JPH08508647A - ラパマイシン検定 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ラパマイシンおよびラパマイシンの４０−Ｏアルキル化誘導体に対するモノクローナルが、新規ハプテン、免疫源性結合体、それらの製造法およびそれらを使用する免疫検定キットと共に提供される。

Description

【発明の詳細な説明】 ラパマイシン検定 本発明は、例えば医薬の血中濃度追跡のためのキットに有用なラパマイシンお よびラパマイシン誘導体に対するモノクローナル抗体に関する。 ラパマイシンは、種々の適用において、特に、例えば器官移植拒絶反応および 自己免疫疾患の処置および予防における使用のための免疫抑制剤として有用な、 ストレプトマイセス・ヒグロスコピクス（Streptomyces hygroscopicus）により 産生されるマクロライド系抗生物質である。しかしながら、ラパマイシンは高投 与量で副作用を示し、いくぶん変わりやすい生体内利用能を有する。ラパミシン で処置している患者の血中のラパマイシン濃度を追跡することは、従って、薬理 学的活性のために充分な最少の濃度を維持し、副作用の過度の危険を避けるため に、強く望まれている。臨床環境で素早く、容易に行うことができる感受性で信 頼できる検定がないことが、医薬としてのラパマイシンの発展の主要な障害とな っている。 ラパマイシンの臨床的追跡のための検定キットの開発のための以前の努力は特 に成功していない。例えば、欧州特許第０４１７９５号は、ラパマイシン濃度が 抗菌活性の関数として測定される微生物検定を記載している。ＷＯ９２／０２９ ４６は、マクロフィリンへの結合を競合測定することによりラパマイシン濃度を 間接的に測定する検定系を提供する。これらの検定の両方とも扱いにくく特に感 受性でない。更に重要なことに、これらの両方の検定は、僅かに異なった試験条 件下で相当変化し得、異なった病院の試験結果の比較が難しい。 ラパマイシンを認識するモノクローナル抗体の先行報告はない。ラパマイシン が免疫源性でなく、それ自身非常に免疫抑制性であるため、ラパマイシンに対す るモノクローナル抗体の製造は本来難しい。更に、ラパマイシンの代謝物が文献 中で十分特徴付されていないため、ラパマイシンとその代謝物の間の識別が可能 なモノクローナル抗体の同定は難しい。 本発明はラパマイシンに非常に感受性のモノクローナル抗体を提供する。本発 明の抗体は、免疫源性タンパク質に結合したラパマイシンの新規誘導体を含む新 規免疫源性結合体の接種に応答して産生される。これらの抗体を使用した検定キ ットは臨床環境での使用に非常に適しており、今まで可能であったものよりはる かに正確で再現性のある結果を提供する。抗体はラパマイシンの精製および単離 にもまた有用である。 ラパマイシンの免疫抑制誘導体のための検定系の提供は、同様の課題が示され る。特に興味のあるのは、例えば米国第５２５８３８９号およびＰＣＴ／ＥＰ９ ３／０２６０４（Ｏ−アリルおよびＯ−アルキルラパマイシン）（両方とも本明 細書に引用して包含する）に開示されているようなラパマイシンの４０−Ｏ−誘 導体、即ちシクロヘキシル環のヒドロキシ（４０位）でＯ−置換されたラパマイ シン；特に、４０−Ｏ−置換基がアルキルまたは置換アルキル；例えばヒドロキ シアルキル、ヒドロキシアルコキシアルキル、アシルアミノアルキルまたはアミ ノアルキルである（ここで、「アルク−」または「アルキル−」は分枝鎖または 直鎖状のＣ_1-6アルキル、好ましくはＣ_1-3アルキルを意味し、炭素鎖は所望によ りエーテル（−Ｏ−）架橋で中断されていてもよい。）である４０−Ｏ−アルキ ル化ラパマイシン；最も好ましくは４０−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−ラパ マイシン、４０−Ｏ−（３−ヒドロキシプロピル）−ラパマイシン、４０−Ｏ− ［２−（２−ヒドロキシ）エトキシ］エチル−ラパマイシンおよび４０−Ｏ−（ ２−アセトアミノエチル）−ラパマイシンである。従って、本発明の更なる対象 は、このような４０−Ｏ−誘導体に対するモノクローナル抗体の提供である。こ のような抗体は診断的検定およびまた本誘導体の精製および産生に有用である。 本発明の新規免疫源性結合体の製造に使用するラパマイシンの新規活性化誘導 体は、ラパマイシン上のヒドロキシ基の一つ、好ましくはラパマイシンのシクロ ヘキシル部分（４０位）または２８位のヒドロキシを通して、活性結合基、即ち タンパク質との直接の反応が可能な基と結合し、タンパク質との反応を可能にし 、作用しまたは促進する結合剤（例えばカルボジイミド試薬）を使用する必要な く共有結合を形成する。好ましくは、活性化結合基は、活性化エステルまたはカ ルボキシ基、即ち式−ＣＯ−Ｏ−Ｘ（ここで、Ｘはo−またはp−ニトロフェニル 、１−ベンズトリアゾール、ペンタフルオロフェニルまたは（特に）Ｎ−サクシ ンイ ミドのようなカルボキシ活性基である。）を有する。他の好適な活性化結合基は 、例えばｉ）例えば式−Ｓ−Ｓ−Ｚ（ここで、Ｚは、ラパマイシンに結合し得る ２−ピリジルのようなジチオ活性化基）で示される活性化ジチオ基；またはii） 例えばエポキシメチルのようなエポキシ基である。活性化結合基は、エステル、 エーテル、アミド、チオまたは他の好適な結合によりラパミシンと結合し得るが 、エステル結合が好ましい。