs).

Standardy IgA DAKO Χ908 (dostarczane przez DAKO, Glostrup, Dania) dla całkowitej IgA kalibrowane wobec standardu WHO Nr 67/86 dla surowicy ludzkiej badano z wykorzystaniem wyżej opisanego protokołu.

Standardy:

Stężenie (pg/ml)	RLU
0	370937
0,02	417000
0,23	557563
2,32	1252260
23,2	1872357

173 049

j.jł./bI

Stężenie całkowitej IgE a Tło x 10 sd -O- Standardy WHO dla całkowitej IgE

173 049

j.s./ml —·— Standardy Magie Lite SQ

- Punkt odcięcia

Magic Lite SQ ( 1.43 j.s./ml )

Steżenie IgE swoistej dla Phleum pratense

Fig. 2

173 049

Sygnał / Tło

—·— Próbki IgE swoiste dla Phleum pratense

Ό- Standardy WHO 75/502 dla całkowitej IgE

Stążeme względne f<3 3

173 049

j.m. ACS = - 0,0837 + 0,13752'j.s. ACS korelacja: r = 0,99618

j.s./ml

Całkowita IgE Korelacja: r = 0,90221

j.m./ml

Całkowita IgE Magie Lite

173 049

IgE swoista dla Phleum pratense Korelacja: r = 0,79645

Magic Lite SQ j.s./ml

Fig 6

Korelacja: r = 0,lb940, p = 0,338

IgE całkowita ( j.m./ml )

ACS

Fig- ?

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz.

Claims

1. Sposób mierzenia stężenia i/lub względnej zawartości swoistej immunoglobuliny w próbce, w którym mierzoną emisję światła oddzielonej fazy stałej składającej się z wychwyconej swoistej immunoglobuliny sprzężonej ze znacznikiem chemiluminescencyjnym porównuje się z mierzoną emisją światła uzyskaną w równoległym immunologicznym teście odniesienia, w którym mierzona jest całkowita zawartość immunoglobulin w próbce, do której należy wymieniona swoista immunoglobulina, znamienny tyra, że miesza się z próbką antygen lub hapten jako ligand, dla którego mierzona jest swoista immunoglobulina związany z biotyną Iub jej funkcjonalną pochodną, przeciwciało skierowane przeciw stałej części mierzonej immunogiobuliny związane z cząstkami paramagnetycznymi oraz chemiluminescencyjny związek akrydynowy związany z awidyną, streptawidyną lub ich funkcjonalną pochodną dla utworzenia pierwszego kompleksu fazy stałej, magnetycznie oddziela się wymienioną pierwszą fazę stałą od fazy ciekłej, inicjuje się stosując nadtlenek wodoru reakcję chemiluminescencyjną i mierzy się emisję światła oddzielonej pierwszej fazy stałej, przy czym miesza się z próbką przeciwciało jako ligand skierowane przeciw wymienionej klasie mierzonych immunoglobulin związane z biotyną lub jej funkcjonalną pochodną, przeciwciało skierowane przeciw stałej części mierzonych immunoglobulin związane z cząstkami paramagnceycznymi, oraz chemiluminescencyjny związek akrydynowy związany z awidyną, streptawidyną lub ich funkcjonalną pochodną dla utworzenia drugiego kompleksu fazy stałej, a następnie magnetycznie oddziela się wymienioną drugą fazę stalą od fazy ciekłej, inicjuje się stosując nadtlenek wodoru reakcję chemiluminescencyjną i mierzy się emisję światła oddzielonej drugiej fazy stałej, oraz porównuje się emisję światła oddzielonej pierwszej fazy stałej z emisją oddzielonej drugiej fazy stałej.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że miesza się z próbką antygen iub hapten jako ligand związany z biotyną iub jej funkcjonalną pochodną i przeciwciało związane z cząstkami paramagnetycznymi dla utworzenia kompleksu fazy stałej, i dodaje się chemiluminescencyjny związek akrydynowy związany z awidyną, streptawidyną iub ich funkcjonalną pochodną dla utworzenia wymienionego pierwszego kompleksu fazy stałej, po czym miesza się z próbką przeciwciało jako ligand związany z biotyną lub jej funkcjonalną pochodną i przeciwciało związane z cząstkami paramagnetycznymi dla utworzenia kompleksu fazy stałej, a następnie dodaje się chemiluminescencyjny związek akrydynowy związany kowalentnie z awidyną, streptawidyną lub ich funkcjonalną pochodną dla utworzenia wymienionego drugiego kompleksu fazy stałej.

3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że swoistą immunoglobulinę wybiera się z grupy składającej się z lgA, lgD, lgE, lgG, lgM oraz ich izotypów, a antygen, przeciwciało lub hapten jako ligand skierowany przeciw zmiennej części swoistej immunoglobuliny jest alergenem, oraz korzystnie, gdy swoista immunoglobulina w próbce należy do klasy immunoglobulin wybranej z grupy składającej się z całkowitej lgA, całkowitej lgD, całkowitej lgE, całkowitej lgG, całkowitej lgM oraz ich izotypów, a antygen, przeciwciało lub hapten jako ligand jest przeciwciałem skierowanym przeciwko wymienionej klasie immunoglobulin.

4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że swoistą immunoglobuliną jest swoista lgE, a klasą immunoglobulin jest całkowita lgE.

5. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że przeciwciało skierowane przeciw mierzonej swoistej immunogłobulinie związane z cząstkami paramagnetycznymi wybiera się spośród grupy składającej się z przeciwciał poliklonalnych, monoklonalnych, łącznie z przeciwciałami rekombinacyjnymi i przeciwciałami fragmentaryzowanymi, korzystnie, gdy jest to monoklonalne mysie przeciwciało anty-immunoglobulinowe.

173 049

6. Sposób według zast.rz.1 albo 2, znamienny t^n, że chemilununescencyjnym związkiem akrydynowym jest ester dwsy-tteloakrydynowe N-Uedrokeyeukcenimidu związane z awidyną, streptawidyną Iub icU funkcjonalną pochodną.