JPH08508492A

JPH08508492A - 非環式ヌクレオシド類似体及びそれらを含むオリゴヌクレオチド配列

Info

Publication number: JPH08508492A
Application number: JP6522133A
Authority: JP
Inventors: ディー．クック，フィリップ; ジェイ．デレッキ，ダニエル; ギノッソ，チャールズ
Original assignee: スターリングウィンスロップインコーポレイティド
Priority date: 1993-03-30
Filing date: 1994-03-21
Publication date: 1996-09-10
Also published as: DK0691968T3; ATE155467T1; DE69404289D1; AU6449394A; CA2159631A1; GR3025053T3; EP0691968A1; US5576427A; EP0691968B1; WO1994022864A1; DE69404289T2; ES2107205T3

Abstract

(57)【要約】式Ｉ：〔式中、Ｒ¹は、水素またはオリゴヌクレオチド合成に適合するブロッキング基であり；Ｒ²は、水素またはメチルであり；Ｒ³は、水素または−P(R⁴)OR⁵であり；Ｒ⁴は、塩素、４−ニトロイミダゾール、イミダゾール、テトラゾール、トリアゾールまたはジ（低級アルキル）アミノ−であり；Ｒ⁵はメチル、２−シアノエチルまたは２，２，２−トリクロロエチルであり；ｎは０〜２であり；Ｘは酸素、硫黄または−NR⁶であり；Ｒ⁶は水素または低級アルキルであり；Ｑはからなる群から選ばれ；Ｒ⁷は低級アルキルであり；且つＲ⁸は水素、ベンゾイル、アニソイルまたは低級アルキルカルボニルである〕の化合物及びその医薬として許容され得る付加塩はヌクレオチド類似体である。式Ｉのヌクレオシド類似体を含む修飾オリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ分解に対して安定であり、遺伝子発現の抑制、配列決定及び突然変異誘発において有用である。

Description

【発明の詳細な説明】非環式ヌクレオシド類似体及びそれらを含むオリゴヌクレオチド配列発明の分野本発明は、新規１，ω−アルキレンジオールヌクレオシド類似体、これらの類似体を含むオリゴヌクレオチド配列、該ヌクレオシド及びそれらを含むオリゴヌクレオチドの製造方法、ヌクレアーゼ分解及び遺伝子発現を抑制するための修飾オリゴヌクレオチドの使用方法、ならびに該修飾オリゴヌクレオチドを含む組成物に関する。情報開示記述 schneider及びBenner〔J. Am. Chem. Soc. 112, 453〜455（1990）〕は、及びこのユニットを含むオリゴヌクレオチド類似体を開示している。これらのオリゴヌクレオチド類似体は、相補的天然オリゴヌクレオチドとハイブリッドを形成するものであった。著者らは、結果を「可変オリゴヌクレオチド類似体をアンチセンス化合物として使用することを期待する人々の期待に反する」ものと記載した。九量体中のたった１個のヌクレオシドを置換した場合でさえ、デュプレックスの融解温度が12〜15℃低下した。 Prisbeら〔J. Med. Chem. 29, 671〜675（1986）〕は抗ウィルス剤として〔式中、Ｒは水素または燐酸残基である〕を開示している。 Harndenらの米国特許第4,965,270号は、抗ウィルス剤として、９−（３−ヒドロキシ−２−ヒドロキシメチルプロプ−１−オキシ）グアニン：を開示している。 Schwarzとその同僚〔Science 228, 585〜587（1985）；J. Molecular Evoluti on 29, 284〜287（1989）；J．Molecular Evolution3〜6（1990）〕は、非環式ヌクレオチド類似体の、鋳型に関連したホモオリゴマー化を記載している。モノマーは、式〔式中、Ｂはシトシン、イミン、グアニンまたはアデニンである〕を有する。 Augustynsら〔Nucleic Acids Research 19 2587〜93（1991）〕は、酵素安定性及びオリゴデオキシヌクレオチドの塩基対合性に対する、（Ｓ）−９−（３，４−ジヒドロキシブチル）アデニンの取り込みの影響を議論している。発明の背景アンチセンス化合物は、核酸、RNAまたはDNA中のヌクレオチド配列に結合するかまたはそれとハイブリッドを形成して、該核酸の作用または合成を阻害する化合物である。アンチセンス化合物はRNAとDNAの両者とハイブリッド形成できるため、転写、RNAプロセッシングまたは翻訳のレベルで遺伝子発現を妨害することができる。アンチセンス分子は、ゲノムDNAとハイブリッド形成して、RNA ポリメラーゼの作用を直接または間接的に阻害することによって、特定の遺伝子のmRNAへの転写を妨害するように、設計及び合成することができる。DNAを標的とする場合に理論上有利な点は、治療効果を達成するのに必要なアンチセンス化合物がごく少量でよいことである。あるいは、アンチセンス化合物はRNAとハイブリッド形成して、転写後修飾（RNAプロセッシング）または蛋白合成（翻訳）メカニズムを阻害するかまたはmRNAの安定性に影響を与えるように、設計及び合成することができる。標的RNAの例は、メッセンジャーRNA（mRNA）、トランスファーRNA（tRNA）、リボソームRNA（rRNA）、ヘテロ核RNA（hnRNA）などである。