最も好ましくは、活性化結合基は、一端にラパマイ シンへのエステル結合を有し、他方の端に活性化エステルまたは活性化カルボキ シ基を有するビス−エステル分子、例えばサクシニルを含む。 本発明の好ましいラパマイシン誘導体は、反応Ｉ： 反応Ｉ 〔式中、式Ｉはラパマイシンであり、それをａ）アシル化剤、例えば環状無水物 またはジカルボン酸誘導体（所望によりヘミ−Ｏ−保護形である。）と、好適な 反応条件下反応させ、必要であれば脱保護し、式II（ここで、Ｙはスペーサー分 子、 好ましくは低級アルキレン、例えばＣ_2-6アルキレン、最も好ましくはエチレン である。）で示されるラパマシンを産生する。式IIで示されるラパマシンを、次 いでｂ）例えば式ＨＯ−Ｘ（ここで、Ｘは上記で定義の意味である。）のような カルボキシ活性化基との反応により活性化し、式111で示される活性化ラパマイ シンを産生する。〕 によって製造される式111で示される化合物である。 ラパマイシンの好ましい活性化誘導体は、例えば反応II： 反応II 〔式中、式Ｉはラパマイシンであり、例えば、より完全に下記実施例１に記載し たように、それをａ）ＤＭＡＰおよびピリジンの存在下、無水コハク酸を使用し てＯ−アシル化し、式II'のラパマイシンヘミサクシネート（４０−Ｏ−（３− カルボキシ）プロパノイル−ラパマイシン）を形成する；それを、次いでｂ）Ｅ ＤＣ、Ｅｔ₃ＮおよびＣＨ₂Ｃｌ₂の存在下、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドで活 性化し て、式III'で示される４０−Ｏ−サクシンイミドオキシサクシニルラパマイシン を形成する。〕 により製造される上記式IIIのサクシンイミド誘導体である。４０位により結合 しているこのようなハプテンを使用して製造したモノクローナル抗体は、通常ラ パマイシンおよび上記のようなラパマイシンの４０−Ｏ−誘導体と交差反応性で ある。このようなモノクローナル抗体は、下記に開示のように、下記のような例 えばバインダードメインまたはエフェクタードメイン中のラパマイシンまたはラ パマイシンの４０−Ｏ−誘導体の特定の領域を認識する化合物に対して選択でき る。 例えばラパマイシンと４０−Ｏ−ラパマイシン誘導体を区別する、またはシク ロヘキシル領域における代謝物を同定するシクロヘキシル領域の修飾に高い感受 性を有するモノクローナル抗体を有するのが好ましい場合がある。このような場 合、ハプテンは好ましくは４０−Ｏ位置よりもむしろ２８−Ｏ位置で結合してい る。例えば、式Ａ： 式Ａ 〔式中、ＲはＯ−保護基または所望により保護形であり得る上記の置換基、例え ばヒドロキシアルキル、ヒドロキシアルコキシアルキル、アシルアミノアルキル またはアミノアルキルである。〕 で示されるラパマイシン誘導体を、反応Ｉにしたがって反応させ、必要であれば 脱保護し、例えば式Ｂ： 式Ｂ 〔式中、Ｒ１はＨまたは上記のＯ−置換基、例えばヒドロキシアルキル、ヒドロ キシアルコキシアルキル、アシルアミノアルキルまたはアミノアルキル、Ｙは上 記のリンカー分子およびＸは上記で定義のカルボキシ活性化基である。〕 で示される化合物である類似の２８−Ｏ活性化ハプテンを得る。ＲがＯ−保護基 またはＯ−保護置換基である本ハプテンの製造において、アシル化剤は、両方Ｏ −保護基の続くアシル化でカルボキシ活性化基を添加する１工程前に除去し得る ように、所望により、例えばヘミ−Ｏ−保護形のジカルボン酸であり得る。例え ば、４０−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−ラパマイシンの認識が可能なモノク ローナル抗体の産生のためのハプテンは、例えば反応III： 反応III に従った、第１級ヒドロキシの保護、ヒドロキシのヘミ−Ｏ−保護形のジカルボ ン酸による２８位のアシル化、脱保護およびカルボキシ基の活性化により製造で きる。 同様に、ラパマイシンそれ自身は、例えば反応IV： 反応IV に従って、Ｃ４０ヒドロキシのＯ−保護、２８位のヒドロキシ基のヘミ−Ｏ−保 護ジカルボン酸によるアシル化、脱保護およびカルボキシ基の活性化により、４ ０−Ｏよりむしろ２８−Ｏで活性化され得る。 活性化ラパマイシンまたはラパマシン誘導体は、次いで好適な免疫源性タンパ ク質、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、オブアルブミン（ＯＶＡ）または キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に結合し、免疫源性結合体を形成 する。モノクローナル抗体は、既知の方法、例えば新規免疫源性結合体を好適な 動物種に投与し、免疫源性チャレンジを行い、上記結合体に感作させた抗体産生 細胞を回収する；上記抗体産生細胞を、好適なミエローマと融合させることによ り不死化する；およびこのようにして確立した選択した不死化細胞系からモノク ローナ ル抗体を回収する：を使用して製造する。 本発明の抗体は、次いで、好適な検定に使用し得る。当業者には、幾つかの可 能性が明確であろう。一つの試みは、例えば、ラパマイシンを含む可能性がある と信じられている試験溶液、例えば患者の血漿または全血の存在下および非存在 下で、マイクロタイタープレートを抗体で被覆し、標識（例えば、蛍光−または 放射−標識、特にビオチニル化）ラパマイシンである競合物質に暴露する、抗体 およびラパマイシントレーサーを使用した競合検定である。