JPH08503376A

JPH08503376A - 細菌内の異種遺伝子の発現の間の内因性アミノペプチダーゼ媒介ｎ−末端アミノ酸開裂の防止

Info

Publication number: JPH08503376A
Application number: JP6512780A
Authority: JP
Inventors: ハイツマン、マルクス; モバ、ラオ; ラメッジ、ポール
Original assignee: サンド・リミテッド
Priority date: 1992-11-30
Filing date: 1993-11-29
Publication date: 1996-04-16
Also published as: GB9225021D0; DE69310540D1; GR3023348T3; WO1994012659A1; ES2101489T3; ATE152772T1; US6165746A; EP0670907B1; DE69310540T2; EP0670907A1; CA2145384A1; DK0670907T3

Abstract

(57)【要約】細菌宿主における、内因性細菌性アミノペプチダーゼの処理の対象となる式Ｘ−Ｐｒｏ−Ｚである、哺乳類タンパク質またはポリペプチドの成熟形の組み換え製造する方法が提供される。式Ｘ−Ｐｒｏ−Ｚにおいて、Ｘはプロリン以外の一個のＮ−末端アミノ酸およびＺはタンパク質またはポリペプチドのアミノ酸残基の残りの配列である。本方法は、Ｍｅｔ−Ｙ−Ｘ−Ｐｒｏ−Ｚ（ここで、Ｙはアミノペプチダーゼで特異的にＹ−Ｘ−Ｐｒｏ−Ｚからイン・ビトロで切断され、内因性細菌アミノペプチダーゼによるイン・ビボ処理処理の耐性を提供する天然アミノ酸）をコードするＤＮＡを含む好適なベクターを細菌宿主に挿入することを含む。細胞で、次いで生産物Ｍｅｔ−Ｙ−Ｘ−Ｐｒｏ−Ｚを発現を誘発し、それを好適なアミノペプチダーゼで処理し、ＭｅｔおよびＹを切断する。

Description

【発明の詳細な説明】細菌内の異種遺伝子の発現の間の内因性アミノペプチダーゼ媒介Ｎ−末端アミノ酸開裂の防止本発明は、原核生物宿主における哺乳類タンパク質およびペプチドの組み換え製造に関する。哺乳類起源のタンパク質を細菌宿主、例えば大腸菌（E.coli）中で発現させた場合、そのＮ−末端にメチオニン残基（Ｍｅｔ）を有する前駆体タンパク質として通常発現される。このＭｅｔ残基は、その天然の成熟形でタンパク質を得るために除去しなければならない。これは、タンパク質からのＮ−末端アミノ酸の連続的切断が可能なある種のアミノペプチダーゼ酵素、例えばエアロモナス（Aero monas）から得られるアミノペプチダーゼ−１（ＡＰ−１）を使用することによりできる。この切断工程は“停止信号”として働くあるアミノ酸またはアミノ酸の組み合わせにより停止する。ＡＰ−１の停止信号はアスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルアミン酸（Ｇｌｕ）および組み合わせＸ−Ｐｒｏ（ここで、Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸である）を含む。従って、国際特許公開ＷＯ８６／０１２２９に記載されているように、本酵素は、Ｎ−末端配列：を有する、細菌宿主で発現されたタンパク質からＮ−末端Ｍｅｔを特異的に切断するのに使用され得る。しかしながら、大腸菌のような細菌宿主は、細菌により製造されたあるタンパク質のＮ−末端残基を非特異的方法で切断できる内因性ペプチダーゼ酵素を含む。これは、しばしば非常に望ましくない生産物の混合物をもたらす。例えば、２位にＰｒｏを有するタンパク質が大腸菌内で発現された場合、初期のＭｅｔ−Ｘ −Ｐｒｏ−タンパク質は、大腸菌のＮ−末端メチオニンアミノペプチダーゼ（ＭＡＰ）により処理される。本酵素はＸ−Ｐｒｏを停止信号として認識せず、Ｍｅｔ残基だけでなくＸも除去し得る。このようなタンパク質の一つの例はＩＬ−６である。ＩＬ−６は、哺乳類細胞中で、Ｎ−末端に２８アミノ酸の信号配列を有する前駆体の合成および処理により製造される、分泌リンホカインである。本信号配列の除去は、Ｎ−末端配列Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−を有する１８５アミノ酸の成熟タンパク質をもたらす。組み換えタンパク質が大腸菌中で製造された場合、タンパク質コード配列が使用され、それは信号ペプチドをコードするコドンを含まないが、成熟タンパク質をコードするコドンに先立つ開始コドンを有する。発現において、本開始コドンは、最初の翻訳生産物がＮ−末端配列：Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−−−−−−−−（ＩＬ−６の残り） −１＋１２・・・・・・・・１８５を有するようにＭｅｔ残基を産生する。しかしながら、本生産物のイン・ビボでの大腸菌のＭＡＰ酵素による部分的処理は、ある発酵条件に対して下に示すように、Ｎ−末端の異なるＩＬ−６種の異種混合物をもたらす：Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−−−−−−− ３３％Ａｌａ−Ｐｒｏ−−−−−−− １６％ｐｒｏ−−−−−−− ５１％。