プロセッシング及び翻訳メカニズムの例としては、前mRNAのスプライシングによるイントロンの除去、mRNAの５′末端のキャッピング、細胞質への輸送、ハイブリッド形成の停止及びリボヌクレアーゼＨが介在するmRNA加水分解が挙げられる。しかしながら、現在のところ、アンチセンス技術の科学及び治療への応用は、数々の技術的問題によってその進展が妨げられている。合成アンチセンス分子は、標的細胞中に存在するヌクレアーゼによって急速に分解されやすい。アンチセンスDNAまたはRNAのオリゴヌクレオチド配列は、例えば、核酸の５′または３′ 末端において作用するエクソヌクレアーゼによって破壊される。さらに、エンドヌクレアーゼが個々のヌクレオチド間の内部ホスホジエステル結合においてDNA またはRNAを分解し得る。このような分解の結果、投与されるアンチセンス化合物の有効半減期は極めて短いため、大用量を短い間隔で投与しなければならない。もう一つの問題は、入手できるDNA半自動合成装置では、アンチセンスDNAまたはRNAの製造コストが非常に高いことである。さらに別の問題は、体及び細胞内の目的とする標的へのアンチセンス薬剤の送達に関するものである。ゲノムDNAを標的とするアンチセンス薬剤は核内に入らなければならない（すなわち、薬剤は原形質膜及び核膜を透過しなければならない）。膜透過性を増大しなければならない（疎水性を増大しなければならない）が、他方において、細胞質及び細胞サイトゾルのような体液区分においては水溶性が必要である（親水性を増大しなければならない）ので、そのいずれかを優先するかを考えなければならない。さらに別の問題は、体内で遊離しているかまたは標的核酸に対してハイブリッド形成するかという、アンチセンス薬剤の安定性に関するものである。アンチセンスDNAのようなオリゴヌクレオチド配列は、キラール燐（phosphorous）中心の回りで立体配置の変換を受けやすい。ヒトの治療において予測される次のステップは、遺伝子をアンチセンス薬剤の標的とすることである〔Armstrong, Business Week、1990年３月５日、p.88〕。しかしながら、疾病の治療にアンチセンス技術をうまく応用するには、前記問題の解決法を見い出さなければならない。安定で、ヌクレアーゼ抵抗性で、製造コストが安く、しかも体中の核酸標的に送達でき且つそれらとハイブリッド形成できるアンチセンス化合物を製造するための１つのアプローチは、正常のホスフェート−糖バックボーン構造及びヌクレオチド塩基への結合点に修飾を有するオリゴヌクレオチド配列を合成することである。本発明はこのようなアプローチに関する。発明の要約生成物の側面において、本発明は式Ｉ〔式中、Ｒ¹は、水素またはオリゴヌクレオチド合成に適合するブロッキング基、たとえば、メトキシトリチルまたはジメトキシトリチルであり；Ｒ²は、水素、ニトロ、低級アルキルアミノ、ジ低級アルキルアミノまたはメチルであり；Ｒ³ は、水素または−P(R⁴)OR⁵であり；Ｒ⁴は、クロロ、イミダゾリル、４−ニトロイミダゾリル、テトラゾリル、トリアゾリルまたはジ低級アルキルアミノ、好ましくはジイソプロピルアミノであり；Ｒ⁵は、メチル、２，２，２−トリクロロエチルまたは２−シアノエチル、好ましくは２−シアノエチルであり；Ｘは、酸素、硫黄または−NR⁶−、好ましくは酸素であり；Ｒ⁶は、水素または低級アルキル、好ましくはメチルであり；ｎは０〜２であり、且つＱは（式中、Ｒ⁷は低級アルキルまたは低級アルキルオキシメチレンであり、且つＲ⁸ は水素、ベンゾイル、アニソイルまたは低級アルキルカルボニルである）からなる群から選ばれた複素環式残基である〕の化合物に関する。複素環Ｑの結合点は、天然のヌクレオシドの場合のような９ −位の窒素ではなく８−位の炭素である。さらに別の生成物の側面において、本発明は、１個またはそれ以上のヌクレオシドが式Ｖの残基で置換された、塩基数が約６〜約200、好ましくは約12〜約24、最も好ましくは約15のオリゴヌクレオチド配列に関する。式Ｉの化合物は、１個またはそれ以上の残基が置換されたオリゴヌクレオチド配列の合成における中間体として有用である。オリゴヌクレオチド配列は、遺伝子発現の抑制のために、核酸の配列決定、診断分析において及びヌクレアーゼ分解の阻害のためにアンチセンス薬剤として有用である。本発明においては、低級アルキルは、炭素数約１〜約４の直鎖、分枝鎖または環状構造の炭化水素基を意味する。ヌクレオシド及びヌクレオチドは当業界における標準的な意味を有する：すなわち、ヌクレオシドは、プリンの９位またはピリミジンの１位を経てリボースまたは２−デオキシリボースに結合するヌクレオシド塩基であり；ヌクレオチドはヌクレオシドの３′または５′−リボース−０ −ホスフェートエステルである。ヌクレオシド塩基は、ウラシル、チミン、シトシン、グアニン、アデニン及びそれらの公知の種々の修飾及び誘導同族体を含む。このような修飾及び誘導塩基の例としては、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ⁶−イソペンテニルアデニン、１−メチルアデニン、１−メチルプソイドウラシル、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−エチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ⁶− メチルアデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５− メトキシウラシル、プソイドウラシル、キューオシン（queuosine）、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル及び２，６−ジアミノプリンが挙げられる。