JPH08503132A - 熱ショックタンパク質および腫瘍の治療 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 腫瘍の治療に使用するための発現ベクターであって、熱ショックポリペプチド（hsp）またはシャペロンであるポリペプチドを発現可能な形態でコードする少なくとも一つの配列を含む核酸を含むベクターが提供される。

Description

【発明の詳細な説明】 熱ショックタンパク質および腫瘍の治療 本発明は熱ショックタンパク質またはシャペロン（chaperone）を発現する発 現ベクターに関する。 通常、固型腫瘍は手術、化学療法および放射線療法の組み合わせにより治療さ れる。また、白血病の如きその他の腫瘍は化学療法および放射線療法により治療 される。しかしながら、これらの治療方法は理想的ではない。何となれば、放射 線療法および化学療法は不快な副作用を生じ、また脳腫瘍の如き或る種の固型腫 瘍は手術により治療し得ないからである。これらの理由のために、腫瘍を治療し 、予防するための新規な方法が絶えず探究されている。現在研究されている一つ の方法は、例えば、IL-2またはTNFをコードする遺伝子の遺伝子移入の使用であ る。 腫瘍はマウスに腫瘍細胞系を投与することにより誘発し得る。特に、マウスマ クロファージ腫瘍細胞系J774が投与されるマウスは、大きな、腹腔内の、悪性度 の高いリンパ細網腫瘍を発生する。驚くことに、このような腫瘍細胞がマイコバ クテリウム・レプラエ(Mycobacterium leprae)65kD hspをコードする遺伝子を移 入され、続いてマウスに投与される場合、細胞の腫瘍形成性の低下または消失が あることがわかった。更に、このような移入細胞をマウスの如き宿主に投与し、 続いて宿主が移入されなかった同じ細胞系からの腫瘍細胞で抗原投与する場合、 腫瘍は発生しない。それ故、その技術は、腫瘍の治療に関する別の、または付加 的なアプローチにつき可能性を有する。 本発明は、熱ショックポリペプチド（hsp）またはシャペロンであるポリペプ チドを発現可能な形態でコードする少なくとも一つの配列を含む核酸を含む、例 えば、腫瘍の治療における治療薬として使用するための哺乳類細胞または発現ベ クターを提供する。 ポリペプチドとして、例えば、熱ショックタンパク質、熱ショックタンパク質 フラグメント、熱ショックタンパク質類縁体、シャペロン、シャペロンフラグメ ントまたはシャペロン類縁体が挙げられる。フラグメントは、長さが少なくとも 10、好ましくは少なくとも15、例えば、20、25、30、40、50または60のアミノ酸 残基であろう。類縁体は一般に少なくとも５、好ましくは少なくとも10、例えば 、20、40、60または100 以上の連続するアミノ酸の領域にわたって熱ショックタ ンパク質またはシャペロンに対し少なくとも70％、好ましくは少なくとも80％ま たは90％、更に好ましくは少なくとも95％相同であろう。類縁体のアミノ酸配列 は、少なくとも一つの残基が欠失、挿入または置換される場合は、熱ショックタ ンパク質またはシャペロンのアミノ酸配列と異なっていてもよい。 シャペロンは、タンパク質からそれらの活性なコンホメーションへの折りたた みを媒介するタンパク質である。シャペロンおよび熱ショックポリペプチドの両 方であるポリペプチドが存在する。熱ショックポリペプチド、例えば、hsp60 、 hsp65 およびhsp70 はその他のタンパク質の折りたたみおよびトランスロケーシ ョンに関与し、それ故、またシャペロンである。 フラグメントは、グリコシル化されていないが、それらの抗腫瘍活性を保持す るポリペプチドを含む。類縁体は、異なるアミノ 酸配列で操作されているが、それらの抗腫瘍活性を保持するタンパク質を含む。 本発明の発現ベクターの核酸は一本鎖または二本鎖であってもよく、またRNA またはDNA であってもよい。一般に、核酸は本明細書に特定されたようなポリペ プチドをコードする唯一の配列を含むが、核酸は本明細書に特定されたようなポ リペプチドを別々にコードする２、３、４またはそれより多い配列を含んでいて もよい。 本発明の発現ベクターまたは細胞系中に含まれる核酸は、本明細書に特定され たようなあらゆる好適なポリペプチドをコードするが、好ましくは宿主のポリペ プチドをコードしない。ポリペプチドはシャパロニンであることが好ましく、ま たポリペプチドはバクテリアのhsp 、例えば、マイコバクテリウム・レプラエ65 kD hsp またはマイコバクテリウム・レプラエ70kD hspであることが最も好まし い。 本発明の発現ベクターは、一般に、ウイルス、プラスミド、コスミド、エピソ ームベクターまたは裸の核酸である。