PL185855B1

PL185855B1 - Monoklonalne przeciwciało i zestaw do testów immunMonoklonalne przeciwciało i zestaw do testów immunologicznychologicznych

Info

Publication number: PL185855B1
Application number: PL94310967A
Authority: PL
Inventors: RichardSedrani Richard Sedrani; ValérieQuesniaux Valérie Quesniaux
Original assignee: Novartis Ag
Priority date: 1993-04-08
Filing date: 1994-03-30
Publication date: 2003-08-29
Also published as: EP0693132A1; JP3397325B2; ATE161289T1; NZ265051A; NO953975L; US6635745B2; DE69407402D1; AU677321B2; JP2006249090A; CZ284431B6; KR100404162B1; GB9307491D0; NO320470B1; DE69407402T2; ES2110230T3; HUT72835A; US8039600B2; US8039599B1; HU9501975D0; EP0693132B1

Abstract

1. Monoklonalne przeciwcialo skierowane przeciwko rapamycynie o wzorze 1, przed- stawionym na schemacie 2, znamienne tym, ze jest zdolne do rozpoznawania epitopu na domenie rapamycyny wiazacej bialko wiazace takrolimus (FK-506) i ma immunologiczna reaktywnosc krzyzowa z takrolimus (FK-506) powyzej 50%. PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku są monoklonalne przeciwciała przeciwko rapamycynie i pochodnym rapamycyny i zestawy do testów immunologicznych do monitorowania poziomu leku we krwi.

Rapamycyna jest antybiotycznym makrolidem produkowanym przez Streptomyces hygroscopicus, który, jak stwierdzono, jest farmaceutycznie przydatny w różnych zastosowaniach, zwłaszcza jako środek immunosupresyjny, na przykład do stosowania w leczeniu i zapobieganiu odrzutom przeszczepianych organów i chorobom immunologicznym. Jednak rapamycyna w wyższych dawkach wykazuje działania uboczne i ma nieco zmienną dostępność biologiczną. Monitorowanie poziomów rapamycyny we krwi u pacjentów traktowanych rapamycyną jest zatem bardzo pożądane, ażeby uzyskać możliwość regulowania dawkowania, w celu utrzymania minimalnego poziomu wystarczającego dla aktywności farmakologicznej i jednocześnie w celu uniknięcia jakiegokolwiek niepotrzebnego ryzyka działania ubocznego. Brak czułego i niezawodnego testu, który może być wykonany szybko i łatwo w układach klinicznych był główną przeszkodą we wprowadzaniu rapamycyny jako środka farmaceutycznego.

Uprzednie wysiłki mające na celu opracowanie zestawu testów do klinicznego monitorowania rapamycyny nie zakończyły się szczególnym powodzeniem. W EP 041795, na przykład, opisano test mikrobiologiczny, w którym stężenie rapamycyny mierzono jako funkcję działania przeciw grzybiczego. W WO 92/02946 przedstawiono układ testów, którym mierzy się poziomy rapamycyny pośrednio przez pomiar kompetycyjnego wiązania z makrofiliną. Oba te testy są uciążliwe i niezbyt czułe. Co jest nawet ważniejsze, wyniki obu tych testów mogą ulegać znacznym zmianom w nieco różnych warunkach, utrudniając porównanie wyników testu z różnych szpitali.

185 855

Nie było wcześniejszych doniesień o monoklonalnych przeciwciałach, które rozpoznają rapamycynę. Istnieją nieodłączne trudności w uzyskaniu monoklonalnych przeciwciał wobec rapamycyny. ponieważ rapamycyna nie jest immunogerma i sama jest ogromnie immunosupresyjna.

Ponadto, ponieważ metabolity rapamycyny nie zostały dobrze scharakteryzowane w literaturze, trudno jest zidentyfikować monoklonalne przeciwciało zdolne do rozróżnienia między rapamycyna i jej metabolitami.

Przedmiotem wynalazku jest monoklonalne przeciwciało skierowane przeciwko rapamycynie o wzorze 1, przedstawionym na schemacie 2. Istota wynalazku polega na tym, że przeciwciało to jest zdolne do rozpoznawania epitopu na domenie rapamycyny wiążącej białko wiążące takrolimus (FK-506) i ma immunologiczną reaktywność krzyżową z takrolimus (FK-506) powyżej 50%. Korzystnie przeciwciało jest produktem otrzymanym przez wykorzystanie koniugatu aktywowanej pochodnej rapamycyny z immunogennym białkiem. Monoklonalne przeciwciało jest korzystnie produktem otrzymanym przez:

a) reakcję związku rapamycyny wybranego z rapamycyny i 40-O-(2-hydroksyetylo)rapamycyny, mającej aktywowaną grupę sprzęgającą z immunogennym białkiem dla wytworzenia immunogennego koniugatu,

b) podanie tego koniugatu odpowiedniemu gatunkowi zwierzęcia powodując prowokację immunogerma i uzyskanie komórek produkujących przeciwciała uwrażliwione na tekoniugaty,

c) unieśmiertelnienie wymienionych komórek produkujących przeciwciała oraz

d) uzyskanie monoklonalnego przeciwciała, z otrzymanej wyselekcjonowanej, unieśmiertelnionej linii komórkowej.

Korzystnie immunogenny koniugat jest produktem reakcji 40-O-sukcynimidooksy-sykcynylo-rapamycyny, 28-O-sukcynimidooksysukcynylo-rapamycyny, lub 28-O-(sukcynimidooksysukcynylo)-40-O-(2-hydroksyetylo)-rapamycyny z immunogennym białkiem.

Inną odmianą wynalazku jest monoklonalne przeciwciało skierowane przeciwko rapamycynie o wzorze 1, przedstawionym na schemacie 2, zdolne do rozpoznawania epitopu na efektorowej domenie rapamycyny i mające immunologiczną reaktywność krzyżową z takrolimus (FK-506) poniżej 20%. Korzystnie przeciwciało według wynalazku jest produktem otrzymanym przez wykorzystanie koniugatu aktywowanej pochodnej rapamycyny z immunogennym białkiem.

Monoklonalne przeciwciało według wynalazku korzystnie jest produktem otrzymanym przez:

b) podanie tego koniugatu odpowiedniemu gatunkowi zwierzęcia powodując prowokację immunogenną i uzyskanie komórek produkujących przeciwciała uwrażliwione na te koniugaty,

c) unieśmiertelnienie wymienionych komórek produkujących przeciwciała oraz

d) uzyskanie monoklonalnego przeciwciała, z otrzymanej wyselekcjonowanej, unieśmiertelnionej linii komórkowej. Korzystnie immunogenny koniugat jest produktem reakcji 40-O-sukcynimidooksysykcynylo-rapamycyny, 28-O-sukcynimidooksysukcynylo-rapamycyny, lub 28-O-(sukcynimidooksysukcynylo)-40-O-(2-hydroksyetylo)-rapamycyny z immunogennym białkiem.

W kolejnej odmianie przedmiotem wynalazku jest monoklonalne przeciwciało skierowane przeciwko 40-O-(2-hydroksyetyło)-rapamycynie, będące produktem otrzymanym przez wykorzystanie koniugatu 28-O-aktywowanej rapamycyny z immunogennym białkiem, mające reaktywność krzyżową z rapamycyną poniżej 10%.

