JPH08510326A

JPH08510326A - 物質を検出する方法

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Publication number: JPH08510326A
Application number: JP6524717A
Authority: JP
Inventors: シュレーデラー，トーマス; フリッツ，ペーター・ゲラルド
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1993-05-12
Filing date: 1994-05-13
Publication date: 1996-10-29
Also published as: DE59403667D1; WO1994027154A1; ATA93693A; EP0698217A1; US5736320A; EP0698217B1; AT399054B; AU6716894A; ATE156592T1

Abstract

(57)【要約】必要に応じて塩基性触媒の存在下で、好ましくはプロトン性媒体中での、化学発光に基づく検出反応を用いて物質を検出する方法が記載される。すなわち、電子伝達によって、検出反応が発光性化合物をその基底状態から励起状態へと高め、その際、発光性化合物がその基底状態に戻るときに放射する放射線を測定する。場合により置換されたシュウ酸エステルまたはオキサミドの酸化的分解に基づく化学発光反応は、レドックス感受性発光性化合物を用いられ、その、発光性化合物が基底状態に戻るときに測定される放射線は、適用される反応の非特異的バックグラウンド放射線より長波長のものである。適用される反応の非特異的バックグラウンド放射線は、適切な波長選択ユニットによって基本的には完全に消化され、および／または、該発色性化合物は、該化学発光反応の実施に先立つ、さらなる化学もしくは酵素反応によって意図的に蓄積される。

Description

【発明の詳細な説明】物質を検出する方法本発明は、場合により塩基性触媒の存在下で、好ましくはプロトン性媒体中での化学発光に基づく検出反応を用いて物質を検出する方法であって、該検出反応に起因する電子伝達によって、発光性化合物（luminophore）がその非励起状態から励起状態へと高められ、次いで、該発光性化合物がその非励起状態に戻るときに放出する放射線を測定する方法に関する。過去２０年以内に、様々な物質の定性的および定量的検出のための複数の技術が開発された。特に、分子生物学はもとより免疫学的手法では、一方では最も低濃度の範囲で操作しなければならず、他方では、例えばＤＮＡやＲＮＡまたはその断片を検出するための様々な技術によくある放射性標識の使用を避けなければならないという問題が生じた。最新の方法の多くも、生体試料中の極めて低濃度（ピコ−、フェムト−およびアト−モルレベル）の物質を検出して、次いで測定に利用できる信号を生ぜしめることができない。最近、蛍光測定や分光光度測定、および放射性放射線の測定に代えて、化学発光法を用いることが提唱されている。そのような化学発光法によれば、化学反応に関係するエネルギーの代謝回転を測定に利用できるようになり、その際、特異的な化学的工程で形成される、例えばエネルギーに富む不安定な中間段階が直ちに再崩壊し、それによって放出されるエネルギーは、いわゆる発光性化合物または蛍光原によって、目視できかつ測定できる放射線へと変換される。こうして、例えば英国特許第１，４６１，８７７号明細書は、基質の検定方法であって、基質の反応を過酸化水素を生成するように触媒する特異的酵素と、適切な化学発光化合物とを体液試料に加える方法を記載している。そのような化学発光反応それ自体は、用いられる発光性化合物を、開裂しようとする基質に、例えば酵素によって結合させ、こうしてそれを不活性化する（この不活性な基質−発光性化合物複合体は、一般に、蛍光原と呼ばれる）ことによって生化学反応と結合させてもよく、この特別な場合には、そうして酵素の作用によって放出された発光性化合物の量が、試料中に存在する酵素の量の尺度となる。酵素に固有の触媒活性のため、これは一種の「酵素性増幅」を伴い、それは、試料中に存在する酵素の量の倍数であり、温置時間はもとより特異的酵素活性にも対応する発光性化合物の放出量で表される。ここおよび以下に用いられる用語「酵素」は、生物学的触媒効果を示すすべての物質、特に抗原、抗体はもとより核酸分子をも含むものとする。 Irena Bronsteinらによる出版物［Chemiluminescent Compounds for Diagnost ic Tests」、Research、Vol.28、January 1990，pp．36〜39］では、修飾された１，２−ジオキセタンが、加水分解で陰イオンを生じ、その後更に分解されて発光を招く蛍光原として用いられる化学発光系が提唱されている。そのような直接的化学発光誘導体は、容易に破壊されて、蛍光原の２生成物への分解を誘発する「弱い」酸素／酸素結合を含み、形成された両生成物は、強い、新たに形成されたカルボニル基を有する。これらのカルボニル基のうち一つは、初めは電子的に励起された状態にあって、その正常な基底状態に復帰するときに、約４２０KJ／モルのエネルギーを放出し、その一部は光の形態で放出する。このようにして、強い化学発光の信号が生成される。用いられる化合物は、ルミネセンスに適切であり、それぞれ励起の際に蛍光や燐光を発することができる。しかし、記載され、そこに用いられた蛍光原は、スピロアダマンチル核、アリール基（ジオキセタンの断片化の際にそれから光が放出される）からなる安定化部分及び、化学発光反応が発生する前に、直接または間接的に測定しようとする適切な酵素によって開裂されなければならない、酵素に不安定な保護官能をはじめとする異なる置換基を必要とする。こうして、蛍光原の蛍光を示す部分は、化学発光反応の際に破壊される。その結果、測定周期は、蛍光原１モルについて１回のみ経過できるにすぎない。一般に、化学発光は、例えば英国特許公開第２２３３４５０号明細書に記載されているとおり、検定しようとする化合物を異なる発光波長の発光性化合物でそれぞれ「標識する」多重分析に用いてもよい。