JPH08511681A - 部位特異的リコンビナーゼ／核レセプタ融合タンパク質による部位特異的組換えの調節 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 細胞、生物又は適当な無細胞系内での組換えの調節を可能にする本発明について記載する。本発明は、リコンビナーゼ・タンパク質、又はリコンビナーゼ系の成分、と核レセプタから誘導されたリガンド結合性ドメインとの間の融合タンパク質を作出することを含む。この融合タンパク質は、リガンド結合性ドメインに結合するリガンドの非存在中で、ほんの僅かなリコンビナーゼ活性を示す。リガンドの結合の間に、リコンビナーゼ活性が誘導される。本発明は、細胞及び生物内で組換えを調節するための実施手段を提供し、そしてリガンド結合を組換えにリンキングすることにより、組換えが達成されたときにリガンド結合がそれにより測定されることができるような単純な手段を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 部位特異的リコンビナーゼ／核レセプタ融合タンパク質による部位特異的組換え の調節 本発明は、遺伝子操作の技術分野、さらに特に、組換え仲介DNA再編成の使用 、及び核レセプタの調節能力の使用に関する。 DNAの所定の再編成（rearrangements）を誘導する部位特異的リコンビナーゼ （site-specific recombinases(SSRs)）の使用は、多様な生物において記載され てきた。これらの報告は、SSR標的部位を含むDNA構築物の導入について記載して いる。SSR酵素活性へのその後の暴露は、その標的部位の配置（disposition）に より決定されるDNA再編成をもたらした（SSRsの最近のレビューについては参照 文献（13）を参照のこと。）。３つのSSRsが今までこのやり方で使用されてきた ；サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の２μエピソー ムからのFLPリコンビナーゼ（１，２，５，６，９，10）、大腸菌（Escherichia coli）ファージＰ１からのCREリコンビナーゼ（３，４，８，１１，１２）と ザイゴサッカロミセス・ロウキシイ（Zygosaccharomyces rouxii）のpSR１から のＲリコンビナーゼ（２）。本明細書中に記載する本発明に関連する他のSSRシ ステムの中に、参照文献（13と14）中に列挙されたもの、並びにクルイベロミセ ス・ドロソフィラリウム（Kluyveromyces drosophilarium）（15）、クルイベ ロミセス・ワルチイ（Kluyveromyces waltii）（16）、λInt（17）、及びファ ージMuからのGin組換え系（18）からのSSRsがある。上記文献の内容を引用によ り取り込む。 細胞、生物及びインビトロにおける無細胞系における多くの用途 のために、SSR誘導DNA再編成は、調節されなければならない。SSRsにより提供さ れる能力の最近の実施は、SSR活性を調節するのに利用可能な手段により制限さ れない。培養細胞による実験においては、調節されていないSSRsが使用されてき た。例えば、SSR標的部位を細胞に導入した後に、DNAのトランスフェクションに よるFLPリコンビナーゼ（４，９）又はCREリコンビナーゼ・タンパク質の注射（ 12）のいずれかのその後の導入により組換えが導入されてきた。すなわち、意図 された組換え事件は、単に、適当な巨大分子の導入の時間により調節された。他 の制限の中で、これは、再編成された標的部位とSSRの両方を含む細胞の同種集 団であって、その組換え事件が細胞数が増加した後に誘導されることができるよ うな集団の作出及び増殖を排除する。 トランスジェニック動物による実験において、SSR調節の論点は、ドロソフィ ラ（Drosophila）における誘導性熱ショック・プロモーター（５）又はマウスに おける組織特異的プロモーター（11）を使用して導入されたSSR遺伝子の発現を 調節することにより届けられてきた。両アプローチは、制限された利用可能性を もつ。すなわち、トランスジーン発現の熱ショック調節は、最近、ハエにおいて のみ有用であり、好適な相手は全く、細胞系又は脊椎動物における使用に利用さ れることができない。