プレートをすすぎ、 抗体に結合している標識競合物質の量を測定し、その量は試験溶液中に存在する ラパマイシンの量に反比例して変化する。他の試みは、抗体、ラパマイシンタン パク質結合体、およびマウスＩｇＧを認識する標識（例えば、酵素−標識）トレ ーサー抗体を使用し、例えばマイクロタイタープレートをラバマイシン−タンパ ク質結合体（例えば、ラパマイシンまたは４０−Ｏ−アルキル化ラパマイシンに 結合したタンパク質を含む上記の免疫源性結合体）で被覆し、試験溶液の存在下 または非存在下、抗体に暴露し、すすぎ、ラパマイシン結合体に結合する抗体を 、ラパマイシン結合体に結合する抗体のトレーサー抗体の結合により検出する。 再び、結合抗体の量は、試験サンプル中のラパマイシンの量に反比例して変化す る。いずれの場合も、検定は既知の濃度のラパマイシンを含む試験溶液で標準化 する。（ｉ）好ましくは凍結乾燥形またはマイクロタイタープレート上に被覆さ せた本発明のモノクローナル抗体を含み、および（ii）所望によりプレートに被 覆した形のラパマイシンタンパク質結合体および／または標識ラパマイシン誘導 体のいずれかを所望によりまた含み、および（iii）標準化のためのラパマイシ ン溶液および使用説明書を所望により更に含む検定キットが従って提供される。 このようなキットは、１０ng/ml以下、例えば１ng/ml以下、例えば０.２５−０. ５ng/mlほど低い濃度でラパマイシンを検出できる。 本発明の抗体は、更に免疫抑制性アスコマイシン、例えばＦＫ−５０６への相 対的結合親和性により、更に特徴付得る。ＦＫ−５０６は結合ドメインでラパマ イシンに幾つかの構造類似性を有する免疫抑制マクロライドである。ラパマイシ ン（例えば、ラパマイシンおよびその免疫抑制誘導体）およびＦＫ−５０６の両 方 ともマクロフィリン（ＦＫＢＰ）に結合し、両方のために、免疫抑制活性のため に、マクロフィリン結合が必要であるが、充分な基準ではないと信じられている 。しかしながら、ラパマイシンのエフェクター領域は、ＦＫ−５０６のものと非 常に異なり、実際、２個の化合物は全く異なる活性機構を有する。（例えば、Ｆ Ｋ−５０６は主にＩＬ−２転写抑制により免疫抑制するように思え、一方ラパマ イシンは明確はＩＬ−２転写への効果はない。）ラパマイシンは、従ってＦＫＢ Ｐ結合ドメインおよびエフェクタードメインを有することにより特徴付けられ、 ＦＫＢＰ結合ドメインが修飾されたラパマイシン代謝物およびエフェクタードメ インが修飾されたものの間の区別ができる。この区別は、本発明のモノクローナ ル抗体により、本発明のモノクローナル抗体とＦＫ−５０６の間の交差反応性（ 交差反応性は、例えば競合ＥＬＩＳＡにより測定する）を測定することによりな すことができる：高い（例えば５０％以上）交差反応性を有するモノクローナル 抗体は、ＦＫ−５０６と類似のラパマイシンのＦＫＢＰ結合ドメインのエピトー プを認識する；低い交差反応性（例えば２０％以下、最適には１０％以下）の交 差反応性のモノクローナル抗体は、ラパマイシンに独特のエフェクター領域のエ ピトープを認識する。 本発明の抗体は、ラパマイシンおよびラパマイシンの４０−Ｏ−誘導体を、例 えば上記のように区別できる能力によりスクリーニングおよび特徴付できる。ラ パマイシンおよびラパマイシンの４０−Ｏ−誘導体の区別をしない抗体が望まし い場合、抗体は、少なくとも７０％、好ましくは９０％以上、ラパマイシンおよ びその４０−Ｏ−誘導体と交差反応性を示すものを選択する。このような場合、 モノクローナル抗体の製造に使用するハプテンは、好ましくは、例えば反応Ｉの 式IIIの４０−Ｏ−活性化ラパマイシンである。ラパマイシンおよびラパマイシ ンの４０−Ｏ−誘導体または代謝物の区別が望ましい場合、抗体は、３０％以下 、好ましくは１０％以下のそれらに対する交差反応性を有するものを選択する。 この場合、抗体の製造に使用するハプテンは、好ましくは例えば、２８−Ｏ−活 性化ラパマイシンまたは式Ｂのラパマイシン誘導体である。 実施例１−４０−Ｏ−活性化ラパマイシンの製造 ａ）ラパマイシンの４０−Ｏ−ヘミサクシネートの製造 ピリジン１２ml中のラパマイシン１.５ｇ（１.６４mmol）および無水コハク酸 ０．５７７ｇ（５.７７mmol）の撹拌した溶液に、ＤＭＡＰ１９５mg（１.６４mm ol）を加る。得られた混合物を環境温度で１９時間撹拌し、減圧下濃縮する。残 渣を酢酸エチルに溶解し、３回水で洗浄する。有機溶液を無水硫酸ナトリウムで 乾燥し、濾過し、減圧下濃縮する。残渣を９：１ＣＨ₂Ｃｌ₂−ＭｅＯＨを使用し たシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製する。予期される生産物を含 むフラクションを合わせ、もう１回１９：１ＣＨ₂Ｃｌ₂−ＭｅＯＨを使用したシ リカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、減圧下で溶媒を除去した後、４０ −Ｏ−（３−カルボキシ）プロパノイル−ラパマイシン（前記式II'のラパマイ シンヘミサクシネート）が白色泡状物として提供され、下記の特異的スペクトル 特性を示す：¹ Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ２.