JPH08507202A - リボザイム増幅診断用薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 核酸、タンパク質、またその他の分子の存在を検出する診断道具としてリボザイムの使用のためのシステムが記載され、このシステムでは、活性リボザイムの形成およびアッセイ可能なマーカーの開裂が、特定の標的分子の存在または非存在に依存する。必須の成分は、リボザイム特異的であるが、好ましくは支持体構造上に固定化された標識された共標的と組み合わせて選択された標的を可逆的に結合する。標的および共標的が結合するとき、リボザイムが共標的から標識を開裂し、それは次いで定量可能である。このリボザイムは標的および共標的により可逆的に結合されるので、別の共標的と再結合し得、より多くの標識を開裂し、それによって、反応シグナルを増幅する。１つの実施態様では、標的は、リボザイムの部分を形成する相補的配列にハイブリダイズする核酸であり；第２の実施態様では、標的は、リボザイム分子の部分との相互作用により結合されるタンパク質またはその他の高分子である。別の実施態様では、熱安定性のリボザイムが使用され、不適切に結合したリボザイムは、脱安定化されそして高温で不活性化される。制御可能なリボザイムを単離する方法がまた記載される。制御可能なリボザイムは、特定の高分子の存在を検出する方法において有用であり、または標的RNA分子の開裂の不活性化または活性化のためのインビトロまたはインビボの方法で使用され得る。

Description

【発明の詳細な説明】 リボザイム増幅診断用薬 発明の背景 本発明は、リボザイムを含む結果として、増幅されるまたは分差応答を有する 診断用薬を設計するためのシステムである。 感染因子、または、代謝産物、核酸、およびタンパク質を含む病気の指標とな る分子の検出は、医学的疾患の診断および治療、ならびに研究における基本的な 要素である。多くの方法論が現在検出に使用されている。これらの方法論は、一 般に、病気を引き起こす因子または病気の副産物のいずれかの成分であるタンパ ク質に対する抗体をベースにした診断アッセイ、および病気を引き起こす因子の 成分をコードする遺伝物質のような、核酸に対する診断アッセイに分けられる。 タンパク質に対するアッセイは、さらに、分子（通常抗体）と、検出されるタ ンパク質との結合反応、または、酵素の活性化をもたらし、検出可能な色の変化 を生じる基質を開裂し得る、酵素と酵素に結合する標的された分子間の反応を含 む方法に分けられる。多くの結合アッセイは、染料、酵素または放射性または蛍 光標識を含み、検出を増強する。タンパク質に対する抗体は、患者、免疫化動物 、または抗原特異的モ ノクローナル細胞株から得られ得る。これらの抗体アッセイは、サンドイッチEL ISAアッセイ、ウェスタンイムノブロット、放射性イムノアッセイ、および免疫 拡散アッセイのようなアッセイを包含する。その他のアッセイは、分子の固定化 および検出のためにアビジンおよびビオチンのような分子を用いる。これらの試 薬を調製する技術およびそれを使用する方法は、当業者に公知である。 核酸配列アッセイは、核酸分子の存在を検出するための放射性標識プローブを 用いるノザンブロットハイブリダイゼーションのような単純な方法から、ハイブ リダイゼーション技術による配列の検出に使用され得るところまで非常に少量の 特定の核酸配列を増幅するためのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）の使用までの範 囲にわたる。ヌクレオチドプローブは、市販の染料、または酵素、蛍光、化学発 光、あるいは放射性の標識を用いて標識され得る。これらのプローブは、ハイブ リダイゼーションにより細胞中または組織試料中の遺伝子または関連配列（そこ ではその遺伝子は通常の成分である）の発現を検出するために、および生物の感 染から生じる疾患を有すると疑われるヒトからの血清または組織試料をスクリー ニングするために、または催腫瘍性細胞中に見い出されるような新規または改変 遺伝子を検出するために使用され得る。核酸プライマーがまた、逆転写酵素、ま たはDNAポリメラーゼおよびポリメラーゼ連鎖反応を用いて調製され得、組織ま たは液体中に非常に少量で存在する核酸分子の検出のために使用され 得る。 酵素をベースにした方法論およびPCR（ポリメラーゼを使用する）のみが、信 号の増幅に連結した検出を用いて、固有に触媒的である。PCRは、非常に少量のD NAを検出し得るかいくつかの欠点を有する：信頼性について高度の技術的能力を 必要とし；偽陽性を生じる汚染に顕著に感受性であり；定性的より定量的に使用 することが困難である。その他の方法は、酵素が、通常、アッセイの付加的成分 への結合により、信号生成および増幅を増加する。これらの付加的リガンドの使 用は、より高いバックグラウンドおよび偽陽性を生じ、システムのノイズを増加 させ、そして対照反応のいくつかのレベルを必要とする。 リボザイムは、酵素様の活性を有するRNA分子として定義される。RNAで触媒さ れる開裂には３つの一般経路がある：（1）ウイロイド様RNAによる開裂；（2）R NAase PまたはRNAase PのRNA成分による開裂、Yale UniversityのSidney Altman の研究；および（3）テトラヒメナリボザイムによる開裂、Universityof Colora doのThomas Cechの研究。現在まで知られている天然に存在するリボザイムは、R NAase Pを除いて、シスに作用しそしてトランスに、即ち、他の分子に作用する ためには加工されなければならない。このことは、酵素活性を有するRNA分子の 部分を基質として供される部分から分離すること、および、開裂されるべき標的 分子に基質様性質、これは適切な２次および３次構造を含むが、を付与するによ り達成される。 特異性は、標的分子上の開裂されるべき部位の近傍でハイブリダイズする相補的 核酸配列を添加することにより付与され得る。 各クラスのリボザイムは、異なる作用メカニズムでヌクレオチドの異なる配列 を開裂する。その上、各クラスは、酵素的活性に必須なヌクレオチド塩基の数に 基づいてさらに区別され得、そしておよび意図される標的の範囲までリボザイム は特異性を変えるために操作され得る。 テトラヒメナリボザイムは、発見された最初のリボザイムであった。このリボ ザイムは、その開裂について、グアノシン依存性である。天然にシスで作用する のは大きなリボザイムである。より小さな内部部分は、トランスに、即ち、別の 分子に作用するために加工され得、特定の４種のヌクレオチド配列を標的する。 