また、トランス・ジーン発現を調節するための組織特異的 なプロモーターの使用は、好適なプロモーターとエンハンサーの制限された利用 可能性に頼り、そして達成された発現パターンは、これらの組織特異的要素が活 性である時と場所に拘束される。 本発明に下にある問題は、従来技術の欠点が少なくとも部分的に取り除かれた 、調節された組換え系を提供することであった。より特に、この問題は、組換え 事件がいずれの組織特異的制限からも独 立して誘導されることができる組換え系を提供することであった。 本特許出願は、その発現よりもむしろ、SSR活性を調節する発明について記載 する。従って、発現を達成し、そして指定するいずれかの手段を、例えば、遍在 し、そして広い活性をもつプロモーター及びエンハンサー、並びに組織特異的又 は誘導性プロモーター及びエンハンサーを使用して使用することができる。 本発明の１の態様は、細胞内又は適当な無細胞系において：（ａ）リコンビナ ーゼ活性がそのリガンド結合性ドメインに結合しているリガンドの非存在中で阻 害され、そして（ｂ）リコンビナーゼ活性がそのリガンド結合性ドメインへのリ ガンドの結合により誘導され又は変更されるような、核レセプタのリガンドに結 合するアミノ酸が含まれるように、核レセプタの一部又は全部に融合された、リ コンビナーゼ・タンパク質又はリコンビナーゼ複合体の成分を含んで成る、融合 タンパク質に関する。 好ましくは、リコンビナーゼ活性は、少なくとも10、より好ましくは少なくと も20、そして最も好ましくは少なくとも40の係数により、リガンド結合性ドメイ ンへのリガンドの結合により変更される。 本発明は、核レセプタのリガンド結合性ドメイン（ligand binding domain(LB D)）にSSRタンパク質を融合させることによるSSR活性の調節にある。SSR-LBD融 合タンパク質は核レセプタのLBDのアミノ酸配列に物理的に付着されたSSRsのア ミノ酸配列を含んで成る。すなわち、本発明は、核レセプタのリガンド結合性ド メインに融合された、リコンビナーゼ・タンパク質、又はリコンビナーゼ複合体 の成分を含んで成る、融合タンパク質である。好ましくは、リコンビナーゼ・タ ンパク質又はリコンビナーゼ複合体の成分は、遺伝子融合により核レセプタ又は そのリガンド結合性ドメインに融合さ れ、すなわち、SSR-LBDタンパク質は、単一の核酸によりコードされた線状遺伝 子融合物である。他方において、本発明は、例えば、各タンパク質ドメインに共 有結合されている、その上に反応性基をもつスペーサー分子を通じて、異なる手 段により連結されたSSR-LBD融合タンパク質をも包含する。 最も簡単には、SSRとLBD成分の付着は、好ましくは、SSRタンパク質のアミノ 末端又はカルボキシ末端のいずれかにおいて、SSRコーディングDNAと同じリーデ ィング・フレーム内に置かれたLBDコーディングDNAをもつSSR-LBD融合タンパク 質のアミノ酸配列をコードするDNA構築物を調製することにより達成されること ができる（19）。より好ましくは、核レセプタ又はそのリガンド結合性ドメイン は、リコンビナーゼ・タンパク質又はリコンビナーゼ複合体の成分のＣ−末端と 融合される。本発明の特に好ましい態様においては、核レセプタ又はそのリガン ド結合性ドメインは、主に親水性の酸から成り、そして好ましくは４〜20の長さ のアミノ酸をもつペプチド・リンカーを通じてリコンビナーゼ・タンパク質又は リコンビナーゼ複合体の成分と融合される。 SSR-LBD融合タンパク質は、組換えを生じることなく標的部位と同時に存在す ることができる。なぜなら、これらのタンパク質は、リコンビナーゼ活性のため にLBDに結合性のリガンドを必要とするからである。我々の実験においては、関 連リガンドの非存在中、SSR-LBD融合タンパク質のリコンビナーゼ活性は、野生 型のリコンビナーゼ活性よりも少なくとも200倍少ない。この関連リガンドをも つSSR-LBD融合タンパク質の提示の間、リコンビナーゼ活性は、野生型の20％を 超えるまで、すなわち40倍誘導に等しいか又はそれ以上に、誘導される。これは 、いずれかの手段によるSSRsの転写後調節の最初の記載である。特に、本発明は 、生体系における非再編成 標的部位とSSR-LBDの両方の増殖を許容する。