式及び置換基は、明細書全体にわたって、最初に与えた定義を持つ。さらに組成物の側面において、本発明は、前記修飾オリゴヌクレオチド及び医薬として許容され得る担体を含んでなる遺伝子発現抑制用組成物に関する。方法の側面において、本発明は、前記修飾オリゴヌクレオチドを供給することを含んでなる、遺伝子発現の抑制方法、ならびにオリゴヌクレオチド配列の、ヌクレアーゼ、特にエクソヌクレアーゼ分解を阻害する方法に関する。製法の側面において、本発明は、式IIIの化合物を式IVの化合物と反応させることを含んでなる、式IIの化合物の製造方法に関する：〔式中、Ｙは求核剤によって容易に置換される脱離基であり、且つＲ³及びＲ¹⁰ は水素（この場合には式IIの化合物は直接得られる）またはヒドロキシル官能基の保護基（この場合には式IIの化合物は公知の手段による保護基の除去によって得られる）である〕。好ましい脱離基Ｙは、臭素、塩素、ヨウ素、トルエンスルホネート及びメタンスルホネートであり；最も好ましいのは臭素である。好ましい保護基は、ｔ−ブチル、ベンジル、フェニルもしくは置換フェニルまたはイソプロピリデンであり；最も好ましいのはイソプロピリデンである。式III〔式中、ｎは０〜２である〕の化合物は市販されているか、公知であるか、または公知の化合物の系に属し、純粋な対掌体として得ることができる。別の製法の側面において、本発明は、遊離３′または５′ヒドロキシルを有するオリゴヌクレオチド配列を式VI 〔式中、DMTはジメトキシトリチル残基を表し、且つＱ^aはＲ⁸が水素以外である（Ｒ^8a）Ｑのサブセットである〕の化合物と反応させることを含んでなる、ヌクレオシドが式Ｖの残基で置換された修飾オリゴヌクレオチドの合成方法に関する。好ましくは、Ｑ^aはである。次に、Ｒ⁸が水素であるオリゴマーは、対応するＲ^8aオリゴマーから公知の方法を用いて脱保護によって得られる。ゴマーから公知の方法を用いて脱保護によって得られる。好ましい実施態様を含む詳細な説明式Ｉの化合物は、反応式Ａに示した経路によって合成できる：反応式Ａグアノシン類似体に関しては、市販の８−ブロモグアニンを適当な酸塩化物または無水物、好ましくは無水イソ酪酸でアシル化し、適当な低級アルキルハロゲン化物またはスルホン酸エステル、好ましくはヨウ化メチルでアルキル化して、式VIIａの２−アシル−９−アルキル−８−ブロモグアニンを生成する。アデノシン類似体に関しては、市販のアデニンを低級アルキルハロゲン化物またはスルホン酸エステル、好ましくはヨウ化メチルでアルキル化し、水性酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液中でpH4.0において臭素分子で臭素化し、そして酸塩化物または無水物、好ましくは塩化ベンゾイルでアシル化して、４，４−ジアシル−９−アルキル−８−ブロモアデニンVIIｂを生成する。８−ブロモプリン（例えば、式VIIａまたはVIIｂ）は、不活性溶媒、好ましくはDMF中で約２当量の１，ω−アルキレンジオールIIIの適当な誘導体と反応させる。Ｘが酸素である場合には、Ｒ⁹及びＲ¹⁰は一緒になってイソプロピリデン残基を形成する；すなわち、IIIが〔式中、ｎは０〜２、好ましくは０または１である〕であるのが好ましく、１当量の水素化ナトリウムの添加によって該アルコールのナトリウム塩をあらかじめ形成するのが好ましい。次いで、８−ブロモプリンは不活性溶媒中、該アルコラートに添加する。Ｘが硫黄または−NR⁶−である場合には、１，ω−ジヒドロキシル官能価を保護する必要がなく、すなわち、Ｒ⁹及びＲ¹⁰は水素であることができ、また、硫黄または窒素陰イオンをあらかじめ形成する必要がない。Ｒ⁹及びＲ¹⁰が水素以外である場合には、ブロモプリンとの縮合後に、それらを適当な脱保護によって水素に転化することが必要である。例えば、Ｘが酸素であり且つＲ⁹及びＲ¹⁰が一緒になってプロピリデン残基（IIIａ）を形成する好ましい例においては、脱保護は、公知の方法によって、たとえば、ジオキサン中0. 25Ｍ H₂SO₄のような緩酸を用いて行う。式IIａの化合物は、公知の方法〔Schaller，Lerch and Khorana，J. Am. Chem . Soc. 85 3821〜3827（1963）参照〕に従ってヒドロキシル基１個を４，４′− ジメトキシトリチルクロリドで保護してから、公知の方法〔Sinhaら、Tet. Lett . 24, 5843〜5846（1983）参照〕に従って他のヒドロキシルをTHF中、約３当量の２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホルアミダイトと反応させることによって、オリゴヌクレオチド配列中への取り込みに備える。さらに配列への合成に好ましい式VIの化合物は、Ｒ⁴がジイソプロピルアミノであり且つＲ⁵がβ−シアノエチルである化合物であるが、Ｒ⁴が塩素、イミダゾール、４ −ニトロイミダゾール、テトラゾール、トリアゾール、または他のジ低級アルキルアミンであり且つＲ⁵がメチルまたは２，２，２−トリクロロエチルである他の「モノマー」（VI）もまた、公知の方法〔Matteucci and Caruthers Tet. Let t. 22, 1859〜1862（1981）ならびにSchallerらの前掲書参照〕によって製造できる。モノマー単位VI及びその前駆体Ｘはキラール化合物である。