６８（７Ｈ，ｍ，Ｈ３３，Ｈ２５およびＯ₂ＣＣ Ｈ₂ＣＨ₂ＣＯ₂Ｈ），３．１４（３Ｈ，ｓおよびｍ，ＯＣＨ₃およびＨ３９），３ .３４（３Ｈ，ｓ，ＯＣＨ₃），３.３８（３Ｈ，ｓ，ＯＣＨ₃），４.６８（１Ｈ ，ｍ，Ｈ４０），４.７２（１Ｈ，ブロードｓ，１０−ＯＨ）；ＭＳ（ＦＡＢ） ｍ／ｚ１０３６（［Ｍ＋Ｎａ］⁺），９８２（［Ｍ−ＣＨ₃Ｏ］⁺），９６４（［ Ｍ−（ＣＨ₃Ｏ＋Ｈ₂Ｏ）］⁺），９４６（［Ｍ−（ＣＨ₃Ｏ＋２Ｈ₂Ｏ）］⁺）。 ｂ）４０−Ｏ−サクシンイミドオキシサクシニル−ラパマイシンの製造 ＣＨ₂Ｃｌ₂８ml中の工程ａ）のラパマイシンヘミサクシネート１２０mg（０. １１８mmol）、Ｅｔ₃Ｎｌ６.５μl（０.１１８mmol）およびＥＤＣ２２.７mg（ ０.１１８mmol）の撹拌した溶液に、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド１３.６mg（ ０.１１８mmol）を加える。得られる混合物を１８時間室温で撹拌し、酢酸エチ ルで希釈し、２回水で洗浄する。有機溶液を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過 し、減圧下濃縮する。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル ）で精製し、４０−Ｏ−サクシンイミドオキシサクシニル-ラパマイシ（即ち、 前記反応IIの式III'で示される化合物）を白色泡状物として得、以下の特異的ス ペクトル特性を示す：¹ Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）δ２.６７（２Ｈ，ｔ，Ｏ₂ＣＣＨ₂ＣＨ₂ＣＯ₂），２. ８１（７Ｈ， ｓ，ＣＨ₃ＯおよびサクシンイミドＣＨ₂），２.９２（２Ｈ，ｔ，Ｏ₂ＣＣＨ₂Ｃ Ｈ₂ＣＯ₂），４.５５（１Ｈ，ｍ，Ｈ４０），５.２６（１Ｈ，ｄ，２８−ＯＨ） ，６.４３（１Ｈ，ｓ，１０−ＯＨ）；ＭＳ（ＦＡＢ）ｍ／ｚ１１３３（［Ｍ＋ Ｎａ］⁺），１１１１（［Ｍ＋Ｈ］⁺），１０９２（［Ｍ−Ｈ₂Ｏ］⁺），１０７９ （［Ｍ−ＣＨ₃Ｏ］⁺），１０６１（［Ｍ−（ＣＨ₃Ｏ＋Ｈ₂Ｏ）］⁺），１０４３ （［Ｍ−（ＣＨ₃Ｏ＋２Ｈ₂Ｏ）］⁺）。 実施例２−ラパマイシンの２８−Ｏ−活性化４０−Ｏ−誘導体の製造 ａ）４０−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−ラパマイシンの２８−Ｏ−ヘミサ クシネート １０：１塩化メチレン−ピリジン２.２ml中の４０−Ｏ−（２−ヒドロキシエ チル）−ラパマイシン９５８mg（１.００mmol）の撹拌した冷却（０℃）溶液に 、アリルクロロギ酸０.１６０ml（１.５０mmol）を加える。撹拌を０℃で続け、 ピリジン０.０８０ml（１.００mmol）およびアリルクロロギ酸各０.０５３ml（ ０.５０mmol）を２回それぞれ３および４時間後に加える。試薬の最後の添加の 後、撹拌を更に１時間続け、反応を１Ｍ水性炭酸水素ナトリウムで停止させる。 得られる混合物を３回酢酸エチルで抽出する。有機相を連続して１Ｎ水性塩酸、 １Ｎ水性炭酸水素ナトリウムおよび飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで 乾燥し、濾過して減圧下濃縮する。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー （５０：５０ヘキサン−酢酸エチル）で精製し、アリルオキシカルボニル保護化 合物（上記反応IIIの式２）が白色泡状物として得られる。 塩化メチレン２ml中の本生産物２０８mg（０.２００mmol）の撹拌した冷却（ ０℃）溶液に、ＤＭＡＰ２.４mg（０.０２０mmol）およびＤＣＣ８２mg（０.４ ００mmol）、続けて塩化メチレン０.５ml中のモノアリルサクシネート６３mg（ ０.４００mmol）の溶液を加える。反応混合物を０℃で１４時間撹拌し、得られ た懸濁液をフリットガラス漏斗で濾過した。有機溶液を減圧下濃縮し、残渣をシ リカゲルカラムクロマトグラフィー（３０：７０ヘキサン−酢酸エチル）で精製 し、白色泡状物として生産物を得る（上記反応IIIの式３）。 塩化メチレン５ml中の本生産物１７７mg（０.１５０mmol）の撹拌した溶液に 、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム１７.３mg（０.０１５mmol ）およ びトリブチリンハイドライド０.０８０ml（０.３mmol）を加える。黄色溶液を２ 時間環境温度で撹拌し、酢酸エチルで希釈し、１回冷２Ｎ水性クエン酸および３ 回飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、減圧下濃縮する 。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（８５：１５酢酸エチルーメタノール） は、ヘミサクシネート（反応IIIの式４）を薄黄色油状物として提供する。 ｂ）２８−Ｏ−サクシンイミドオキシサクシニル−４０−Ｏ−（２−ヒドロキ シエチル）−ラパマイシン 塩化メチレン２.５ml中の工程ａ）のヘミサクシネート５３mg（０.