さらに特に： （ａ）生化学的研究又は生物への導入のために不可欠なものとして非再編成標的 部位とSSR-LBDの両方を担持するセルラインが樹立されることができる。このセ ルラインは、同質であり、そして必要な量への事前増殖及びその関連リガンドの 投与による組換えのその後の誘導を特徴とする。 （ｂ）組換えは、関連リガンドの投与によりいずれかの実験的に操作可能な多細 胞生物において調節されることができる。SSR-LBDは、細胞の取り込みを通じて か又は直接的な手段、例えばマイクロインジェクションのいずれかにより、上記 生物に、あるいは、ウイルス・ベースのベクターのゲノム内に、導入されること ができるであろう。組換えは、関連リガンドの投与による特徴付けの後に誘導さ れることができる。 用語“核レセプタ（nuclear receptor）”とは、本明細書中に使用するとき、 分子、好ましくはタンパク質分子であって、糖添加されても又はされなくてもよ いものであって、リガンドに結合し、かつ、細胞の核に取り込まれる能力をもつ ものをいう。特に、用語核レセプタとは、リガンド結合に関してステロイド・ホ ルモン・レセプタにより示される働き又は生化学的特性に近似する働き又は生化 学的特性を示すようなタンパク質、例えばジオキシン・レセプタ（di son，J.-A．and Poellinger，L.,（1993）EMBO J．12，4169-4179）。より特に 、用語核レセプタとは、それらのアミノ酸配列により、ステロイド・ホルモン・ レセプタのLBDsに関連付けられるようなタ i，C.，Coll，J.，Catzeflis，F．and Stehelin，D.（1992）EMBO J．11，1003- 1013）は、標準的な方法論を使用した核レセプタ・ア ミノ酸配列の整列について記載している。本明細書中に使用する核レセプタの定 義の内には、Laudet et al．中に列挙されていないようなタンパク質も含まれる が、それは、Laudet et al．により使用された方法を使用して包含されることが できる。用語核レセプタは、Laudet et al．により使用された方法を使用して関 連するものと同定されるような核レセプタ・アミノ酸配列への関連性を十分に保 持する核レセプタ・アミノ酸配列の突然変異誘導体をも含む。 リコンビナーゼ・タンパク質に融合される核レセプタは、好ましくは、ホルモ ン・レセプタ、例えばステロイド、ビタミン又は関連リガンドにより識別される レセプタである。好適な核レセプタの例は、参照文献（20）（これを、引用によ り本明細書中に取り込む。）中に列挙されている。好ましくは、核レセプタは、 ステロイドホルモン・レセプタ、より好ましくは、グルココルチコイド、エスト ロゲン、プロゲステロン、又はアンドロゲン・レセプタである。 本発明に係るSSR-LBD融合タンパク質においては、完全な核レセプタが存在す ることは必要ではない；すなわち、そのリガンドに結合するアミノ酸がそのSSR に融合されることで十分である。 それらの関連リガンドの結合の間、核レセプタは活性になり、又は転写要素が 変更されるようになる。タンパク質のステロイド・レセプタ・ファミリーのメン バーをコードするcDNAsのクローニングは、それらが、特にリガンドに結合する タンパク質ドメイン内においてアミノ酸配列の相同性を共有することを現わした 。LBDは、そのタンパク質の残りから分離され、そして得られた融合タンパク質 上へのリガンド調節を付与する他の転写因子に融合されることができる。グルコ コルチコイドとエストロゲン・レセプタについては、リガンドに結合するドメイ ンは、他の転写因子、そしてまた癌タンパク質に融合されてきた。これは、活性 についてその関連リガンド に依存する融合タンパク質を与えた（19，21−26）。今日までこのやり方で実験 的に調節されてきた特徴付けされた癌タンパク質の全てが転写因子でもある。転 写因子と癌タンパク質は分類学的な意味においては酵素ではなく、そして参照文 献（19，21−26）中に記載されたステロイドとLBDsによるそれらの活性の調節は 、LBDsがステロイド・レセプタの調節において演じる役割に本質的に近似してい る。転写因子と癌タンパク質を超えるLBD融合タンパク質戦略の調節の可能性を 広げる先の試みは、未だ報告されていない。