説明した合成によって生じるラセミ混合物は、オリゴマー中に取り込ませると、オリゴマーのジアステレオマーの組を生じる可能性があり、それら自体は所望ならば、分離することもできるしまたはモノマーの段階で対掌体を分離することもできる。分割が望ましい場合に使用できる通常の方法としては、キラール媒体上におけるクロマトグラフィーまたはＸのジアステレオマーエステルの、キラール酸の単一対掌体による促進、ジアステレオマーの分離及び加水分解によるＸの単一対掌体の生成が挙げられる。式VIの化合物は、式VIの化合物を、オリゴヌクレオチドの標準合成法におけるその対応するジメトキシトリチルヌクレオシドホスホルアミダイトの代わりに用いることによってオリゴヌクレオチド中に取り込ませる。特に好ましいのは、Ma tteucci及びCaruthers〔J. Am. Chem. Soc. 103, 3185〜3191（1981）〕ならびにGait〔Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, M.J．Gait編、p. 35〜81，IRL Press，Washington，D.C．1984〕によって記載されたような固相合成である。固相合成の最初の工程は、固体支持体、好ましくは気孔制御ガラス（controll ed pore glass，CPG）支持体へのヌクレオシドの結合である。ヌクレオシドは、ヌクレオシドの３′−ヒドロキシ位においてスクシネート結合を介してCPGに結合させるのが好ましい。ヌクレオシドを固体支持体に結合させる他の手段は公知であり、オリゴヌクレオチド合成技術の熟練者には容易にわかる。第１のヌクレオシドを固体支持体に結合させた後、５′−ヒドロキシ保護基の除去、ホスホルアミダイト試薬の存在下における５′ヒドロキシ基の活性化、所望のヌクレオシドの添加、未反応ヌクレオシドのキャッピング及び燐結合の酸化という一連の工程によって、鎖伸張が起こる。結合したヌクレオシドの５′−ヒドロキシ位の保護基は酸、好ましくはトリクロロ酢酸で除去する。この方法に従って使用できる活性化試薬は当業者にはよく知られたものである。好ましい活性化試薬は、テトラゾール及び活性化因子金である（Beckman Inst r．Inc.，Palo Alto，CA）。活性化工程は、添加したヌクレオシド及びトリチルジオールシアノホスフィン化合物の存在下で起こり、トリチルジオールシアノホスフィン化合物は常用の合成法のヌクレオシドホスホルアミダイトに代わるものである。未反応鎖は終了させるか、または無水酢酸及びＮ−メチルイミダゾールのようなキャッピング試薬でキャッピングする。不安定な三価燐結合は、好ましくはヨウ素によって、オリゴヌクレオチドの安定な五価ホスホジエステル結合に酸化する。所期のオリゴヌクレオチド鎖アセンブリーが完成後、燐酸保護基を除去し、鎖を固体支持体から分離し、塩基保護基を常法によって除去する。Gaits,上記、67 〜70。本発明の化合物は、遺伝子発現メカニズムの変化に伴う遺伝疾患または遺伝病を持つ哺乳類の治療に有用である。このような疾病の例は、HIV、サイトメガロウィルス、単純ヘルペス、Ｂ型肝炎、パピローマウィルス及びピコルナウィルスのようなウィルス感染；肺、結腸、子宮頸、乳房及び卵巣の癌；炎症性疾患；ならびに免疫系の疾患、たとえば、後天性免疫不全症候群（AIDS）、血液腫瘍及び過増殖性疾患である。Armstrong，上記、89；Klausner，Biotechnology 8, 303 （1990）。代表的な実施態様は、以下の例中で開示する。これらの例が長さ及び配列の異なったヌクレオチドオリゴマーをするために標準的方法によって容易に修正できることは、当業者ならばわかるであろう。合成の標的は通常、ヌクレアーゼ分解から保護すべき配列中または無能にすべき配列に相補的な配列中のグアノシンまたはアデノシンを各々、式ＶａまたはＶｂの残基に代えることによって選ぶものとする。本発明の化合物の構造は、合成の様式、元素分析、ならびに赤外分光学、核磁気共鳴分光学及び質量分析法によって確認した。反応の過程ならびに生成物の同一性及び均質性は、薄層クロマトグラフィーまたは高速液体クロマトグラフィーによって評価した。略語THFはテトラヒドロフランを、DMFはＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを、iPrはイソプロピルを及びDMTは４，４′−ジメトキシトリチルを表す。温度は摂氏度で示す。例１９−メチルアデニンアデニン43.2ｇ（0.23モル）と40％テトラブチルアンモニウムヒドロキシド水溶液210mlとの混合物を室温で30分間攪拌し、塩化メチレン250mlを添加した。このヘテロ混合物に塩化メチレン200ml中ヨウ化メチル40ml（0.64モル）を添加した。塩化メチレンをさらに450ml添加し、反応を10時間激しく攪拌した。反応を1 0℃に冷却し、形成された乳白色沈殿物から、塩化メチレン及び水を含む液相をデカントした。この沈殿物にメタノールを添加し、混合物を40℃までゆるやかに加温し、10℃に冷却し、得られた粒状固体を濾去した。固体を水350mlから再結晶して、９−メチルアデニン20.9ｇを生成した。例２８−ブロモ−９−メチルアデニン酢酸ナトリウム30.8ｇ、水1.4ｌ及びpHを4.0にするのに充分な量の酢酸から調製した緩衝液1.5ｌ中に、例１の９−メチルアデニン15ｇ（0.1モル）を溶解させた。この溶液に２時間にわたって水２ｌ中臭素25mlを滴加した。反応をさらに２時間攪拌し、得られた固体を濾去し、水ですすいだ。固体を風乾し、メタノール約80ml中で約50℃に加温し、ストリッピングして濁りを帯びた懸濁液とし、濾過した。