０５０mmol ）の溶液を、ＤＭＡＰ２mg、ＥＤＣ２４mg（０.１２５mmol）およびＮ−ヒドロ キシサクシンイミド１４mg（０.１２５mmol）で処理する。２時間環境温度で撹 拌した後、反応を１Ｎ水性炭酸水素ナトリウムで停止する。混合物を３回酢酸エ チルで抽出する。有機溶液を水性炭酸水素ナトリウムおよび食塩水で洗浄し、無 水炭酸水素ナトリムで乾燥し、濾過し、濃縮して標題活性化ハプテン（反応III の式５で示される化合物）を得、それを更に精製することなく、タンパク質−ハ プテン結合体の製造に使用し、以下の特異的スペクトル特性を示す：¹ Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ２.４３（１Ｈ，ｄｄ，Ｈ３３ａ），２.５０−２. ９８（１０Ｈ，ｍ，Ｈ２５，Ｈ３３ｂ，サクシネート水素，サクシンイミド水素 ），３.５８（２Ｈ，ｍ，Ｈ６ｂ，１ヒドロキシエチルＨ），３.６８（３Ｈ，ｍ ，Ｈ１６，２ヒドロキシエチルＨ），３.８１（２Ｈ，ｍ，Ｈ１４，１ヒドロキ シエチルＨ），３.９３（１Ｈ，ｄ，Ｈ２７），５.２８（２Ｈ，ｍ，Ｈ２，Ｈ３ ０），５.３４（１Ｈ，ｄ，Ｈ２８）；ＭＳ（ＦＡＢ）１１６１（［Ｍ＋Ｌｉ］⁺ ）。 実施例３−２８−Ｏ−活性化ラパマイシンの製造 ａ）ラパマイシンの２８−Ｏヘミサクシネート １０：１塩化メチレン−ピリジン２.２ml中のラパマイシン９１４mg（１.００ mmol）の撹拌した冷却（０℃）溶液に、クロロギ酸アリル０.２１２ml（２.００ mmol）を加える。３時間後、ピリジン０.０８０ml（１.０００mmol）およびクロ ロギ酸アリル０.０５３ml（０.５０mmol）を加える。撹拌を更に１時間続け、反 応を１Ｍ水性炭酸水素ナトリウムで停止する。得られる混合物を３回メチル−ｔ −ブチルエ ーテルで抽出する。有機溶液を連続して冷１Ｎ水性塩酸、１Ｎ水性炭酸水素ナト リウムおよび飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、減圧 下濃縮する。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（７０：３０ヘキサン −酢酸エチル）で精製し、アリルオキシカルボニル保護化合物（反応IVの式２） が白色泡状物として得られる。 塩化メチレン５ml中の本生産物４００mg（０.４００mmol）の撹拌した冷却（ ０℃）溶液にＤＭＡＰ４.８mg（０.０４０mmol）およびＤＣＣ１６４mg（０.８ ００mmol）、続いて塩化メチレン１ml中のモノアリルサクシネート１２７mg（０ .８００mmol）の溶液を加える。反応混合物を−１５℃で１４時間撹拌し、得ら れた懸濁液をフリットガラス漏斗で濾過する。有機溶液を減圧下濃縮し、残渣を シリカゲルカラムクロマトグラフィー（４０：６０ヘキサン−メチル−ｔ−ブチ ルエーテル）で精製し、反応IVの式３を白色泡状物として得る。 塩化メチレン５ml中の本生産物２８５mg（０.２５０mmol）の撹拌した溶液に 、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム２８.８mg（０.０２５mmol ）およびトリブチルチンハイドライド０.１３３ml（０.５mmol）を加える。黄色 溶液を１時間環境温度で撹拌し、メチル−ｔ−ブチルエーテルで希釈し、冷２Ｎ 水性クエン酸および３回飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾 過し、減圧下濃縮する。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（９０：１０−６ ０：４０メチル−ｔ−ブチルエーテル−メタノール）により、薄黄色油状物とし て２８−Ｏラパマイシンヘミサクシネート（反応IV、式４の化合物）が得られる 。 ｂ）２８−Ｏ−サクインイミドオキシサクシニル−ラパマイシン 塩化メチレン２ml中の工程ａ）の生産物５１mg（０.０５０mmol）の溶液をＤ ＭＡＰ２mg、ＥＤＣ２４mg、０．１２５mmol）およびＮ−ヒドロキシサクシンイ ミド１４mg（０.１２５mmol）で処理する。４時間環境温度で撹拌した後、反応 を１Ｎ水性炭酸水素ナトリウムで停止する。混合物をメチル−ｔ−ブチルエーテ ルで３回抽出する。有機溶液を水性炭酸水素ナトリウムおよび食塩水で洗浄し、 無水炭酸水素ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮して、活性化標題混合物を得、 それを更に精製することなくタンパク質−ハプテン結合体の製造に使用し、それ は以下 の特異的スペクトル特性を示す：¹ Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ２.４３（１Ｈ，ｄｄ，Ｈ３３ａ），２.５５−３. ０２（１１Ｈ，ｍ，Ｈ２５，Ｈ３３ｂ，Ｈ３９，サクシネート水素、サクシンイ ミド水素），３.５６（１Ｈ，ｍ，Ｈ６ｂ），３.６８（１Ｈ，ｄｄ，Ｈ１６）， ３.８３（１Ｈ，ｍ，Ｈ１４），３．９３（１Ｈ，ｄ，Ｈ２７），５.２８（２Ｈ ，ｍ，Ｈ２，Ｈ３０），５.３４（１Ｈ，ｄ，Ｈ２８）；ＭＳ（ＦＡＢ）１１１ ７（［Ｍ＋Ｌｉ］⁺）。 実施例４−免疫源性結合体の製造 ａ）４０−Ｏ−架橋ラパマイシン結合体 実施例１の４０−Ｏ−活性化ラパマイシン１７.