従って、得られるタンパク質生産物のわずか１６％のみが、所望の成熟タンパク質である。更に、本混合物の、最初の生産物のＭｅｔを切断するためのＡＰ− １での処理は、更に３番目の生産物のＶａｌ³−Ｐｒｏ⁴−−−−ＩＬ−６への切断を担い、不均質を更に増加させる。このようなタンパク質の別の例は、ＥＰ０２８５４４８に記載されているＬＩＦ（白血病阻害因子）である。本タンパク質を大腸菌中で製造した場合、最初の翻訳生産物は、Ｎ−末端配列：Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−−−−−−−（ＬＩＦの残り） −１＋１＋２１８５を有する。本生産物の大腸菌のＭＡＰ酵素による部分的処理は、ある発酵条件で、以下のＬＩＦ種の異種混合物をもたらす：Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−−−−−−− ７９％Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−−−−−−− １２％Ｐｒｏ−−−−−−− ９％。従って、得られたタンパク質の僅か１２％が所望の成熟タンパク質である。また、本混合物の、最初の生産物のＭｅｔを切断するためのＡＰ−１での処理は、更に３番目の生産物の切断を担う。同様の問題が多くの有用な他のタンパク質の細菌宿主中での組み換え製造において発生する。従って、生産物の内因性ＭＡＰ酵素による処理が減少した、原核宿主細胞中のタンパク質およびペプチドの製造法を提供するのが本発明の目的である。ドイツ特許公開ＤＥ４０３９４１５は、細菌宿主を、付加的アミノ酸をＮ−末端に発現させることにより、タンパク質からＮ−末端Ｍｅｔを特異的に切断する方法を記載している。発現されたタンパク質は、Ｍｅｔ−Ｙ−Ｘ−Ｐｒｏ−Ａ（ここで、ＸはＴｈｒ、ＡｌａまたはＳｅｒ；ＹはＰｒｏ−Ｐｒｏ配列を伴う少なくとも２個のアミノ酸末端または、ＸがＳｅｒの場合、Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｒｏ；およびＡは興味の対象のタンパク質の残りである）である。ＩｇＡ−プロテアーゼを、次いでＭｅｔ−Ｙを切断するのに使用し、タンパク質Ｘ−Ｐｒｏ−Ａを遊離させる。しかしながら、本ドイツ特許公開は、ＩｇＡ−プロテアーゼを使用したＭｅｔの切断を得るための問題を扱っており、初期タンパク質のＭＡＰによるイン・ビボ切断の問題は扱っていない。ＷＯ８６／０１２２９において、エアロモナスアミノペプチダーゼがＭｅｔ− Ｌｅｕ−ｂＧＨおよびＭｅｔ−ｂＧＨを切断するのに使用し得、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）を成熟させることを記載している。しかしながら、Ｌｅｕの挿入により得られる利点の示唆はなく、細菌内因性アミノペプチダーゼによるイン・ビボ処理の問題は、記載されていないか、考慮中である。最初に翻訳したタンパク質またはポリペプチドが、一個の好適な、付加的なアミノ酸をＮ−末端Ｍｅｔおよびタンパク質またはポリペプチドの成熟形の最初のアミノ酸残基の間に有していれば、内因性ＭＡＰにより、タンパク質またはポリペプチドは処理されないか、または僅かしか処理されないことが、本発明により分かった。また、タンパク質またはポリペプチドは好適なアミノペプチダーゼにより、タンパク質またはポリペプチドの所望の成熟形へ特異的に切断される。従って、本発明は、内因性細菌アミノペプチダーゼの処理の対象となる哺乳類タンパク質またはポリペプチドの成熟形の細菌宿主内の組み換え製造の方法を提供し、タンパク質またはポリペプチドは式Ｘ−Ｐｒｏ−Ｚ（式中、Ｘはプロリン以外の一個のＮ−末端アミノ酸およびＺはタンパク質またはポリペプチドのアミノ酸残基の残りの配列である）である；本方法は：ａ）Ｍｅｔ−Ｙ−Ｘ−Ｐｒｏ−Ｚ（ここで、ＸおよびＺは上記で定義の意味およびＹはアミノペプチダーゼで特異的にＹ−Ｘ−Ｐｒｏ−Ｚからイン・ビトロで切断可能で、内因性細菌アミノペプチダーゼによるイン・ビボ処理処理の耐性を提供する天然アミノ酸）をコードするＤＮＡを含む好適なベクターで細菌宿主細胞を形質転換する；ｂ）形質転換細胞の生産物Ｍｅｔ−Ｙ−Ｘ−Ｐｒｏ−Ｚの発現を誘発する；ｃ）生産物Ｍｅｔ−Ｙ−Ｘ−Ｐｒｏ−Ｚを好適なアミノペプチダーゼで処理し、ＭｅｔおよびＹを切断する；およびｄ）タンパク質またはポリペプチドＸ−Ｐｒｏ−Ｚを単離する；ただし、Ｘ−Ｐｒｏ−Ｚが成熟ウシ成長ホルモンの場合、ＹはＬｅｕではない：の工程を含む。Ｍｅｔ−Ｙ−Ｘ−Ｐｒｏ−Ｚ生産物中の好適も選択されたアミノ酸残基Ｙの挿入は、細菌宿主細胞の発現生産物の均質性の非常な改善をもたらす。次に、好適なアミノペプチダーゼで処理した後の生産物の均質性に大きな改善をもたらす。好ましくは、細菌宿主は大腸菌である。哺乳類タンパク質またはペプチドはＸ −ＰｒｏをＮ−末端の最初の２個のアミノ酸残基として有している任意のタンパク質またはポリペプチドであり得る。好ましい哺乳類タンパク質はＩＬ−６およびＬＩＦを含む。別の例は、Ｎ−末端配列Ａｌａ¹−Ｐｒｏ²−Ｍｅｔ³−を有するＩＬ−３である。アミノペプチダーゼは好ましくはバシラス・ステアロサーモフィラス（Bacillus Stearothermophilus）、ストレプトマイセス・クリセウス（St reptomyces qriseus）またはエアロモナス、より好ましくはエアロモナスから得られるものである。