一般に、裸の核酸は、調節配列と一緒にポ リペプチドをコードする配列を含む。裸の核酸は、一般に、少なくとも100 、例 えば、少なくとも200 、400 、600 、800 、1000、2000または4000の塩基対を含 む。裸の核酸は一本鎖または二本鎖であってもよく、またDNA またはRNA であっ てもよい。好適なプラスミドとして、例えば、pZIPNeo、pLXSN およびMFG が挙 げられる。 本発明の発現ベクターとして都合よく使用されるウイルスとして、ベクターの 核酸がRNA であるウイルス、例えば、不能状態の レトロウイルス、およびDNA ウイルス、例えば、ワクシニアウイルスまたはアデ ノウイルスが挙げられる。ベクターまたはウイルスは、感染細胞中のポリペプチ ドの発現を得るように宿主に直接投与されてもよく、または最初に細胞系にとり 込まれ、次にこれが宿主に投与されてもよい。ベクターまたはウイルスが宿主に 直接投与される場合、使用されるウイルスは一般にヘルパーを含まず、かつ複製 欠損である。 発現ベクターは組換え核酸を含むことが好ましい。 また、本発明は、裸の核酸以外の発現ベクターの生産方法を提供するものであ り、その方法は本明細書に特定されたポリペプチドをコードする遺伝子をベクタ ーにクローン化することを含む。本発明の方法によれば、ポリペプチドをコード する遺伝子は既知の方法（Silva，Palacios，Colston およびLowrie，Microbiol P-athogenesis 12，27-38（1992）） を使用して発現ベクターに直接クローン 化し得る。また、本発明は、異種DNA を細胞のゲノムに挿入し、または本発明の 発現ベクターを細胞系に移入することを含む細胞の生産方法を提供する。本発明 によれば、異種DNA は既知の方法（Molecular Cloning： A Laboratory Manual ，T.Maniat-isら，Cold Spring Harbour，1989）を使用してゲノムに挿入し得る 。 移入細胞系は、通常の技術を使用してポリペプチドをコードする遺伝子を好適 なベクター、例えば、レトロウイルスシャトルベクター、例えば、pZIPNeoSV（x ）にクローン化し、そして既知の方法（Silvaら）を使用してそのベクターを細 胞系に移入することにより調製される。 本発明の発現ベクターがとり込まれ得る細胞系は一般に哺乳類であり、腫瘍細 胞系、MHC IおよびII陰性細胞系、並びにマウスおよびヒトの細胞系を含む。そ れらが、特に、定着した腫瘍を治療するために投与されるであろう宿主または患 者に由来する細胞系、例えば、腫瘍細胞系を使用することが可能である。移入さ れる細胞系は、それに対する保護が探究される腫瘍の細胞系であることが最も好 ましい。 本発明の発現ベクターまたは細胞は、腫瘍関連抗原またはインターロイキンを コードする配列を更に含んでいてもよい。本発明の発現ベクターまたは細胞は、 腫瘍関連抗原またはインターロイキンをコードする配列を有する発現ベクターを 含んでいてもよい。幾つかの研究は、サイトカインをコードする遺伝子によるマ ウス腫瘍細胞のトランスフェクションが親腫瘍の免疫拒絶を生じることを示した 。この種の実験に使用されたサイトカイン遺伝子として、IL-4、IL-2、γIFN、T NF α、IL-6、IL-7およびGM-CSFが挙げられる。これらの遺伝子の一種以上が本 発明のポリペプチドをコードする遺伝子と相乗作用し、それ故、腫瘍撲滅を得る 機会を最大にし得る。 異なり、かつ無関係の腫瘍細胞系により生じた腫瘍は共通の腫瘍関連抗原を有 することがあり、この場合、このような共通抗原を発現する一つの細胞系による 本発明の免疫化が、また共通抗原を有するその他の腫瘍に対する保護を与え得る （しかし、共通抗原を有しない腫瘍に対して大きな保護を与えそうもない）。そ れ故、本発明はまた本明細書に特定されたポリペプチドおよび腫瘍関連抗原を発 現する細胞系を提供する。このような細胞系は、腫 瘍関連抗原をコードする別のベクターと一緒に本発明の発現ベクターが移入され てもよく、またはそれらは発現可能な形態の腫瘍関連抗原をコードする配列をも 含む本発明の発現ベクターが移入されてもよい。 本発明によれば、発現ベクターまたは細胞系は、健康な宿主（患者）の腫瘍の 予防及び宿主（患者）に存在する腫瘍の治療に使用し得る。発現ベクターは患者 に直接投与し得る。発現ベクターがウイルスである場合、細胞トランスフェクシ ョンはウイルスを宿主に直接投与することによりin vivo で行い得る。また、in vitroの免疫化は、宿主（患者）から採り出した好適なリンパ球を本発明の移入 細胞系に感作し、そしてリンパ球を宿主（患者）に戻すことにより行い得る。 