M1 RNAは、E.coli RNAase PのRNAリボザイムサブユニットであり、約400塩基 のRNA分子である。このRNA分子は細胞中の、全種類の別の他の分子を開裂し、tR NA前駆体から成熟tRNAを生成する。その他の分子は、M1 RNAの基質に転換され得 るが、それは外部ガイド配列の使用を通して行われる。この外部ガイド配列はそ の5'末端に、開裂されるべきRNA中の開裂部位の3'側のヌクレオチドに相補的な 少なくとも７つのヌクレオチド、およびその3'末端に、その相補的なヌクレオチ ドに直接結合するヌクレオチドNCCAを有する、単離オリゴリボヌクレオチドとし て特徴付けられる。ここで、Nは、任意のヌクレオ チドであり、そしてオリゴリボヌクレオチド中の相補的ヌクレオチドは、これは 開裂されるべきRNA中の相補的ヌクレオチドにハイブリダイズする。Forsterおよ びAltman、Science 249：783-786（1990）、「RNA酵素のための外部ガイド配列 」に記載されている。Altmanら、Proc．Natl．Acad．Sci．89（17）：8006-8010 （1992）、「ヒトRNase PによるメッセンジャーRNAの標的された開裂」は、最近 、前駆体TRNAに由来する構造に基づき、E.coli RNAase Pの真核性相当物に対す る外部ガイド配列の構築について記載した。RNAase P反応およびテトラヒメナ反 応の両者は、5'ホスフェートおよび3'ヒドロキシル末端を作製するように作用す る。 植物および動物中で見い出されたいくつかの種類のウイロイド様RNAリボザイ ムがある。ハンマーヘッド（hammerhead）リボザイムは、このカテゴリーの１つ のクラスであり、そしてデルタ肝炎リボザイムは、第２のクラスである。RNAase Pおよびテトラヒメナリボザイムとは異なり、設計されたトランス作用性植物ウ イロイド様リボザイムは、等しく短い基質を有するほんの18〜20ヌクレオチド塩 基長である。中心的な主題は、特徴的な保存配列であり、Uhlenbeckが1987年に 説明し、そしてNature 328：596-600（1987）で公開された。その中で、彼は、 すべてのハンマーヘッドは特定の特徴を共有することを提案した。ウイロイド様 リボザイムの開裂反応は、2'、3'環状ホスフェートおよび5'ヒドロキシル末端を 作製する。従って、M1 RNA反応またはテトラヒメナ反応と比較して、これ らウイロイド様RNA反応について基本的におよびメカニズム的に異なる化学が存 在する。しかし、最終結果は同一、即ち、別のRNA分子の開裂である。 いくつかのグループにより、リボザイムが、除かれるのではなく除くべき遺伝 子から転写されるウイルスRNAまたはMRNAのような、標的RNAを開裂することによ り病気または遺伝疾患を治療するために使用される能力を有することが提案され た。しかし、それらを診断に使用することは誰も提案しなかった。 従って、本発明の目的は、リボザイムを用いる診断応答の増幅または生成のた めの手段を提供することである。 本発明のさらなる目的は、核酸、タンパク質、およびその他の分子の検出にお いて、リボザイムを触媒として作用するように利用することである。検出は、リ ボザイムによる基質の開裂の結果である。 発明の要旨 核酸、タンパク質、またその他の分子の存在を検出する診断道具としてリボザ イムを使用するシステムが記載され、このシステムでは、活性リボザイムの形成 およびアッセイ可能なマーカーの開裂が、特定の標的分子の存在に依存する。必 須の成分は、リボザイムであり、このリボザイムは、好ましくは支持体構造上に 固定化された、標識された共標的と組み合わせて選択された標的と特異的である が可逆的に結合する。 標的および共標的が結合する場合、リボザイムが共標的から標識を開裂し、それ は次いで定量される。このリボザイムは標的および共標的により可逆的に結合さ れるので、別の共標的と再結合し得、より多くの標識を開裂し、それによって、 反応シグナルを増幅する。１つの実施態様では、標的は、リボザイムの部分を形 成する相補的配列にハイブリダイズする核酸であり；第２の実施態様では、標的 は、リボザイム分子の部分との相互作用により結合されるタンパク質またはその 他の高分子である。別の実施態様では、熱安定性のリボザイムが使用され、不適 切に結合したリボザイムは、脱安定化されそして高温で不活性化される。 制御可能なリボザイムを単離する方法がまた記載される。制御可能なリボザイ ムは、特定の高分子の存在を検出する方法において有用であり、または標的RNA 分子の開裂の不活性化または活性化のための方法としてインビトロまたはインビ ボで使用され得る。 図の簡単な説明 図１Ａ、１Ｂ、および１Ｃは、リボザイム増幅診断用組成物の略図である。こ れは標識したNUX開裂部位を持つ標識したRNA分子であって、固体支持体にしっか りと固定され、「共標的」RNAというRNA分子と塩基対を形成するために設計され た１本のアーム、および「標的」RNAとして検出されるRNA上の予め定められた配 列と塩基対を形成するために設計されたも う１本のアームを持つリボザイムである。 図２Ａおよび２Ｂは、非核酸分子検出のためのリボザイム増幅診断用組成物で ある。これは、リガンド結合部位が、検出されるべきリガンド、および活性リボ ザイムによって開裂され検出可能な標識された配列を遊離する共標的分子と結合 した時に、酵素的に活性なコンホメーションを形成するリボザイムである。図２ Ａは、リボザイムがリガンドに結合して活性なコンホメーションをとっている場 合；図２Ｂは、リボザイムがリガンドに結合せず、不活性なコンホメーションを とっている場合である。 図３Ａおよび３Ｂは、熱安定性リボザイム増幅診断システムの略図である。こ こで、標的および共標的と適切に適合し、コンホメーション的にも活性であるこ のリボザイムを、図３Ａに示し、不安定化し、コンホメーション的にも不活性な リボザイムを図３Ｂに示す。 図４Ａおよび４Ｂは、RNAase Pを適切なEGSと接触させて細菌のRNAse P（図４ Ａ）またはヒトのRNAase P（図４Ｂ）のどちらかに誘導することを用いる標的の 開裂の略図である。 図５Ａおよび５Ｂは、共標的および標的に結合した活性リボザイム（図５Ａ） および共標的のみに結合した不活性リボザイム（図５Ｂ）の略図である。 図６は、15％ポリアクリルアミド／７Ｍ尿素ゲルを１×TBE中で800ボルトで電 気泳動したものである。反応は、50mMトリス、30mM Mg++で行い、37℃で２時間 インキュベートした。 