化学発光を分析の問題に適用するには、ルミノール誘導体、アクリジニウム誘導体、フェナントリジニウム誘導体、生体ルシフェリン−ルシフェラーゼ系および安定ジオキセタンからなる物質群が、発光性化合物としての先導的役割を現在まで果たしている。通常、慣用のルミネセンス系は、アルカリまたはその他の触媒はもとより、その系によって放出されるエネルギーを測定可能な発光へと増進、安定化または移す他の化合物の存在を必要とする。こうして、英国特許公開第２２３３４５１号明細書は、発光する発蛍光団を水性媒体中で安定化させ、こうして、放射される光の強さを増大させるための水溶性増進物質の使用を記載している。しかしながら、更なる試薬を用いることによるこれらの反応の最適化は、追加する添加物が、用いた反応による許容できないまでに高いバックグラウンド放射線を同時に生じる結果となり、実際の信号を測定する際に問題を伴うことから、ほとんどのシステムでは技術的に困難であると判明している。ところが、添加物の量が少な過ぎる場合は、信号が減少する結果となる。抗原に結合させた化学発光供与体（Ａｇ−Ｌ）と抗体に結合させた蛍光受容体（Ａｋ−Ｆ）との間に生じるエネルギー伝達を検出法に用いることは、Campbell ら［Biochem．J．、216 pp.185-1941983］によっても示唆されたが、ここで、化学発光供与体結合抗原（Ａｇ−Ｌ）は、蛍光受容体結合抗体（Ａｋ−Ｆ）と結合する際に、測定しようとする未標識抗原（Ａｇ）と競合する。これを実施する際は、（Ａｇ−Ｌ）複合体とは異なる発光波長を有する複合体（Ｌ−ＡｇＡｋ−Ｆ）（あり得るエネルギー伝達に基づく）または複合体（ＡｇＡｋ−Ｆ）（このときエネルギー伝達は不可能である）のいずれかが形成される。そのため、放射強度の測定は、２種類の波長、すなわち（Ａｇ−Ｌ）複合体の発光波長と（Ｌ−ＡｇＡｋ−Ｆ）複合体との発光波長とで実施され、より良く信号を分離するために、それ自体も濃度特異的である互いに他方の信号を濾去して、実施する。その後、（測定しようとする）未標識抗原の量は、両信号の強度の比率の減少から得られるが、これは、測定しようとするものが微量である場合、最小限であるにすぎない。そのような「均一系の免疫検定」は競合系であるから、微量および最微量の物質を検出する際に直面する上記の問題に加え、例えば、用いようとする化学発光供与体に結合した抗原（Ａｇ−Ｌ）の、検出しようとする未標識抗原の量にほぼ相当するはずの量の測定に関して、著しい実際的な問題も随伴する。その実施にあたり、用いられる測定装置、例えば化学発光光度計も、２種類の波長での適切な検出器を備えていなければならない。この系の検出限度は、ほぼ１０^-16モル／１００μｌにある。さらに、一般式Ｒ¹Ｒ²（ＣＯＯ）₂のシュウ酸エステルを定量する方法がドイツ国特許公開第２８０，８２４号公報から公知であるが、ここでは、シュウ酸またはシュウ酸エステルを含有する試料溶液を、それぞれ、適切な酸化剤によってモノペルオキシシュウ酸へと転換し、活性化剤の存在下でのモノペルオキシシュウ酸の分解の結果、化学発光測定装置を用いて記録することができる光子の放射が生じる。本発明は、初めに定義した形式の方法であって、場合により置換されたシュウ酸エステル（Oxalates）またはオキサミドの酸化的分解に基づく化学発光反応において、非励起状態に戻る間に放射される、測定しようとするその放射線が、用いられる反応の非特異的バックグラウンド放射線より長波長のものであるレドックス感受性発光性化合物を用い、そして該反応の非特異的バックグラウンド放射線を適切な波長選択ユニットによって実質的に完全に消光し、および／または、該化学発光反応を実施する前に、該発光性化合物を追加の化学もしくは酵素反応によって意図的に蓄積する方法に関する。従来、上記の化学発光系は、プロトン性溶媒では溶解度が低く、ソルボリシスに対する耐性が不充分なために免疫学的手法にはほとんど利用できないことから、専らＨＰＬＣ用の化学発光検出器として興味が持たれていた。ＨＰＬＣ検出器として用いるときは、化学誘導電子交換ルミネセンス（ＣＩＥＥＬ）に基づくような系を用いて、既に低濃度である発光性化合物を検出できたが、それは、発光性化合物を添加しない酸化反応は、発光性化合物を添加した反応より数倍も弱い光を放射するからである。適切な波長選択ユニットに関して特殊な発光性化合物を用いる測定の本発明の組合せによって、発光性化合物の濃度に対する検出限度を数倍も高めることができる。一方、用いた化学発光の非特異的バックグラウンド放射線を消光する上記の方法と同時に用いる、化学発光反応の非特異的バックグラウンド放射線を上回る化学もしくは酵素的な反応による増幅によって、または代替策として、ペルオキシシュウ酸エステル系のエネルギーに富む中間段階を生じるのに必要な、場合により置換されたシュウ酸エステルを加える前に非励起発光性化合物を蓄積することによっても、検出しようとする信号を増大させることができ、これにより、検出しようとする信号の著しい「化学的増幅」が達成され、非特異的バックグラウンド放射線を消光する波長選択ユニットの使用もある程度まで不必要になる。本発明によれば、新規な溶媒系の利用が、場合により置換されたシュウ酸エステルまたはオキサミドの酸化的分解に基づく化学発光反応を、生物検定に従った検出反応として用いることが初めて可能になるが、それは、水溶液中での生化学反応が最初に生じ、その後、それ自体公知である適切な非プロトン性溶媒または溶媒系、例えばアセトニトリル中の必要な試薬を加えることによって、化学発光反応が実施されるからである。そのため、実際上無限に高い濃度まで水を用いることができるが、約５０％の水の濃度が特に好ましい。ペルオキシシュウ酸エステルの化学発光反応において、非励起状態に戻るときに放射される測定すべきその放射線が約５００nmより長い波長のものであるレドックス感受性発光性化合物を用いるならば、そしてまた約３５０〜５４０nmのバックグラウンド放射線を実質的に完全に消光する波長選択ユニットを用いるならば、それも好都合である。