Takie przeciwciało jest korzystnie produktem otrzymanym przez:

185 855

b) podanie tego koniugatu odpowiedniemu gatunkowi zwierzęcia wywołując powodując prowokację immunogennąi uzyskanie komórek produkujących przeciwciała uwrażliwione na te koniugaty,

c) unieśmiertelnienie wymienionych komórek produkujących przeciwciała oraz

Korzystnie immunogenny koniugat jest produktem reakcji 40-O-sukcynimidooksysykcynylo-rapamycyny, 28-O-sukcynimidooksysukcynylo-rapamycyny, lub 28-O-(sukcynimidooksysukcynylo)-40-O-(2-hydroksyetylo)-rapamycyny z immunogennym białkiem.

Przedmiotem wynalazku jest również zestaw do testów immunologicznych do pomiaru poziomu rapamycyny lub 40-O-(2-hydroksyetylo)-rapamycyny we krwi, który zawiera monoklonalne przeciwciało skierowane przeciw rapamycynie o wzorze 1, przedstawionym na schemacie 2, zdolne do rozpoznawania epitopu na domenie rapamycyny wiążącej białko wiążące takrolimus (FK-506) i mające reaktywność krzyżowoimmunologiczną z takrolimus (FK-506) powyżej 50%, lub monoklonalne przeciwciało skierowane przeciw rapamycynie o wzorze 1, przedstawionym na schemacie 2, zdolne do rozpoznawania epitopu na efektorowej domenie rapamycyny i mające immunologiczną reaktywność krzyżową z takrolimus (FK-506) poniżej 20%, lub monoklonalne przeciwciało skierowane przeciwko 40-O-(2-hydroksyetylo)-rapamycynie będące produktem otrzymanym przez wykorzystanie koniugatu 28-O-aktywowanej rapamycyny z immunogennym białkiem, o reaktywności krzyżowej z rapamy cyną poniżej 10%.

Przeciwciała według wynalazku zostały scharakteryzowane ich względnym powinowactwem wiązania z immunosupresyjną askomycyną, takrolimus (FK-506). Takrolimus (FK-506) jest immunosupresyjnym makrolidem o pewnym podobieństwie strukturalnym do rapamycyny w domenie wiążącej. Zarówno rapamycyny (na przykład rapamycyną i jej immunosupresyjne pochodne) jak i takrolimus (FK-506) wiążą makrofiliny (FKBP) i przy obu przypuszcza się, że wiązanie makrofiliny jest koniecznym, ale nie wystarczającym kryterium działania immunosupresyjnego. Jednakże, region efektorowy rapamycyny jest całkiem różny niż takrolimus (FK-506) i w rzeczywistości te dwa związki mają zupełnie różny mechanizm działania, (na przykład wydaje się, że takrolimus (FK-506) powoduje immunosupresję głównie przez supresję transkrypcji IL-2, podczas gdy rapamycyną nie ma znaczącego wpływu na transkrypcję IL-2). Rapamycyną zatem została scharakteryzowana tym, że posiada domenę wiążącą białko wiążące takrolimus (FK-506) i domenę efektora i rozróżnienie można przeprowadzić między metabolitami rapamycyny, które są modyfikowane w domenie wiążącą białko wiążące takrolimus (FK-506) a tymi, które są modyfikowane w domenie efektora. To rozróżnienie może być zrobione z monoklonalnymi przeciwciałami według wynalazku przez pomiar względnej reaktywności krzyżowej przeciwciał monokłonalnych według wynalazku z takrolimus (FK-506) (reaktywność krzyżowa mierzona jest na przykład w kompetycyjnym ELISA): monoklonalne przeciwciała mające wysoki stopień reaktywności krzyżowej (na przykład większy od 50%) rozpoznają epitopy w domenie wiążącej białko wiążące takrolimus (FK-506) rapamycyny, która jest podobna do takrolimus (FK-506); monoklonalne przeciwciała o niskim stopniu reaktywności krzyżowej (na przykład mniejszej niż 20%, optymalnie mniej niż 10%) rozpoznają epitopy w regionie efektora, który jest unikalny względem rapamycyn.

Przeciwciała według wynalazku mogą być również poddane skriningowi i charakteryzowane według ich zdolności odróżniania rapamycyny od 40-O-pochodnej rapamycyny, na przykład tak jak zdefiniowano powyżej. Gdy jest to pożądane, aby przeciwciała nie rozróżniały rapamycyny od 40-O-pochodnej rapamycyny, dobiera się przeciwciała, które wykazują co najmniej 70%, korzystnie więcej niż 90% reaktywności krzyżowej między rapamycyną a jej 40-O-pochodną. W takim przypadku, hapten stosowany do wykonania monoklonalnego przeciwciała stanowi korzystnie 4Ó-0-aktywowaną rapamycynę na przykład o wzorze 3 według schematu 1. Gdzie pożądane jest rozróżnienie między rapamycyną a 40-O-pochodną lub metabolitem rapamycyny, dobiera się przeciwciała mające wobec nich mniej niż 30%, korzystnie mniej niż 10% reaktywności krzyżowej. W tym przypadku, hapten stosowany do

185 855 sporządzenia przeciwciała, korzystnie stanowi 28-O-aktywowaną rapamycynę lub pochodną rapamycyny, na przykład o wzorze B.

Zgodnie z wynalazkiem szczególnie warte zainteresowania są przeciwciała monoklonalne skierowane przeciwko 40-O-pochodnym rapamycyny tj. rapamycyny, które są O-podstawione przy grupie hydroksylowej pierścienia cykloheksylowego (pozycja 40), na przykład O-arylo i O-alkilo rapamycyny. zwłaszcza 40-O-alkilowane rapamycyny, w których podstawnik w pozycji 40-0- jest alkilem lub podstawionym alkilem; na przykład hydroksyalkilem, hydroksyalkoksyalkilem, acyloaminoalkilem lub aminoalkilem, w których „alk” lub „alkil” oznacza C_]^alkil, rozgałęziony lub prosty, korzystnie C^alkil, w którym łańcuch węglowy może być ewentualnie przerwany eterowym połączeniem (-O-); w szczególności 40-O-(2-hydroksyetylo)-rapamycyna, 40-O-(3-hydroksypropylo)-rapamycyna, 40-O-[2-(2-hydroksy)etoksy]etylo-rapamycyna i 40-O-(2-acetamino-etylo)-rapamycyna.