また、本発明は、（a）有効な無毒量の発現ベクターまたは細胞系を宿主に投 与することを含む腫瘍の治療方法、（b）腫瘍の治療に使用するための発現ベク ターまたは細胞系および（c）腫瘍の治療用の薬剤を製造するための発現ベクタ ーまたは細胞系の使用を提供する。 更に、本発明は、腫瘍の治療用の薬剤を製造するための本明細書に特定された 核酸の使用を提供する。 本発明は精製された形態の本明細書に特定された発現ベクターまたは細胞を提 供する。更に、本発明は単離された場合の本明細書に特定された発現ベクターま たは細胞を提供する。更に、本発明は熱ショックポリペプチド（hsp）またはシ ャペロンであるポリペプチドを発現可能な形態でコードする少なくとも一つの配 列を含む核酸から実質的になる本明細書に特定された発現ベクターを 提供する。 本発明の発現ベクターまたは細胞は、治療される症状に適したあらゆる経路に よりヒトを含む哺乳類に投与でき、好適な経路として、経口経路、直腸経路、鼻 内経路、局所経路（頬側および舌下を含む）、膣内経路および非経口経路（皮下 、筋肉内、静脈内、皮内、鞘内および硬膜外を含む）が挙げられる。好ましい経 路は、例えば、レシピエントの状態および求められる治療の型により変化し得る ことが理解されるであろう。こうして、存在する腫瘍は全身治療されてもよく、 またはベクターもしくは細胞を病変の部位に直接送出するように選択された経路 により治療し得る。予防措置は、おそらく標的腫瘍により冒されているであろう 組織中で予防免疫を剌激することを目的とするであろう。 本発明の発現ベクターは、単独で、またはリポソームもしくはその他の送出分 子と組み合わせて患者に投与し得る。有効投与量は、いずれの送出分子が使用さ れるのかに依存するが、一般に、好ましくは腫瘍に局所注射される、腫瘍１g当 たり100〜500mgのベクター、または治療もしくは転移の予防のために静脈内注射 される毎週体重１kg当たり10〜100mgである。 下記の製剤中の活性成分は先に特定された本発明のベクターもしくは細胞また はin vitroで免疫化された細胞である。 上記の実用性および指示のそれぞれにつき、個々の活性成分の必要量は、治療 される症状の重度およびレシピエントの同一性を含む幾つかの因子に依存するで あろうし、また最終的には主治医の判断によるであろう。しかしながら、一般に 、これらの実用性および指示のそれぞれにつき、治療が移入腫瘍細胞で行われる 場 合、好適な有効投与量は、毎週レシピエントの体重１kg当たり10⁴〜10¹⁰の細胞 の範囲、好ましくは毎週体重１kg当たり10⁵〜10⁸の細胞の範囲、最も好ましくは 毎週体重１kg 当たり10⁵〜10⁷の細胞の範囲であろう。投与量は、所望により、 その週にわたって適当な間隔で投与される２回、３回、４回またはそれより多い 回数のサブ投与量として与えられてもよい。治療がhsp65 遺伝子を含むベクター を用いて行われる場合、有効投薬量は毎週体重１kg 当たり10⁴〜10¹²の無ヘルパ ーの複製欠損ウイルスの範囲、好ましくは毎週体重１kg 当たり10⁵〜10¹¹のウイ ルスの範囲、最も好ましくは毎週体重１kg 当たり10⁶〜10¹⁰のウイルスの範囲で あろう。本明細書に記載された投与量は上記の投与量のそれぞれに適用可能であ る。 化合物は単独で投与することが可能であるが、それらを医薬製剤として与える ことが好ましい。本発明の製剤は、一種以上の許容可能な担体および必要により その他の治療成分とともに、先に特定された少なくとも一種の活性成分を含む。 一種以上の担体は、製剤のその他の成分と適合性であり、そのレシピエントに有 害ではないという意味で“許容可能な”必要があり、例えば、リポソームである 。好適なリポソームとして、例えば、正に荷電された脂質Ｎ［１−（２，３−ジ オレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアンモニウム（DOTMA） を含むもの、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（DOPE）を含むもの 、および３β［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コ レステロール（DC-Chol）を含むものが挙げられる。 製剤として、経口投与、直腸投与、鼻内投与、局所投与（頬側 および舌下を含む）、膣内投与または非経口投与（皮下、筋肉内、静脈内、皮内 、鞘内および硬膜外を含む）に適した製剤が挙げられる。製剤は単位投与形態で 都合よく与えられてもよく、また薬学の分野で公知の方法のいずれかにより調製 されてもよい。このような方法は、一種以上のアクセサリー成分を構成する担体 と活性成分とを混在させる工程を含む。