沈殿物を水ですすいでから、一晩、減圧下で40℃において乾燥させたところ、重量が15.6ｇであった。濾液からメタノールをストリッピングし、さらに1. 6ｇ採取した。一緒にした固体をアセトン約100ml中で３時間こね、次いで、一晩放置した。得られた沈殿物を濾過し、アセトンで洗浄し、一晩、真空ポンプ上で 40℃において乾燥させた後、13.3ｇが得られた。例３６−（ジベンゾイルアミノ）−８−ブロモ−９−メチル−プリン例２の方法に従って製造した６−アミノ−８−ブロモ−９−メチルプリン34ｇ（0.15モル）を無水ピリジン100ml中に溶解させ、ストリッピングした。残渣をピリジン800ml中に再溶解させ、０〜10℃に冷却し、塩化ベンゾイル80ml（0.69 モル）を２時間の間に滴加した。反応混合物をさらに４時間、15℃において攪拌し、少量の不溶性残渣から、炭酸水素ナトリウムで飽和された氷水中にデカントした。生成物を塩化メチレン約2.5ｌ中に抽出し、硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、そしてストリッピングした。残渣をトルエンで２回ストリッピングして、極微量のピリジンを除去し、酢酸エチル約150ml中に溶解させ、結晶種を入れた。結晶化が始まった後、酢酸エチルをさらに70ml添加し、２時間後に、混合物を冷却し、生成物約34ｇを濾取した。生成物を塩化メチレン約500ml中に溶解させ、シリカゲル約400mlを通して濾過し、ストリッピング後、６−（ジベンゾイルアミノ）−８−ブロモ−９−メチル−プリン21.5ｇを生成した。例４６−（ベンゾイルアミノ）−９−メチル−８−〔５−（２，２，５−トリメチル −１，３−ジオキシアニル）メトキシ〕プリン油中60％水素化ナトリウム1.5ｇ（37.5ミリモル）の懸濁液に、V.W．Gash，J ．Org．Chem.37，2197−2201（1972）の方法に従って製造した２，２，５−トリメチル−５−〔１，３〕ジオキサンメタノール5.0ｇ（31ミリモル）を添加した。混合物を30℃で約１時間攪拌し、例３の８−ブロモ−６−（ジベンゾイルアミノ）−９−メチル−プリン12ｇ（27ミリモル）を攪拌しながら添加した。90分後、TLCは主に出発原料を示したので、さらに18ミリモルのヒドロキシメチルジオキサンのナトリウム塩を添加した。混合物を35℃において12時間攪拌した。TLC は若干量の残留出発原料を示したので、さらに８ミリモルのナトリウム塩を添加し、反応を35℃においてさらに４時間攪拌した。反応を10℃に冷却し、氷水と酢酸エチルとの混合物中に滴下した。層を分離し、約400mlからなる水層を酢酸エチル500mlで３回抽出した。酢酸エチル洗液を合し、硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、真空ポンプを用いてrotovap上でストリッピングして、粘稠な黄色油18.4ｇを生成したが、それは依然として水素化ナトリウムからの鉱油を含んでいた。油18.4ｇを、トリエチルアミン１mlを含む塩化メチレン400ml中に溶解させ、シリカゲル250mlに適用した。若干量の不純物を徹底的にすすぎ、生成物を0.2％トリエチルアミンを含むジクロロメタン中10％メタノールで溶離した。黄色固体生成物８ｇ及び生成物と若干のDMFからなる淡黄色ガム1.4ｇが得られた。例５６−ベンゾイルアミノ−８−〔３−ヒドロキシ−２−（ヒドロキシメチル）−２ −メチルプロポキシ〕−９−メチルプリン前記例の黄色固体８ｇをジオキサン60ml中に溶解し、0.25Ｍ硫酸60mlを添加した。反応を室温で２時間攪拌した後、室温に５日間放置した。トリエチルアミンを用いてpHを7.5に調整し、反応を35℃においてストリッピングした。反応をトルエンで２回ストリッピングして、残りの水を除去した。残渣11ｇを塩化メチレン150ml中に溶解させ、シリカゲル445ml上でクロマトグラフ処理し、ジクロロメタン中１〜10％のメタノールの勾配で溶離させた。ジクロロメタン中10％メタノールによって溶出する生成物を、酢酸エチルから再結晶して、６−（ベンゾイルアミノ）−８−〔３−ヒドロキシ−２−（ヒドロキシメチル）−２−メチルプロポキシ〕−９−メチルプリン5.25ｇを生成した。例６化合物Ｘ：Ｒ₂＝メチル、Ｘ＝酸素、Ｑ^a＝Ｑ^a1、Ｒ₇＝メチル例５からのジオール500mg（13.5ミリモル）のピリジン20ml中溶液を、室温で1 8時間、塩化ジメトキシトリチル500mg（14ミリモル）と共に攪拌し、メタノール１mlを添加した。反応をさらに６時間攪拌し、炭酸水素塩飽和水溶液中に注入した。生成物を塩化メチレンで３回抽出し、水洗し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、トルエンで２回ストリッピングした。得られたガラスを約0.1％のトリエチルアミンを含む塩化メチレン中５％メタノール中に溶解させ、シリカゲル上でクロマトグラフ処理し、塩化メチレン中１〜10％のメタノールの勾配で溶離した。生成物は約0.1％のトリエチルアミンを含む塩化メチレン中約２〜５％のメタノールで溶出した。得られた泡を少量のメタノール中に溶解させ、次いで、トリエチルアミン２滴及び水約10mlを添加し、得られた固体を濾別して、生成物530mgを生成した。例７化合物VI；Ｒ₂＝メチル、Ｒ₄＝ジイソプロピルアミノ、Ｒ₅＝シアノエチル、Ｘ＝酸素、Ｑ^a＝Ｑ^a1及びＲ₇＝メチル例６の生成物とホスホルアミダイトとの縮合を、Sinha et al．Tett．Letters 24, 5843〜5846（1983）によって記載されたようにして実施した。