４mgをＤＭＦまたはＤＭＳＯ ４００μlに溶解する。本溶液１２０μl（即ち活性化ラパマイシン５.２２mgを 含む）を０.１Ｍ ＮａＨＣＯ₃緩衝液（ｐＨ７.７）２ml中のＫＬＨ８mgを含む 激しく撹拌した溶液に滴下する。反応混合物を室温で２時間撹拌し、得られるラ パマイシン−ＫＬＨ結合体を４℃でＰＢＳ５１、３×に対して４８時間にわたっ て透析して精製する。本結合体を、所望により、マイクロコンセントレーター管 を使用した遠心により更に濃縮する。ラパマイシン−ＢＳＡおよびラパマイシン −ＯＶＡ結合体は、上記方法のＫＬＨをそれぞれＢＳＡおよびＯＶＡに変えて同 様の方法で製造する。 ｂ）２８−Ｏ−架橋（所望により４０−Ｏ−アルキル化）ラパマイシン結合体 実施例２の２８−Ｏ−活性化化合物５mgをＤＭＳＯ２mlに溶解し、５０mMリン 酸緩衝液（ｐＨ７.３）１ml中のＫＬＨ５mgを含む激しく撹拌した溶液に滴下す る。反応混合物を室温で２時間撹拌し、得られる結合体を４℃でＰＢＳ２１、３ ×に対して４８時間にわたって透析して精製する。ＢＳＡおよびＯＶＡとの結合 体は、同様の方法で製造する。実施例３の２８−Ｏ活性化化合物を使用して、同 様の方法に従って、ラパマイシンはＫＬＨ、ＢＳＡおよびＯＶＡと２８位で結合 する。 実施例５−モノクローナル抗体の製造 ａ）ラパマイシンに対するモノクローナル抗体 モノクローナル抗体を、本質的にケーラーおよびミルスタインら、Nature256: 49に記載の方法に従って既知の技術を使用して、製造する。雌Ｂａｌｂ／Ｃマウ ス（２０−２５ｇ）は、各々、フロインド完全アジュバント０.２ml中の実施例 ４ａ）の４０−Ｏ−架橋ラパマイシン−ＫＬＨ免疫源性結合体１０または５０μ gを、４カ所に皮下注射により投与される。２週間後、フロインド不完全アジュ バント０.２mlに乳化した同量の免疫源性結合体を含む２回目のブースター注射 を、再び皮下注射により投与する。動物血清中の抗原に対して反応性の抗体の存 在は、下記実施例６に記載の直接ＥＬＩＳＡにより確認する。マウスは、所望に より、エフェクター領域（ＦＫ−５０６との低い交差反応性）およびＦＫＢＰ結 合領域（ＦＫ−５０６との高い交差反応性）に対する抗体について更に選択し得 る。例えば、図１は、ラパマイシン結合ドメインに対する高濃度の抗体を有する マウス（Ｍ１）およびエフェクタードメインに対する相対的に高い濃度の抗体を 有する他のマウス（Ｍ７）の力価曲線を示す。好適な特異性の抗体の最大血清濃 度を示すマウスは、抗原１０μgを半分腹腔内および半分静脈内で−３日、静脈 内で−２日および−１日にブースター注射を受ける。０日において、マウスを屠 殺し、その脾臓細胞を単離し、ＰＡＩ−０細胞または他の好適なミエローマ系と 融合する。得られるハイブリドーマを培養し、ＥＬＩＳＡを使用して、ラパマイ シンに高親和性を有する抗体の発現について選択する。 ｂ）４０−（ヒドロキシエチル）−ラパマイシンに対するモノクローナル抗体 雌Ｂａｌｂ／Ｃマウスは、フロインド完全アジュバンド０.２ml中の４０−（ ヒドロキシエチル）−ラパマイシンＫＬＨ免疫源性結合体１０または５０μgを 、皮下注射により４カ所に投与される。２週間後、フロインド不完全アジュバン ト０.２mlに乳化した同量の免疫源性結合体を含む２回目の注射（ブースター） を、再び皮下注射により投与する。動物血清中の抗原に対して反応性の抗体の存 在を、下記の直接ＥＬＩＳＡにより試験する。加えて、マウスは、ＢＳＡ−４０ −Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−ラパマイシンの結合体よりもＢＳＡ−ラパマ イシンの結合体に結合することにより４０−Ｏ領域修が飾更されたラパマイシン 分子の領域に対する抗体を選択し得る。４０−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）− ラパマイシン結合体に結合するが、ラパマイシン結合体に結合しない抗体および ４０−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−ラパマイシンおよびラパマイシン結合体 の両方に結合す る抗体の両方が得られる。好適な特異性の抗体の最大血清濃度を示すマウスは、 抗原１０μgを半分腹腔内および半分静脈内で、−３日、静脈内で−２日および −１日にブースター注射を受ける。０日において、マウスを屠殺し、その脾臓細 胞を単離し、ＰＡＩ−０細胞と融合する。得られるハイブリドーマを培養し、Ｅ ＬＩＳＡを使用して、４０−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−ラパマイシンに高 親和性を有する抗体の発現について選択する。 実施例６−固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ） ａ）ラパマイシンのＥＬＩＳＡ マイクロタイタープレートを、ＰＢＳ中の１−２μg／mlラパマイシン−ＢＳ Ａ結合体で２時間３７℃で被覆し、次いでＰＢＳ中の２％ＢＳＡで飽和し、０. ０５％ツイン−ＰＢＳで３×洗浄する。スクリーニングすべきハイブリドーマ上 清をＰＢＳ中の１％ＢＳＡ溶液で希釈し、一晩室温（または１８時間４℃または ３７℃２時間）でインキュベーションする。