従来、ペルオキシシュウ酸エステルの化学発光反応は、場合により置換されたシュウ酸エステルまたはオキサミドの酸化的分解に基づくほとんどすべての化学発光反応の場合のように、非プロトン性媒体に限定されており、そのため、適切な技術分野での生物検定のための検出反応としてこの化学発光反応を用いることに対して、このことを理由として既に偏見が存在している。ペルオキシシュウ酸エステルの反応は、特に高い量子収率（０．４アインシュタイン／モル以上）を与える非常に強力な化学発光系であるが、この系は、上記に指摘した短所に加え、３５０〜５４０nmの範囲でのその強いバックグラウンド放射線のために、従来は生物検定、すなわち非常に僅かな量を検出することには適用されなかった。ところが、ペルオキシシュウ酸エステルの反応の使用は、用いた発光性化合物が破壊されず、そのため、１回より多くの励起周期を経過できるという利点を与える。したがって、（発光性化合物を基準として）２アインシュタインより多い量に達する量子収率が可能であると思われる。非励起状態に戻るときに放射される、測定しようとするその放射線が約５００nmより長い波長のものである発光性化合物を用い、同時に、適切な波長選択ユニットを用いて約３５０〜５４０nmでのバックグラウンド放射線を実質的に完全に消光するという、本発明に従って講じられる測定によって、検出波長でのバックグラウンド放射線は著しく削減されるか、または消光され、こうして、用いる発光性化合物に対する検出限度は大幅に高められる。理論的には、約５００nmより長波長の放射スペクトルを有するすべての化合物を発光性化合物として用いてよく、レゾルフィン塩（resorufinate）、テトラフェニルポルフィリン、ローダミン１２３、クロロフィルおよび／または（Ｚ，Ｚ）−１６，１７−ジフルオロボリル−１３−エチル−２，３，７，８，１２，１４−ヘキサメチル−１，１７−ジヒドロ−１５Ｈ−トリピリン−１−オンが特に好ましい。本発明による方法に適切な波長選択ユニットとしては、例えば遮光フィルター類、干渉フィルター類、格子類またはプリズム類がある。その上、ペルオキシシュウ酸エステルの化学発光反応に、非励起状態に戻るときに放射される測定しようとするその放射線が約５００nmより長い波長のものである、検出しようとする物質量の直接の影響下で適切な基質から放出されるレドックス感受性発光性化合物を、本発明による方法で用いるならば、好都合である。これによって、望まれるいかなる物質を検出するにも、本発明による非常に鋭敏な検出方法を用いることが可能となり、唯一の必要条件は、適切な基質を選び、ついで基質を発光性化合物と結合させ、こうしてそれを不活性化することである。検出反応の際は、検出しようとする物質の影響下で、発光性化合物のこの不活性化を解除し、こうしてそれを電子伝達による活性化に利用できるようにする。これに関して、検出しようとするある量の酵素の直接の影響下で活性化されるか、または基質から開裂される発光性化合物と基質とからなる蛍光原を用いるならば、特に好都合である。したがって、例えば、３０分の温置時間後の酵素について毎秒約１，０００回の代謝回転率では、酵素１モルあたり約１．８×１０⁶ モルの発光性化合物という数が既に存在し、こうして信号を著しく増強する。この温置時間の後には、ペルオキシシュウ酸エステルの反応がそこで開始され、生成された信号は直ちに測定される。そうする際は、温置時間の間に測定を実施する必要は全くなく、したがって、特に一連の検定を実施するときに、時間の著しい節減が可能になるのが特に好都合である。発光性化合物を、それぞれ、活性化するか、または遊離させるのに用いる酵素は、抗体、抗原または核酸プローブに直接もしくは間接的に結合していてよい。これに関して、述べなければならないのは、用語「間接的に結合している」とは、それぞれの物質が直接ではないが、例えばアフィニティークロマトグラフィーから知られるような、無機または有機のスペーサーを介して結合される、酵素と抗体、抗原または核酸プローブとの間のいかなる結合も表すことである。発光性化合物、および関係する発光性化合物／基質複合体を、それぞれ、活性化するか、または遊離させるための酵素に関しても、やはり、酵素特異的基質（発光性化合物に結合）と、それが関係する酵素複合体の既知のすべての組合せを考慮して、特に、アルカリ性ホスファターゼ、セイヨウワサビのペルオキシダーゼおよび／またはβ−ガラクトシダーゼを酵素に用いてよい。本発明のもう一つの好適な実施態様によれば、用いる発光性化合物を、検出しようとする物質量の間接的な影響下で、それぞれ、活性化するか、または適切な基質から放出させることが提供される。それによって、例えば血液凝固カスケードから知られるような、いわゆるカスケード様検定手法への、本発明による方法の利用が可能になり、直接的な反応によって達成できる信号の追加的な化学的および／または酵素的増幅が、適用されるカスケードのいかなる個別的段階でも実施可能になる。好ましくは、発光性化合物を遊離する酵素に結合した抗体または抗原に対する、検出しようとするある量の抗原または抗体の間接的な影響は、一つまたはいくつかのさらなる抗原−抗体反応を介して及ぼされる。その際は、得られる信号の増幅が達成されるばかりでなく、特に特異的な定量的検出も実施可能である。したがって、例えば、初めにウサギからの抗ＨＩＶ抗体を用い、次いで酵素と結合したヤギからの抗ウサギ抗体を用いて、ＨＩＶ抗原を検出することが可能であって、その後、酵素は、用いた発光性化合物−基質複合体から発光性化合物を遊離する。発光性化合物を遊離する酵素と結合した形の抗体または抗原に対する、検出すべきある量の抗原または抗体の間接的な影響が、その後それぞれの酵素に結合する少なくとも一つの更なる化合物に対する１個もしくは数個の特定の同定部位を備えた、１種類もしくは数種類の中間体物質を介して及ぼされるのも好都合である。この形式の系は、例えば、抗体に結合したビオチンとアビジンもしくはストレプトアビジン−酵素複合体を、または、一般的には、発光性化合物をそれぞれ活性化するかまたは遊離させるのに用いられる酵素をその一方に結合した、結合するもの同士のいかなる公知の組合せをも含む系となるであろう。言うまでもなく、逆の検出法を用いてもよく、盲検試料に関連する放射線の減少を消光剤の空間的存在によって測定するのである。