0.5％トリエチルアミンを含む窒素飽和酢酸メチルであらかじめ平衡させられたシリカゲルカラム上に直接、反応混合物を置いた。前記混合物で溶離すると、少量の出発原料を含む生成物600mgが得られた。それを、0.5％トリエチルアミンを含む塩化メチレン中窒素飽和20％酢酸エチルを用いてシリカゲル上で再びクロマトグラフ処理して、純粋な生成物100mgが得られた。例８〜12 Applied Biosystems model 380B DNA合成装置上で標準法を用いて、例８〜12 のオリゴマーを合成した（修飾については概説した通りである）。全ての無事完了したカップリングにおいて、例７からの非環式モノマーを５倍〜10倍過剰で用いた。以下の表中において、Ａ^*は構造：の残基を示す。オリゴマーの純度は逆相及びイオン交換HPLCによって評価した。例13 ６−（ベンゾイルアミノ）−９−メチル−８−〔５−（２，２−ジメチル−１，３−ジオキサニル）メトキシ〕プリン、IX：Ｒ₂＝Ｈ、Ｒ₉＋Ｒ₁₀＝イソプロピリデン、Ｘ＝Ｏ、Ｑ_a＝Ｑ^a1、Ｒ₇＝CH₃ 例４と同様な方法によって、例３の８−ブロモ−６−（ジベンゾイルアミノ） −９−メチルプリン7.4ｇ（17ミリモル）及び２，２−ジメチル−５−ヒドロキシメチル−１，３−ジオキサン5.16ｇ（35ミリモル）から、６−（ベンゾイルアミノ）−９−メチル−８−〔５−（２，２−ジメチル−１，３−ジオキサニル）メトキシ〕プリン4.17ｇを合成した。例14 ６−（ベンゾイルアミノ）−８−〔３−ヒドロキシ−２−（ヒドロキシメチル）プロポキシ〕−９−メチルプリン、IIａ：Ｒ₂＝Ｈ、Ｘ＝Ｏ、Ｑ^a＝Ｑ^a1、Ｒ₇＝C H₃ 例５と同様な方法によって、例13のイソプロピリデン保護ジオール4.1ｇから６−（ベンゾイルアミノ）−８−〔３−ヒドロキシ−２−（ヒドロキシメチル）プロポキシ〕−９−メチルプリン1.5ｇを合成した。生成物をメタノール／エーテルから再結晶した；m.p. ：151〜153℃（一水和物として）。例15 Ｎ−（８−ブロモ−６，７−ジヒドロ−６−オキソ−３Ｈ−プリン−２−イル） −２−メチルプロパンアミド、XI：Ｒ^8a＝（CH₃）₂CHCO− 無水イソ酪酸100ml中８−ブロモグアニン3.45ｇ（15ミリモル）の懸濁液を窒素下で150℃において４時間、加熱し、冷却し、生成物3.6ｇを濾別した。生成物をエーテルで洗浄し、例16で使用した。例16 Ｎ−（８−ブロモ−６，９−ジヒドロ−９−メチル−６−オキソ−３Ｈ−プリン −２−イル）−２−メチルプロパンアミド、VIIａ：Ｒ⁷＝CH₃、Ｒ^8a＝（CH₃）₂C HCO− 例１と同様な方法によって、例15のＮ−（８−ブロモ−６，７−ジヒドロ−６ −オキソ−３Ｈ−プリン−２−イル）−２−メチルプロパンアミド3.0ｇ（10ミリモル）をＮ−（８−ブロモ−６，９−ジヒドロ−９−メチル−６−オキソ−１Ｈ−プリン−２−イル）−２−メチルプロパンアミド610mgに転化した。m.p.：2 94℃（ｄ）（クロロホルム／ヘキサンから）。例17 Ｎ−（８−ブロモ−６，９−ジヒドロ−６−オキソ−９−プロピル−３Ｈ−プリン−２−イル）−２−メチルプロパンアミド、VIIａ：Ｒ⁷＝ｎ−プロピル、Ｒ^8a ＝（CH₃）₂CHCO− 例16と同様な方法によって、ヨウ化メチルの代わりにヨウ化ｎ−プロピルを用いて、例15のＮ−（８−ブロモ−６，７−ジヒドロ−６−オキソ−３Ｈ−プリン −２−イル）−２−メチルプロパンアミドから、Ｎ−（８−ブロモ−６，９−ジヒドロ−６−オキソ−９− プロピル−３Ｈ−プリン−２−イル）−２−メチルプロパンアミドを合成できると考えられる。例18 化合物IIａ：Ｒ₂＝Ｈ、Ｘ＝NCH₃、Ｑ^a＝Ｑ^a1、Ｒ⁷＝CH₃ 例４と同様な方法によって、例３のブロモプリンと、２−メチルアミノ−１，３−プロパンジオールのモノメチル化によって得られる２−〔（メチルアミノ）メチル〕−１，３−プロパンジオールとから、前記IIａの化合物が得られると考えられる。例19 化合物IIａ：Ｒ²＝Ｈ、Ｘ＝Ｓ、Ｑ^a＝Ｑ^a1、Ｒ⁷＝CH₃ 例４と同様な方法によって、例３のブロモプリンと５−メルカプトメチル−２，２−ジメチル−１，３−ジオキサンから、前記IIａの化合物が得られると考えられる。５−メルカプトメチル−２，２−ジメチル−１，３−ジオキサンが対応するアルコール（例４参照）から、ヨウ素／トリフェニルホスフィンによるヨウ素化とそれに続く硫化ナトリウムによる置換によって合成できると考えられる。本発明の代表的オリゴマーをヌクレアーゼ阻害、ハイブリッド形成及びmRNA翻訳の阻害に関して試験した。ヌクレアーゼ安定性アンチセンスオリゴヌクレオチドをそれらの安定性に関して、20mM HEPES緩衝液を含むRPMI 1640細胞培養培地（完全培地）中で10％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（FBS）の存在下において評価した（未修飾オリゴヌクレオチドと比較した）。F BS及びヒト血清は３′-->５′エクソヌクレアーゼ活性を含むことが知られている。これは、FBS、ヒト血清及びヒト血漿中で検出することができた唯一のヌクレアーゼ活性である。オリゴヌクレオチドサンプルを完全培地中で 37℃において６時間にわたってインキュベートし、出発化合物の量を、HPLCに基づく方法を用いて測定した。例10の化合物はGEN−PAK FAX（Waters）陰イオン交換カラム上で２つの主ピークとして溶出する。これらの２つのピークは、分子の予想されるＲ形及びＳ形を表す。10％FBSの存在下で６時間後に、例10に関しては安定な反応生成物が観測された。