各組成物：酵素（E）、共標的（CT）、および疾患標的（DT）を、およそ同等の 比活性で添加した。レーン１では、反応物の３つ全てが存在したがMg++は存在し なかった；レーン２では反応物の３つ全てがMg++とともに存在した；そしてレー ン３では、酵素および共標的のみが存在した。開裂産物（CP）は、レーン２で見 ることができ、そしてレーン３でそれよりは少なく見える。 図７Ａおよび７Ｂは、リボザイム／共標的システムの略図である。このシステ ムは、疾患標的が存在するときの方がそれが存在しないときよりはるかに活性で ある。図７Ｃは、４％ポリアクリルアミド／７Ｍ尿素ゲルを１×TBE中で800ボル トで電気泳動したものである。反応物は、図７Ａおよび７Ｂにおけるそれらに対 応する。反応は、50mMトリス中て30mM Mg++を伴うかまたは伴わないかのどちら かで37℃で３時間行った。反応物は以下の量存在した：リボザイム ７pmole； 共標的（CT）11.4pmole;疾患標的（DT）0.37pmole。 発明の詳細な説明 リボザイムをもとにした診断方法は、既存の診断方法に比べていくつかの利点 を有する。本方法は、高度に特異的なリガンドの相互作用を固有の触媒性の性質 と組み合わせており、従って単純で感度が良く、そして定量性がある。この特異 性は、リボザイムのアームと標的RNA間の特異的な相補性だけでなく、開裂認識 部位の存在と正しい空間的な配向、例えばト リプレット（NUX）、に依存する。さらに、リボザイムは主として他のRNA分子と 相互作用しているように見えるが、最近の研究は、インビトロでRNAおよびDNAが 選択されて結合するかまたは薬剤および代謝物を含む他の分子、または核酸およ びタンパク質を含むマクロ分子の反応を触媒することを示している。Joyce，Gen e 82:83，1989；Robertson and Joyce，Nature344:467，1990；Ellington and S zostak，Nature 346:818，1990；Piccirilliら、Science 256:1420，1992；Noll erら、Science，256:1416，1992；Ellington and Szostak，Nature 355:850，19 92；Bockら、Nature 355:564 1992を参照されたい。これらの教示を特にここで 援用する。 リボザイム診断システムは、単一分子、シス−作用性リボザイムを２分子また は３分子のトランス作用性システムに分割する能力を利用する：２分子システム では、活性リボザイムはリボザイム分子と疾患標的分子との複合体により形成さ れ、このリボザイム分子には開裂部位があり；あるいは３分子システムでは、活 性リボザイムは、リボザイム分子、開裂部位を有する共標的分子、および疾患標 的分子の複合体により形成される。 リボザイム増幅診断検出法 図１Ａで示したように、リボザイム増幅診断（RAD）の方法論は、３つの重要 な構成物を含む：リボザイム10、NUX開裂部位を有し、「共標的」と呼ばれ、固 体支持体16に固定されてい る標識されたRNA分子14と塩基対を形成するように設計された１本のアーム12、 および検出されるRNA上の予め定められた配列、「標的」RNA20と塩基対を形成す るためのリボザイムのもう１本のアーム18。 リボザイム10が共標的RNA14を開裂する場合、共標的の部分22は、支持体16に 結合したまま残り、標識されたNUXを持つ部分24は解離される。未知のサンプル から標識をはずすことにより存在するおよその分子数を決定し得る；すなわち、 種々の量の標的存在下で共標的の開裂の検量線を引くことにより、サンプル中の およその標的分子数を決定し得る。 図１Ｂに見られる変化において、３つの塩基対形成が関与している。１つは、 リボザイム10と支持体16に結合した共標的26の間の26bであり、１つは、リボゾ ーム10と標的28の間であり、そして１つは、共標的26と標的28の間の26aである 。標的RNA28が存在し、リボザイム10および共標的26がそれに結合している場合 にのみ、触媒的に活性なリボザイムコンホメーションを形成する。リボザイム10 、共標的26および標的28の活性３分子複合体は、標識された共標的26がNUX部位 で開裂し、標識オリゴヌクレオチド26aが固体支持体16から溶液中に解離する。 塩基対形成は可逆的なので、リボザイム10、開裂した共標的26および標的28は、 お互いに自由に解離して、リボザイム、開裂していない新しい共標的分子、およ び標的分子の間で新しい活性複合体を形成する。この再循環によってラベル、そ して従ってシグナルの解離が増幅し、システムの感度 を高め、そして疑陰性のレベルを低くするすることにつながる。システムの高い 特異性は、疑陽性のレベルを低くすることになる。 本方法のさらなるバリエーションを図１Ｃに示す。デルタ肝炎ウイルス由来の 設計したリボザイムは、２つのサブドメインに分離し得、これらは再構築された 場合、開裂の結果得られたドメインの一つを用いて活性リボザイムを再形成する （Branch and Robertson，Proc.Natl.Acad.Sci．88:10163（1991）この文献の教 示はここに取り入れている）。デルタリボザイムは、ドメインI中の指定した配 列を、標的RNA34中の選ばれた配列に相補的な配列32および36と置き換えること によって再び標的とされ得る。指定した部位38での開裂の結果、リボザイム30の 活性なコンホメーションを再構築するために適切な標的RNA 34と複合体化するま で、再び標的となったドメインＩ 30は不活性なまま残る。 リボザイムのドメインＩ 30が固体支持体16に固定され、検出可能なラベル（ 例えば、放射活性ラベル、蛍光物質ラベル、染色、化学発光ラベル、発色性物質 と反応性の酵素）で標識される場合、それを臨床サンプルに存在する標的RNA 34 の存在を検出するために用い得る。活性リボザイムのコンホメーションは、次に 標的RNA 34と結合し、標識されたオリゴヌクレオチド36aの開裂と解離に終わる 。この方法は、デルタリボザイムのみならず同様の形式で分離し得るいかなるリ ボザイムにも適用し得る。 反応は、マイクロタイターウェルプレートのようなアッセイ用の標準反応容器 で行い得る。好ましい実施態様においては、固体物質はマイクロタイタープレー トの壁、マイクロビーズ、あるいはその他の診断アッセイに一般用いる不活性な 物質であり得る。固定方法は、例えばNature 357:519-520（1992）に記載のよう に、当業者には公知であり、この教示はここに取り入れる。 