グルココルチコイドLBDとそれらを 融合することによりβ−ガラクトシダーゼ又はジヒドロ葉酸レダクターゼのいず れかの酵素活性を調節する試みは成功していない（D. Picard，public seminar given at EMBL，Heidelberg，Nov．1991）。 本発明は、酵素活性を含むように、核レセプタから他の転写因子までの最近頒 布されたリガンド調節の移転を超えるLBD融合タンパク質戦略の調節可能性を広 げる、すなわち部位特異的リコンビナーゼである。用語“部位特異的リコンビナ ーゼ（site specific recombinase）”とは、インテグラーゼ又はリゾルバーゼ ／インベルターゼ・クラスの部位特異的リコンビナーゼ（13；Abremski，K.E．a nd Hoess，R.H.（1992）Protein Engineering 5，87-91；Khan，E.，Mack，J.P. G.，Katz，R.A.，Kulkosky，J．and Skalka，A.M.（1991）Nucleic acids Res． 19，851-860）及びイントロン・コードされたエンドヌクレアーゼにより仲介さ れた部位特異的組換え（Perrin，A.，Buckle，M．and Dujon，B.（1993）EMBO J ．12，2939-2947）を含む、特異的DNA座内でDNA再編成を仲介するいずれかの組 換え系のいずれかのタンパク質成分をいう。本発明に従って融合タンパク質内で 使用されることができる好ましいリコンビナーゼ・タンパク質は；FLPリコンビ ナーゼ、Creリコンビナーゼ、ザイゴサッカ ロミセス・ロウキシイ（Zygosaccharomyces rouxii）プラスミドpSR１からのＲ リコンビナーゼ、クルイベロミセス・ドロソフィラリウム（Kluyveromyces dro sophilarium ）プラスミドpKDIからのＡリコンビナーゼ、クルイベロミセス・ワ ルチイ（Kluyveromyces Waltii）プラスミドpKW１からのＡリコンビナーゼ、λ Int組換え系のいずれかの成分、Gin組換え系のいずれかの成分、又はそらの変異 体から成る群から選ばれる。用語“変異体(variant)”とは、本文脈中、アミノ 酸の欠失、置換及び／又は付加により上記タンパク質から誘導され、そしてそれ らが由来するタンパク質に固有の機能のいくつか又は全てを保持しているような タンパク質をいう。特に、この変異体は、リコンビナーゼとして作用する能力を 保持することができるであろうし、又はそれは、組換え反応又はその組換え反応 の調節に決定的なタンパク質／タンパク質又はタンパク質／DNA相互作用を保持 することができるであろう。 本発明の好ましい態様においては、FLPリコンビナーゼが、エストロゲン、グ ルココルチコイド、プロゲステロン又はアンドロゲン・レセプタのLBDに融合さ れる（20）。他の好ましい態様は、これらのLBDsに、Creリコンビナーゼ又はＲ リコンビナーゼ、又はKluyveromyces drosophilarium又はKluyveromyces Walt ii からのSSRsを融合することを含む。他の好ましい態様は、これらのLBDsに対し てSSR複合体の１以上の成分、特に、λInt又はGin組換え系の成分、を調製する ことを含む。しかしながら、本発明は、組換えを調節するための手段の提供にお いて、公知のリコンビナーゼと組換え複合体に限定されず、そして公知の核レセ プタLBDsに限定されない。むしろ、核レセプタのLBDsへの、リコンビナーゼ、又 は組換え複合体の成分の融合の戦略は、当業者の一部に対し不当な実験によらず 容易に同定することができる所望の特徴を示すこれらのタンパ ク質のいずれかの融合組合せに利用されることができる。 本発明のさらなる対象は、本発明に係る融合タンパク質をコードする核酸であ る。好ましくは、核酸はDNA又はRNAである。 さらなる本発明の対象は、先に定義したような核酸の少なくとも１のコピーを 含んで成る組換えベクターである。この組換えベクターは、真核細胞ベクター、 ウイルス・ベクター、又は原核細胞ベクター、又は真核及び原核宿主細胞内で維 持されることができるベクター、であることができる。この組換えベクターは、 SSR-LBD融合タンパク質をコードする核酸を好適な出発ベクター内に挿入するこ とにより得られることができる。好適な出発ベクターの特定の例は、例えばMole cular Cloning，A Laboratory Manual，2nd edition，J．