一般に、製剤は、活性成分を液体担体も しくは微細な固体担体またはその両方と一様かつ緊密に混在させ、次に、必要に より、その製品を成形することにより調製される。 経口投与に適した本発明の製剤は、それぞれ、前もって決めた量の活性成分を 含むカプセル、カシェ剤または錠剤の如き不連続単位として；粉末または顆粒と して；水性液または非水性液中の溶液または懸濁液として；または水中油液体エ マルションもしくは油中水液体エマルションとして与えられてもよい。また、活 性成分は巨丸剤、舐剤またはペーストとして与えられてもよい。 錠剤は、必要により一種以上のアクセサリー成分と一緒に、圧縮または成形に よりつくられてもよい。圧縮錠剤は好適な機械中で必要によりバインダー（例え ば、ポビドン、ゼラチン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース）、滑剤、不活 性希釈剤、防腐剤、崩壊剤（例えば、ナトリウム澱粉グリコレート、架橋ポビド ン、架橋ナトリウムカルボキシメチルセルロース）、表面活性剤または分散剤と 混合された粉末または顆粒の如き易流動性形態の活性成分を圧縮することにより 調製し得る。成形錠剤は好適な機械中で不活性液体希釈剤で湿らされた粉末化合 物の混合物を成形することにより製造し得る。錠剤は必要により被覆または刻ま れても よく、また、例えば、種々の割合でヒドロキシプロピルメチルセルロースを使用 してその中の活性成分の遅い放出または調節された放出を与えて所望の放出プロ フィールを与えるように製剤化し得る。 製剤は、例えば、0.075 〜20％w/w、好ましくは0.2 〜15％w/w、最も好ましく は0.5 〜10％w/w の量の活性成分を含む局所軟膏またはクリームとして適用し得 る。軟膏中で製剤化される場合、活性成分はパラフィン系または水混和性の軟膏 ベースと共に使用し得る。また、活性成分はクリーム中で水中油クリームベース で製剤化し得る。 また、眼への局所投与に適した製剤は点眼剤を含み、この場合、活性成分は好 適な担体、特に、活性成分用の水性溶媒中に溶解または懸濁される。活性成分は 0.5 〜20％、有利には0.5 〜10％、特に、約1.5 ％w/w の濃度でこのような製剤 中に存在することが好ましい。 口中の局所投与に適した製剤として、矯味矯臭されたベース、通常、蔗糖およ びアカシアまたはトラガカント中に活性成分を含むロゼンジ；不活性ベース、例 えば、ゼラチンおよびグリセリン、または蔗糖およびアカシア中に活性成分を含 むトローチ；並びに好適な液体担体中に活性成分を含む含嗽剤が挙げられる。 直腸投与用の製剤は、例えば、ココアバターまたはサリチル酸塩を含む適当な ベースを含む座薬として与えられてもよい。 担体が固体であるような鼻内投与に適した製剤は、例えば、20〜500 ミクロン の範囲の粒子サイズを有する粗大粉末を含み、これは嗅剤が、例えば、鼻の近く に保持された容器から鼻通過によ る迅速な粉末の吸入により摂取されるような方法で投与される。 例えば、鼻内スプレーまたは点鼻液としての投与に適した製剤（その担体は液体 である）として、活性成分の水性または油性の溶液が挙げられる。 膣内投与に適した製剤は、活性成分の他に、当業界で適当であることが知られ ているような担体を含むペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、フ ォームまたはスプレー製剤として投与し得る。 非経口投与に適した製剤として、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤および製剤を意 図されるレシピエントの血液で等張性にする溶質を含んでいてもよい水性および 非水性の滅菌注射液；並びに懸濁剤および増粘剤、およびリポソームまたはその 他の微粒状系（これらはその化合物を血液成分または一つ以上の臓器を標的とす るように設計される）を含んでいてもよい水性および非水性の滅菌懸濁液が挙げ られる。製剤は単位投与容器または多投与容器、例えば、シールされたアンプル およびバイアル中で与えられてもよく、また、使用直前に滅菌液体担体、例えば 、注射用の水の添加のみを必要とする凍結乾燥状態で貯蔵し得る。注射溶液およ び懸濁液は前記の種類の滅菌粉末、顆粒および錠剤から即時に調製し得る。 好ましい単位投与製剤は、活性成分の、本明細書に上記された毎日の投与量ま たは単位の毎日のサブ投与量またはその適当なフラクションを含む製剤である。 特に上記された成分の他に、本発明の製剤は、当該製剤の型に関して当業界で 通常のその他の薬剤を含んでいてもよいことが理 解されるべきであり、例えば、経口投与に適した製剤は矯味矯臭剤を含んでいて もよい。 