上記の方法論は、病原性の分子、または核酸以外の高分子、例えばタンパク質 、を検出し得るように改変し得、これを図２に示す。図２Ａを参照して、設計し た共標的42に完全に関係している（すなわちリボザイムの両方のアーム40ａおよ び40bは、共標的42aおよび42bに相補的である）リボザイム配列40を構築する。 次いでリボザイム40を配列44に結合させる。この配列44は、タンパク質のような 非核酸リガンド46と結合するため、そして結合した場合にはリボザイム40の全配 列およびリガンド結合部位44をリボザイムが活性であるコンホメーションにする ように選択された。従って、リボザイムの活性化を用いて共標的42を開裂し、ラ ベルされ検出し得るオリゴヌクレオチド42bを放出させ得る；ラベルの放出は、 与えられたリガンド46の存在を示す。この調節可能なリボザイム40は、可逆的に 共標的42に結合し、従って開裂していない共標識と相互作用を続け得、その結果 シグナルを増幅し得る。リボザイム40の不活性なコンホメーションを図２Ｂに示 す。ここではリガンド結合配列44は、リボザイム40の上に折り返さ れ、このリボザイム40は、不活性なコンホメーションをとっていて、共標的42を 開裂し得ない。 図１および２で示す方法論の触媒速度を上げるために、および／または、反応 の特異性を上げるために、耐熱性微生物から単離された（Brownら、Keystone RN A Processing Meetin g，Keystone，p55abs，1992）、または「インビトロ遺伝学 」（Szostak,TIBS 17:89，1992）を用いて選択したより熱安定性のリボザイムを 、より高い温度で上記の方法を行うために、用い得る。thermus aquaticusおよ びthermotoga maritima由来の熱安定性RNase Pもまた用い得る。より高い反応温 度では、リボザイムのガイド配列と標的との間のミスマッチは、安定で、活性な 複合体の形成にとって熱力学的に好ましくない、すなわちアームはターゲットに 対して正確な相補性を伴ったハイブリダイズをしないままになる。従って、温度 が上昇しても触媒中心がコンホメーション的に活性であるリボザイムは、標的お よび全ての起こりうる部分的に相同な非標的配列の間を識別し得る。標準反応温 度では、プロティピカル（protypical）なリボザイムは、本質的に同じ反応速度 論で、類似してはいるが同一ではない配列、例えば、10個中２個がミスマッチで あるような配列、に結合し、厳密な区別をし得ない。これは、１塩基対のミスマ ッチを、標準ハイブリダイゼーションプローブ技術、またはPCRによって同定す るのと類似している。 インビトロの選択については、上記のインビトロ遺伝学に ついての方法論を適用して、37℃で最適に機能するリボザイムの配列においてラ ンダムな遺伝的変化を有するリボザイム集団を生成する。従って、温度が上昇し ても効果的に機能するそれらのリボザイムについてアッセイし選択する。例とし てBeaudry and Joyce，Science 257:635-641（1992）を参照されたい。この教示 をここでは援用する。例えば、遺伝子産物は、そのリガンドへの結合能または化 学反応能によって選択され得る。選択された遺伝子産物に相当する遺伝子、また は特定のリボザイムは、反復プライマー方法、例えばポリメラーゼ連鎖反応、に よって増幅され得る。２つのポリメラーゼ酵素の組み合わせを用いて、実質的に はいかなるRNAも増幅し得る。RNAは、逆転写酵素（RT）を用いて相補的なDNA（c DNA）に逆転写され、そして得られたcDNAを、T7 RNAポリメラーゼを用いてRNAに 転写する。増幅は、T7ポリメラーゼがcDNAテンプレートの１コピー当たり200〜1 200コピーのRNA転写物を生じる能力の結果として、転写の間に起こる。増幅は選 択的に行われ、そこでは集団内の個々のRNAが、増幅に好適となるために、特定 の化学反応を触媒することが要求される。選択は、リボザイムがオリゴヌクレオ チドまたはオリゴデオキシヌクレオチド基質が関与する配列特異的反応を触媒す る能力に基づく。反応産物は、リボザイムの３’末端に付着した３’部分の物質 を含む分子である。選択は、オリゴデオキシヌクレオチドプライマーが連結接合 点を越えてハイブリダイズし、cDNA合成を始めるために使われる場合に起こる。 変異は、発生の頻度が固定されているランダムな置換を含む変異誘発性オリゴ デオキシヌクレオチドのセットを使用して誘導し得る。これらの部分的にランダ マイズしたオリゴヌクレオチドは、自動化したDNA合成機で不正確なモノマーを 数％含むヌクレオシド３’−ホスホルアミダイト溶液を用いて生成される。選択 的増幅の各ラウンドの後、ランダムな変異を変異誘発性条件下でPCRを行うこと により誘発する。選択的増幅によって得られたRNAを、逆転写し、得られたcDNA をPCRで増幅し、PCR産物を転写して変異RNAの子孫の分布（progeny distributio n）を生じる。 図３Ａに示すように、温度安定性リボザイム50は、上昇した温度で標的52およ び共標的54に対して特異的で、たとえば、60℃対45℃、である。温度は、各リボ ザイムのシステム、例えば、ハンマーヘッド、RNase P、またはHDVリボザイム、 によって変化する。図３Ｂに示すミスマッチは、温度が37℃より上がる場合、す なわち45〜60℃の場合は、開裂しない。 要するに、開示する方法論は、リボザイムの開裂が起こるためには多数の要件 があるため、高度に特異的である；シグナルの増幅をさせるリボザイムの固有の 触媒的性質のために高感度である；このシステムは、あらゆるRNA分子を標的に するように容易に改変され得（リボザイムのたった１つのアームだけが配列を変 えればよい）、リボザイムの再合成のみが要求される；マイクロタイタープレー トリーダーのような、既に存在しているハードウエアを簡単に使用し得る；ロジ ス ティックに単純で迅速であり、連続的ではなく同時に相互作用するいくつかの構 成物が必要である；そして最後には、容易に定量し得る。 リボザイム 種々のリボザイムが上記の方法で用いられ得る。リボザイムの選択は開裂特異 性を決定し、そして固定化される共標的は適宜に設計されなければならない。リ ボザイム活性は、標的および／または共標的への結合により影響されるリボザイ ムのコンホメーションの変化、または共標的と同程度に非核酸リガンドに結合し 得るリボザイムの構築により調節され得る。このリボザイムは、リガンドの非存 在下では、リボザイムのコンホメーションが立体的に結合を阻害するので、共標 的に結合し得ない。