結合抗体の濃度を、基質としてのパ ラ−ニトロフェニルホスフェートと一緒にアルカリホスファターゼが結合した抗 −マウスＩｇＧヤギグロブリンにより測定する。３７℃で２時間インキュベーシ ョンした後、酵素基質を加水分解（１時間室温）し、４０５nmの吸光度を測定す る。ハイブリドーマを、高親和性モノクローナル抗体の産生に対して選択する。 選択した抗体のラパマイシンに対する相対的親和性を決定するための標準曲線 は、既知の濃度のラパマイシン（例えば、血清中１から１４０ng／ml）を含む溶 液を使用して調製する。例えば、図２は、我々のモノクローナル抗体Ｍ７−９１ の標準曲線を示し、ラパマイシンに非常に特異的であるとして選択したモノクロ ーナル抗体が、濃度が０.２５ng／mlほど低くてもラパマイシンを検出可能であ ることを証明する。 抗体は、更に、ラパマイシン−ＢＳＡ結合体と同様に製造できるＦＫ−５０６ −ＢＳＡ結合体で被覆したマイクロタイタープレートを使用した類似の直接ＥＬ ＩＳＡでＦＫ−５０６との交差反応性を測定することにより、ラパマイシンのエ フェクターまたはＦＫＢＰ結合ドメインに結合するものとして特徴付け得る。例 えば、１７個の選択したモノクローナル抗体のラパマイシン−ＢＳＡおよびＦＫ −５０６検定における比較を図３に示す；パーセントとしての交差反応性は図４ に示す。このラパマイシン−ＢＳＡ対ＦＫ−５０６−ＢＳＡの結合の比較におい て、非常に低い親和性のモノクローナル抗体が検出される。 上記の直接ＥＬＩＳＡは、コンペティターを、モノクローナル抗体溶液に加え 、競合物質存在下および非存在下でのモノクローナル抗体の結合体への結合を測 定する競合的ＥＬＩＳＡに変え得る。競合物質−がＦＫ−５０６またはラパマイ シンである場合、例えば１mg／mlのエタノール性溶液中の競合物質をモノクロー ナル抗体溶液に直接加え（例えば２μl／２００μl／ウェル）、マイクロタイタ ープレート中で更に希釈する。例えば図５は、異なった濃度の遊離ラパマイシン の存在下でのＭ７−９１抗体（Ｍ７．９１．１３）のＢＳＡ−ラパマイシンへの 結合の阻害曲線を示す。このようなモノクローナル抗体の遊離ＦＫ−５０６対遊 離ラパマイシンへの結合を比較する競合的ＥＬＩＳＡにおいて、ラパマイシンお よびＦＫ−５０６の間の直接ＥＬＩＳＡよりも低い交差反応性が見られる。ある モノクローナル抗体が、遊離形のその抗原に結合するには低すぎる親和性を有す るが、それにもかかわらず巨大タンパク質分子上で違いに緊密に近接して結合し た多くのハプテンから成る多量体抗原への二価または多価結合を示すと信じられ ているため、このような競合的検定はモノクローナル抗体の選択に好ましい。競 合的検定は、このような低親和性抗体を除外する。このような競合的検定の結果 を図６に示し、それは、相対的に低い交差親和性を有するＭ７−９１抗体（Ｍ７ ．９１．１３）と、相対的に高い交差反応性を有するＭ１−３０３（Ｍ１．３０ ３．３）を比較する。 ｂ）４０−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−ラパマイシンのＥＬＩＳＡ 本ＥＬＩＳＡは、ａ）に記載の方法と同様に行う。マイクロタイタープレート をマイクロタイタープレートを、４０−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−ラパマ イシン−ＢＳＡで被覆し、次いでＢＳＡで飽和し、洗浄する。スクリーニングす べきハイブリドーマ上清を１８時間４℃、または２時間３７℃でインキュベーシ ョンする。結合抗体の濃度を、基質としてのパラ−ニトロフェニルホスフェート を伴ったアルカリホスファターゼが結合した抗−マウスＩｇＧヤギグロブリンで 測 定する。平衡ＥＬＩＳＡを、結合ラパマイシン−ＢＳＡを使用して行い、４０− Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−ラパマイシンをラパマイシンと分けることがで きるモノクローナル抗体を選択する。例えば図７は、４０−Ｏ−（２−ヒドロキ シエチル）−ラパマイシン−ＢＳＡ（図中ではＢＳＡ−２８−ＲＡＤと呼ぶ）へ 特異的に結合するハイブリドーマＢ３−２０３（図７Ａ）、４０−Ｏ−（２−ヒ ドロキシエチル）−ラパマイシン−ＢＳＡおよびラパマイシン−ＢＳＡ結合体を ２８位により認識するハイブリドーマＢ３−１１３（図７Ｂ）および加えて４０ 位によりＢＳＡに結合したラパマイシンを認識するハイブリドーマＢ３−１６４ （図７Ｃ）の上清を示す。 抗体の４０−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−ラパマイシン対ラパマイシンへ の相対的親和性を、被覆４０−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−ラパマイシン− ＢＳＡ結合体の、溶液中の４０−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−ラパマイシン または遊離ラパマイシンへの結合を比較して更に測定する。例えば、図８は、ラ パマイシンと低い交差反応性で４０−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−ラパマイ シンと強く反応するハイブリドーマＢ３−２０３により産生された抗体（図８Ａ ）および４０−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−ラパマイシンおよびラパマイシ ンと同等に結合するハイブリドーマＢ３−１１３およびＢ３−１６４により産生 された抗体（図８Ｂおよび８Ｃ）を示す。