本発明による方法は、特に、非常に効率的な系であるペルオキシシュウ酸エステルの化学発光反応を、検出しようとする基質の発光性化合物による直接的標識において、および化学発光が増幅される酵素免疫検定において用いることを可能にする。ソルボリシスに対する不充分な耐性および低い溶解度のために、ペルオキシシュウ酸エステルの反応がプロトン性媒体と融和し得ないことに関連して従来直面していた困難は、好ましくは約５０％の水からなる新規溶媒系の使用によって克服された。このように、用いた反応のバックグラウンド放射線より長波長で、特に約５００nmより長波長で発光する適切な発光性化合物を選び、同時に、適切な波長選択ユニットを用いることによって、酵素免疫検定における検出反応としてペルオキシシュウ酸エステルの反応を用いたときに、用いた発光性化合物および、結果的に、検出しようとする物質に対する検出限界の大幅な改良を達成することができる。下記の実施例は、本発明をより詳しく説明するものである。実施例１：量子収率の算出材料および方法試薬：（Ｚ，Ｚ）−１６，１７−ジフルオロボリル−１３−エチル−２，３，７，８，１２，１４−ヘキサメチル−１，１７−ジヒドロ−１５Ｈ−トリピリン−１− オン（ＧＲ１３２）を、リンツ大学有機化学研究所のGrubmayr助教授から入手した。発泡させた過酸化尿素は、Organon Teknika社のＨＩＶ抗体検定から得た。ビス（２，４−ジニトロフェニル）オキザラート（ＤＮＰＯ）は、グラーツのLa mbda Probes社から入手した。酢酸エチルおよび水は、分光学的に純粋であり、ドイツ国ダルムシュタットのメルク社から入手した。ルミネセンスは、HoyaＦＬ赤色フィルターを備えた浜松ＭＴＰリーダーで測定した。検定：水４ml中の過酸化尿素１２５mgの溶液１０μｌ、酢酸エチルに溶かした１０μ ｌのＧＲ１３２、および酢酸エチル中のＤＮＰＯの１ミリモル溶液２００をガラス管にピペットで計り入れ、生成された光子を直ちに浜松ＭＴＰリーダーで５分間積算した。ブランク値として、ＧＲ１３２溶液１０μｌに代えて純酢酸エチル１０μｌをピペットで計り入れた。感度および量子収率を決定するため、酢酸エチルによるＧＲ１３２の希釈系列を作成した。１ウェルあたり２．３４×１０⁸分子の濃度まで希釈した。空間角度、光学機器および検出ユニットによる損失を考慮し、ＭＴＰリーダーでは１４，０００量子の計数率が期待される。４という信号／ノイズ比では、ブランク値の控除後に３０，０００量子が測定された。これは、発光性化合物を基準にして２を上回る量子収率となる。実施例２：ペルオキシシュウ酸エステルの反応にフィルターを用いることによる感度の向上材料および方法試薬：シュウ酸ビス（２，４，６−トリクロロフェニル）エステル（ＴＣＰＯ）は、リンツ大学有機化学研究所で合成し、酢酸エチルから２回再結晶させた。メルク社から入手したイミダゾールは、エーテルから再結晶させた。水はウバゾール（ Uvasol）の品質を有し、アセトニトリルはPromochem ChromARから入手した。発泡させた過酸化尿素はOrganon Teknika社のＨＩＶ抗体検定から得た。ナトリウムレゾルフィナートは、グラーツのLambda Probes社から入手した。ルミネセンスは、Berthold Biolumat ＬＢ９５００Ｔルミノメーター、および、Schott社から入手したＯＧ５９０nmフィルター（１mm）を備えた同じルミノメーターを、管室と光増幅器との間に配置して測定した。検定：レゾルフィン−Ｎａ塩をイミダゾール緩衝液（Ｈ₂Ｏ１０ml中にイミダゾール７mg）で希釈した。Berthold管（ＬＢ９５００Ｔに適合）に過酸化尿素水溶液（１２５mg／１０ml）１０μｌ、およびアセトニトリル中のＴＣＰＯ溶液（１ミリモル）２００μｌをピペットで計り入れて、それぞれの希釈液１００μｌに加え、ルミノメーターを閉鎖し、１０秒積算モードでの記録を手動で開始した。吸光は、Anthos htIII光度計のマイクロタイタープレート内で、５７０nm、および６２０nmの参照波長で決定した。測定された値は下記のとおりである。これらの数字から、非特異的バックグラウンド放射を抑えるためのフィルターの使用は、感度を１０の２乗も増大させることが明らかである。実施例３：Ｐｄ−コプロポルフィリン（比較例）材料および方法（実施例２のとおりの装置）試薬：Ｐｄ−コプロポルフィリンは、グラーツのLambda Probes社から入手した。残余の試薬は既に説明したとおりである。ルミノメーターは、Schott社から入手したＯＧ５９０nmフィルター（１mm）を備えたものである。検定：Ｐｄ−コプロポルフィリンをアセトン／イミダゾール緩衝液に溶解し（１０^-2 モル、pH＝７）、イミダゾール緩衝液で希釈系列を調製した。過酸化尿素溶液（１２５mg／水１０ml）１０μｌ、およびアセトニトリル（１ミリモルのＴＣＰＯ）２００μｌを緩衝液１００μｌに加えた。ルミノメーターを直ちに手動で始動し、１０秒積算モードでカウントを測定した。この系では、水溶性のＰｄ−コプロポルフィリンを８×１０^-10モル／１の検出限度まで決定できるが、ＧＲ１３２（３．０×１０^-11モル／１）またはＮａレゾルフィナート（２．１３×１０^-11モル／１）には比肩しないことが明らかである。実施例４：β−ガラクトシダーゼの測定材料および方法（実施例２のとおりの装置）試薬：アビジン−β−ガラクトシダーゼはPierce社から入手し、レゾルフィン−β− Ｄ−ガラクトピラノシドはLambda Probes社から入手し、ＭｇＣｌ₂・６Ｈ₂ＯおよびＮａＣｌはメルク社から、ＨＥＰＥＳ／ＢＳＡ緩衝液はCodon社から入手した。レゾルフィン−β−ガラクトピラノシドをクロロホルム／メタノール（４／１）に溶解し、クロロホルム／メタノール／水（２６０／７０／１０）を溶媒としてシリカゲル６０で不純物から分離し、高真空ポンプで室温で乾燥した。淡赤色の生成物を６０℃でウバゾール−水から２回再結晶させ、ウバゾール−水で再洗浄し、分光学的に純粋なアセトニトリルで乾燥した。検定：ＨＥＰＥＳ／ＢＳＡ（２０ミリモルのＨＥＰＥＳ）０．５モルＮａＣｌ、１．０mg／mlのＢＳＡを用いてpH７．５とする）によるアビジン−β−ガラクトシダーゼの希釈系列を調製した。