Nowymi aktywowanymi pochodnymi rapamycyny stosowanymi do sporządzania nowych immunogennych koniugatów według wynalazku są rapamycyny, które są połączone poprzez jedną z grup hydroksylowych rapamycyny, korzystnie grupę hydroksylową usytuowaną w części cykloheksylowej rapamycyny (pozycja 40) lub hydroksylową w pozycji 28, z aktywowaną grupą sprzęgaj ącątj. grupą zdolną do bezpośredniej reakcji z białkiem tworząc połączenie kowalencyjne bez potrzeby stosowania środka sprzęgającego (na przykład reagentów karbodiimidowych) w celu umożliwienia lub zapoczątkowania reakcji z białkiem. Korzystnie aktywowana grupa sprzęgająca ma aktywowaną grupę estrową lub karboksylową na przykład o wzorze -CO-O-X, w którym X oznacza grupę akty wuj ącą grupę karboksylową takąjak o-lub p-nitrofenylowa, 1-benzotriazolowa, pentafluorofenylowa lub (zwłaszcza) N-sukcynoimidowa. Innymi odpowiednimi aktywowanymi grupami sprzęgającymi są na przykład i) aktywowane grupy ditio, na przykład o wzorze -S-S-Z, w której Z oznacza grupę aktywującą grupę ditio takąjak 2-pirydylowa, która może być przyłączona do rapamycyny lub ii) grupy epoksy na przykład epoksymetyl. Aktywowane grupy sprzęgające mogą być przyłączone do rapamycyny za pomocą wiązania estrowego, eterowego, amidowego, tiulowego lub innego odpowiedniego. ale korzystne jest wiązanie estrowe. Najkorzystniej, aktywowana grupa sprzęgająca zawiera część bis-estrową na przykład sukcynyl mający wiązanie estrowe z rapamycyną z jednego końca i aktywowaną grupę estrową lub karboksylową z drugiego końca.

Korzystnymi pochodnymi rapamycyny według wynalazku są pochodne o wzorze 3 wytwarzane tak jak przedstawiono na schemacie 1, na którym wzór 1 przedstawia rapamycynę, którą a) poddaje się w odpowiednich warunkach reakcji ze środkiem acylującym na przykład bezwodnikiem cyklicznym lub kwasem dikarboksylowym (ewentualnie w postaci chemi-O-chronionej) i ewentualnie usuwa się grupy ochronne otrzymując rapamycynę o wzorze 2, w którym Y oznacza grupę oddzielającą korzystnie niższy alkilen na przykład, C₂.₆alkilen, najkorzystniej etylen. Rapamycynę o wzorze 2 następnie b) aktywuje się przez reakcję z grupą aktywującą karboksy na przykład o wzorze Η0Χ, w którym X ma znaczenie podane powyżej, otrzymując aktywowaną rapamycynę o wzorze 3.

Korzystną aktywowaną pochodną rapamycyny jest pochodna sukcynimidowa o wzorze 3' otrzymana tak, jak przedstawiono na schemacie 2, zgodnie z którym rapamycynę o wzorze 1, a) O-acyluje się bezwodnikiem bursztynowym w obecności DMAP i pirydyny tworząc hemibursztynian rapamycyny o wzorze 2' (40-Ó-(3-karboksy)propanoilo-fapamycynę), którą następnie b) aktywuje się N-hydroksy sukcynimidem w obecności EDC, Et₃N i CH₂C1₂ otrzymując 40-O-sukcynimidooksysukcynylo rapamycynę o wzorze 3' na przykład tak jak pełniej opisano w przykładzie 1 poniżej. Monoklonalne przeciwciała wytworzone z zastosowaniem haptenu (antygenu resztkowego) takiego jak ten, który jest połączony poprzez pozycję 40, będą zwyczajnie krzyżowo reaktywne między rapamycyną a 40-O-pochodną rapamycyny, jak opisano powyżej. Takie monoklonalne przeciwciała mogą być dobrane jak opisano poniżej dla związków, które rozpoznają dany region rapamycyny lub 40-O-pochodnej rapamycyny na przykład w domenie czynnika wiążącego lub w domenie efektora, jak opisano poniżej.

W niektórych przypadkach pożądane jest posiadanie monoklonalnych przeciwciał o dużej czułości zdolnych do modyfikacji w regionie cykloheksylu na przykład dla rozróżnienia między rapamycyną a 40-O-pochodnymi rapamycyny lub do zidentyfikowania metabolitów w regionie

185 855 cykloheksylowym. W takim przypadku hapten korzystnie połączony jest raczej poprzez pozycję 28-0- niż pozycję 40-O-. Na przykład, pochodną rapamycyny o wzorze A, w którym R oznacza grupę O-ochronną lub podstawnik taki jak opisany powyżej, na przykład hydroksyalkil, hydroksyalkoksyalkil, acyloaminoalkil lub aminoalkil, ewentualnie w postaci chronionej, poddaje się reakcji zgodnie ze schematem 1, ewentualnie usuwa się grupy ochronne, otrzymując analogiczny 28-O-aktywowany hapten, na przykład związek o wzorze B, w którym RI oznacza H lub O-podstawnik taki jak opisany powyżej na przykład hydroksyalkil, hydroksyalkoksyalkil, acyloaminoalkil lub aminoalkil, Y oznacza grupę łączącą zdefiniowaną powyżej a X oznacza grupę karboksylową akty wującąjak zdefiniowana powyżej. Przy wytwarzaniu tego haptenu, w którym R oznacza grupę O-ochronną lub podstawnik O-ochroniony, środkiem acylującym może ewentualnie być na przykład kwas dikarboksylowy w postaci chemi chronionej, tak, ażeby po acylacji obie grupy O-ochronne mogły być usunięte w jednym etapie przed dodaniem aktywującej grupy karboksylowe. Na przykład hapteny do generowania monoklonalnych przeciwciał zdolnych do rozpoznawania 40-Ó-(2-hydroksyetylo)-rapamycynę, można wytwarzać przez ochronę pierwszorzędowej grupy hydroksylowej, acylowanie grupy hydroksylowej w pozycji 28 kwasem dikarboksylowym w postaci hemi-O-ochronionej, usunięcie grup ochronnych i aktywowanie grupy karboksylowej na przykład według schematu reakcji 3.

Podobnie, samą rapamycynę można aktywować raczej w pozycji 28-0- niż 40-O-przez O-ochronę grupy C40 hydroksy, acylowanie grupy hydroksylowej w pozycji 28 hemi-0-chronionym kwasem dikarboksylowym, usunięcie grup ochronnych i aktywację grupy karboksylowej, na przykład zgodnie ze schematem 4.

Aktywowaną rapamycynę lub pochodną rapamycyny przyłącza się następnie do odpowiedniego immunogennego białka, na przykład albuminy z surowicy bydlęcej (BSA), albuminy z jaja kurzego (0VA) lub hemocyjaniny z pąkli (Megathura crenulata·, keyhole limpet hemocyanine) (KLH) tworząc immunogenny koniugat.

Przeciwciała według wynalazku są przydatne w testach diagnostycznych a także przy oczyszczaniu i wytwarzaniu pochodnych.

Zestaw testów, w którym zastosowano te przeciwciała może być stosowany z powodzeniem w układach klinicznych, a także zapewnia znacznie bardziej dokładne i powtarzalne wyniki niż było wcześniej możliwe. Przeciwciała te są również przydatne do oczyszczania i wyodrębniania rapamycyny.

Przeciwciała według wynalazku mogą być następnie stosowane w odpowiednim teście.