Sambrook et al.（198 9），Gold Spring Harbor Laboratory Press，chapter 1，2，3，4，16 and 17 中に与えられている。 本発明に係るベクターは、染色体外ベクター又は宿主細胞のゲノム内に組み込 まれたベクターであることができる。染色体外ベクター、例えば環状プラスミド が特に好ましい。プラスミド・ベクターの例は、FLPリコンビナーゼとエストロ ゲン・レセプタのリガンド結合性ドメインとの融合をコードする核酸を含んで成 るプラスミドpHFE１である。このプラスミドpHFE１は、ブダペスト条約の要求に 従って受託番号DSM9265の下、1994年６月25日にDeutsche Sammlung von Mikroor ganismen and Zellkulturen GmbH（DSM），Mascheroder Weg 1b，D-38124 Braun schweigに寄託されている。 そしてさらなる本発明の対象は、先に定義したような核酸又は組換えベクター を含む細胞である。好ましくは、この細胞は、その核酸又はそのベクターにより 安定的に形質転換される。好適な細胞は、真核又は原核細胞である。原核細胞の 例は、グラム陰性バクテリア細胞、特に大腸菌、（E．coli）細胞である。真核 細胞の例は、 哺乳類細胞、酵母とトリパノソーマ属の住血鞭毛虫（trypanosomes）である。 本発明は、転写因子の働きからリガンド結合性の働きを分離して、リガンド結 合性をリコンビナーゼ活性とカップリングさせる。それにより、リガンドの結合 は、リコンビナーゼ活性を測定するいずれかの手段により評価されることができ る。従って、本発明のさらなる態様は、核レセプタのLBDへのリガンドの結合を 測定する方法であって、以下の段階： （ｉ）SSR-LBD融合タンパク質又はそれをコードする核酸を細胞、又は無細胞系 であって、SSRのためのDNA標的部位を含むものに導入し； （ii）上記リガンド；又はそのリガンドが上記系内に既に存在しない場合、評価 されるべきリガンド（単数又は複数）を含むと疑われる混合物を投与し； （iii）DNA標的部位間の組換え又はその速度における変化を直接又は間接的に検 出することより、それが存在する場合、SSR-LBDのリコンビナーゼ活性を検出す る、 を含んで成る方法を含む。 SSR-LBD融合タンパク質の細胞内への導入は、SSR-LBD融合タンパク質をコード する核酸を含む適当なベクターにより細胞を形質転換することにより達成される ことができる。評価されるべきリガンドの投与は、そのリガンドを既に含む系で あって、DNA標的部位間の組換えを検出することによりそのリガンド濃度が測定 されるような系においては必要ではない。 特に好ましい態様は、以下の事項を含む： （ａ）DNA分子のゲル電気泳動、サザン・ブロッティング又はポリメラーゼ連 鎖反応のような技術を使用して標的部位の物理的編成 の直接的測定。 （ｂ）組換えの前後において標的部位を担持するDNA領域によりコードされた 特性を評価することによる間接測定。例えば、組換えは、宿主のゲノムから抗生 物質耐性遺伝子を切除することができるであろうし、そしてそれ故組換えはその 抗生物質に対する感受性として測定されることができる。 （ｃ）SSR-LBD融合タンパク質を担持する細胞内に在るDNA標的部位間の組換え を評価することによる細胞内リガンド濃度の測定。 （ｄ）放射標識されたリガンド誘導体を使用する必要性を伴わずに又は対応の 核レセプタの転写因子特性に頼らずに、LBDに結合するリガンドを評価すること 。 （ｅ）リガンド結合に対するLBD内の突然変異の効果を評価すること。SSR-LBD 組換えはリガンドを要求するので、リガンド結合を減少させるLBD内の突然変異 が確かめられることができる。あるいは、異なるリガンドの結合を改良する突然 変異が選択されることができる。例えば、リガンド保存性組換えは、抗生物質耐 性遺伝子が発現されるように、そのDNAを再編成することができるであろう。こ の再編成されたDNAをもつ細胞は、適当な抗生物質選択下で成長するであろうし 、再編成されていないDNAをもつ細胞は、成長しないであろう。