この希釈系列１０μｌをOrganon Teknika社からのマイクロタイタープレート内で基質緩衝液（１×１０^-4モルのレゾルフィン−β −Ｄ−ガラクトピラノシド、０．１モルＮａＣｌ、２ミリモルＭｇＣｌ₂、５ミリモルのイミダゾール）１００μｌと混合し、３７℃で９０分間温置した。次いで、吸光を測定し、１００μｌを試験管に移し、Ｈ₂Ｏ₂（１モルのウバゾールＨ₂ Ｏ）を加え、ルミノメーターに移し、アセトニトリル中のＴＣＰＯ溶液１００ μｌを加え（１ミリモル）、手動で開始し、１０秒積算モードで記録した。評価のために、β−ガラクトシダーゼの分子量５００，０００を基準として用いた。評価：この方法は、自動添加を用いることによって確実に向上させ得る非常に低い変動係数を特徴とする。明らかなように、この系によって、１００μｌ中に１，０００個未満の分子を２時間以内に決定することができる。実施例５：セイヨウワサビのペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の決定材料および方法試薬：抗ヒトＩｇＧペルオキシダーゼ結合体、結合体希釈剤、テトラメチルベンジジンの試薬および過酸化物の試薬は、Coulter社の検出ＨＩＶ試験キットから入手した。ジヒドロローダミン１２３はLambda社から得た。ルミネセンスは、ＯＧ５３０nmフィルター（３mm）を備えた、管室と光電子増倍管との間に配置したBerthold BiolumatＬＢ９５００Ｔで測定した。検定： Organon Teknikaマイクロタイター希釈プレート内で、抗ヒトＩｇＧペルオキシダーゼ結合体の希釈系列（１：１０）を結合体希釈剤で調製した。この希釈物１０μｌをそれぞれ、光度計での評価のために基質試薬（テトラメチルベンジジン試薬／過酸化物試薬＝１：１０）１００μｌにピペットで加えた。希釈物１０ μｌを、ルミノメーターでの評価のために基質試薬（アセトニトリル中のジヒドロローダミン１２３の１０^-3モル溶液１０μｌ、および過酸化物試薬９０μｌ）１００μｌにピペットで加えた。両調製物を１５分間温置し、そこでＴＭＢ調製物をAnthos光度計で６２０nmで評価し、ルミノメーター用の調製物１００μｌは、ルミノメーターのBerthold管内でアセトニトリル中のＴＣＰＯの０．１ミリモル溶液１００μｌと混合し、メーターを手動で開始し、１０秒積算モードで評価した。評価：これらの数字から、ＨＲＰの感度は、この試薬系を用いたときには１００倍も増大できることが明らかである。実施例７：アルカリ性ホスファターゼの測定材料および方法（実施例２のとおりの装置）試薬：ストレプトアビジンアルカリ性ホスファターゼ結合体はPierce社から入手し、リン酸レゾルフィンピリジニウム塩はLambda社から得た。炭酸緩衝液（０．０１モル、pH＝９．６、１ミリモルのＭｇＣｌ₂）はウイーンのCodon社から得た。残余の試薬は既に述べたとおりである。ルミノメーターはＯＧ５９０nmフィルター（１mm）を備えていた。検定：ＨＥＰＥＳ／ＢＳＡ（２０ミリモルのＨＥＰＥＳ、０．５モルのＮａＣｌ、pH ７．５、１．０mg／mlのＢＳＡ添加）でストレプトアビジンアルカリ性ホスファターゼ結合体の希釈系列を調製した。この希釈系列１０μｌをOrganon Teknika 社のマイクロタイタープレート内で基質緩衝液（１×１０^-5モルのリン酸レゾルフィンピリジニウム塩、０．１モルＮａＣｌ、１ミリモルＭｇＣｌ₂、０．０１モルの炭酸緩衝液、pH＝９．６）１００μｌと混合し、３７℃で９０分間温置した。そうして、吸光度を測定し（５７０／６２０nm）、１００μｌを試験管に移し、Ｈ₂Ｏ₂ （１モルのウバゾールＨ₂Ｏ）１０μｌを混合し、ルミノメーターに移し、アセトニトリル中のＴＣＰＯの溶液１００μｌを混合し（１ミリモル）、手動で開始し、１０秒積算モードで記録した。評価の基準として、７５，０００のアルカリ性ホスファターゼの分子量を用いた。評価：この試薬系では、ルミノメーターでの評価の方法により、光度計での評価に比して感度を１０倍も増大させることができた。実施例８：ＨＩＶ−１ｐ２４抗原決定への系の利用材料および方法（実施例２のとおりの装置）試薬： Retro-TekというＨＩＶ−１ｐ２４抗原のＥＬＩＳＡは、バッファローのCellu lar Products社から入手し、アビジンβ−ガラクトシダーゼはPierce社から、レゾルフィン−β−Ｄ−ガラクトピラノシドはLambda Probes社から、ＭｇＣｌ₂・６Ｈ₂ＯおよびＮａＣｌはメルク社から、ＨＥＰＥＳ／ＢＳＡ緩衝液はCodon社から得た。検定：同封の作業指示に従って、ＨＩＶ−１ｐ２４のＥＬＩＳＡを実施した。ストレプトアビジンペルオキシダーゼの作業溶液に代えて、アビジンβ−ガラクトシダーゼをＨＥＰＥＳ／ＢＳＡ（２０ミリモルのＨＥＰＥＳ、０．５モルのＮａＣｌ、pH７．５、１．０mg／mlのＢＳＡ添加）で１：１０，０００に希釈して用いた。ルミノメーターでの評価のための基質緩衝液として、（１×１０^-4モルのレゾルフィン−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、０．１モルＮａＣｌ、２ミリモルＭｇＣｌ₂、５ミリモルのイミダゾール）１００μｌを用い、３７℃で９０分間温置した。そうして１００μｌを試験管に移し、Ｈ₂Ｏ₂（１モルのウバゾールＨ₂Ｏ）を加え、ルミノメーターに移し、アセトニトリル中のＴＣＰＯの溶液１００μ ｌを加え（１ミリモル）、手動で操作開始し、１０秒積算モードで記録した。また、ルミノメーターでの評価のために、キットに同封された緩衝液も洗浄緩衝液として用いた。比較：この比較から、確実に最適に達しない条件である条件下では、ルミノメーターでの評価は、光度計での評価と同じ結果を与えることが明らかである。この実施例により、この系がＥＬＩＳＡの手法に用い得ることを示している。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９５年４月１９日【補正内容】進、安定化または移す他の化合物の存在を必要とする。こうして、英国特許公開第２２３３４５１号明細書は、発光する発蛍光団を水性媒体中で安定化させ、こうして、放射される光の強さを増大させるための水溶性増進物質の使用を記載している。