最も好ましくは、エアロモナス由来のＡＰ−１であり、その製造法はプレスコットら、J.Biol.Chem.２４６、１７５６（１９７１）に記載されている。ｂ）のＭｅｔ−Ｙ−Ｘ−Ｐｒｏ−Ｘ発現生産物は、好ましくは好適なアミノペプチダーゼで処理する前に単離する。工程ｄ）において、所望のタンパク質またはポリペプチドＸ−Ｐｒｏ−Ｚは、実質的にＭｅｔ−Ｙ−Ｘ−Ｐｒｏ−Ｚ、Ｙ− Ｘ−Ｐｒｏ−ＺおよびＰｒｏ−Ｚのような他の形なしに、成熟形として単離される。アミノ酸Ｙの選択は、個々の哺乳類タンパク質またはペプチドおよび使用する発現系に依存し、最初の発現生産物Ｍｅｔ−Ｙ−Ｘ−Ｐｒｏ−Ｚの以下の特性により決定されるであろう：ｉ）生産物は使用する宿主／ベクター系において高濃度の発現が可能でなければならない； ii）生産物は内因性細菌性アミノペプチダーゼによるイン・ビボ処理に耐性であるか、またはＭｅｔ^-1以上を除去する任意の内因性処理に耐性でなければならない；および iii）生産物は上記工程ｃ）で使用するアミノペプチダーゼにより、Ｘ−Ｐｒｏ−Ｚへ特異的に切断されなければならない。好ましくはＹは、長側鎖を有するアミノ酸から選択され、特にＳｅｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、ＩｌｅおよびＬｅｕから選択される。好適なアミノ酸Ｙの選択は、アミノ酸の既知の特性および好適な最適化を基本にして行うことができる。例えば、あるタンパク質では、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、ＶａｌおよびＨｉｓからのＹの選択は、ＡＰ−１によるＹの特異的および早い切断をもたらす。従って、もしＡＰ−１を使用するのであれは、Ｙはこれらのアミノ酸から選択することがかなりありそうである。しかしながら、アミノ酸Ｙの内因性ＭＡＰ切断阻害の能力と釣り合っていることが必要である。あるタンパク質において、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｔｙｒ、ＰｈｅおよびＭｅｔは強く内因性ＭＡＰ切断を阻害し、Ａｓｎ、ＩｌｅおよびＬｅｕもまたこれらのタンパク質で切断を阻害する。これらの両方の群に含まれるアミノ酸の選択は、したがって、特異的ＡＰ−１切断および内因性ＭＡＰ切断の阻害を非常に提供しそうである。得られるベクターは、次いでタンパク質の充分な発現について試験しなければならない。ＩＬ−６系（Ｍｅｔ−Ｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｚ）において行われる試験で、ＹがＧｌｎ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｔｙｒ、ＰｈｅまたはＭｅｔの場合、ＭＡＰによるタンパク質のイン・ビボ処理は見られない。ＹがＬｅｕ、ＩｌｅまたはＡｓｎの場合、処理の程度は非常に少ない；非常に少量のＹ−Ａｌａ−Ｐｒｏ− Ｚが検出されるだけである。しかしながら、非常に特異的なＡＰ−１によるＭｅｔ−Ｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＺのＡｌａ−Ｐｒｏ−Ｚへの切断は、ＹがＩｌｅ、Ｌｅｕ、Ｈｉｓ、ＰｈｅまたはＭｅｔの場合得られる。従って、Ｍｅｔ−Ｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｚタンパク質（ここで、ＹはＩｌｅ、Ｌｅｕ、Ｈｉｓ、ＰｈｅまたはＭｅｔである）は、ＩＬ−６の好適な前駆体である。充分なレベルの発現は、ＹがＨｉｓ、ＰｈｅおよびＭｅｔの場合得られる。好ましくは、ＩＬ−６にとって、ＹがＰｈｅである。ＬＩＦ系（Ｍｅｔ−Ｙ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｚ）において、ＹがＨｉｓ、ＰｈｅおよびＩｌｅの場合、イン・ビボＭｅｔ切断は著しく減少する。Ｍｅｔ−Ｙ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−ＺのＡＰ−１による成熟形への切断の高特異性は、ＹがＰｈｅまたはＩｌｅの場合である。発現の程度は、これらの残基の両方で充分高い。好ましくは、ＬＩＦ系にとって、ＹはＩｌｅである。Ｙ−Ｘ−Ｐｒｏ−ＺをコードするＤＮＡを含むベクターは、任意の多くの慣用の技術により製造できる。好ましくはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を使用し、好適な５’および３’プライマーおよび鋳型としての成熟タンパク質のＤＮＡコード付けを使用して、タンパク質コドン配列を製造する。次いで、ＤＮＡを好適なベクターにクローン化し、得られる発現ベクターを大腸菌のような好適な宿主に形質導入する。次いで、宿主の発酵を行い、宿主に、必要なタンパク質を発現させる。一度充分高い細胞密度に到達したら、細胞を回収し、溶解してタンパク質を遊離させることができる。これは、浸透または機械的技術を使用してできる。マントン−ガウリンプレスの使用は、通常完全な分裂をもたらす。必要ならば、細胞を最初にリソザイムで処理して、細胞をより分裂に感受性にする。