あるいはこのリボザイムは、リボザイムが不活性なコンホメ ーションを保持するので、結合するが開裂し得ない。リガンドが存在する場合、 リボザイムはそのリガンドに結合し、それによりそのリボザイムが共標的に結合 し、活性コンホメーションをとり、そして標的を開裂し得る。 調節され得るリボザイムは、以下に記載の方法により調製され単離され得る。 適切なオリゴヌクレオチドがApplied Biosystems Incorporated（ABI，850 Linc oln Center Dr.，Foster City，CA 94404）392型シンセサイザーで同社の試薬を 用いて合成される。一般的な設計基準は図面を参照して上記で説明される。これ らは、すべてリボザイムの機能を変えない ような改変および変形が可能である。 共標的分子の開裂部位は、リボザイム系の選択に依存する。開裂される配列は 、リボザイムの選択に依存する。例えば、リボザイムがイモリサテライトRNAに 由来する場合、開裂部位はNUXに従う：ここでNはいずれのヌクレオチドでもよく 、XはG以外のいずれかのヌクレオチドであり、そしてUはウリジンである。RNase Pについて、公知の配列特異的要求性を図４Ａおよび４Ｂに示す（それぞれ細菌 性RNAase Pおよび真核生物RNAase P）。開裂部位に対しては選択基準が必要とさ れない。なぜなら、これは共標的に備わっており、公知のシス開裂リボザイム配 列に由来するからである。本明細書中に記載の方法のストラテジーは、常に、共 標的中に開裂部位配列要求性を完全に配置するようにしてリボザイム系を分離す ることであり、よってリボザイム／共標的と疾患標的との間の相互作用に対する 要求性のみが、いずれの特異的配列要求性をも伴わないで、相補的ヌクレオチド の範囲となる。 ハイブリダイゼーションのための塩基対のセット数は存在しない。リボザイム と標的との間、リボザイムと共標的との間、および共標的と標的との間の塩基対 の長さは、各リボザイム系および特定の診断状況により変化し得る。例えば、塩 および温度、または他の反応条件は、シグナル／ノイズ比を最大にするために、 各場合について経験的に最適化され得る。 標的RNAおよび共標的RNAの選択 いずれのRNA分子も、本発明の方法での使用のために標的にされ得る。好まし いRNA分子は、少なくとも部分配列が知られているRNA分子であって、リボザイム 配列が標的分子および共標的分子の両方に結合するように相補的配列を生成させ 得る。標的される分子の例には、タンパク質をコードするmRNA、特に特定の症状 、障害、あるいは疾患で特徴づけられているかまたは病原因子に由来するタンパ ク質をコードするmRNA、および、ウイルスタンパク質をコードするRNAあるいはR NAゲノムが包含される。標的されるRNAの例には、内因性RNAまたは外因性RNAが 包含される。内因性RNAは、タンパク質をコードするmRNAあるいは非コーディン グRNAのいずれかであり、特定の障害、状態、あるいは疾患の病因に関連する。 外因性RNAは細胞の内部あるいは外部に存在するが、疾患状態に直接または間接 的に関わる病原因子（ウイルス、細菌、真菌など）に由来する。標的される非核 酸分子の例には、タンパク質類、例えば、腫瘍特異的タンパク質あるいは癌タン パク質（例えば、ras変異体）；ホルモン類、例えばヒト絨毛性ゴナドトロピン 、薬物使用を示す代謝産物；および毒素（環境試験または法医学試験により同定 される）が包含される。 リボザイム活性の制御 制御可能なリボザイムの構築方法は、以下に記載する。ここで、リボザイム配 列はリガンド結合配列に連結されており、これによりリボザイムの活性がそのリ ガンドの調節下に置か れ、そしてその存在は活性化または不活化に必要とされる。DNAオリゴヌクレオ チドを、T7プロモーターおよび所定のリボザイムをコードする配列が、長さｎの ランダム配列の前または後に存在するように合成する。得られるDNAは分子の混 合物である（複雑度４ｎ）。T7 RNAポリメラーゼによるインビトロ転写は、RNA 分子の複合プールを生じ、それぞれは、長さｎのランダム配列に連結した所定の リボザイム配列を有する。リボザイム配列は規定されているが、リボザイムに対 応する部分を含む全体分子のコンホメーションは、ランダム配列と、それ自身お よびリボザイム配列との相互作用により決定される。折り畳みにより所望のリガ ンド、好ましくは、結合を可能にするのに十分な複雑度の小有機分子、またはタ ンパク質のような高分子を結合させるコンホメーションになる分子を選択するに は、RNA分子の複合プールをアフィニティークロマトグラフィーの繰り返しラウ ンドにかける。ここで、リガンドがマトリックスに共有結合し、結合するそれら のRNA分子がカラム上に保持され、その後特異的に溶出する。溶出したリガンド 結合RNAを、このリガンド結合分子を富化するためにポリメラーゼ連鎖反応（PCR ）を用いて増幅する。PCR試薬および方法論は、Perkin Elmer，761 Main Ave.， Norwalk，Conn.06850；またはRoche Molecular Systems，1145 Atlantic Ave.， Suite 100，Alameda，CA 94501から入手可能である。このようなサイクルをいく らか行った後で、事実上すべての分子がリガンドに結合し得るRNA集団が生じる 。 一定数の分子は、分子のリボザイム部分のアームが標的RNAに結合する能力を 立体的に妨げることによりリボザイムを不活化するように、および／または、リ ボザイムの触媒中心のコンホメーションを変化させるように折り畳まれ、それに より開裂が阻害されるが、しかし、続く共リガンドへの結合がリボザイムを活性 化するように折り畳まれる。リガンドの例には、標的として上記で規定されたよ うなタンパク質が包含される。あるいは、一定数の分子は、リガンドの存在下で のみ折り畳まれて不活性コンホメーションになり、そしてその非存在下では触媒 的に活性なコンホメーションになる。 次に、リガンド結合RNA集団を、共薬剤リガンドによりリボザイムの活性化ま たは不活化に対してスクリーニングする。選択は、少なくとも２つの方法で達成 され得る。第一に、リガンド結合RNA分子の純集団を逆転写酵素により二本鎖DNA 分子に変換し、次にインビトロ発現ベクターにクローニングする。クローニング された配列を有する個々の細菌形質転換体を生育させ、組換えプラスミドを精製 し、リガンド結合／リボザイムRNAをコードする遺伝子を転写させる。