Dla fachowca będzie jasnych kilka możliwości. Jedną z nich jest test kompetycji przy użyciu przeciwciała i znacznika rapamycyny, na przykład, w którym szalki do mikromiareczkowania pokrywa się przeciwciałem i wystawia na działanie związku konkurującego, którym jest znakowana (na przykład znakowana fluorem lub izotopem promieniotwórczym, zwłaszcza biotynylowana) rapamycyna, w obecności i bez testowanego płynu ewentualnie zawierającego rapamycynę na przykład osocza lub całej krwi pacjenta. Szalki spłukuje się i mierzy się ilość znakowanego związku konkurującego, który przyłączył się do przeciwciała, która to ilość jest odwrotnie proporcjonalna do ilości rapamycyny w badanym teście. Inną możliwością jest test ELISA przy użyciu przeciwciała, koniugatu rapamycynowo białkowego i znakowanego (na przykład znakowanego enzymatycznie) znacznikiem przeciwciała rozpoznającego mysią IgG, na przykład, w którym szalki do mikromiareczkowania pokrywa się koniugatem rapamycyna-białko (na przykład koniugatem immunogennym opisanym powyżej zawierającym białko połączone z rapamycyna lub 40-O-alkilowaną rapamycyną) wystawioną na działanie przeciwciała w obecności lub pod nieobecność badanego płynu, płucze się i przeciwciało połączone z koniugatem rapamycyny wykrywa się przez przyłączenie znacznika przeciwciała do przeciwciała związanego z koniugatem rapamycyny również, ilość związanego przeciwciała będzie odwrotnie proporcjonalna do ilości rapamycyny w próbce. W każdym przypadku test jest standaryzowany roztworami testowymi zawierającymi znane stężenia rapamycyny. Zatem, zestaw testowy zawiera (i) monoklonalne przeciwciało według wynalazku, korzystnie w postaci liofilizowanej lub pokrytej na szalce do mikromiareczkowania i (ii) ewentualnie również zawiera koniugat rapamycynowo białkowy, ewentualnie naniesiony na szalkę i/lub znakowaną pochodną rapamycyny oraz (iii) dalej ewentualnie zawiera roztwór

185 855 rapamycyny. w celu standaryzowania i instrukcję użytkowania. Taki zestaw może być stosowany do wykrywania rapamycyny w stężeniach poniżej 10 ng/ml na przykład poniżej 1 ng/ml na przykład zaledwie 0,25-0,5 mg/ml.

Przykład 1. Wytwarzanie 40-O-akty wowanej rapamycyny

a) Wytwarzanie 40-O-hemibursztynianu rapamycyny

Do mieszanego roztworu 1,5 g (1,64 mmola) rapamycyny i 0,577 g (5,77 mmola) bezwodnika bursztynowego w 12 ml pirydyny dodano 195 mg (1,64 mmola) DMAP. Otrzymaną mieszaninę mieszano w temperaturze otoczenia przez 19 godzin i zatężono pod obniżonym ciśnieniem. Pozostałość rozpuszczono w octanie etylu i trzykrotnie przemyto wodą. Roztwór organiczny osuszono nad bezwodnym siarczanem sodu, przesączono i zatężono pod obniżonym ciśnieniem. Pozostałość oczyszczono za pomocą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym stosując 9:1 CH₂C1₂ -MeOH. Frakcje zawierające oczekiwany produkt połączono i ponownie oczyszczono za pomocą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym stosując 19:1 CH₂C1₂ - MeOH, do otrzymania po usunięciu rozpuszczalnika pod obniżonym ciśnieniem, 40-O-(3-karboksu)propanoilorapamycyny (hemibursztynian rapamycyny o wzorze 2') w postaci białej piany wykazującej następujące charakterystyczne własności spektroskopowe:

Ή NMR (CDC1₃) δ 2,68 (7H, m, H33, H25 i O,CCH,CH,CO,H), 3,14 (3H, s i m, OCH₃i H39), 3,34 (3H, s, OCH₃), 3,38 (3H, s, OCH₃), 4,68 (1H, m, H4Ó), 4,72 (1H szeroki s, 10-OH); MS (FAB) m/z 1036 ([M+Na]^T), 982 ([M-CH30]⁺), 964 ([M-CH3O+H,O)]⁺), 946 ([M-(CH₃O)+2H,O)]’). '

b) Wytwarzanie 40-O-sukcynimidooksysukcynylo-rapamycyny

Do mieszanego roztworu 120 mg (0,118 mmola) hemibursztynianu rapamycyny z etapu a), 16,5 μΐ (0,118 mmola) Et₃N i 22,7 mg (0,118 mmola) EDC w 8 ml CH₂C1₂ dodano 13,6 mg (0,118 mmola) N-hydroksysukcynoimidu. Otrzymaną mieszaninę mieszano przez 18 godzin w temperaturze pokojowej, następnie rozcieńczono octanem etylu i dwukrotnie przemyto wodą. Roztwór organiczny osuszono nad bezwodnym siarczanem sodu, przesączono i zatężono pod obniżonym ciśnieniem. Pozostałość oczyszczono za pomocą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (octan etylu) otrzymując 40-O-sukcynimidooksysukcynylo rapamycynę (tj. związek o wzorze 3' według schematu 2, powyżej) w postaci białej piany mającej następujące charakterystyczne własności spektroskopowe:

Ή NMR (DMSO) δ 2,67 (2H, t, O₂CCH₂CH₂CO₂), 2,81 (7H, s, CH₃O i CH₂ sukcynamidu), 2,92 (2H, t, O^CCH^CH^CO,), 4,55 (1H, m, H40), 5,26 (1H, d, 28-OH), 6,43 (1H, s, 10-OH); MS (FAB) m/z 1'133 ((M+Na]⁺), 1111 ([M+H]⁺), 1092 ([M-H,O]), 1079 ([M-CH₃O]·), 1061 ([M-CH₃O+H₂O)D ,1043 ([M-(CH₃O)+2H₂O)]⁺).

Przykład 2. Wytwarzanie 28-O-aktywowanej 40-O-pochodnej rapamycyny

a) 28-O-hemibursztynian 40-O-(2-hydroksyetylo)-rapamycyny Do mieszanego, ochłodzonego (0°C) roztworu 958 mg (1, 00 mmola) 40-O-(2-hydroksyetylo)-rapamycyny w 2,2 ml 10:1 chlorku metylenu-pirydyny dodano 0,160 ml (1,50 mmola) chloromrówczanu allilu. Mieszanie kontynuowano w temperaturze 0°C i dwie porcje, każda po 0,080 ml (1,00 mmola) pirydyny i 0,053 ml (0,50 mmola) chloromrówczanu allilu dodano po 3 godzinach i 4 godzinach odpowiednio. Po ostatnim dodaniu reagentów mieszanie kontynuowano przez 1 godzinę dłużej i reakcję przerwano przez zalanie IN wodnym wodorowęglanem sodu. Otrzymaną mieszaninę wyekstrahowano trzykrotnie octanem etylu. Roztwór organiczny przemyto kolejno IN wodnym kwasem solnym, IN wodnym wodorosiarczanem sodu i nasyconą solanką następnie osuszono nad bezwodnym siarczanem sodu, przesączono i zatężono pod obniżonym ciśnieniem. Pozostałość oczyszczono za pomocą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (50:50 heksan-octan etylu) otrzymując związek chroniony alliloksykarbonylem (wzór 2 na schemacie reakcji 3) w postaci białej pianki.