しかしながら、更なる試薬を用いることによるこれらの反応の最適化は、追加する添加物が、用いた反応による許容できないまでに高いバックグラウンド放射線を同時に生じる結果となり、実際の信号を測定する際に問圃を伴うことから、ほとんどのシステムでは技術的に困難であると判明している。ところが、添加物の量が少な過ぎる場合は、信号が減少する結果となる。抗原に結合させた化学発光供与体（Ａｇ−Ｌ）と抗体に結合させた蛍光受容体（Ａｋ−Ｆ）との間に生じるエネルギー伝達を検出法に用いることは、Campbell ら［Biochem．J．、216 pp.185-1941983］によっても示唆されたが、ここで、化学発光供与体結合抗原（Ａｇ−Ｌ）は、蛍光受容体結合抗体（Ａｋ−Ｆ）と結合する際に、測定しようとする未標識抗原（Ａｇ）と競合する。これを実施する際は、（Ａｇ−Ｌ）複合体とは異なる発光波長を有する複合体（Ｌ−ＡｇＡｋ−Ｆ）（あり得るエネルギー伝達に基づく）または複合体（ＡｇＡｋ−Ｆ）（このときエネルギー伝達は不可能である）のいずれかが形成される。そのため、放射強度の測定は、２種類の波長、すなわち（Ａｇ−Ｌ）複合体の発光波長と（Ｌ−ＡｇＡｋ−Ｆ）複合体との発光波長とで実施され、より良く信号を分離するために、それ自体も濃度特異的である互いに他方の信号を濾去して、実施する。その後、（測定しようとする）未標識抗原の量は、両信号の強度の比率の減少から得られるが、これは、測定しようとするものが微量である場合、最小限であるにすぎない。そのような「均一系の免疫検定」は競合系であるから、微量および最微量の物質を検出する際に直面する上記の問題に加え、例えば、用いようとする化学発光供与体に結合した抗原（Ａｇ−Ｌ）の、検出しようとする未標識抗原の量にほぼ相当するはずの量の測定に関して、著しい実際的な問題も随伴する。その実施にあたり、用いられる測定装置、例えば化学発光光度計も、２種類の波長での適切な検出器を備えていなければならない。この系の検出限度は、ほぼ１０^-16モル／１００μｌにある。さらに、一般式Ｒ¹Ｒ²（ＣＯＯ）₂のシュウ酸エステルを定量する方法がドイツ国特許公開第２８０，８２４号公報から公知であるが、ここでは、シュウ酸またはシュウ酸エステルを含有する試料溶液を、それぞれ、適切な酸化剤によってモノペルオキシシュウ酸へと転換し、活性化剤の存在下でのモノペルオキシシュウ酸の分解の結果、化学発光測定装置を用いて記録することができる光子の放射が生じる。 M．L．GrayeskiおよびW．R．Seitz、Anal、Biochem.、第136巻277〜284ページ（1984年）；R．BadorおよびM．Morin、Anal．Chim．Acta、第251巻215〜222ページ（1991年）、ならびにS．Takaysuら、J．Immunol．Meth．、第83巻317〜325 ページ（1985年）によれば、ペルオキシシュウ酸エステルの化学発光は、非常に鋭敏な検出系として免疫検定法に利用される。言及した文書中では、実際の免疫反応は水性媒体中で実施し、検出しようとする化学発光反応は、シュウ酸エステルの溶解度が低いため、水性媒体と有機溶媒との混合物中で実施している。 Badorら（1991年）ならびにTakaysuら（1985年）による方法では、適切な酵素、例えばグルコースオキシダーゼまたはペルオキシダーゼの作用によって、それぞれの発光性化合物が活性化する。更に、M．L．Grayeskiら（1984年）によれば、バックグラウンド放射線を瀘去することによって、検定系の感度を上げようとの試みがなされた。しかし、明らかにこれは不成功に終った（２８１ページの最初の段落全体および表１を参照されたい）。本発明は、初めに定義した形式の方法であって、場合により置換されたシュウ酸エステル（Oxalates）またはオキサミドの酸化的分解に基づく化学発光反応において、非励起状態に戻る間に放射される、測定しようとするその放射線が、用いられる反応の非特異的バックグラウンド放射線より長波長のものであるレドックス感受性発光性化合物を用い、そして該反応の非特異的バックグラウンド放射線を適切な波長選択ユニットによって実質的に完全に消光し、および／または、該化学発光反応を実施する前に、該発光性化合物を追加の化学もしくは酵素反応によって意図的に蓄積する方法に関する。従来、上記の化学発光系は、プロトン性溶媒では溶解度が低く、ソルボリシスに対する耐性が不充分なために免疫学的手法にはほとんど利用できないことから、専らＨＰＬＣ用の化学発光検出器として興味が持たれていた。ＨＰＬＣ検出器として用いるときは、化学誘導電子交換ルミネセンス（ＣＩＥＥＬ）に基づくような系を用いて、既に低濃度である発光性化合物を検出できたが、それは、発光性化合物を添加しない酸化反応は、発光性化合物を添加した反応より数倍も弱い光を放射するからである。適切な波長選択ユニットに関して特殊な発光性化合物を用いる測定の本発明の組合せによって、発光性化合物の濃度に対する検出限度を数倍も高めることができる。ペルオキシシュウ酸エステル系のエネルギーに富む中間段階を形成するのに必要な、場合により置換されたシュウ酸エステルの追加の前に非励起発光性化合物を蓄積することによって、用いる化学発光の非特異的バックグラウンド放射線を消光する上記の方法と同時に用いられる、化学発光反応の非特異的バックグラウンド放射線を上回る化学または酵素反応を用いた増幅によって、測定しようとする信号を増幅することができ、検出しようとする信号の著しい「化学増幅」を生じる結果となる。本発明によれば、新規な溶媒系の利用が、場合により置換されたシュウ酸エステルまたはオキサミドの酸化的分解に基づく化学発光反応を、生物検定に従った検出反応として用いることが初めて可能になるが、それは、水溶液中での生化学反応が最初に生じ、その後、それ自体公知である適切な非プロトン性溶媒または溶媒系、例えばアセトニトリル中の必要な試薬を加えることによって、化学発光反応が実施されるからである。そのため、実際上無限に高い濃度まで水を用いることができるが、約５０％の水の濃度が特に好ましい。