通常、発現タンパク質は密集封入体の形であり、それを遠心により回収する。次いで、タンパク質をグアニジン塩酸塩または尿素のようなカオトロープ（Ch aotrope）で処理することにより、封入体フラクションから可溶化する。得られる可溶化および折り畳まれていないタンパク質を、次いで希釈、酸化的再折り畳み、界面活性剤の添加等の好適な技術により、リネーチャー（renature）する。これらの技術は既知であり、ＥＰ−Ａ０２１９８７４、ＥＰ−Ａ０１１４５０６およびＷＯ８４／０３７１１に例を見ることができる。再折り畳みしたタンパク質を、次いで、個々のタンパク質に好適なクロマトグラフィー法を使用して単離する。また、これらの技術は既知である。アミノペプチダーゼ、好ましくはＡＰ−１を、次いで、単離タンパク質に、通常、酵素：基質の比が１：１００から１：１００００、更に好ましくは１：１０００から１：５０００の範囲で加える。好適な温度および反応時間は選択でき、一度必要な時間が経ったら、通常、酸の添加または酵素のクロマトグラフィー的除去により反応を停止する。次いで、タンパク質を好適なクロマトグラフィー法を使用して更に精製する。必要であれば、蛋白質の酸化形およびエンドトキシンを除去する更なる精製を行うことができる。アミノペプチダーゼが充分な時間活性である限り、工程により回収されたタンパク質の９９％以上の均質性を得ることができる。別の態様において、本発明は、配列Ｘ−Ｐｒｏ−Ｚの成熟哺乳類タンパク質またはポリペプチド生産物の前駆体の製造法であり、前駆体がＭｅｔ−Ｙ−Ｘ−Ｐｒｏ−Ｚ（ここで、Ｙはアミノペプチダーゼにより特異的にＹ−Ｘ−Ｐｒｏ−Ｚからイン・ビトロ切断され、内因性細菌性アミノペプチダーゼのイン・ビボ処理に対する耐性を与える天然アミノ酸、Ｘはプロリン以外の一個のＮ−末端アミノ酸およびＺは成熟生産物の残りのアミノ酸配列であるが、ただし、Ｘ−Ｐｒｏ− Ｚが成熟ウシ成長ホルモンである場合、ＹはＬｅｕではない）で示される配列を有し、細菌宿主細胞内での前駆体の発現を含む方法をまた含む。更に別の態様において、本発明は、配列Ｘ−Ｐｒｏ−Ｚ（ここで、Ｘはプロリン以外の一個のＮ−末端アミノ酸およびＺは成熟生産物の残りのアミノ酸）である成熟哺乳類タンパク質またはポリペプチド生産物の製造法であり、Ｍｅｔ−Ｙ −Ｘ−Ｐｒｏ−Ｚ（ここで、ＸおよびＺは上記で定義の意味およびＹはアミノペプチダーゼにより特異的にＹ−Ｘ−Ｐｒｏ−Ｚからイン・ビトロ切断され、内因性細菌性アミノペプチダーゼによる処理に対する耐性を与える天然アミノ酸であるが、Ｘ−Ｐｒｏ−Ｚが成熟ウシ成長ホルモンである場合、ＹはＬｅｕではない）で示される前駆体を、アミノペプチダーゼで処理し、成熟生産物を産生することを含む方法を含む。典型的に、後者の態様におけるＭｅｔ−Ｙ−Ｘ−Ｐｒｏ−Ｚ前駆体は、細菌宿主細胞中の発現により製造される。好ましくは、Ｍｅｔ−Ｙ−Ｘ−Ｐｒｏ−Ｚ前駆体は成熟生産物を得るためのアミノペプチダーゼによるイン・ビトロ処理の前にまた単離する。更にまだ別の態様において、本発明は、配列Ｍｅｔ−Ｙ−Ｘ−Ｐｒｏ−ＺまたはＹ−Ｘ−Ｐｒｏ−Ｚ（ここで、Ｘ−Ｐｒｏ−Ｚは成熟生産物の配列および、ここで、Ｘはプロリン以外の一個のアミノ酸、Ｚは成熟生産物の残りのアミノ酸、Ｙはアミノペプチダーゼにより特異的にＹ−Ｘ−Ｐｒｏ−Ｚからイン・ビトロ切断され、内因性細菌性アミノペプチダーゼによる処理に対する耐性を与える天然アミノ酸であるが、ただしＸ−Ｐｒｏ−Ｚが成熟ウシ成長ホルモンの場合、ＹはＬｅｕではない）を有する成熟哺乳類タンパク質またはポリペプチド生産物のＮ −末端伸長前駆体を含む。我々は、ＩＬ−６の場合、Ｍｅｔ−Ｙ−ＩＬ−６およびＹ−ＩＬ−６前駆体の幾つかがＩＬ−６様活性を有することを発見した。ある場合、例えば、Ｍｅｔ− Ｐｈｅ−ＩＬ−６の場合、本生理活性はＡｌａ−Ｐｒｏ−Ｚ成熟タンパク質と同じである。他のＭｅｔ−Ｙ−Ｘ−Ｐｒｏ−ＺおよびＹ−Ｘ−Ｐｒｏ−Ｚ前駆体が、その成熟Ｘ−Ｐｒｏ−Ｚタンパク質相対物に対応する生理活性を有することが期待される。このような生理活性前駆体は、ある場合、成熟Ｘ−Ｐｒｏ−Ｚタンパク質相対物と同様の適用症において、薬理活性成分として使用し得る。本発明の実施態様を、実施例のみの方法で記載する。実施例１：ＬＩＦの製造ａ）クローンの製造ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を、Ｍｅｔ−Ｙ−ＬＩＦを製造するために行う；ここで、ＹはＰｈｅ、ＨｉｓまたはＩｌｅ。ＬＩＦコード配列は鋳型として使用する。ヒトＬＩＦの遺伝子は、ゴー、Ｈ．ら；１９８８；Proc.Natl.Acad.S ci.US、８５；２６２３−２６２７に報告されている。５’プライマーは、ＬＩＦの最初の１５アミノ酸および付加アミノ酸Ｙを明示するオリゴヌクレオチドである。５’オリゴヌクレオチドはまたＨｐａＩ制限部位をその５’末端に含む。ＬＩＦ遺伝子の独自の３’末端の配列を明示し、またその３’末端にＨｐａＩ制限部位を有する３’オリゴヌクレオチドは、ＰＣＲパートナーとして選択される。ポリメラーゼ連鎖反応を、次いで、ＤＮＡ配列を有するベクターを提供するために行う。ＰＣＲ技術は既知であり、マークス、Ｊ．Ｌ．；１９８８；Science ；２４０、１４０８−１４１０およびサイキ、Ｒ．Ｋ．