Do mieszanego, ochłodzonego (0°C) roztworu 208 mg (0,200 mmoli) tego produktu w 2 ml chlorku metylenu dodano 24 mg roztwór 63 mg (0,400 mmola) bursztynianu monoallilu w 0.5 ml chlorku metylenu. Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze 0°C przez 14 godzin a otrzymaną zawiesinę przesączono przez lejek ze szkła spiekanego. Roztwór organiczny zatęzono pod obniżonym ciśnieniem i pozostałość oczyszczono za pomocą

185 855 chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (30:70 heksan - octan etylu) otrzymując produkt (wzór 3 na schemacie reakcji 3) w postaci białej pianki.

Do mieszanego roztworu 177 mg (0,150 mmola) tego produktu w 5 ml chlorku metylenu dodano 17,3 mg (0,015 mmola) tetrakis(trifenylofosfino)palladu i 0,080 ml (0,3 mmola) wodorku tributylocyny. Żółty roztwór mieszano przez 2 godziny w temperaturze otoczenia i rozcieńczono octanem etylu, przemyto raz zimnym 2N wodnym kwasem cytrynowym i trzykrotnie nasyconą solanką, osuszono nad bezwodnym siarczanem sodu, przesączono i zatężono pod obniżonym ciśnieniem. Chromatografia kolumnowa na żelu krzemionkowym (85:15 octan etylu-metanol) dała hemibursztynian (wzór 4 na schemacie 3) w postaci blado żółtego oleju.

b) 28-O-sukcynimidooksysukcynyl 40-O-(2-hydroksyetylo)-rapamycyny

Roztwór 53 mg (0,050 mmola) hemibursztynianu z etapu a) w 2,5 ml chlorku metylenu zadano 2 mg DMAP, 24 mg (0,125 mmola) EDC i 14 mg (0,125 mmola) N-hydroksysukcynimidu. Po 2 godzinach mieszania w temperaturze otoczenia mieszaninę reakcyjną zalano IN wodnym wodorowęglanem sodu. Mieszaninę wyekstrahowano trzema porcjami octanu etylu. Roztwór organiczny przemyto wodnym wodorowęglanem i solanką osuszono nad bezwodnym wodorodowęglanem sodu, przesączono i zatężono otrzymując tytułowy aktywowany hapten (związek o wzorze 5 na schemacie reakcji 3), który stosowano do sporządzenia koniugatu białko-hapten bez dalszego oczyszczania i który miał następujące charakterystyczne własności spektroskopowe:

Ή NMR (CDClj) δ 2,43 (1H, dd, H33a), 2,50-2,98 (10H, m, H25, H33b, wodory bursztynianowe, wodory sukcynimidowe), 3,58 (2H, m, H6b, 1H hydroksyetylu), 3,68 (3H, m, H16, 2H hydroksyetylu), 3,93 (1H, d, H27), 5,28 (2H, m, H2, H30), 5,34 (1H, d, H28); MS(FAB)1161([M+Li]^Ł).

Przykład 3. Wytwarzanie 28-O-aktywowanej rapamycyny

a) 28-O-hemibursztynian rapamycyny

Do mieszanego, ochłodzonego roztworu (0°C) roztworu 914 mg (1,00 mmola) rapamycyny w 2,2 ml 10:1 chlorku metylenu - pirydyny dodano 0,212 ml (2,00 mmola) chloromrówczanu allilu. Po 3 godzinach dodano 0,080 ml (1,000 mmola) pirydyny i 0,053 ml (0,50 mmola) chloromrówczanu allilu. Mieszanie kontynuowano przez 1 godzinę dłużej i reakcję przerwano zalewając Im wodnym wodorowęglanem sodu. Otrzymaną mieszaninę wyekstrahowano trzykrotnie eterem metylowo t-butylowym. Roztwór organiczny przemyto kolejno zimnym IN wodnym kwasem solnym, IN wodnym wodorowęglanem sodu i nasyconą solanką po czym osuszono nad bezwodnym siarczanem sodu, przesączono i zatężono pod obniżonym ciśnieniem. Pozostałość oczyszczono za pomocą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (70:30 heksan-octan etylu) otrzymując związek chroniony alliloksykarbonylem (wzór 2 na schemacie reakcji 4) w postaci białej piany.

Do mieszanego, ochłodzonego (0°C) roztworu 400 mg (0,400 mmola) tego produktu w 5 ml chlorku metylenu dodano 4, 8 mg (0,040 mmola) DMAP i 164 mg (0,800 mmola) DCC, a następnie roztwór 127 mg (0,800 mmola) bursztynianu monoallilu w 1 ml chlorku metylenu. Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze -15°C przez 14 godzin i otrzymaną zawiesinę przesączono przez lejek ze spiekanego szkła. Roztwór organiczny zatężono pod obniżonym ciśnieniem i pozostałość oczyszczono za pomocą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (40:60 heksan-eter metylowo t-butylowy) otrzymując związek o wzorze 3 ze schematu 4 a postaci białej piany.

Do mieszanego roztworu 285 mg (0,250 mmola) tego produktu w 5 ml chlorku metylenu dodano 28,8 mg (0,025 mmola) tetrakis(trifenylofosfino)palladu i 0,133 ml (0,5 mmola) wodorku tributylocyny. Żółty roztwór mieszano przez 1 godzinę w temperaturze otoczenia i rozcieńczono eterem metylowo t-butylowym, przemyto dwukrotnie zimnym 2N wodnym kwasem cytrynowym i trzykrotnie nasyconą solanką osuszono nad bezwodnym siarczanem sodu, przesączono i zatężono pod obniżonym ciśnieniem. Po kolumnowej chromatografii na żelu krzemionkowym (90:10-60:40 eter metylowo t-butylowy -metanol) uzyskano 28-O-hemibursztynian rapamycyny (związek o wzorze 4 ze schematu 4) w postaci blado żółtego oleju.

b) 28-)-sukcynimidooksysukcynylo-rapamycyna

185 855

Roztwór 51 mg (0,050 mmola) produktu z etapu a) w 2 ml chlorku metylenu zadano 2 mg DMAP, 24 mg (0,125 mmola) EDC i 14 mg (0,125 mmola) N-hydroksysukcynimidu. Po 4 godzinach mieszania w temperaturze otoczenia reakcję przerwano przez zalanie IN wodnym wodorowęglanem sodu. Mieszaninę wyekstrahowano trzema porcjami eteru metylowo t-butylowego. Roztwór organiczny przemyto wodnym wodorowęglanem sodu i solanką, osuszono nad bezwodnym wodorowęglanem sodu, przesączono i zatężono otrzymując aktywowany związek tytułowy, który jest stosowany do wytwarzania koniugatu białko-hapten bez dalszego oczyszczania i który wykazuje następujące charakterystyczne własności spektroskopowe:

Ή NMR (CDClj) δ 2,43 (1H, dd, H33a), 2,55-3,02 (11H, m, H25, H33b, H39, wodory bursztynianu, wodory sukcynimidu), 3,56 (1H, m, H6b), 3,68 (1H, dd, H16), 3,83 (1H, m, H14), 3,93 (1H, d, H27), 5,28 (2H, m, H2, H30), 5,34 (1H, d, H28); MS (FAB)