ｄ（Ａ）₁₅の分解とは異なり、FBS関連３′-->５′エクソヌクレアーゼ活性の進行は非環式残基で停止する。DNA／DNAデュプレックス融解温度の測定 Warsaw，Cantor，and Tinoco〔CRC Handbook of Biochemistry and Molecular Biology（G.D．Fasman，editor）1：589（1975）〕よって提示された方法及び値を用いて計算された260nmにおける吸光係数を用いて、オリゴヌクレオチド濃度を分光光度法によって測定した。等モル濃度のオリゴヌクレオチドとその相補的配列を一緒にし（0.1mM EDTA，10mM燐酸ナトリウム、0.1 Ｍ Nacl，pH7.0中）、80℃に加熱し、室温で徐々に冷却させた。サンプルを室温に約2.5時間放置した。次いで、サンプルをサーモスタット制御ヒートブロック中で0.5℃／分（25 ℃〜75℃）の速度で加熱し、Perkin Elmer Lambda 4C UV分光光度計を用いて260 nmにおいて吸光度を監視した。Ａ₂₆₀測定値を15秒毎に取った。データを、RS／１データ分析ソフトウェアを用いる、データ分析用のDEC VAXに移した。dA260／ dT対温度のプロットからTmを求めた。TmはdA260／dTが極大である温度である。結果を表２に示す。例12（ジアステレオマー混合物）及びその相補鎖を一晩４℃でアニーリングしてから融解させ、温度上昇速度を18〜38℃の温度範囲にわたって0.1℃／分に設定し、30秒ごとにＡ260測定値を取った。このデュプレックスに関する熱変性プロフィルは、それほど鋭敏ではなく、複数のdA260／dT極大が観測されたが；ハイブリッド形成は起こったことがわかるであろう。ウサギα−グロビンmRNA翻訳の阻害アンチセンスオリゴヌクレオチドの添加による、ウサギグロビンmRNA（Bethes da Res．Labs，Gaithersburg，MD）＋／− 6.5単位／５μＬ E.coli RNase H （Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN）の無細胞翻訳を、ウサギ網状赤血球ライセート（Promega，Madison，WI）を総容量50μＬで用いて実施した。各翻訳反応に35Ｓ−メチオニン（New England Nuclear，Boston，MA）25μCiを添加した。翻訳を30℃において10分間インキュベートし、次いで、サンプルをドライアイス上でスナップフリーズした。α及びβグロビン鎖を、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて分離した。電気泳動緩衝液（0.1Ｍ燐酸ナトリウム、pH7 .2、SDS1.0ｇ／Ｌ含有）を用いて15cmのゲルを調製した。それらは、アクリルアミド12.5％及びビスアクリルアミド0.6％を含んでいた。翻訳反応のアリコート（１μＬ）を、電気泳動緩衝液、２−メルカプトエタノール1.1％、グリセロール2.5％及びブロモフェノールブルーからなるローディング緩衝液11μＬで希釈した。サンプルを、100℃に３分間加熱することによって変性させてから、ゲル上にローディングした。ゲルを用いて30mAMPにおいて18時間実験した。電気泳動後、ゲルをクーマシーブルーで染色し、乾燥させ、−70℃において16時間、オートラジオグラフィーを行った。 α−グロビンの合成に対する、α−グロビンに関連したアンチセンスオリゴヌクレオチドの作用の定量を、AT＆T PC6300コンピュータに連結されたUItrascan XLレーザーデンシトメーター（LKB／Bromma）を用いてオートラジオグラフを走査することによって行った。データを採取し、表示し、Gelscan XLデータ分析ソフトウェアパッケージ（LKB／Bromma）を用いて積分した。オリゴマーの蛋白合成に対する作用を対照αグロビン合成のパーセントとして表した。例８のオリゴマーは、オリゴマー鎖濃度30μＭで、RNAase Hの不存在下においては対照の74± 10％まで、RNase Hの存在下においては84±５％まで翻訳を阻害した。本発明の医薬組成物は、本発明の１種またはそれ以上の化合物を１種またはそれ以上の無毒性の生理的に許容され得る担体、補助剤または賦形剤（本明細書中においてはこれらをひとまとめにして担体と称する）と共に非経口注射用、固体または液体の形態の経口投与用、直腸または局所投与用などの組成物に製剤化したものを含む。組成物は、ヒト及び動物に経口、直腸、非経口（静脈内、筋肉内または皮下）、槽内、膣内、腹腔内、局所（散剤、軟膏剤または点滴剤）投与することもできるし、頬または鼻用噴霧剤として投与することもできる。非経口注射に適当な組成物は、生理的に許容され得る水性または非水性の滅菌溶液、分散液、懸濁液または乳濁液及び滅菌注射溶液もしくは分散液に再構成される滅菌散剤を含むことができる。適当な水性及び非水性担体、希釈剤、溶剤または賦形剤の例としては、水、エタノール、ポリオール（プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセロールなど）、それらの適当な混合物、植物油（例えば、オリーブ油）及び注射可能な有機エステル、例えば、オレイン酸エチルが挙げられる。適当な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用、分散液の場合には必要な粒度の保持、及び界面活性剤の使用によって保持できる。これらの組成物はまた、補助剤、例えば、保存剤、湿潤剤、乳化剤及び分散助剤を含むことができる。