次に、各 クローン由来の相同的RNAをリガンドの存在下または非存在下で開裂に対してア ッセイする。あるいは、スクリーニングをロジステッィクに簡易化するためのス トラテジーが用いられ得、これは単離し転写しアッセイするクローンの総数を減 少させる。このような方法の１つは、リガンド結合分子の複合プールの限界希釈 を行うことである。RNA濃度および既知のサイズ の分子から、単位体積当たりの分子数、RNA溶液のモル濃度が容易に決定され得 る。RNAの希釈は、統計上好ましいように、例えば、アッセイウェルあたり10RNA 分子で行われる。100マイクロタイタープレート（96ウェル）では、約105分子が 開裂に対してアッセイされ得た。EllingtonおよびSzostak（1990）は、1015の異 なる配列の原集団中では、所定のリガンドに結合するように折り畳まれている10 10RNA分子あたり１つが存在し、最終調製物では102〜103配列が存在すると評価 した。リガンド結合に対して精製した後では、事実上100％の分子がリガンドに 結合する。105の異なるリガンド結合分子から１つの分子のみが、リガンドの存 在により活性化または不活化したリボザイムを有するとすれば、このスキームに よりその単離が可能になるであろう。リガンド結合RNAは、PCRによりアフィニテ ィークロマトグラフィーのサイクルで1010倍オーダーに富化されているので、か なり低い割合で存在するリガンド制御リボザイムであっても過度の実験を行うこ となく単離することが可能である。共リガンドの存在または非存在下で開裂が生 じるそれらのウェルは、PCR増幅されてクローニングされ、そして個々のクロー ンの転写物は、リガンドによる不活化または活性化についてアッセイされる。 共リガンドの性質が、外生的に供給されるように選択され得る（例えば、少な くとも標的分子に容易に入り込むいくつかの非毒性分子）か、あるいは完全な内 生系が設計され得る（ここでは、調節リガンドが、病原に直接または間接的に関 連する標的細胞内の低分子代謝産物または高分子である）。例えば、標的RNAに よりコードされるタンパク質はリガンドとなり得る。制御可能なリボザイムの活 性は、病原性タンパク質への結合に依存する。標的RNAレベルはリガンド活性化 リボザイムによる開裂のため低下するので、タンパク質リガンド濃度は低下する 。濃度が調節可能なRNA分子が全て占められる濃度以下に低下する場合、リボザ イム開裂速度が低下し始める。リボザイム−リガンドアフィニティーの差異につ いて選択することにより、標的RNAがリボザイムの仲介で破壊される適切なレベ ルの制御がいかなる与えられた条件下でも達成され得る。例えば、RNAプールは 、目的のタンパク質をカラムに結合したアフィニティークロマトグラフィーにか けられる。タンパク質に結合し得るリボザイム分子は、カラム上に保持され、そ の後溶出する。PCRおよびクロマトグラフィーを繰り返し行って、このようにタ ンパク質に結合するリボザイム分子を富化する。次に、この集団を上記のように スクリーニングし、リガンドの存在下でのみ活性リボザイムとなる分子を単離す る。 本発明は、以下の限定されない実施例を参照することにより、さらに理解され る。 実施例１：Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原mRNAの一部分に対応する短い配列の検出 図５Ａおよび５Ｂに示されるように、ハンマーヘッドリボ ザイムの構造に基づいて、２つの構築物を設計した。１つは「リボザイム」60（ 配列番号１）と称し、１つは「共標的」62（配列番号２）と称した。疾患標的RN A 64の存在下で、ステムA〜D70（配列番号４）、72（配列番号５）、74、76（配 列番号３）からなる３分子複合体が形成される。得られた複合体は、図５Ａに示 されるように、リボザイムおよび基質の活性コンホメーションを生じ、続いて共 標的分子62（配列番号２）が開裂し、標識オリゴヌクレオチド62aが遊離する。 疾患標的RNA64の非存在下では、ステムＡ70（配列番号２）およびＢ72（配列番 号１）のみが完全に形成されている。ステムＣ74（配列番号１）は２つの塩基対 のみからなるので、従って、３分子複合体に比較して、共標的62（配列番号４） の効果的な開裂を支持するには十分に安定ではない。 図６は、リボザイムおよび共標的のみで構成される２分子複合体に比較した、 リボザイム、共標的、および疾患標的で構成される完全複合体の活性を示す。疾 患標的は、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（HBsAg）mRNAに対応する、20ヌクレオチ ドでなるRNAである。レーン１には、３つの全反応物が存在するがMg++が存在し ない：開裂は観察されない。レーン２では、Mg++とともに３つの全反応物が存在 し、そして開裂が生じている。重要なことには、疾患標的の存在しないレーン３ に見られるように、共標的の開裂量がレーン２よりも明らかに少ない。 実施例２：Ｂ型肝炎表面抗原mRNAの一部分に対応する800ヌクレオチドフラグメ ントの検出 図７Ａおよび７Ｂは、リボザイムの模式図であり、これは標的の非存在下での 共標的の開裂が標的の存在下よりも多いことを示す。 図７Ｃの結果は、疾患標的の存在または非存在下におけるリボザイムおよび共 標的の効果を実証する。HBV転写物が存在する場合、リボザイム活性は低い。こ れは本明細書に記載の方法の好例である。ここでは、分子の存在が、標識の遊離 が増加することにより検出される。これはおそらく別の塩基対合による。 図７Ｃに示されるように、レーン１では、３つの全反応物が存在するがMg++が 存在しない：開裂は観察されない。レーン２では、Mg++とともに３つの全反応物 が存在し、そして開裂が生じている。重要なことには、疾患標的の存在しないレ ーン３に見られるように、共標的の開裂量がレーン２よりも明らかに多い。 本発明の方法および組成物の改変および変形は、前述の詳細な説明から当業者 に明らかである。このような改変および変形は、以下の請求の範囲内にあること が意図される。 配列表 （１）一般的情報： （ｉ）出願人：イノーバー ラボラトリーズ、インコーポレイテッド （ii）発明の名称：リボザイム増幅診断用薬 （iii）配列数：５ （iv）連絡住所： （A）住所人：パトレア エル．