Przykład 4. Wytwarzanie koniugatów immunogennych

a) Koniugaty rapamycyny związanej w pozycji 40-0

17,4 mg 40-O-aktywowanej rapamycyny z przykładu 1 rozpuszczono w 400 μΐ DMF lub DMSO. 120 μΐ tego roztworu (tj. zawierającego 5,22 mg aktywowanej rapamycyny) wkroplono przy energicznym mieszaniu do roztworu zawierającego 8 mg KLH w 2 ml 0,1 m buforu NaHCO₃ (pH 7,7). Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 2 godziny w temperaturze pokojowej i otrzymany koniugat rapamycyna-KLH oczyszczono za pomocą dializy w temperaturze 4°C wobec 5 1 PBS 3x w ciągu 48 godzin. Koniugat ewentualnie dalej zatężono przez wirowanie przy użyciu mikroprobówek do urządzenia zatężającego. W ten sam sposób sporządzono koniugaty rapamycyna-BSA i rapamycyna-OVA zastępując w powyższym postępowaniu KLH odpowiednio przez BSA lub OVA.

b) Koniugaty 28-O-połączonej (ewentualnie 40-O-alkilowanej) rapamycyny mg 28-O-aktywowanego związku z przykładu 2 rozpuszczono w 2 ml DMSO i wkroplono podczas energicznego mieszania do roztworu zawierającego 5 mg KLH w 1 ml 50 mmolowego buforu fosforanowego (pH 7,3). Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 2 godziny w temperaturze pokojowej i otrzymany koniugat oczyszczono za pomocą dializy w temperaturze 4°C wobec 5 1 PBS 3x w ciągu 48 godzin. W ten sam sposób sporządzono koniugaty z BSA i OVA. Rapamycyna koniugowana jest z KLH, BSA i OVA poprzez pozycję, 28 przy użyciu 28-0-aktywowanego związku z przykładu 3, stosując takie samo postępowanie.

Przykład 5.

Wytwarzanie monoklonalnego przeciwciała

a) monoklonalne przeciwciało skierowane przeciwko rapamycynie.

Wyprodukowano monoklonalne przeciwciało stosując tradycyjne techniki, zasadniczo jak opisane przez Koehlera i Milsteina w Naturę, 256:49. Każda z samic myszy Balb/C (20-25 g) otrzymała 10 lub 50 pg immunogennego koniugatu z przykładu 4a), 40-Ó-związanej rapamycyny - KLH w 0,2 ml kompletnego adjuwanta Freunda, podanego przez iniekcję podskórną w czterech miejscach. Po 2 tygodniach wykonano drugą wzmacniającą iniekcję dawki zawierającej taką samą ilość immunogennego koniugatu zemulgowanego w 0,2 ml niekompletnego adjuwanta Freunda, ponownie przez iniekcję podskórną. Obecność reaktywnych przeciwciał przeciwko antygenowi w osoczu krwi zwierząt została potwierdzona przez bezpośredni ELISA jak opisano w przykładzie 6 poniżej. Myszy mogły być dalej dobierane pod względem przeciwciał dla regionu efektorowego (niska reaktywność krzyżowa z K-506) i dla domeny wiążącej białko wiążące takrolimus (FK-506) (wysoka reaktywność krzyżowa z takrolimus (FK-506)). Fig. 1, na przykład, przedstawia krzywe miareczkowania dla myszy (Ml) mającej wysoki poziom przeciwciał o domenie wiązania rapamycyny i innej myszy (M7) mającej stosunkowo wysokie poziomy przeciwciał o domenie efektorowej. Myszy wykazujące w osoczu krwi maksymalne poziomy przeciwciał o odpowiedniej specyficzności otrzymały uzupełniającą iniekcję zawierającą 10 pg antygenu, połowę dootrzewnowo, połowę dożylnie dnia 3 oraz dootrzewnowe dnia 2 i 1. Dnia 0 myszy uśmiercono i komórki ich śledziony wyodrębniono i poddano fuzji z komórkami PAI-0. Otrzymane komórki hybrydomy hodowano i wyselekcjonowano stosując ELISA do ekspresji przeciwciała mającego wysokie powinowactwo wiązania z 40-O-(2-hydroksyety lo)-rapamy cy ną.

185 855

Przykład 6. Enzymatyczny test immunosorbcyjny (ELISA) a) ELISA rapamycyny

Szalki do mikromiareczkowania powleczono 1-2 pg/ml koniugatu rapamycyna-BSA w PBS na 2 godziny w temperaturze 37°C, następnie nasycano 2% BSA w PBS przez 1 godzinę w temperaturze 37°C i przemyto 3x 0,05% Tween-PBS. Supematanty z hybrydomy do skriningu rozcieńczono 1% roztworem BSA w PBS i inkubowano przez noc w temperaturze pokojowej (lub 18 godzin w temperaturze 4°C lub 2 godziny w temperaturze 37°C). Poziom związanego przeciwciała mierzono kozią globuliną przeciwko mysiej IgG sprzężoną z alkaliczną fosfatazą z para-nitrofenylodosforanem jako substratem. Po inkubowaniu przez dwie godziny w temperaturze 37°C substrat enzymatyczny hydrolizowano (i godzinę w temperaturze pokojowej) i zmierzono absorbancję przy 405 nm. Wyselekcjonowano komórki hybrydomy do produkcji monoklonalnego przeciwciała o wysokim powinowactwie.

Sporządzono krzywe wzorcowe w celu oznaczania względnego powinowactwa wybranego przeciwciała wobec rapamycyny, stosując roztwory zawierające znane stężenia rapamycyny (na przykład 1 do 140 ng/ml w osoczu krwi). Fig. 2, na przykład, pokazuje krzywą standardową dla naszego monoklonalnego przeciwciała M7- 91, wykazując, że to monoklonalne przeciwciało, które jest wyselekcjonowane jako wysoce specyficzne wobec rapamycyny, jest zdolne do wykrywania rapamycyny w stężeniach wynoszących zaledwie 0,25 ng/ml.

Przeciwciała mogą być dalej charakteryzowane przez wiązanie się z domenami efektorowymi rapamycyny lub wiążącymi białko wiążące takrolimus (FK-506) za pomocą pomiaru reaktywności krzyżowej z takrolimus (FK-506) w analogicznym bezpośrednim ELISA stosując szalki do mikromiareczkowania pokryte koniugatem takrolimus (FK-506)-BSA, który może być sporządzony analogicznie jak koniugat rapamycyna-BSA. Na przykład, porównanie poziomów wiązania 17 wyselekcjonowanych przeciwciał monoklonalnych w testach rapamycyna-BSA i takrolimus (FK-506) przedstawiono na fig. 3; reaktywność krzyżową w % pokazano na fig. 4. W tym porównaniu wiązania z rapamycyna-BSA w stosunku do wiązania z takrolimus (FK-506)-BSA, wykryto monoklonalne przeciwciała o bardzo niskim powinowactwie.