微生物の作用は、種々の抗菌剤及び抗真菌剤、たとえば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などによって確実に防止できる。等張化剤、たとえば、糖、塩化ナトリウムなどを添加するのも望ましい。注射用剤形の吸収の延長は、吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを用いれば可能である。望ましくは、また、分布をより有効にするためには、化合物は徐放出系または標的送達系、たとえば、ポリマーマトリックス、リポソーム及び微小球に取り込ませることもできる。それらは、例えば、細菌固定フィルターを通して濾過することによって、または、使用直前に滅菌水もしくは他のいくつかの滅菌注射用基材中に溶解できる滅菌固体組成物の形態で滅菌剤を取り入れることによって滅菌できる。経口投与用の固体剤形としては、カプセル剤、錠剤、丸剤、散剤及び顆粒剤が挙げられる。このような固体剤形の場合には、活性化合物は、少なくとも１種の常用の不活性賦形剤（または担体）、たとえば、クエン酸ナトリウムもしくは燐酸二カルシウムまたは（ａ）充填剤または増量剤、例えば、澱粉、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール及び珪酸、（ｂ）結合剤、例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロース及びアラビアゴム、（ｃ）保湿剤、例えば、グリセロール、（ｄ）崩壊剤、たとえば、寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカ澱粉、アルギン酸、ある種の複合珪酸塩及び炭酸ナトリウム、（ｅ）溶解遅延剤、例えば、パラフィン、（ｆ）吸収促進剤、例えば、第四アンモニウム化合物、（ｇ）湿潤剤、例えば、セチルアルコール及びモノステアリン酸グリセロール、（ｈ）吸着剤、たとえば、カオリン及びベントナイト、ならびに（ｉ）滑沢剤、たとえば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウムまたはそれらの混合物と混合する。カプセル剤、錠剤及び丸剤の場合には、剤形はさらに緩衝剤を含むことができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ギノッソ，チャールズアメリカ合衆国，カリフォルニア 92083, ビスタ，エンチノ 313

Claims

【特許請求の範囲】１．式Ｉ：〔式中、Ｒ¹は、水素またはオリゴヌクレオチド合成に適合するブロッキング基であり；Ｒ²は、水素またはメチルであり；Ｒ³は、水素または−P(R⁴)OR⁵であり；Ｒ⁴は、塩素、４−ニトロイミダゾール、イミダゾール、テトラゾール、トリアゾールまたはジ（低級アルキル）アミノ−であり；Ｒ⁵はメチル、２−シアノエチルまたは２，２，２−トリクロロエチルであり；ｎは０〜２であり；Ｘは酸素、硫黄または−NR⁶であり；Ｒ⁶は水素または低級アルキルであり；Ｑはからなる群から選ばれ；Ｒ⁷は低級アルキルであり；且つＲ⁸は水素、ベンゾイル、アニソイルまたは低級アルキルカルボニルである〕の化合物。２．Ｒ¹及びＲ³が共に水素である請求の範囲第１項に係る化合物。３．Ｒ⁷がメチルであり且つｎが１である請求の範囲第２項に係る化合物。４．Ｘが酸素である請求の範囲第３項に係る化合物。５．請求の範囲第４項に係る、式の化合物。６．請求の範囲第４項に係る、式の化合物。７．式：〔式中、Ｒ⁸はベンゾイルまたは低級アルキルカルボニルである〕を有する、請求の範囲第１項に係る化合物。８．Ｒ⁵がシアノエチルであり、ｎが１であり且つＲ⁴がジイソプロピルアミノである請求の範囲第７項に係る化合物。９．Ｘが酸素である請求の範囲第８項に係る化合物。 10．請求の範囲第９項に係る、式：の化合物。 11．１個またはそれ以上のヌクレオシドが式：〔式中、Ｒ²は、水素またはメチルであり；Ｘは酸素、硫黄または−NR⁶であり；ｎは０〜２であり；Ｒ⁶は水素または低級アルキルであり；Ｑはからなる群から選ばれ；Ｒ⁷は低級アルキルであり；且つＲ⁸は水素、ベンゾイル、アニソイルまたは低級アルキルカルボニルである〕の残基で置換された、塩基数約６〜約200のオリゴヌクレオチド配列を含んでなる化合物。 12．Ｘが酸素であり、且つｎが１である請求の範囲第11項に係る化合物。 13．前記オリゴヌクレオチド配列が約12〜約24個の塩基を含んでなる請求の範囲第12項に係る化合物。 14．前記オリゴヌクレオチド配列が15個の塩基を含んでなる請求の範囲第13項に係る化合物。 15．請求の範囲第14項に係る、式：の化合物。 16．オリゴヌクレオチド内の１個またはそれ以上のヌクレオシドを式：〔式中、Ｒ²は、水素またはメチルであり；Ｘは酸素、硫黄または−NR⁶であり；ｎは０〜２であり；Ｒ⁶は水素または低級アルキルであり；Ｑはからなる群から選ばれる〕の残基によって置換することを含んでなる、オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ分解の阻害方法。 17．有効量の、請求の範囲第11項に係る化合物を供給することを含んでなる、遺伝子発現の抑制方法。 18．有効量の、請求の範囲第13項に係る化合物を供給することを含んでなる、遺伝子発現の抑制方法。 19．請求の範囲第11項に係る化合物及び医薬として許容され得る担体を含んでなる遺伝子発現抑制用組成物。 20．請求の範囲第13項に係る化合物及び医薬として許容され得る担体を含んでなる遺伝子発現抑制用組成物。