本発明の発現ベクターまたは細胞により治療し得る腫瘍の例は、例えば、骨原 性肉腫および軟組織肉腫を含む肉腫、癌種、例えば、乳癌、肺癌、膀胱癌、甲状 腺癌、前立腺癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胃癌、肝臓癌、子宮癌、および卵巣 癌、ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫を含むリンパ腫、神経芽細胞腫 、メラノーマ、骨髄腫、ウィルムス腫瘍、並びに急性リンパ芽球性白血病および 急性骨髄芽球性白血病を含む白血病、グリオーマおよび網膜芽細胞腫である。 添付図面中、図１（a）は対照細胞および本発明に従って調製された移入細胞 中のマイコバクテリウム・レプラエ65kD熱ショックタンパク質（hsp）をコード する遺伝子の発現を示す。図１（b）は21日にわたる親細胞、ベクター単独を移 入された親細胞およびマイコバクテリウム・レプラエ65kD hsp遺伝子を移入され た親細胞の増殖を示す。 図２は本発明に従って免疫化されたマウスの脾臓細胞のin vitroでの細胞毒性 を示す。標的細胞はJ774-hsp 65 （□）、J774（△）、Pu518（◇）およびWehi 164（○）であった。 図３はDNA 含量に対する増殖細胞の数を示す。J774細胞、ベクター単独を移入 されたJ774細胞、リン酸カルシウム沈殿によりhsp-65遺伝子を移入されたJ774細 胞およびリポソーム介在性遺伝子移入によりhsp-65遺伝子を移入されたJ774細胞 に関する結果が示される。 図４はJ774-hsp 65 細胞中でp53 エピトープを発現する細胞の ％を示す。 図５はhsp 65遺伝子を含むプラスミドを受けるマウス（○）およびhsp 65遺伝 子を受けないマウス（□）中の腫瘍サイズを示す。 本発明が下記の実施例により説明される。 実施例１ 腫瘍細胞系に熱ショックポリペプチド（hsp）をコードする遺伝子を移入する 効果を、マウスマクロファージ腫瘍細胞系J774にマイコバクテリウム・レプラエ 65kD hspをコードする遺伝子を移入することにより調べた。 遺伝子トランスフェクションを、Silva，Palacios，Colston＆Lowrie，Microb iol Pathogenesis 12, 27-38（1992）に記載されたようにして行った。M.レプラ エ65kD hsp遺伝子をレトロウイルスシャトルベクターpZIPNeoSV（x）にクローン 化し、これをリン酸カルシウム沈殿によりウイルスパッケージング細胞系psi-CR E に移入した。ネオマイシン耐性クローンからの上澄みをポリブレンおよび選択 されたネオマイシン耐性細胞の存在下でJ774-G8 細胞でインキュベートした。65 kD hsp遺伝子の発現を、モノクローナル抗体C1118（これはM.レプラエ65kDタン パク質を認識する）およびフルオレセインイソチオシアネート標識ウサギ抗マウ スF（ab'）₂を使用する間接標識後に細胞のFACS分析により分析した。図１（a） は間接免疫蛍光により分析された対照細胞および移入細胞中のhsp65 の発現を示 す。破線は二次抗体単独との反応性を示す。 親（J774）細胞系および移入細胞系の腫瘍形成性を胸腺機能正常マウスおよび 胸腺欠損マウスで試験した。腫瘍細胞は親J774-G8（J774）細胞、ベクター単独 を移入された親細胞系（J774-ベクター）、 またはミクロバクテリアhsp65 遺伝子を移入された親細胞系（J774-hsp65）であ った。成功した安定なトランスフェクションをSilvaらに記載されたようにして ノーザンブロッティングおよびウェスタンブロッティングにより更に確かめた。 群当たり５匹のマウスに10⁶の細胞を腹腔内注射した。図１（b）はそれぞれ正常 Balb/cマウスおよび胸腺欠損Balb/ｃマウス中の細胞系の増殖を示す。腫瘍サイ ズを、試験マウスの一次腫瘍および腹部臓器を計量し、そして５匹の年齢のマッ チした正常な対照の腹部臓器の重量を引くことにより計算した。 図１に示された結果から、J774-hsp65細胞を注射されたマウス中の腫瘍の発生 率はJ774細胞またはJ774- ベクター細胞を注射されたマウス中の腫瘍の発生率よ り極めて低いことが明らかである。注射の21日後に、J774細胞またはJ774ベクタ ー細胞を注射された全てのマウスが少なくとも８gの重量の腫瘍を有し、一方、J 774-hsp65 細胞を注射されたマウスは腫瘍を発生しなかったか、または３g未満 の重量の腫瘍を有する。 実施例２ 正常なBalb/cマウス、胸腺欠損Balb/cマウスおよびCBA マウスに、表１に示さ れた数の腫瘍細胞を腹腔内注射した。