Powyższy bezpośredni ELISA może być przekształcony w test kompetycyjny ELISA, w którym do roztworu monoklonalnego przeciwciała dodaje się związek współzawodniczący o miejsce wiązące i mierzy się wiązanie monoklonalnego przeciwciała z koniugatem w obecności i pod nieobecność związku współzawodniczącego. Gdzie związkiem współzawodniczącym jest takrolimus (FK-506) lub rapamycyna, związek współzawodniczący w roztworze etanolowym na przykład 1 mg/ml dodaje się bezpośrednio do roztworu monoklonalnego przeciwciała (na przykład 2 μ1/200 μΐ/wgłębienie) i dalej rozcieńcza na szalce do mikromiareczkowania. Fig. 5, na przykład, pokazuje krzywą hamowania wiązania przeciwciała M7-91 (M7.91.13) z BSA-rapamycyną w obecności różnych stężeń wolnej rapamycyny. W takich kompetycyjnych testach ELISA porównanie wiązania monoklonalnych przeciwciał z wolnym takrolimus (FK-506) względem wiązania z wolną rapamycyna, widoczna jest mniejsza reaktywność krzyżowa pomiędzy rapamycyna a takrolimus (FK-506) niż w bezpośrednim ELISA. Taki kompetycyjny test jest wskazany do selekcji monoklonalnych przeciwciał, ponieważ przypuszcza się, że niektóre monoklonalne przeciwciała mogą mieć zbyt niskie powinowactwo wiązania z ich antygenem w postaci wolnej w roztworze, ale tym niemniej mogą wykazać dwuwartościowe łub wielowartościowe wiązanie z multimerycznym antygenem, który zawiera wiele haptenów związanych bardzo blisko jeden obok drugiego na dużej cząsteczce białka. Test kompetycyjny wyklucza takie przeciwciała o niskim powinowactwie. Wyniki takiego kompetycyjnego testu pokazano na fig. 6, na której porównano przeciwciało M7-91 (M7.91.13), które ma stosunkowo niską reaktywność krzyżową z przeciwciałem Ml-303 (Ml.303.3) mającym stosunkowo wysoką reaktywność krzyżową.

b) ELISA 40-O-(2-hydroksyetylo)-rapamycyny

Ten ELISA przeprowadzono analogicznie do postępowania opisanego w punkcie a). Szalki do mikromiareczkowania pokryto 40-O-(2-hydroksyetylo)-rapamycyną-BSA, nasycono BSA i przemyto. Supematanty komórek hybrydoma do skriningu inkubowano przez 18 godzin w temperaturze 4°C lub 2 godziny w temperaturze 37°C. Poziom związanego przeciwciała mierzono

185 855 za pomocą globuliny koziej przeciwko-mysiej IgG sprzężonej z alkaliczną fosfatazą z para-nitrofenylofosforanem jako substratem. Przeprowadzono równoległy ELISA stosując związaną rapamycynę-BSA dla wyselekcjonowania monoklonalnych przeciwciał zdolnych do odróżnienia 40-O-(2-hydroksyetylo)-rapamycyny od rapamycyny. Fig. 7 pokazuje, na przykład, supematanty komórek hybrydoma B3-203 wiążące selektywnie 40-O-(2-hydroksyetylo)-rapamycynę-BSA (oznaczona na fig. jako BSA-28-RAD) (fig. 7a), komórek hybrydomy B3-113 rozpoznających zarówno 40-O-(2-hydroksyetylo)-rapamycynę-BSA jak i rapamycynę-BSA sprzężone poprzez pozycję 28 (fig. 7B) i hybrydomy B3-164, które rozpoznają dodatkowo rapamycynę sprzężoną z BSA poprzez pozycję 40 (fig. 7C).

Względne powinowactwo przeciwciał przeciwko 40-O-(2-hydroksyetylo)-rapamycynie względem rapamycyny jest dalej mierzone przez wiązanie kompetycyjne przeciwciał z opłaszczonym koniugatem 40-O-(2-hydroksyetylo)-rapamycyny-BSA, z 40-O-(2-hydroksyetylo)-rapamycyną lub wolną rapamycyną w roztworze. Fig. 8 przedstawia na przykład, że przeciwciała produkowane przez komórki hybrydomy B3-203 silnie reagują z 40-O-(2-hydroksyetylo)-rapamycyną przy niskiej reaktywności krzyżowej z rapamycyną (fig. 8A) i że przeciwciała produkowane przez komórki hybrydomy B3-113 i B3-164 wiążą się równie dobrze z 40-O-(2-hydroksyetylo)-rapamycyną jak i rapamycyną (fig. 8B i 8C). Komórki innych hybrydom produkujące przeciwciała wiążące się przynajmniej 10-100 razy lepiej z 40-0-(2-hydroksyetylo)rapamycyną niż z rapamycyną obejmują B3-22, B3-127 i B3-156. Inne hybrydomy takie jak B3-29, B3-265 i B3-539 produkują przeciwciała, które wiążą się z rapamycyną równie dobrze jak z 40-O-(2-hydroksyetylo)-rapamycyną.

Po wybraniu odpowiedniego przeciwciała, ten sam test ELISA jest stosowany do określania poziomów rapamycyny we krwi pacjentów. Zestaw testowy zgodnie z niniejszym przykładem dostarcza jednego lub więcej wybranego przeciwciała w postaci zliofilizowanej, szalkę mikrotitracyjną powlekaną koniugatem rapamycyny (np. koniugat rapamycyna-BSA lub koniugat 40-O-(2-hydroksyetylo)-rapamycyna-BSA), wzorzec rapamycyny i instrukcję użycia. Ewentualnie zestaw może również zawierać znakowaną pochodną rapamycyny do stosowania w teście kompetycyjnym. Koniugat anty-mysia IgG-enzym, a substrat jak opisano powyżej może dodatkowo być włączony do zestawu. W innym rozwiązaniu, użytkownik może używać przeciwciało monoklonalne według wynalazku w swoim własnym teście ELISA lub innym układzie testowym.

185 855

WZÓR B

185 855

SCHEMAT 1 (cd.)

185 855

SCHEMAT 2 (cd.)

185 855

Ο X

185 855

SCHEMAT 3 (cd.)

185 855

Ο

X

185 855

FIG. 1

MIANO MYSZY Ml (RAPA/FK) KONJUGAT Z OVA

MIANO MYSZY M7 (RAPA/FK) KONJUGAT Z KLH

185 855

FIG. 2

185 855

FIG. 3

SKRINING MONOKLONALNYCH PRZECIWCIAŁ RAPA RAPA/FK 506 ELISA

M7-350

M7-301

M7-91 M7-441 M7-101 M7-194

M7-9 M7-280 M7-392

M7-50 M7-456 M7-432 M1-309 M1-106 M1-207

H-155

MYB-141

0,5 1 1,5 2 2,5 3

HM RAPA-BSA

FK-BSA

185 855

FIG. 4

SKRINING MONOKLONALNYCH PRZECIWCIAŁ RAPA RAPA/FK 506 ELISA

M7-350 M7-301

M7-91 M7-441 M7-101 M7-194

M7-9 M7-280 M7-392

M7-50 M7-456 M7-432 M1-309 M1-106 M1-207

H-155 MYB-141

0% 25% 50% 75% 100%

SM RAPA-BSA

FK-BSA

185 855

ABSORBANCJA

[RAPAMYCYNA] /ig/ml

185 855

FIG. 6

Specyficzność mAbs wobec Rapamycyny dla Rapamycyny v^z w stosunku FK 506 (Δ) w konkurencyjnym FLISA.