特に、これは、 リガンドに結合するその能力に対する核レセプタのLBD内の突然変異の効果を測 定するための方法であって、（ａ）SSR-LBD融合タンパク質のLBD内への突然変異 の導入、及び（ｂ）上記（ｉ）〜（iii）のその後の段階、の段階を含んで成る 方法について記載する。 また本発明は、DNA標的部位の組換えを調節するための方法であって、以下の 段階： （ａ）部位特異的リコンビナーゼのためのDNA標的部位を含む細 胞又は適当な無細胞系を提供し、 （ｂ）そのDNA標的部位を本発明に係る融合タンパク質と接触させ、その接触 が、そのタンパク質の直接的導入により又はそのタンパク質をコードする核酸に よる細胞の形質転換及びそのタンパク質を作り出すための核酸の発現により達成 されることができる、 （ｃ）その融合タンパク質とその融合タンパク質の核レセプタ成分のためのリ ガンドとの接触により、例えばそのリガンドをその系に所定の時に添加すること により、又はその系内でのそのリガンドの生産を所定の時において行うことによ り、そのDNA標的部位の組換えを行うこと、 を含んで成る方法をも包含する。 図面の説明 図１Ａは、293細胞のゲノム（太線）内に組み込まれた、プラスミド、pNEOBGA L（細線）を表す。FLPリコンビナーゼ標的部位（FRTs）は、太い矢印として表さ れ、そして２つのFRTsの間にネオマイシン耐性遺伝子がある。エストラジオール 投与の間、FRTs間のDNAが切除され、そのゲノム内に１のFRTを、そして切除され た環状DNA上に１のFRTを残す。図２のサザン・ブロットのために使用したプロー ブについても表す。 図１Ｂは、プラスミドpHFE１の作出に含まれる段階を表す。 図２は、セルラインＰ1.4内で生じた組換えの時間経過のサザン・ブロットを 示す。図の上部に示された、エストラジオール、又はエタノールだけの投与後の 時間において、細胞が溶解され、DNA精製され、NdeＩにより制限酵素処理され、 1.25％アガロース・ゲル上でランされ、そして標準的な方法論によりBiodyne Ｂ 膜にブロットされた。この膜を、図ＩＡに表わした放射性標識されたプローブ とハイブリダイズさせた。上のバンドは、非組換え組み込みDNAを示し、下は、 組換えられたバンドを示す。エストラジオールはエタノール中に溶解され、そし てその直右のレーンは、51時間目についてのエストラジオールを含まない等量の エタノールにより処理された細胞を示す。 図３は、プラスミドpHFE１によりコードされたSSR-LBD-融合ポリペプチドの完 全アミノ酸配列を示す。FLPリコンビナーゼ・ドメインはアミノ酸1-423にある。 リンカー・ペプチドは、アミノ酸424-428にある。エストロゲン結合性ドメイン は、アミノ酸429-773にある。 図４は、図３のSSR-LBD融合ポリペプチドをコードする核酸配列を示す。FLPリ コンビナーゼ・ドメイン、リンカー・ペプチドとエストロゲン結合性ドメインを それぞれコードする部分を特定する。 以下の実施例は、説明により提供され、そしていかなるやり方によっても本発 明を限定するものと意図されない。 実施例１ SSR-LBD-融合遺伝子を含むプラスミドの構築 本実験は２つのプラスミドを含み、その中の１が組換えについての標的であり 、そして他がリコンビナーゼ発現プラスミドである。標的プラスミドとして、pN EOBGAL（９）を使用した。pNEOBGALは、ネオマイシン耐性をコードする遺伝子の 周囲に２つのFLPリコンビナーゼ標的部位（FRT）を含む（図１ａ）。発現プラス ミド、pHFE１は２つの遺伝子、１がFLPリコンビナーゼ−エストロゲン・レセプ タLBD融合タンパク質をコードし、そして他がハイグロマイシン耐性をコードす る（図１ｂ）。プラスミドを、pBluescribe（Stratagene），pOG44（９），pHE6 3（22）とpCNH２（27）を使用して標準的な クローニング手順により構築した。pOG44中に存在するFLPリコンビナーゼ・コー ディング領域の終止コドンをオリゴヌクレオチド置換により突然変異させてBamH Ｉ，BsiWＩとEcoRＩ部位を導入し、そしてオープン・リーディング・フレームを 連続させた。pHE63によりコードされたエストロゲン・レセプタ内のBamHＩ部位 を、FLPリコンビナーゼとエストロゲン・レセプタLBDのコーディング領域を連結 するために使用した。BamHＩ部位に対してカルボキシ末端をもつエストロゲン・ レセプタ・コーディング領域の全ては、その終止コドンを含むプラスミド内に存 在する。 