細胞を最初にエンドトキシンを含まないPB S 0.5ml 中で懸濁した。腫瘍細胞は実施例１と同じ方法で調製し、親細胞系（J7 74）、ミコバクテリアhsp65 遺伝子を移入された親細胞系（J774-hsp65）、また はベクター単独を移入された親細胞系（J774-ベクター）であった。腫瘍発生率 を腫瘍細胞の注射の21日後に剖検および組織検査により測 定した。結果を表１に示す。 実施例３ J774-hsp65細胞を実施例１に記載された方法に従って調製した。正常なBalb/c マウスおよび胸腺欠損Balb/cマウスを、毎週の間隔 で与えられる10⁶のJ774-hsp65細胞を４回の腹腔内注射で免疫した。28日目に、 マウスに異なる起源の10⁶の細網肉腫細胞を腹腔内に抗原投与した。腫瘍発生率 および腫瘍サイズを抗原投与の21日後に記録した。腫瘍サイズを実施例１と同じ 方法で測定した。結果を表２に示す。 表２に示された結果は、正常なBalb/cマウスが、J774-hsp細胞で注射された場 合、J774細胞およびJ774- ベクター細胞に対して良好な免疫を発生することを示 す。また、これらの結果は、正常なBalb/c免疫マウスがPu518 細胞系に対し若干 の抵抗性を有することを示す。全てのマウスが腫瘍を発生するとは限らず、そし て発生したマウスにおいて、形成した腫瘍は免疫されなかったマウスよりかなり 小さいサイズのものであった。Wehi 164細胞系に対し免疫されたマウスの抵抗性 は不十分であった。マウスの大部分が、免疫されなかったマウスに発生した腫瘍 と同様のサイズである腫瘍を発生した。 J774-hsp65細胞による免疫化はBalb/c胸腺欠損マウスに対し効果を有しなかっ た。 実施例４ J774-hsp65細胞を実施例１に記載された方法に従って調製した。 J774-hsp65細胞で免疫されたマウスからの脾臓細胞のin vitroでの細胞毒性活 性を、正常なBalb/cマウスおよびBalb/c胸腺欠損マウスを、毎週の間隔で、10⁶ のJ774-hsp65細胞を４回の腹腔内注射で免疫することにより調べた。28日目に、 脾臓を採り出し、単細胞懸濁液をRPMI 1640＋10％ウシ胎児血清中で調製した。 細胞を30Gyにより照射されたJ774-hsp65細胞で６日間インキュベートした。Ｂ細 胞をウサギ抗マウスIgG 被覆プレートでパンニングすることにより除去した。CD 4 およびCD8 Ｔ細胞サブセットを、LukacsおよびKurlander，J．Immunol．143， 3731-3736（1989）に記載された方法を使用して精製した。NK細胞およびCD4 細 胞また はCD8 細胞を、４℃で30分間の10μg/mlのPK136（抗NK1.1）および抗L3T4または 抗Lyt 2モノクローナル抗体により10⁷/mlの細胞を処理することにより採り出し 、続いて37℃で60分間、ウサギ補体の1/10希釈液によりインキュベートしてCD4 集団およびCD8集団を得、これらはFACS分析により測定して90％を越えて純粋で あった。細胞毒性活性を、種々の数のCD4またはCD8エフェクター細胞を３重のウ ェル中で⁵¹Crで標識した2000/ ウェルの標的細胞でＶ字形の底の96ウェルマイク ロタイター・プレート中で37℃で６時間にわたってインキュベートすることによ り測定した。⁵¹Cr放出を、エフェクターＴ細胞および標的細胞を含むウェル（cp m _experimental）、培地単独中でインキュベートされた標的細胞を含むウェル（ cpm _spontan-eous） および標的細胞＋0.1 ％のトリトンＸを含むウェル（cpm _{m aximal} ）中で測定した。次式を使用して、細胞毒性を計算した。 結果を平均士標準偏差として図２に示す。標的細胞は、J774-hsp65（□）、J7 74（△）、Pu518（◇）およびWehi 164 （○）であった。 図２中の結果は、免疫されたマウスからの脾臓細胞のin vitroでの細胞毒性が J774細胞に対するのと同様にJ774-hsp65に対して大きく、またPu518 細胞（細胞 毒性は有意であったが、小さかった）およびWehi 164細胞（細胞毒性なし）に対 するよりも極めて大きいことを示す。 実施例５ 腫瘍細胞の細胞周期に関するhsp トランスフェクションの効果を、細胞をDNA 特異的ベンズイミド色素、ヘキスト33342 で染色することにより調べた。二つの 異なる方法、リン酸Ca沈殿（J774-HSP-Ca） およびリポソーム介在性遺伝子移入 （J774-HSP-L）によりマイコバクテリウム・レプラエhsp-65を移入されたJ774腫 瘍細胞、並びに移入されなかった対照J774細胞およびベクター移入された対照J7 74細胞（２ x 10⁶/ml）を37℃で30分間にわたって10μg/mlのヘキスト色素で染 色した。