ら；１９８８；Science ；２３９、４８７−４９１に記載されている。Ｍｅｔ−Ｙ−ＬＩＦコード化領域を含むＰＣＲ産物を、ＨｐａＩ−ＨｐａＩフラグメントとして除去し、ファルマシアから得られる発現プラスミドｐＰ_LのＨｐａＩ制限部位にクローン化する。正しい大きさのフラグメントがプラスミドにクローン化されることを確実にするために、注意を払い、正確な定位でフラグメントを有するプラスミドを選択し、更に使用する。本プラスミドにおいて、λＰ_Lプロモーターを、ファージλのｃＩリプレッサーにより制御する。プロモーターは、温度感受性ｃＩ８５７リプレッサーを含むＮ４８３０−１のような細菌宿主株を使用して、温度制御し得る。低温（２９− ３１℃）で、ｃＩ８５７リプレッサーは、抑制段階にプロモーターを維持する；一方、例えば４２℃まで温度を上げると、リプレッサー活性が破壊され、Ｐ_Lプロモーターからの広範な転写を可能にする。ｃＩ＋リプレッサーを有する細菌宿主のλＰ_Lプロモーターは、ナリジクス酸の成育培地への添加により誘発され得る（モットら、ＰＮＡＳ８２、８８、（１９８５））。Ｍｅｔ−Ｙ−ＬＩＦ発現プラスミドは、Ｎ４８３０−１のような好適な大腸菌宿主株に形質転換し、形質転換体はアンピシリン上で選択および維持する（ｐＰ_L プラスミドはアンピシリン耐性マーカー遺伝子を有する）。形質転換体を栄養培地上で成育させ、Ｍｅｔ−Ｙ−ＬＩＦ生産物を回収する。Ｍｅｔ−Ｙ−ＬＩＦ生産物を発現プラスミドを含む大腸菌から単離し、エドマン分析により特徴付する。本質的に均質で、Ｎ−末端Ｍｅｔを期待通り有する。プラスミドＭｅｔ−Ｉｌｅ−ＬＩＦを発現する大腸菌を、更なる処理のために選択する。本株から得られた一個のコロニーを発酵のために選択する。比較のために、Ｍｅｔ−ＬＩＦをコードするプラスミドをまた大腸菌宿主中へ導入する。エドマン分析による、プラスミドＭｅｔ−ＬＩＦを含む大腸菌から続いて精製した発現生産物の特徴付は、７９％のＭｅｔ−ＬＩＦ、１２％の正確に処理されたＬＩＦおよび９％のＮ−末端Ｐｒｏ（通常ＬＩＦの２番目のアミノ酸残基）のＬＩＦから成る異種混合物であることを示す。ｂ）Ｍｅｔ−Ｉｌｅ−ＬＩＦの発現選択クローンの前培養を製造し、発酵の接種物として使用する。発酵槽を滅菌塩および微量金属溶液で満たし、溶液の温度を３０℃に、ｐＨを７に維持する。溶液を通気し、３００rpmで撹拌する。次いで、発酵を発酵槽に接種物を加えることにより開始する。２ｇ／ｌ酵母抽出物（ＢＢＬ）および７ｇ／ｌカサミノ酸を含む栄養溶液を、次いで必要に応じて加える。５５０ｇ／ｌグルコース・１Ｈ₂Ｏを含むグルコース溶液およびアンモニア溶液（濃２５％ＮＨ₄ＯＨ）を溶液のｐＨを７に戻すための間隔で加える。増殖相を光学密度（ＯＤ₅₅₀）が７から１５の間に到達するまで続ける。大腸菌からのＭｅｔ−Ｉｌｅ−ＬＩＦ発現を、次いで、温度を３０℃から４２ ℃に変えることにより誘発する。更に栄養培地を必要に応じて加える。グルコースおよびアンモニア溶液の供給は続ける。誘導３時間後、発酵を、培養ブロスを移動容器に回収することにより終結させ、それを遠心分離機に移す。遠心を、管状遠心分離機（パッドベルグ（Padberg）Ｚ４１）を使用して、１８０００ｇで、平均滞在時間１５０秒で行う。ｃ）Ｍｅｔ−Ｉｌｅ−ＬＩＦの単離遠心で得た湿大腸菌ペレットを、氷冷緩衝液Ａ（５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８.０；２mM ＤＴＴ（ジチオスレイトール）、５mMベンズアミジン−ＨＣｌおよび１mM ＥＤＴＡ含有）に加え、溶液を氷上で激しく撹拌し、細胞を懸濁液にする。次いで、懸濁細胞をマントン−ガウリンホモジナイザーを通過（１２００バールで２回通過）させることにより溶解し、その後、溶解物を緩衝液Ａで２倍に希釈し、遠心を助ける。希釈細胞溶解物を３０分、１６０００ｇで遠心する。ペレットを緩衝液Ａに再懸濁し、もう一度マントン−ガウリンホモジナイザーを通し、次いで先のように遠心する。本洗浄工程をもう１回繰り返すが、遠心は減少する（２５分、１３０００ｇ）。得られるペレットを、次いで水に懸濁し、前記のように遠心し、秤量し、−２０℃で凍結する。ＬＩＦ封入体を含む凍結ペレットを可溶化緩衝液（緩衝液Ｂ：０．１Ｍグリシン−ＨＣｌｐＨ３.０；８.５Ｍ尿素含有）に、５０ml／ｇで再懸濁する。３０分、室温で撹拌後、ＤＴＴ（ジチオスレイトール）を１００mMまで加え、混合物を一晩減圧下で撹拌する。減少した、可溶化封入体を、次いで遠心（２５分；１３０００ｇ）し、上清を傾捨し、濾過する。濾過上清を、緩衝液Ｂで予じめ平衡化した流速５０ml／分のファルマシアＳ−セファロース・ファスト・フローのＸＫ５０／２０カラムに充填する。クロマトグラフィーを室温で行う。充填の後、カラムを緩衝液Ｃ（５０ mMクエン酸／ＮａＯＨｐＨ５.０；８.５Ｍ尿素および１００mM ＮａＣｌ含有）で洗浄する。洗浄の間、鮮明な黄色バンドがカラムの上部に形成され、徐々に下方に移動する。一度バンドが溶出したら、緩衝液Ｃ洗浄を、８００mlにわたって形成される１００から１０００mM ＮａＣｌ勾配に変える。一個のタンパク質ピークが溶出し、手動で回収し、用量を測定する。溶出ピークを、すぐに２Ｍ尿素まで、３用量の１００mM脱気酢酸を加えることにより希釈し、減圧下（６０mmHg）に、正確なＨＰＬＣタンパク質測定を行うことができるまで放置する。