ラパマイシンと比較して、少なくとも １０−１００倍４０−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−ラパマイシンに結合する 抗体を産生する他のハイブリドーマは、Ｂ３−２２、Ｂ３−１２７およびＢ３− １５６を含む。Ｂ３−２９、Ｂ３−２６５およびＢ３−５３９のような他のハイ ブリドーマは、ラパマイシンおよび４０−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−ラパ マイシンに結合する抗体を産生する。 一度所望の抗体を選択したら、同じＥＬＩＳＡを使用して、患者のラパマイシ ンの血中濃度を測定する。本実施例の検定キットは、凍結乾燥形の１個またはそ れ以上の選択した抗体、ラパマイシン結合体（例えばラパマイシン−ＢＳＡ結合 体または４０−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−ラパマイシン−ＢＳＡ結合体） で被覆したマイクロタイタープレート、ラパマイシン標準および使用説明書を提 供 する。所望により、キットは、競合検定に使用するための標識ラパマイシン誘導 体を更に含む。上記のような抗−マウスＩｇＧ−酵素結合体および基質は、付加 的に提供され得る。別法として、消費者は、本発明のモノクローナル抗体を、彼 ら自身が確立したＥＬＩＳＡまたは他の検定系中で使用し得る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 15/02 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ Ｇ０１Ｎ 33/577 9281−4Ｂ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ， ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＴ，ＵＡ，Ｕ Ｓ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ラパマイシンを特異的に認識できるモノクローナル抗体。 ２．ラパマイシンのＦＫＢＰ−結合部分のエピトープを認識できる、請求項１ 記載のモノクローナル抗体。 ３．ラパマイシンのエフェクター部分のエピトープを認識できる、請求項１記 載のモノクローナル抗体。 ４．ａ）活性化結合基を有するラパマイシンを免疫源性タンパク質と反応させ 、免疫源性結合体を産生し、 ｂ）上記免疫源性結合体を好適な動物種に投与し、免疫源性チャレンジを行い 、上記結合体に感受性の抗体−産生細胞を回収し、 ｃ）上記抗体−産生細胞を不死化し、および ｄ）このように確立した不死化細胞系からモノクローナル抗体を回収する： ことにより得たまたは得ることができる、請求項１から３のいずれかに記載のモ ノクローナル抗体。 ５．ラパマイシンが（ｉ）ラパマイシン；または（ii）４０−Ｏ−アルキル化 ラパマイシン（好ましくは４０−Ｏ−アルキル置換基がヒドロキシアルキル、ヒ ドロキシアルコキシアルキル、アシルアミノアルキルまたはアミノアルキルから 選択される）である、請求項１から４のいずれかに記載のモノクローナル抗体。 ６．ラパマイシンが、 ｉ）４０−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）-ラパマイシン、 ii）４０−Ｏ−（３−ヒドロキシプロピル）−ラパマイシン、 iii）４０−Ｏ−［２−（２−ヒドロキシ）エトキシ］エチル−ラパマイシンお よび iv）４０−Ｏ−（２−アセトアミノエチル）−ラパマイシンから選択されたもの である、請求項５記載のモノクローナル抗体。 ７．ラパマイシンおよび請求項５または６記載の４０−Ｏ−アルキル化ラパマ イシンを区別することができる、請求項１から６のいずれかに記載のモノクロー ナル抗体。 ８．ラパマイシン部分およびタンパク質部分を含む、免疫源性結合体。 ９．タンパク質を、活性化結合基を有するラパマイシン誘導体と反応させて産 生した、請求項８記載の免疫源性結合体。 １０．ラパマイシン誘導体がｉ）４０−Ｏ−サクシンイミドオキシサクシニル −ラパマイシン、 ii）２８−Ｏ−サクシンイミドオキシサクシニル−ラパマイシンまたは iii）２８−Ｏ−（サクシンイミドオキシサクシニル）−４０−Ｏ−（２−ヒド ロキシエチル）−ラパマイシン から選択されたものである、請求項９記載の免疫源性結合体。 １１．活性化結合基を有するラパマイシン。 １２．ｉ）４０−Ｏ−サクシンイミドオキシサクシニル−ラパマイシン、 ii）２８−Ｏ−サクシンイミドオキシサクシニル−ラパマイシンまたは iii）２８−Ｏ−（サクシンイミドオキシサクシニル）−４０−Ｏ−（２−ヒド ロキシエチル）−ラパマイシン から選択されたものである、請求項１１記載のラパマイシン。 １３．請求項１から７のいずれかで定義のモノクローナル抗体の産生が可能な 、ハイブリドーマ細胞系。 １４．請求項１から７のいずれかで定義のモノクローナル抗体を含む、ラパマ イシンの血中濃度測定のための免疫検定キット。