パブスト （B）番地：スイート２８００、１１００ ピーチツリー ストリート （C）市：アトランタ （D）州；ジョージア （E）国：アメリカ合衆国 （F）郵便番号：30309-4530 （v）コンピューター読み出し形態： （A）媒体型：フロッピーディスク （B）コンピューター：IBM PC互換用 （C）操作システム：PC-DOS/MS-DOS （D）ソフトウェア：パテントインリリース＃1.0、バージョン＃1.25 （vi）現在の出願データ： （A）出願番号： （B）出願日： （C）分類： （vii）先行出願データ： （A）出願番号：US 07/985,308 （B）出願日：１９９２年１２月４日 （viii）代理人／事務所情報： （A）氏名：パブスト，パトレア エル． （B）登録番号：31,284 （C）照会／記録番号：ILI106 （ix）電話回線情報： （A）電話：404-815-6508 （B）テレファックス：404-815-6555 （2）配列番号１の情報： （ｉ）配列の特色： （A）長さ：41塩基対 （B）型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：不明 （ii）配列の種類：cDNA to mRNA （iii）ハイポセティカル：No （iv）アンチセンス：No （vi）起源： （A）生物名：合成 （ix）配列の特徴： （A）特徴を表す記号：misc feature （B）存在位置；1..41 （D）他の情報：／機能＝「活性リボザイム」 （xi）配列 配列番号１： （2）配列番号2の情報： （ｉ）配列の特色： （A）長さ：14塩基対 （B）型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：不明 （ii）配列の種類：cDNA to mRNA （iii）ハイポセティカル：No （iv）アンチセンス：No （vi）起源： （A）生物名：合成 （ix）配列の特徴： （A）特徴を表す記号：misc feature （B）存在位置：1..14 （D）他の情報：／機能＝「結合した共標的」 （ix）配列の特徴： （A）特徴を表す記号：misc feature （B）存在位置：8..9 （D）他の情報：／産物＝「開裂部位」 （xi）配列：配列番号2： （2）配列番号3の情報： （i）配列の特色： （A）長さ：14塩基対 （B）型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：不明 （ii）配列の種類 genomic RNA （iii）ハイポセティカル：No （iv）アンチセンス：No （vi）起源： （A）生物名：Ｂ型肝炎ウイルス （ix）配列の特徴： （A）特徴を表す記号：misc feature （B）存在位置：1..14 （D）他の情報：／機能＝「標的RNA−肝炎表面抗原メッセージ」 （xi）配列：配列番号3： （2）配列番号4の情報： （ｉ）配列の特色： （A）長さ：14塩基対 （B）型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：不明 （ii）配列の種類：cDNA to mRNA （iii）ハイポセティカル：No （iv）アンチセンス：No （vi）起源： （A）生物名：合成 （ix）配列の特徴： （A）特徴を表す記号：misc feature （B）存在位置：1..14 （D）他の情報：／機能＝「標識した共標的」 （xi）配列：配列番号4： （2）配列番号5の情報： （ｉ）配列の特色： （A）長さ：41アミノ酸 （B）型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：不明 （ii）配列の種類：cDNA to mRNA （iii）ハイポセティカル：No （iv）アンチセンス：No （vi）起源： （A）生物名：ウイロイド（植物） （ix）配列の特徴： （A）特徴を表す記号：misc feature （B）存在位置：1..41 （D）他の情報：／機能＝「不活性リボザイム」 （xi）配列：配列番号5：

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/566 8310−2Ｊ (72)発明者 ボックマン，ジェフリー エム. アメリカ合衆国 ニューヨーク 10003, ニューヨーク，フィフス アベニュー 41，アパートメント ４ビー (72)発明者 ジョージ，シャージ ティー. アメリカ合衆国 ニューヨーク 10021, ニューヨーク，イースト 70ティーエイチ ストリート 220

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．溶液中の標的核酸分子を検出する方法であって、以下の工程： 溶液中に、２つの相補的なヌクレオチド分子がハイブリダイズし得る条件下で ：リボザイム分子、標的核酸分子、およびリボザイムに対する開裂部位を含む標 識された共標的核酸分子、を提供する工程、ここで、該共標的分子および標的分 子は異なる配列を有し、そして該リボザイム分子は、該標識された共標的核酸分 子に相補的な領域および該標的核酸分子に相補的な領域を含み、ここで、該相補 的な領域は、少なくとも、該リボザイム分子と共標的核酸分子と標的核酸分子と の間の結合を得るために最小限の数の相補的ヌクレオチドを含み、 該リボザイム分子を、該標識された共標的核酸分子および標的核酸分子と反応 させる工程、および 該標的核酸分子が溶液中に存在する場合、該標的核酸分子が溶液中に存在しな い場合と比較して遊離の標識の存在を検出する工程： を包含する方法。 ２．前記リボザイムが、テトラヒメナリボザイム、RNAase P、イモリのサテライ トリボザイム由来のリボザイム、植物ウイロイド由来のハンマーヘッドリボザイ ム、およびデルタ肝炎ウイルス由来のアクスヘッド（axehead）リボザイムから なる群 に由来する、請求項１に記載の方法。 ３．前記標的核酸分子が共標的の第１の核酸分子により結合される、請求項１に 記載の方法。 ４．前記標的核酸分子がタンパク質をコードする、請求項３に記載の方法。 ５．前記標識された共標的核酸分子が固体支持体上に固定化されている、請求項 １に記載の方法。 ６．前記標識された共標的核酸分子が、染料、発色性基質と反応性の酵素、蛍光 標識、化学発光標識、および放射性標識からなる群から選択される標識で標識さ れる、請求項１に記載の方法。 ７．前記リボザイムが、該リボザイムが前記標的核酸分子に結合するときに、構 造的に活性である、請求項１に記載の方法。 ８．前記リボザイムが、該リボザイムが前記標的核酸分子および標識された共標 的核酸分子の両者に結合するときに、構造的に活性である、請求項１に記載の方 法。 ９．前記リボザイムの酵素活性を変える分子に対する結合に基づいて該リボザイ ム分子を選択する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。 １０．請求項９に記載の方法であって、さらに前記リボザイム分子を繰り返し合 成する工程；該リボザイム分子と、活性を変える分子とを、いくつかのリボザイ ム分子が該分子に結合し得る条件下で反応させる工程； 該活性を変える分子と結合しないリボザイムを除去する工程、 該リボザイムの活性について結合分子の影響をスクリーニングする工程、 該活性を変える分子に結合し、そしてそれによってその活性が変化し得るリボ ザイム分子を単離する工程、および 該分子と結合しそしてその活性が該分子との結合により変化し得るリボザイム 分子が単離されるまで、このプロセスを繰り返す工程；を包含する方法。 １１．前記リボザイムが37℃を超える高温で安定で、そして標的核酸分子が37℃ を超える条件下で結合する、請求項１に記載の方法。 １２．前記標的核酸分子が前記リボザイム分子により結合されるときに、該標的 核酸分子が結合されない場合に比べ検出 される標識がより少ない、請求項１に記載の方法。 １３．前記標的核酸分子が前記リボザイム分子により結合されるときに、該標的 核酸分子が結合されない場合に比べ検出される標識がより多い、請求項１に記載 の方法。 １４．リボザイム分子、標的核酸分子、および該リボザイムに対する開裂部位を 含む標識された共標的核酸分子を含む組成物であって、ここで、該共標的分子お よび標的分子は異なる配列を有し、そして該リボザイム分子は、該標識された共 標的核酸分子に相補的な領域および該標的核酸分子に相補的な領域を含み、ここ で、該相補的な領域は、少なくとも、該リボザイム分子と共標的核酸分子と標的 核酸分子との間の結合を得るために最小限の数の相補的ヌクレオチドを含む、組 成物。 １５．前記共標的核酸分子が、標的核酸分子に結合し、そして前記リボザイム分 子により結合されおよび開裂される、請求項１４に記載の組成物。 １６．前記標的核酸分子がタンパク質をコードする、請求項１４に記載の組成物 。 １７．前記リボザイムが、テトラヒメナリボザイム、RNAase P、イモリのサテライトリボザイム由来のリボザイム、植物ウイロイド由来のハ ンマーへッドリボザイム、およびデルタ肝炎ウイルス由来のアクスヘッドリボザ イムからなる群に由来する、請求項１４に記載の組成物。 １８．前記リボザイムが、前記共標的核酸分子上の第１の部分に結合するときに 、構造的に活性である、請求項１４に記載の組成物。 １９．前記リボザイムが、第１の相補的な領域が共標的分子に結合し、そして第 ２の相補的な領域が標的分子上の第２の部分に結合するときに、構造的に活性で ある、請求項１４に記載の組成物。 ２０．前記リボザイムの酵素的活性が、該リボザイムへの制御性分子の結合によ り変えられる、請求項１４に記載の組成物。 ２１．前記リボザイム分子が、37℃と60℃との間の温度で構造的に活性である、 請求項１４に記載の組成物。 ２２．前記標識された共標的核酸分子が、固体支持体上に固定化されている、請 求項１４に記載の組成物。 ２３．前記標識された共標的核酸が、染料、発色性基質と反応性の酵素、蛍光標 識、化学発光標識、および放射性標識からなる群から選択される標識で標識され る、請求項１４に記載の組成物。 ２４．前記標的核酸分子が、前記リボザイムまたは共標的分子のいずれかにハイ ブリダイズする場合、該標的核酸分子が結合されない場合に比べ検出される標識 がより少ない、請求項１４に記載の組成物。 ２５．前記標識核酸が、前記リボザイムまたは第２の分子のいずれかにハイブリ ダイズする場合、該標識核酸が結合されない場合に比べ検出される標識がより多 い、請求項１４に記載の組成物。 ２６．リボザイム分子を選択する方法であって、該リボザイム活性が制御性分子 との結合により変えられ得、以下の工程； 該リボザイム分子を繰り返し合成する工程、 該リボザイム分子と、活性を変える分子とを、いくつかのリボザイム分子が該 分子に結合し得る条件下で反応させる工程、 該活性を変える分子と結合しないリボザイムを除去する工程、 該リボザイムの活性に関して結合分子の影響をスクリーニ ングし、該リボザイム分子を単離する工程、ここで、該分子が該リボザイムを結 合しそしてその活性に影響を与え、および 該分子と結合し、そしてその活性が該分子との結合により変えられ得るリボザ イム分子が単離されるまで、このプロセスを繰り返す工程、を包含する方法。 ２７．トランスに作用するリボザイム診断システムであって、染料、発色性基質 と反応性の酵素、蛍光標識、化学発光標識、および放射性標識からなる群から選 択される標識で標識され、そして標的分子に相補的な２つの領域を有するリボザ イムを含み、ここで、該標識は、該リボザイムが該標的分子に結合する場合、該 リボザイムから開裂される、システム。 ２８．前記標識リボザイムが、テトラヒメナリボザイム、RNAase P、イモリのサ テライトリボザイム由来のリボザイム、植物ウイロイド由来のハンマーヘッドリ ボザイム、およびデルタ肝炎ウイルス由来のアクスヘッドリボザイムからなる群 に由来する、請求項２７に記載のリボザイム診断システム。 ２９．溶液中の標的された核酸分子を検出する方法であって、 トランスに作用するリボザイム診断システムを提供する工程であって、該シス テムは、染料、発色性基質と反応性の酵素、蛍光標識、化学発光標識、および放 射性標識からなる群 から選択される標識で標識され、そして該標的された分子に相補的な２つの領域 を有するリボザイムを含み、ここで、該標識は、該リボザイムが該標的された分 子に結合するときに開裂され；および 該リボザイムから開裂された該標識を検出することにより該標的された分子を 検出する工程、を包含する方法。 ３０．溶液中の標的された核酸分子を検出する方法であって、前記リボザイムが 、テトラヒメナリボザイム、RNAase P、イモリのサテライトリボザイム由来のリ ボザイム、植物ウイロイド由来のハンマーヘッドリボザイム、およびデルタ肝炎 ウイルス由来のアクスヘッドリボザイムからなる群に由来する、請求項２９に記 載の方法。 ３１．染料、発色性基質と反応性の酵素、蛍光標識、化学発光標識、および放射 性標識からなる群から選択される標識で標識され、そして標的分子に相補的な２ つの領域を有し、ここで、該標識は、該リボザイムが該標的分子に結合するとき に開裂される、リボザイム ３２．テトラヒメナリボザイム、RNAase P、イモリのサテライトリボザイム由来 のリボザイム、植物ウイロイド由来のハンマーヘッドリボザイム、およびデルタ 肝炎ウイルス由来のアクスヘッドリボザイムからなる群に由来する、請求項３１ に記載のリボザイム。