この２Ｍ尿素までの“急速希釈”工程測定を行い、再折り畳みを開始させる。一度タンパク質決定を行ったら、Ｍｅｔ−Ｉｌｅ−ＬＩＦを、更に５０mM酢酸（２Ｍ尿素含有）で、タンパク質濃度が５０μg／mlに到達するまで希釈する。固体Ｔｒｉｓを添加し、Ｍｅｔ−Ｉｌｅ−ＬＩＦ溶液を５０mMまで希釈し、続いて酸化グルタチオン（ＧＳＳＧ）を、１．５モル過剰まで添加する。溶液を、５ＮＮａＯＨを加えてｐＨを８.０に調節し、室温で撹拌する。３〜５時間後、ｐＨを８.０に再調節し、２０時間後、氷酢酸を加えて、ｐＨを５.０にする。酸化、酸性化Ｍｅｔ−Ｉｌｅ−ＬＩＦ溶液を、サートブラン（Sartobran）０. ４５／０.２２μm二重膜フィルターを使用して濾過する。濾液を、次いで、Ｓ− セファロースＦＸＫ５０／１５イオン−交換クロマトグラフィー（緩衝液Ｄ；５０mM Ｎａ酢酸ｐＨ５.０５０ml／分で平衡化および溶出）により濃縮する。充填の後、カラムを緩衝液Ｄで、Ｕ.Ｖ.追跡がバックグランドに戻るまで洗浄する。次いで、塩勾配を適用し（緩衝液Ｄ中で、８００mlにわたって０から１ＭＮａＣｌ）、Ｍｅｔ−Ｉｌｅ−ＬＩＦを溶出する。得られるＭｅｔ−Ｉｌｅ−ＬＩＦプール（４００から６００ml）を、１mg／ml まで濃縮し、０.２μmフィルターを通して濾過する。濾液を、次いで、ＰＢＳｐＨ７.２で平衡化したファルマシア・ハイ−ロード・スーパーデックスＸＫ２６／６０（Pharmacia Hi-Load Superdex XK26/60）ゲル濾過カラムに、１５ml注入物として充填する。一量体Ｍｅｔ−Ｉｌｅ−ＬＩＦ（１６０から２２５mlで溶出）を、次いでプールする。Ｍｅｔ−Ｉｌｅ−ＬＩＦ一量体を、ＡＰ−１による優れた消化を容易にするために、０.５から１.０mg／mlに濃縮する。濃縮、一量体Ｍｅｔ−Ｉｌｅ−ＬＩＦは、実質的に均質である。ｄ）アミノペプチダーゼ処理濃縮、一量体Ｍｅｔ−Ｉｌｅ−ＬＩＦの処理を、一晩、室温で、酵素：基質比１：６００およびＭｅｔ−Ｉｌｅ−ＬＩＦ濃度０.５mg／mlを使用して行う。酵素は、予じめ０.５mg／ml保存溶液から、２６μg／mlの希釈および７０℃、３時間の前インキュベーションによる不純活性物の熱不活化により、調製する。処理の後、反応を氷酢酸を添加して、ｐＨ５.０にすることにより停止し、溶液を濾過し、その後、５０mM Ｔｒｉｓ／ＨＣｌｐＨ８.０で前平衡化したファルマシア・ＤＥＡＥ・ファスト・フロー（Pharmacia DEAE Fast Flow）ＸＫ２６／３カラムにかける。ＬＩＦ（これらの条件下では非結合）を回収し、滅菌濾過する。１時間の処理の後、タンパク質の９１.４％が、Ｎ−末端にＳｅｒを有するＬＩＦに消化されている。２４時間処理の後、１００％のＮ−末端にＳｅｒを有するＬＩＦが得られる。実施例２：ＩＬ−６の製造ａ）クローンの製造ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を、Ｍｅｔ−Ｙ−ＩＬ−６をコードするＤＮＡ配列を製造するために行う；ここで、Ｙは慣用方法において、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、ＩｌｅまたはＬｅｕ。ポリメラーゼ連鎖反応を、次いで、ＤＮＡ配列を有するベクターを提供するために行う。Ｍｅｔ−Ｙ−ＩＬ−６コード領域を含む１２個のＰＣＲ産物を、次いで、各々実施例１に記載の発現プラスミドにクローン化する。次いで、プラスミドを各々大腸菌宿主に、実施例１の記載と同様の方法で挿入する。プラスミドは、前記のように、アンピシリン選択により維持する。ｂ）Ｍｅｔ−Ｙ−ＩＬ−６の発現大腸菌を、慣用方法で発酵させ、Ｍｅｔ−Ｙ−ＩＬ−６生産物の発現を誘導する。発酵は、培養ブロスを移動容器に回収することにより終結させ、それを遠心分離機に移す。遠心を、次いで、行う。ｃ）Ｍｅｔ−Ｙ−ＩＬ−６の単離遠心で得た湿大腸菌ペレットを、次いで緩衝液に再懸濁する。次いで、懸濁細胞を、ガラスボール−ミルまたは高圧ホモジナイザーを通して溶解する。希釈細胞溶解物を遠心し、得られる上清（粘性物質を含む）を傾捨し、ペレットを回収する。Ｍｅｔ−Ｙ−ＩＬ−６封入体を含むペレットを７Ｍグアニジン塩酸塩／５mMＤＴＴ／Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ８に懸濁し、タンパク質を可溶化する。還元した可溶化タンパク質を、次いで、溶液を１Ｍグアニジン塩酸塩で、好適な量の酸化グルタチオンおよびＴｒｉｓ緩衝液ｐＨ８．０の存在下希釈することにより酸化的に再折り畳みする。５時間後、溶液を更に希釈し、ｐＨを５に調節し、濾過する。タンパク質を、次いで、Ｓ−セファロースＦＦクロマトグラフィーにより単離する。次いで、各々のＭｅｔ−Ｙ−ＩＬ−６のＮ−末端の組成をエドマン分析により決定する。ｄ）アミノペプチダーゼ処理Ｍｅｔ−Ｙ−ＩＬ−６タンパク質の処理を、３時間、３７℃およびｐＨ７で、酵素：基質比１：１０００を使用して行う。処理の後、反応を溶液をＱ−セファロースカラムを通して濾過することにより停止する。次いで、各々のＩＬ−６タンパク質のＮ−末端の組成をエドマン分析により決定する。与えられた細胞密度での各々のＭｅｔ−Ｙ−ＩＬ−６タンパク質のタンパク質の収率および生産物の検出Ｎ−末端配列の比を表１に示す。１．