ペルオキシシュウ酸エステルの化学発光反応において、非励起状態に戻るときに放射される測定すべきその放射線が約５００nmより長い波長のものであるレドックス感受性発光性化合物を用いるならば、そしてまた約３５０〜５４０nmのバックグラウンド放射線を実質的に完全に消光する波長選択ユニットを用いるならば、それも好都合である。従来、ペルオキシシュウ酸エステルの化学発光反応は、場合により置換されたシュウ酸エステルまたはオキサミドの酸化的分解に基づくほとんどすべての化学発光反応の場合のように、非プロトン性媒体に限定されており、そのため、適切な技術分野での生物検定のための検出反応として、この化学発光反応を用いることに対して、このことを理由として既に偏見が存在している。ペルオキシシュウ酸エステルの反応は、特に高い量子収率（０．４アインシュタイン／モル以上）を与える非常に強力な化学発光系であるが、この系は、上記に指摘した短所に加え、３５０〜５４０nmの範囲でのその強いバックグラウンド放射線のために、従来は生物検定、すなわち非常に僅かな量を検出することには適用さ請求の範囲１．場合により塩基性触媒の存在下で、好ましくはプロトン性媒体中での、化学発光に基づく検出反応を用いて物質を検出する方法であって、該検出反応に起因する電子伝達によって、発光性化合物がその非励起状態から励起状態へと高められ、次いで、該発光性化合物がその非励起状態に戻るときに放射する放射線を測定する、該検出反応を用いて物質を検出する方法において、場合により置換されたシュウ酸塩またはオキサミドの酸化的分解に基づく化学発光反応に、非励起状態に戻る間に放射されるその測定しようとする放射線が、用いられる反応の非特異的バックグラウンド放射線より長波長のものであるレドックス感受性発光性化合物を用い、そして該反応の非特異的バックグラウンド放射線を適切な波長選択ユニットによって実質的に完全に消光することを特徴とする方法。２．化学発光反応を実施する前に、追加的に、発光性化合物を更なる化学反応又は酵素反応によって意図的に蓄積することを特徴とする請求項１記載の方法。３．最初に、水溶液中での生化学反応が生じ、その後、それ自体公知である適切な非プロトン性溶媒または溶媒系、例えばアセトニトリル中の必要な試薬を加えることによって、化学発光反応を実施することを特徴とする請求項１または２に記載の方法。４．ペルオキシシュウ酸エステルの化学発光反応において、非励起状態に戻るときに放射される、その測定しようとする放射線が約５００nmより長波長のものであるレドックス感受性発光性化合物を用いること、および約３５０〜５４０nm のバックグラウンド放射線を実質的に完全に消光する波長選択ユニットを用いることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。５．該発光性化合物として、レゾルフィン塩を用いることを特徴とする請求項４記載の方法。６．該発光性化合物として、テトラフェニルポルフィリンを用いることを特徴とする請求項４記載の方法。７．該発光性化合物として、ローダミン１２３を用いることを特徴とする請求項４記載の方法。８．該発光性化合物として、クロロフィルを用いることを特徴とする請求項４記載の方法。９．該発光性化合物として、（Ｚ，Ｚ）−１６，１７−ジフルオロボリル−１３−エチル−２，３，７，８，１２，１４−ヘキサメチル−１，１７−ジヒドロ −１５Ｈ−トリピリン−１−オンを用いることを特徴とする請求項４記載の方法。１０．波長選択ユニットとして、遮光フィルターを用いることを特徴とする請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。１１．波長選択ユニットとして、干渉フィルターを用いることを特徴とする請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。１２．波長選択ユニットとして、格子を用いることを特徴とする請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。１３．波長選択ユニットとして、プリズムを用いることを特徴とする請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。１４．非励起状態に戻るときに放射される、測定しようとするその放射線が約５００nmより長波長のものである、検出しようとする物質量の直接の影響下で適切な基質から放出されるレドックス感受性発光性化合物を用いることを特徴とする請求項４〜１３のいずれか一項に記載の方法。１５．基質と、検出しようとするある量の酵素の直接の影響下で、それぞれ、活性化されるか、または基質から開裂される発光性化合物とを含む蛍光原を用いることを特徴とする請求項１４記載の方法。１６．酵素が抗体に直接結合されることを特徴とする請求項１５記載の方法。１７．酵素が抗体に間接的に結合されることを特徴とする請求項１５記載の方法。１８．酵素が抗原に直接結合されることを特徴とする請求項１５記載の方法。１９．酵素が抗原に間接的に結合されることを特徴とする請求項１５記載の方法。２０．酵素が核酸プローブに直接結合されることを特徴とする請求項１５記載の方法。２１．酵素が核酸プローブに間接的に結合されることを特徴とする請求項１５記載の方法。２２．用いる発光性化合物を、アルカリ性ホスファターゼを用いて遊離させることを特徴とする請求項１５〜２１のいずれか一項に記載の方法。２３．用いる発光性化合物を、セイヨウワサビのペルオキシダーゼを用いて活性化することを特徴とする請求項１５〜２１のいずれか一項に記載の方法。２４．用いる発光性化合物を、β−ガラクトシダーゼを用いて遊離させることを特徴とする請求項１５〜２１のいずれか一項に記載の方法。２５．用いる発光性化合物を、検出しようとする物質量の間接的な影響下で、それぞれ、活性化するか、または適切な基質から遊離させることを特徴とする請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。２６．発光性化合物を遊離させるための酵素に結合させた抗体または抗原に対する、検出しようとするある量の抗原または抗体の間接的な影響が、一つまたはいくつかの更なる抗原−抗体反応を介して及ぼされることを特徴とする請求項２５記載の方法。２７．発光性化合物を遊離させるための酵素に結合させた抗体または抗原に対する、検出しようとするある量の抗原または抗体の間接的な影響が、その後それぞれの酵素に結合される少なくとも一つの更なる化合物に対する１個もしくは数個の特異的同定部位を備えた１種類もしくは数種類の中間体物質を介して及ぼされることを特徴とする請求項２５または２６記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者フリッツ，ペーター・ゲラルドオーストリア国、アー―6020 ザルツブルク、ハンマーアウアーシュトラーセ 76デー