FACSアナライザーを使用して、DNAヒストグラムを得、そして細胞周期 のそれぞれの時期の細胞の％を測定した。 図３中の結果は、高DNA 含量を有する増殖細胞（Ｓ期およびG2期）の数がhsp- 65遺伝子（J774-HSP-CaおよびJ774-HSP-L）を移入された腫瘍細胞中で減少した ことを示す。同時に、対照腫瘍細胞と比較して低DNA 含量を有するhsp-65発現細 胞（GO/G1期）の数に増加が見られた。これらの実験は、hsp-65遺伝子による腫 瘍細胞のトランスフェクションが細胞周期の調節の変化を生じることを示し、そ して腫瘍細胞の基本的な特性の一つである制御できない増殖を変化させることを 示唆する。 実施例６ 機能不全性p53 腫瘍サプレッサータンパク質を生じるp53 遺伝子の突然変異は 、悪性腫瘍における最も頻繁に観察される遺伝的病変である。マイコバクテリウ ム・レプラエhsp65 を移入された 腫瘍細胞および対照腫瘍細胞を、p53 腫瘍サプレッサータンパク質の発現につき 調べた。J774-HSP細胞を実施例１に記載された方法に従って調製した。p53 タン パク質の発現をFACS分析により分析した。細胞膜を0.05％のサポニンにより透過 性にし、次に細胞をp53 に対し特異的なモノクローナル抗体（D．Laneにより提 供されたAb-248およびAb-421）およびFITC標識ウサギ抗マウスF（ab'）₂二次抗 体でインキュベートした。 図４はJ774-hsp65細胞中の両方のp53 エピトープの増大された発現を示す。p5 3 は正常な細胞周期調節に必須のDNA 結合タンパク質であるので、本発明者らの 実験はhsp65 がp53 腫瘍サプレッサータンパク質を通じて細胞周期に対するその 効果を与え得ることを示唆する。hsp65 移入細胞の増大されたシャペロン活性は 、有効ではない変異体p53 タンパク質の適当な折りたたみおよびコンホメーシ ョンをもたらすことができ、それにより腫瘍サプレッサー機能のその損失を修正 することができた。 実施例７ 後発的細網肉腫を有するBalb/cマウスが、10⁶のJ774腫瘍細胞による腫瘍誘発 の14日後にマイコバクテリウム・レプラエhsp65遺伝子によるin vitroでの遺伝 子治療を受けた。100 μg のpZIPML65プラスミドおよび100 μg のリポソームの 混合物を腫瘍に腹腔内および静脈内に４回注射して転移細胞を治療した。21日目 に、マウスを殺し、解剖を行い、そして腫瘍サイズを測定した。図５中の結果は hsp65 遺伝子を含むプラスミドを受けたマウスにおける腫瘍の縮小を示す。６匹 の治療マウスの群のうち１匹のみに 腫瘍が見られ、一方、６匹の治療されていない対照の全てが21日目までに大きな 腫瘍を発生した。更なる研究が必要とされ、組織学的証拠が腫瘍縮小につき得ら れたが、本発明者らのデータはhsp65 遺伝子がin vitroで腫瘍にうまく送出され 、腫瘍縮小をもたらし得ることを示す。hsp65 遺伝子のin vitro注射は、移入さ れることとなった細胞の失われた腫瘍形成性をもたらすことができ、その一方、 移入細胞により生じた細胞毒性Ｔ細胞応答が残りの移入されなかった細胞の撲滅 を果たすことができた。この二重の効果がhsp65 を癌の遺伝子治療における魅力 的な選択にする。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 39/00 Ｈ 9284−4Ｃ Ａ 9284−4Ｃ 48/00 8314−4Ｃ Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｂ 8615−4Ｃ Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ 9282−4Ｂ // Ａ６１Ｋ 35/12 7431−4Ｃ (Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:32） (Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:32） (72)発明者 ローリー，ダグラス イギリス国 エヌダブリュー７ １エイエ イ ロンドン ミル ヒル，ザ リッジウ ェイ，ナショナル インスティテュート フォー メディカル リサーチ（番地な し) (72)発明者 ルカクス，カタリン ヴェロニカ イギリス国 エヌダブリュー７ １エイエ イ ロンドン ミル ヒル，ザ リッジウ ェイ，ナショナル インスティテュート フォー メディカル リサーチ（番地な し)