５％Ｐｒｏ²−Ｖａｌ³−Ｐｒｏ⁴−Ｚがまた得られた。２．４％Ｖａｌ³−Ｐｒｏ⁴−Ｚがまた得られ、これはＰｒｏ²−Ｖａｌ³−Ｐｒｏ⁴ −ＺのＡＰ−１切断により説明される。比較として、Ｍｅｔ−ＩＬ−６をコードするＤＮＡを含む対応するプラスミドで工程を繰り返し、以下の結果を得る：タンパク質収率：２０．０mg Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｚ：３３％Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｚ：１６％（３.２mg）Ｐｒｏ−Ｚ：５１％従って、ＩＬ−６において、実質的に均質なタンパク質が、ＹがＨｉｓ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、ＩｌｅおよびＬｅｕの場合に得られ、これらの収率は、ＹがＨｉｓ、ＭｅｔおよびＰｈｅのとき最も高い。

【手続補正書】特許法第１８４条の７第１項【提出日】１９９４年４月１５日【補正内容】請求の範囲１．細菌宿主における、内因性細菌性アミノペプチダーゼの処理の対象となる哺乳類タンパク質またはポリペプチドの成熟形の組み換え製造する方法であって、タンパク質またはポリペプチドは式Ｘ−Ｐｒｏ−Ｚ（式中、Ｘはプロリン以外の一個のＮ−末端アミノ酸およびＺはタンパク質またはポリペプチドのアミノ酸残基の残りの配列である）である；本方法は：ａ）Ｍｅｔ−Ｙ−Ｘ−Ｐｒｏ−Ｚ（ここで、ＸおよびＺは上記で定義の意味およびＹはアミノペプチダーゼで特異的にＹ−Ｘ−Ｐｒｏ−Ｚからイン・ビトロで切断され、内因性細菌アミノペプチダーゼによるイン・ビボ処理処理の耐性を提供する天然アミノ酸）をコードするＤＮＡを含む好適なベクターで細菌宿主細胞を形質転換する；ｂ）細胞の生産物Ｍｅｔ−Ｙ−Ｘ−Ｐｒｏ−Ｚを発現を誘発する；ｃ）Ｍｅｔ−Ｙ−Ｘ−Ｐｒｏ−Ｚ生産物を好適なアミノペプチダーゼで処理し、ＭｅｔおよびＹを切断する；およびｄ）タンパク質またはポリペプチドＸ−Ｐｒｏ−Ｚを単離する；ただし、Ｘ−Ｐｒｏ−Ｚが成熟動物成長ホルモンの場合、ＹはＬｅｕまたはＬｙｓではない：の工程を含む。２．配列Ｘ−Ｐｒｏ−Ｚの成熟哺乳類タンパク質またはポリペプチド生産物の前駆体の製造法であり、前駆体がＭｅｔ−Ｙ−Ｘ−Ｐｒｏ−Ｚ（ここで、Ｙはアミノペプチダーゼにより特異的にＹ−Ｘ−Ｐｒｏ−Ｚからイン・ビトロ切断され、内因性細菌性アミノペプチダーゼのイン・ビボ処理に対する耐性を与える天然アミノ酸、Ｘはプロリン以外の一個のＮ−末端アミノ酸およびＺは成熟生産物の残りのアミノ酸配列であるが、ただし、Ｘ−Ｐｒｏ−Ｚが成熟動物成長ホルモンである場合、ＹはＬｅｕまたはＬｙｓではない）で示される配列を有し、細菌宿主細胞内での前駆体の発現を含む方法。３．配列Ｘ−Ｐｒｏ−Ｚ（ここで、Ｘはプロリン以外の一個のＮ−末端アミノ酸およびＺは成熟生産物の残りのアミノ酸）である成熟哺乳類タンパク質またはポリペプチド生産物の製造法であり、Ｍｅｔ−Ｙ−Ｘ−Ｐｒｏ−Ｚ（ここで、ＸおよびＺは上記で定義の意味およびＹはアミノペプチダーゼにより特異的にＹ− Ｘ−Ｐｒｏ−Ｚからイン・ビトロ切断され、内因性細菌性アミノペプチダーゼによる処理に対する耐性を与える天然アミノ酸であるが、Ｘ−Ｐｒｏ−Ｚが成熟動物成長ホルモンである場合、ＹはＬｅｕまたはＬｙｓではない）で示される前駆体を、アミノペプチダーゼで処理し、成熟生産物を産生することを含む方法。４．ＹがＳｅｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、ＩｌｅおよびＬｅｕから選択される、請求項１、２または３記載の方法。５．タンパク質Ｘ−Ｐｒｏ−ＺがＩＬ−６であり、ＹがＰｈｅ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、ＩｌｅまたはＬｅｕである、請求項１から４のいずれかに記載の方法。６．ＹがＰｈｅ、ＨｉｓまたはＭｅｔである、請求項５記載の方法。７．タンパク質Ｘ−Ｐｒｏ−ＺがＬＩＦであり、ＹがＨｉｓ、ＰｈｅまたはＩｌｅである、請求項１、２または３記載の方法。８．ＹがＩｌｅである、請求項７記載の方法。９．細菌宿主が大腸菌である、請求項１から８のいずれかに記載の方法。１０．ＭｅｔとＹを切断するのに使用するアミノペプチダーゼがバシラス・ステアロサーモフィラス、ストレプトマイセス・クリセウスまたはエアロモナスから得られたものから選択される、請求項１から９のいずれかに記載の方法。１１．アミノペプチダーゼがＡＰ−１である、請求項１０記載の方法。１２．配列Ｍｅｔ−Ｙ−Ｘ−Ｐｒｏ−ＺまたはＹ−Ｘ−Ｐｒｏ−Ｚ（ここで、Ｘ−Ｐｒｏ−Ｚは成熟生産物の配列および、ここで、Ｘはプロリン以外の一個のアミノ酸、Ｚは成熟生産物の残りのアミノ酸、Ｙはアミノペプチダーゼにより特異的にＹ−Ｘ−Ｐｒｏ−Ｚからイン・ビトロ切断可能で、内因性細菌性アミノペプチダーゼによる処理に対する耐性を与える天然アミノ酸であるが、ただしＸ− Ｐｒｏ−Ｚが成熟動物成長ホルモンの場合、ＹはＬｅｕまたはＬｙｓではない）で示される成熟哺乳類タンパク質またはポリペプチド生産物のＮ−末端伸長前駆体。１３．ＹがＳｅｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、ＩｌｅおよびＬｅｕから選択される、請求項１２記載の前駆体。１４．Ｘ−Ｐｒｏ−ＺがＩＬ−６であり、ＹがＰｈｅ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、ＩｌｅまたはＬｅｕである、請求項１２または１３記載の前駆体。１５．Ｘ−Ｐｒｏ−ＺがＬＩＦであり、ＹがＨｉｓ、ＰｈｅまたはＩｌｅである、請求項１２または１３記載の前駆体。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｐ 21/06 9282−4Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims

【特許請求の範囲】１．細菌宿主における、内因性細菌性アミノペプチダーゼの処理の対象となる哺乳類タンパク質またはポリペプチドの成熟形の組み換え製造する方法であって、タンパク質またはポリペプチドは式Ｘ−Ｐｒｏ−Ｚ（式中、Ｘはプロリン以外の一個のＮ−末端アミノ酸およびＺはタンパク質またはポリペプチドのアミノ酸残基の残りの配列である）である；本方法は：ａ）Ｍｅｔ−Ｙ−Ｘ−Ｐｒｏ−Ｚ（ここで、ＸおよびＺは上記で定義の意味およびＹはアミノペプチダーゼで特異的にＹ−Ｘ−Ｐｒｏ−Ｚからイン・ビトロで切断され、内因性細菌アミノペプチダーゼによるイン・ビボ処理処理の耐性を提供する天然アミノ酸）をコードするＤＮＡを含む好適なベクターで細菌宿主細胞を形質転換する；ｂ）細胞の生産物Ｍｅｔ−Ｙ−Ｘ−Ｐｒｏ−Ｚを発現を誘発する；ｃ）Ｍｅｔ−Ｙ−Ｘ−Ｐｒｏ−Ｚ生産物を好適なアミノペプチダーゼで処理し、ＭｅｔおよびＹを切断する；およびｄ）タンパク質またはポリペプチドＸ−Ｐｒｏ−Ｚを単離する；ただし、Ｘ−Ｐｒｏ−Ｚが成熟ウシ成長ホルモンの場合、ＹはＬｅｕではない：の工程を含む。２．配列Ｘ−Ｐｒｏ−Ｚの成熟哺乳類タンパク質またはポリペプチド生産物の前駆体の製造法であり、前駆体がＭｅｔ−Ｙ−Ｘ−Ｐｒｏ−Ｚ（ここで、Ｙはアミノペプチダーゼにより特異的にＹ−Ｘ−Ｐｒｏ−Ｚからイン・ビトロ切断され、内因性細菌性アミノペプチダーゼのイン・ビボ処理に対する耐性を与える天然アミノ酸、Ｘはプロリン以外の一個のＮ−末端アミノ酸およびＺは成熟生産物の残りのアミノ酸配列であるが、ただし、Ｘ−Ｐｒｏ−Ｚが成熟ウシ成長ホルモンである場合、ＹはＬｅｕではない）で示される配列を有し、細菌宿主細胞内での前駆体の発現を含む方法。３．配列Ｘ−Ｐｒｏ−Ｚ（ここで、Ｘはプロリン以外の一個のＮ−末端アミノ酸およびＺは成熟生産物の残りのアミノ酸）である成熟哺乳類タンパク質またはポリペプチド生産物の製造法であり、Ｍｅｔ−Ｙ−Ｘ−Ｐｒｏ−Ｚ（ここで、ＸおよびＺは上記で定義の意味およびＹはアミノペプチダーゼにより特異的にＹ− Ｘ−Ｐｒｏ−Ｚからイン・ビトロ切断され、内因性細菌性アミノペプチダーゼによる処理に対する耐性を与える天然アミノ酸であるが、Ｘ−Ｐｒｏ−Ｚが成熟ウシ成長ホルモンである場合、ＹはＬｅｕではない）で示される前駆体を、アミノペプチダーゼで処理し、成熟生産物を産生することを含む方法。４．ＹがＳｅｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、ＩｌｅおよびＬｅｕから選択される、請求項１、２または３記載の方法。５．タンパク質Ｘ−Ｐｒｏ−ＺがＩＬ−６であり、ＹがＰｈｅ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、ＩｌｅまたはＬｅｕである、請求項１から４のいずれかに記載の方法。６．ＹがＰｈｅ、ＨｉｓまたはＭｅｔである、請求項５記載の方法。７．タンパク質Ｘ−Ｐｒｏ−ＺがＬＩＦであり、ＹがＨｉｓ、ＰｈｅまたはＩｌｅである、請求項１、２または３記載の方法。８．ＹがＩｌｅである、請求項７記載の方法。９．細菌宿主が大腸菌である、請求項１から８のいずれかに記載の方法。１０．ＭｅｔとＹを切断するのに使用するアミノペプチダーゼがバシラス・ステアロサーモフィラス、ストレプトマイセス・クリセウスまたはエアロモナスから得られたものから選択される、請求項１から９のいずれかに記載の方法。１１．アミノペプチダーゼがＡＰ−１である、請求項１０記載の方法。１２．配列Ｍｅｔ−Ｙ−Ｘ−Ｐｒｏ−ＺまたはＹ−Ｘ−Ｐｒｏ−Ｚ（ここで、Ｘ−Ｐｒｏ−Ｚは成熟生産物の配列および、ここで、Ｘはプロリン以外の一個のアミノ酸、Ｚは成熟生産物の残りのアミノ酸、Ｙはアミノペプチダーゼにより特異的にＹ−Ｘ−Ｐｒｏ−Ｚからイン・ビトロ切断可能で、内因性細菌性アミノペプチダーゼによる処理に対する耐性を与える天然アミノ酸であるが、ただしＸ− Ｐｒｏ−Ｚが成熟ウシ成長ホルモンの場合、ＹはＬｅｕではない）で示される成熟哺乳類タンパク質またはポリペプチド生産物のＮ−末端伸長前駆体。１３．ＹがＳｅｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、ＩｌｅおよびＬｅｕから選択される、請求項１２記載の前駆体。１４．Ｘ−Ｐｒｏ−ＺがＩＬ−６であり、ＹがＰｈｅ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、ＩｌｅまたはＬｅｕである、請求項１２または１３記載の前駆体。１５．Ｘ−Ｐｒｏ−ＺがＬＩＦであり、ＹがＨｉｓ、ＰｈｅまたはＩｌｅである、請求項１２または１３記載の前駆体。