実施例２ 部位特異的組換えの調節 pNEOBGALを電気泳動（５μｇのApaＩ線状プラスミドを含む500μｌホスフェー ドバッファー生理食塩水中５×10⁶細胞；Bio-Rad Gene Pulserを使用して１mlキ ュベット中125μＦにおける300Ｖ及びネオマイシン耐性（Ｇ418，0.4mg／ml）に ついての選択により293ヒト胎児腎細胞内に導入した。耐性細胞の単一コロニー をクローン化し、そしてサザン・ブロッティングによる標的プラスミドDNAの取 り込みについて特徴付けた。標的プラスミドDNAの単一コピーの組み込みを示す クローン、Ｐ１を選択し、そしてリン酸カルシウム手順を使用して、第２プラス ミド、pHFE１によりトランスフェクトした（１μｇのXmnＩ線状pHFE１を標準的 なリン酸カルシウム法により10⁷Ｐ１細胞上に沈殿させ、これを、フェノール・ レッドを含まないDMEM、10％活性炭ストリップ胎児ウシ血清中で培養した。）。 ネオマイシンとハイグロマイシン（0.4mg／ml Ｇ418，0.4mg／mlハイグロマイ シンＢ）の両方に耐性の４つのクローンを単離し、そしてエストラジオール投与 への組換えの依存を４つの全てにおいて観察した。クローンＰ1.4について、10^{- 6} Ｍエストラジオール の存在中の組換えの時間経過を示す（図２）。

【手続補正書】 【提出日】１９９５年１２月２７日 【補正内容】 請求の範囲 １．細胞内又は適当な無細胞系において： （ａ）リコンビナーゼ活性が、リガンド結合性ドメインに結合するリガンドの 非存在中で阻害され、そして （ｂ）リコンビナーゼ活性が、リガンド結合性ドメインへのリガンドの結合に より誘導され又は変更されるように、核レセプタのリガンドに結合するアミノ酸 が含まれるように核レセプタの一部又は全部に融合された、リコンビナーゼ・タ ンパク質又はリコンビナーゼ複合体の成分を含んで成る、融合タンパク質。 ２．請求項１に記載の融合タンパク質をコードする核酸。 ３．プラスミドpHFE１（DSM9265）。 ４．核レセプタのリガンド結合性ドメインへのリガンドの結合を測定するため の方法であって、以下の段階： （ａ）組換えのためのDNA標的部位を含む、細胞又は適当な無細胞系内に、請 求項１に記載の融合タンパク質、又は請求項２に記載の核酸を導入し、 （ｂ）場合により、評価されるべき、上記リガンド、又は、リガンド（単数又 は複数）を含むと疑われる混合物を投与し、 （ｃ）組換え又は上記DNA標的部位間のその組換え速度における変化を検出す ることにより、それが存在する場合に、その融合タンパク質のリコンビナーゼ活 性を検出する、 を含んで成る方法。 ５．DNA標的部位の組換えの調節方法であって、以下の段階： （ａ）部位特異的リコンビナーゼのためのDNA標的部位を含む細胞又は適当な 無細胞系を提供し、 （ｂ）請求項１に記載の融合タンパク質とDNA標的部位を接触させ、そして （ｃ）上記融合タンパク質の核レセプタ成分についてのリガンドとその融合タ ンパク質を接触させることにより上記DNA標的部位の組換えを行う、 を含んで成る方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ， ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ， ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，Ｓ Ｅ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．細胞内又は適当な無細胞系において： （ａ）リコンビナーゼ活性が、リガンド結合性ドメインに結合するリガンドの 非存在中で阻害され、そして （ｂ）リコンビナーゼ活性が、リガンド結合性ドメインへのリガンドの結合に より誘導され又は変更されるように、核レセプタのリガンドに結合するアミノ酸 が含まれるように核レセプタの一部又は全部に融合された、リコンビナーゼ・タ ンパク質又はリコンビナーゼ複合体の成分を含んで成る、融合タンパク質。 ２．核レセプタが、ホルモン・レセプタである、請求項１に記載の融合タンパ ク質。 ３．核レセプタが、ステロイド・ホルモン・レセプタである、請求項１又は２ に記載の融合タンパク質。 ４．核レセプタが、それが請求項１に記載の融合タンパク質の特徴を保持する ような核レセプタの突然変異された誘導体である、請求項１〜３のいずれか１項 に記載の融合タンパク質。 ５．核レセプタが、脊椎動物のグルココルチコイド、エストロゲン、プロゲス テロン又はアンドロゲン・レセプタである、請求項１〜４のいずれかに記載の融 合タンパク質。 ６．リコンビナーゼ・タンパク質又はリコンビナーゼ複合体の成分が：FLPリ コンビナーゼ、Creリコンビナーゼ、ザイゴサッカロミセス・ロウキシイ（Zygos accharomyces rouxii）プラスミドpSR１由来のＲリコンビナーゼ、クルイベロ ミセス・ドロソフィラリウム（Kluyveromyces drosophilarium）プラスミドpKD １由来のＡリコンビナーゼ、クルイベロミセス・ワルチイ（Kluyveromyces wal tii ）プラスミドpKW１由来のＡリコンビナーゼ、λInt組換 え系のいずれかの成分、Gin組換え系のいずれかの成分、又はその変異体から成 る群から選ばれる、請求項１〜５のいずれか１項の融合タンパク質。 ７．リコンビナーゼ・タンパク質又はリコンビナーゼ複合体の成分が、遺伝子 融合により核レセプタ又はそのリガンド結合性ドメインに融合される、請求項１ 〜６のいずれかに記載の融合タンパク質。 ８．核レセプタ又はそのリガンド結合性ドメインが、リコンビナーゼ・タンパ ク質又はリコンビナーゼ複合体の成分のＮ−又はＣ−末端に融合されている、請 求項１〜７のいずれかに記載の融合タンパク質。 ９．核レセプタが、ペプチド・リンカーを介してリコンビナーゼ・タンパク質 又はリコンビナーゼ複合体の成分に融合されている、請求項１〜８のいずれかに 記載の融合タンパク質。 10．FLPリコンビナーゼとエストロゲン・レセプタのリガンド結合性ドメイン を含んで成る、請求項１〜９のいずれかに記載の融合タンパク質。 11．請求項１〜10の中のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードする核 酸。 12．DNA又はRNAである、請求項11に記載の核酸。 13．請求項11又は12の核酸の中の少なくとも１のコピーを含んで成る組換えベ クター。 14．プラスミドである、請求項13に記載のベクター。 15．プラスミドpHFE１（DSM9265）。 16．請求項11又は12に記載の核酸あるいは請求項13〜15の中のいずれか１項に 記載の組換えベクターを含む細胞。 17．哺乳動物細胞である、請求項16に記載の細胞。 18．核レセプタのリガンド結合性ドメインへのリガンドの結合を測定するため の方法であって、以下の段階： （ａ）組換えのためのDNA標的部位を含む、細胞又は適当な無細胞系内に、請 求項１〜９のいずれかに記載の融合タンパク質、又は請求項10又は11に記載の核 酸を導入し、 （ｂ）場合により、評価されるべき、上記リガンド、又は、リガンド（単数又 は複数）を含むと疑われる混合物を投与し、 （ｃ）組換え又は上記DNA標的部位間のその組換え速度における変化を検出す ることにより、それが存在する場合に、その融合タンパク質のリコンビナーゼ活 性を検出する、 を含んで成る方法。 19．DNA標的部位間の組換えが、それらの標的部位物理的編成の直接的な測定 により検出される、請求項18に記載の方法。 20．DNA標的部位間の組換えが、組換えの前後において標的部位を担持するDNA 領域によりコードされる特性を評価することにより検出される、請求項18に記載 の方法。 21．リガンドに結合するその能力に対する核レセプタのリガンド結合性ドメイ ン内の突然変異の効果を測定するための方法であって、以下の段階： （ａ）請求項１〜10のいずれかに記載の融合タンパク質のリガンド結合性ドメ イン内に突然変異を導入し、 （ｂ）請求項18に記載の段階（ａ）〜（ｃ）に従う を含んで成る方法。 22．DNA標的部位の組換えの調節方法であって、以下の段階： （ａ）部位特異的リコンビナーゼのためのDNA標的部位を含む細胞又は適当な 無細胞系を提供し、 （ｂ）請求項１〜10のいずれか１項に記載の融合タンパク質とDN A標的部位を接触させ、そして （ｃ）上記融合タンパク質の核レセプタ成分についてのリガンドとその融合タ ンパク質を接触させることにより上記DNA標的部位の組換えを行う、 を含んで成る方法。