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １. 腫瘍の治療に使用するための発現ベクターであって、熱ショックポリペプチ ド（hsp）またはシャペロンであるポリペプチドを発現可能な形態でコードする 少なくとも一つの配列を含む核酸を含むベクター。 ２. ポリペプチドがシャパラロニンである請求項１に記載の発現ベクター。 ３. ポリペプチドが細菌のhsp である請求項１に記載の発現ベクター。 ４. hsp がマイコバクテリウム・レプラエ（Mycobacterium leprae）65kD hspま たはマイコバクテリウム・レプラエ70kD hspである請求項３に記載の発現ベクタ ー。 ５. マイコバクテリウム・レプラエ65kD hsp、マイコバクテリウム・レプラエ70 kD hspまたはマイコバクテリウム・ツバキュロシス(Mycobacterium tuberculosi s)の65kDa 抗原をコードする配列を含む核酸を含む発現ベクター以外の熱ショッ クポリペプチドを発現可能な形態でコードする配列を含む発現ベクター。 ６. ウイルスである請求項１〜５のいずれか一項に記載の発現ベクター。 ７. 核酸がRNA である請求項６に記載の発現ベクター。 ８. 不能状態のレトロウイルスである請求項７に記載の発現ベクター。 ９. レトロウイルスシャトルベクターである請求項７に記載の発現ベクター。 10. pZIPNeoSV（x）である請求項９に記載の発現ベクター。 11. ワクシニアウイルスである請求項６に記載の発現ベクター。 12. アデノウイルスである請求項６に記載の発現ベクター。 13. プラスミドである請求項１〜５のいずれか一項に記載の発現ベクター。 14. エピソームベクターである請求項１〜５のいずれか一項に記載の発現ベクタ ー。 15. 腫瘍関連抗原をコードする配列を更に含む請求項１〜14のいずれか一項に記 載の発現ベクター。 16. インターロイキンをコードする配列を更に含む請求項１〜15のいずれか一項 に記載の発現ベクター。 17. 請求項１〜16のいずれか一項に記載の発現ベクターを含む細胞。 18. 細胞が請求項１〜16のいずれか一項に記載の発現ベクターを含む腫瘍細胞系 。 19. 請求項17または18に記載のヒト細胞または細胞系。 20. 請求項１に記載のポリペプチドを発現可能な形態でコードする異種核酸をゲ ノム中に有する細胞またはウイルス。 21. 腫瘍関連抗原をコードする配列を有する発現ベクターを更に含む請求項17〜 20のいずれか一項に記載の細胞または細胞系。 22. 腫瘍関連抗原またはインターロイキンをコードする配列を有する発現ベクタ ーを更に含む請求項６〜12のいずれか一項に記載の発現ベクター。 23. 請求項１〜22のいずれか一項に記載の発現ベクター、細胞、細胞系またはウ イルスおよび医薬上許容可能な担体を含む医薬組 成物。 24. 担体がリポソームである請求項23に記載の医薬組成物。 25. 腫瘍関連抗原またはインターロイキンをコードする配列を有する発現ベクタ ーを更に含む請求項23または24に記載の医薬組成物。 26. 無毒性の有効量の請求項１〜22のいずれか一項に記載の発現ベクター、細胞 系、細胞またはウイルスを含む医薬組成物。 27. ポリペプチドをコードする遺伝子をベクターにクローン化することを含む、 請求項１〜16のいずれか一項に記載の発現ベクターの生産方法。 28. ポリペプチドをコードする遺伝子をベクターにクローン化し、そのベクター を細胞または細胞系に移入することを含む、請求項17〜21のいずれか一項に記載 の細胞または細胞系の生産方法。 29. 腫瘍の治療用の薬剤を製造するための請求項１〜22のいずれか一項に記載の 発現ベクター、細胞系、細胞またはウイルスの使用。 30. 腫瘍の治療用の薬剤を製造するための請求項１〜４のいずれか一項に記載の 核酸の使用。 31. 治療が既存の腫瘍の治療である請求項29または30に記載の使用。 32. 治療が予防である請求項29または30に記載の使用。 33. 無毒性の有効量の請求項１〜22のいずれか一項に記載の発現ベクター、細胞 系、細胞若しくはウイルスまたは請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸を宿 主に投与することを含む腫瘍の治療方法。 34. 宿主が健康であり、かつ治療が予防である請求項33に記載の治療方法。 35. 宿主が腫瘍を有し、かつ処置が治療である請求項33に記載の治療方法。 36. 熱ショックポリペプチド（hsp）またはシャペロンであるポリペプチドを発 現可能な形態でコードする少なくとも一つの配列を含む核酸を含む治療薬として 使用するための発現ベクター。