MAb M7.91.13

0,001 0,01 0,1 1,0 10,0

[LEKI] /ig/ml

MAb Ml.303.3

0,8 _Ί

0,001 0,01 0,1 1,0 10,0

[LEKI] pg/ml

185 855 ◄ ο Z «I ο al ο <η η

FIG. 7

BSA-28-RAD BSA-40-RAPA

KONJUGATY BSA ZASTOSOWANE DO POWLEKANIA

Z

O tó O tn Q

BSA

BSA-28-RAPA

BSA-28-RAD

BSA-40-RAPA

KONJUGATY BSA ZASTOSOWANE DO POWLEKANIA

o Z

BSA

BSA-28-RAPA

BSA-28-RAD

BSA-40-RAPA

KONJUGATY BSA ZASTOSOWANE DO POWLEKANIA

185 855

INHIBICJA ELISA (%

FIG. 8

STĘŻENIE INHIBITORA (log 10 g/ml)

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz. Cena 6,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Monoklonalne przeciwciało skierowane przeciwko rapamycynie o wzorze 1, przedstawionym na schemacie 2, znamienne tym, że jest zdolne do rozpoznawania epitopu na domenie rapamycyny wiążącej białko wiążące takrolimus (FK-506) i ma immunologiczną reaktywność krzyżową z takrolimus (FK-506) powyżej 50%.
2. Monoklonalne przeciwciało według zastrz. 1, znamienne tym, że jest produktem otrzymanym przez wykorzystanie koniugatu aktywowanej pochodnej rapamycyny z immunogennym białkiem.
3. Monoklonalne przeciwciało według zastrz. 2 znamienne tym, że jest produktem otrzymanym przez:

a) reakcję związku rapamycyny wybranego z rapamycyny i 40-O-(2-hydroksyetylo)rapamycyny, mającej aktywowaną grupę sprzęgającą z immunogennym białkiem dla wytworzenia immunogennego koniugatu,

b) podanie tego koniugatu odpowiedniemu gatunkowi zwierzęcia powodując prowokację immunogennąi uzyskanie komórek produkujących przeciwciała uwrażliwione na te koniugaty, c) unieśmiertelnienie wymienionych komórek produkujących przeciwciała oraz

d) uzyskanie monoklonalnego przeciwciała, z otrzymanej wyselekcjonowanej, unieśmiertelnionej linii komórkowej.
4. Monoklonalne przeciwciało według zastrzeżenia 3, znamienne tym, że immunogenny koniugat jest produktem reakcji 40-O-sukcynimidooksysykcynylo-rapamycyny, 28-O-sukcynimidooksysukcynylo-rapamycyny, lub 28-O-(sukcynimidooksysukcynylo)-40-O-(2-hydroksyetylo)-rapamycyny z immunogennym białkiem.
5. Monoklonalne przeciwciało skierowane przeciw rapamycynie o wzorze 1, przedstawionym na schemacie 2, znamienne tym, że jest zdolne do rozpoznawania epitopu na efektorowej domenie rapamycyny i ma immunologiczną reaktywność krzyżową z takrolimus (FK-506) poniżej 20%.
6. Monoklonalne przeciwciało według zastrz. 5, znamienne tym, że jest produktem otrzymanym przez wykorzystanie koniugatu aktywowanej pochodnej rapamycyny z immunogennym białkiem.
7. Monoklonalne przeciwciało według zastrz. 6, znamienne tym, że jest produktem otrzymanym przez:

a) reakcję związku rapamycyny wybranego z rapamycyny i 40-O-(2-hydroksyetylo)rapamycyny, mającej aktywowaną grupę sprzęgającą z immunogennym białkiem dla wytworzenia immunogennego koniugatu,

b) podanie tego koniugatu odpowiedniemu gatunkowi zwierzęcia powodując prowokację immunogenną i uzyskanie komórek produkujących przeciwciała uwrażliwione na te koniugaty,

c) unieśmiertelnienie wymienionych komórek produkujących przeciwciała oraz

d) uzyskanie monoklonalnego przeciwciała, z otrzymanej wyselekcjonowanej, unieśmiertelnionej linii komórkowej.
8. Monoklonalne przeciwciało według zastrzeżenia 7, znamienne tym, że immunogenny koniugat jest produktem reakcji 40-O-sukcynimidooksysykcynylo-rapamycyny, 28-O-sukcynimidooksysukcynylo-rapamycyny, lub 28-Ó-(sukcynimidooksysukcynylo)-40-O-(2-hydroksyetylo)-rapamycyny z immunogennym białkiem.
9. Monoklonalne przeciwciało skierowane przeciwko 40-O-(2-hydroksyetylo)-rapamycynie, znamienne tym, że jest produktem otrzymanym przez wykorzystanie koniugatu 28-O-aktywowanej rapamycyny z immunogennym białkiem, mające reaktywność krzyżową z rapamycyną poniżej 10%.

185 855
10. Monoklonalne przeciwciało według zastrz. 9, znamienne tym, że jest produktem otrzymanym przez:

a) reakcję związku rapamycyny wybranego z rapamycyny i 40-O-(2-hydroksyetylo)rapamycyny, mającej aktywowaną grupę sprzęgającą z immunogennym białkiem dla wytworzenia immunogennego koniugatu,

b) podanie tego koniugatu odpowiedniemu gatunkowi zwierzęcia wywołując powodując prowokację immunogenną i uzyskanie komórek produkujących przeciwciała uwrażliwione na te koniugaty,

c) unieśmiertelnienie wymienionych komórek produkujących przeciwciała oraz

d) uzyskanie monoklonalnego przeciwciała, z otrzymanej wyselekcjonowanej, unieśmiertelnionej linii komórkowej.
11. Monoklonalne przeciwciało według zastrzeżenia 10, znamienne tym, że immunogenny koniugat jest produktem reakcji 40-O-sukcynimidooksysykcynylo-rapamycyny, 28-0-sukcynimidooksysukcynylo-rapamycyny, lub 28-O-(sukcynimidooksysukcynylo)-40-O-(2-hydroksyetyloj-rapamycyny z immunogennym białkiem.
12. Zestaw do testów immunologicznych do pomiaru poziomu rapamycyny lub 40-0-(2-hydroksyetylo)-rapamycyny we krwi, znamienny tym, ze zawiera monoklonalne przeciwciało skierowane przeciw rapamycynie o wzorze 1, przedstawionym na schemacie 2, zdolne do rozpoznawania epitopu na domenie rapamycyny wiążącej białko wiążące takrolimus (FK-506) i ma reaktywność krzyżowo-immunologiczną z takrolimus (FK-506) powyżej 50%, lub monoklonalne przeciwciało skierowane przeciw rapamycynie o wzorze 1, przedstawionym na schemacie 2, zdolne do rozpoznawania epitopu na efektorowej domenie rapamycyny i ma immunologiczną reaktywność krzyżową z takrolimus (FK-506) poniżej 20%, lub monoklonalne przeciwciało skierowane przeciwko 40-O-(2-hydroksyetylo)-rapamycynie jest produktem otrzymanym przez wykorzystanie koniugatu 28-O-aktywowanej rapamycyny z immunogennym białkiem, o reaktywności krzyżowej z rapamycyną poniżej 10%.

* * *