Claims

【特許請求の範囲】１．場合により塩基性触媒の存在下で、好ましくはプロトン性媒体中での、化学発光に基づく検出反応を用いて物質を検出する方法であって、該検出反応に起因する電子伝達によって、発光性化合物がその非励起状態から励起状態へと高められ、次いで、該発光性化合物がその非励起状態に戻るときに放射する放射線を測定する、該検出反応を用いて物質を検出する方法において、場合により置換されたシュウ酸エステルまたはオキサミドの酸化的分解に基づく化学発光反応に、非励起状態に戻る間に放射されるその測定しようとする放射線が、用いられる反応の非特異的バックグラウンド放射線より長波長のものであるレドックス感受性発光性化合物を用い、そして該反応の非特異的バックグラウンド放射線を適切な波長選択ユニットによって実質的に完全に消光し、および／または、該化学発光反応の実施に先立って、該発光性化合物を追加の化学もしくは酵素反応によって意図的に蓄積することを特徴とする方法。２．最初に、水溶液中で生化学反応が生じ、その後、それ自体公知である適切な非プロトン性溶媒または溶媒系、例えばアセトニトリル中の必要な試薬を加えることによって、化学発光反応を実施することを特徴とする請求項１記載の方法。３．ペルオキシシュウ酸エステルの化学発光反応において、非励起状態に戻るときに放射される、その測定しようとする放射線が約５００nmより長波長のものであるレドックス感受性発光性化合物を用いること、および約３５０〜５４０nm のバックグラウンド放射線を実質的に完全に消光する波長選択ユニットを用いることを特徴とする請求項１または２記載の方法。４．該発光性化合物として、レゾルフィン塩を用いることを特徴とする請求項３記載の方法。５．該発光性化合物として、テトラフェニルポルフィリンを用いることを特徴とする請求項３記載の方法。６．該発光性化合物として、ローダミン１２３を用いることを特徴とする請求項３記載の方法。７．該発光性化合物として、クロロフィルを用いることを特徴とする請求項３記載の方法。８．該発光性化合物として、（Ｚ，Ｚ）−１６，１７−ジフルオロボリル−１３−エチル−２，３，７，８，１２，１４−ヘキサメチル−１，１７−ジヒドロ −１５Ｈ−トリピリン−１−オンを用いることを特徴とする請求項３記載の方法。９．波長選択ユニットとして、遮光フィルターを用いることを特徴とする請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。１０．波長選択ユニットとして、干渉フィルターを用いることを特徴とする請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。１１．波長選択ユニットとして、格子を用いることを特徴とする請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。１２．波長選択ユニットとして、プリズムを用いることを特徴とする請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。１３．非励起状態に戻るときに放射される、測定しようとするその放射線が約５００nmより長波長のものである、検出しようとする物質量の直接の影響下で適切な基質から放出されるレドックス感受性発光性化合物を用いることを特徴とする請求項３〜１２のいずれか一項に記載の方法。１４．基質と、検出しようとするある量の酵素の直接の影響下で、それぞれ、活性化されるか、または基質から開裂される発光性化合物とを含む蛍光原を用いることを特徴とする請求項１３記載の方法。１５．酵素が抗体に直接結合されることを特徴とする請求項１４記載の方法。１６．酵素が抗体に間接的に結合されることを特徴とする請求項１４記載の方法。１７．酵素が抗原に直接結合されることを特徴とする請求項１４記載の方法。１８．酵素が抗原に間接的に結合されることを特徴とする請求項１４記載の方法。１９．酵素が核酸プローブに直接結合されることを特徴とする請求項１４記載の方法。２０．酵素が核酸プローブに間接的に結合されることを特徴とする請求項１４記載の方法。２１．用いる発光性化合物を、アルカリ性ホスファターゼを用いて遊離させることを特徴とする請求項１４〜２０のいずれか一項に記載の方法。２２．用いる発光性化合物を、セイヨウワサビのペルオキシダーゼを用いて活性化することを特徴とする請求項１４〜２０のいずれか一項に記載の方法。２３．用いる発光性化合物を、β−ガラクトシダーゼを用いて遊離させることを特徴とする請求項１４〜２０のいずれか一項に記載の方法。２４．用いる発光性化合物を、検出しようとする物質量の間接的な影響下で、それぞれ、活性化するか、または適切な基質から遊離させることを特徴とする請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。２５．発光性化合物を遊離させるための酵素に結合させた抗体または抗原に対する、検出しようとするある量の抗原または抗体の間接的な影響が、一つまたはいくつかの更なる抗原−抗体反応を介して及ぼされることを特徴とする請求項２４記載の方法。２６．発光性化合物を遊離させるための酵素に結合させた抗体または抗原に対する、検出しようとするある量の抗原または抗体の間接的な影響が、その後それぞれの酵素に結合される少なくとも一つの更なる化合物に対する１個もしくは数個の特異的同定部位を備えた１種類もしくは数種類の中間体物質を介して及ぼされることを特徴とする請求項２４または２５記載の方法。