JPH08511687A - ステムブロメラインプロテアーゼの医療への使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、環状ヌクレオチド経路に作用することが知られている酵素混合物であるブロメラインの一成分酵素に関するものである。したがって、酵素、即ち、ステムブロメラインプロテアーゼは、環状ヌクレオチド経路が仲介する病気及び症状の治療に使用される。

Description

【発明の詳細な説明】 ステムブロメラインプロテアーゼの医療への使用 本発明は、環状ヌクレオチドおよび池の細胞内および／または細胞外経路に依 存する様々な症状（condition）の処置における酵素混合物であるブロメライン の一成分の使用に関するものである。 ヒトの感染性及び非感染性の下痢の治療におけるタンパク質分解酵素の使用に 関する研究はすでに行われており、この件に関してはＷＯ−Ａ−９４００１４７ 号の優先権主張の基礎であるイギリス国の同時継続中の出願番号９２１３８６２ ．７号及び９３０８１６４．４号において記載されている。上記出願において、 タンパク質分解酵素、特に、ブロメラインが分泌を阻害できることを示す様々な 実験が報告された。これらの出願はまた、ブロメラインが毒素結合活性を減少さ せ、熱に不安定な毒素（ＬＴ）やコレラ毒素（ＣＴ）等の毒素及び熱に安定な毒 素（ＳＴ）等の毒素の分泌作用を阻害することも開示した。このことは、ＳＴが ＬＴやＣＴとは全く異なる作用形態を有するという事実にもかかわらずいえるこ とである。 ＬＴやＳＴは両方とも、大腸菌の腸毒素産生株（ＥＴＥＣ）によって産生され る。ＥＴＥＣ株によっては、集落形成因子抗原（colonisation factor antigen ）と呼ばれる線毛付着を生じるものもある。これらの付着は、ＥＴＥＣ株の小腸 粘膜への付着を促進し、これによって集落形成およびエンテロトキシンのデリバ リー（delivery）が容易になる。下痢性の病気は最終的にはエンテロトキシンの 産生および効率的なデリバリー（delivery）に左右される。 エンテロトキシンは、シグナル経路の活性化によって細胞による分泌 を剌激する。細胞内の内部シグナルは「二次メッセンジャー」によって運搬され る。少なくとも３つのシグナル経路が分泌に重要であることが知られている。１ つの経路は、二次メッセンジャーとしてサイクリックアデノシン一リン酸（サイ クリックＡＭＰ）を用いるものである。もう一つの経路は、二次メッセンジャー としてサイクリックグアノシン一リン酸（サイクリックＧＭＰ）を用いるもので ある。これらの２つのメッセンジャーは環状ヌクレオチドと称される。第三のシ グナル経路（Ｃａ²⁺−依存経路）は、二次メッセンジャーとしてＣａ²⁺を必要と するものである。 ＬＴの作用形態は、コレラ毒素（CT）の作用形態とほとんど一致しており、す でにかなり報告されている。簡潔にいうと、Ｂプロモーターが、刷子縁膜上に位 置するガングリオシド受容体ＧＭ１［ガラクトシル−Ｎ−アセチルガラクトサミ ニル−（Ｎ−アセチルノイラミニル）ガラクトシルグルコシルセラミド［galact osyl-N-acetylgalactosaminyl-(N-acetylneuraminyl)galactosylglucosylcerami de］］に結合する。最近の研究によって、ＬＴはＣＴは結合しない構造関連糖タ ンパク質（structurally related glycoprolein）にも結合することが示された 。結合後、Ａサブユニットが膜から輸送され、Ａ１断片がタンパク質分解活性化 後サイトゾル中に放出される。アデニル酸シクラーゼ活性は、ＮＡＤ−依存性シ クラーゼ複合体を触媒した後剌激される。その結果、アデニル酸シクラーゼは、 ＧＴＰからＧＤＰ及びリン酸基（Ｐｉ）への加水分解を一般的に含む本来のフィ ードバック調節機構の阻害によって活性状態に閉じ込められる。調節サブユニッ トの不活性化によって、二次メッセンジャーである、サイクリックＡＭP（ｃＡ ＭＰ）値が上昇する。ｃＡＭＰは、順番にタンパク質をリン酸化するプロテイン キナーゼＡと呼ばれる酵素を活性化する。タンパク質のリン酸化（即ち、リン酸 基の付加） によって、塩素チャンネルが開口し、これにより分泌が起こる。ｃＡＭＰ値の上 昇がＮａＣｌの吸収を阻害することも知られている。 ＳＴの作用形態は、ＬＴのものほどよく知られていない。ＥＴＥＣによって産 生されるＳＴは、約２，０００から５，０００Ｄａの分子量を有し、本来は非抗 原性である不均質な分子群である。一般的なＳＴの例としては、１８または１９ アミノ酸ペプチドであるＳＴ Ｉがある。腸の細胞のアデニル酸シクラーゼを活 性化するＬＴに対して、ＳＴ Ｉは粒状の腸のグアニル酸シクラーゼのみを剌激 する。ＳＴ Ｉの作用はほとんど瞬間で起こる。ＳＴの生物学的作用における初 期段階は細胞における膜結合グアニル酸シクラーゼとの相互作用であり、これに よってサイクリックＧＭＰの細胞内濃度が上昇した後、サイクリックＧＭＰに依 存性のプロテインキナーゼ（プロテインキナーゼＧ）が活性化される。Ｎａ⁺吸 収が阻害され、Ｃ１^-の分泌が刺激されて終了する。アデニル酸シクラーゼ及び 液体の分泌に関するＬＴの遅いが一様で不可逆的な効果に対して、ＳＴで誘導さ れる液体の分泌は、寿命がかなり短く、容易に逆転される。腸のＳＴ Ｉ受容体 は、他のタンパク質または糖タンパク質が役割を果たしてもよいが、グアニルシ クラーゼを有することが示された。 電解質の腸の経細胞吸収及び分泌は、エンテロサイト（enterocyte）の基底外 側膜中に位置する、Ｎａ⁺／Ｋ⁺アデノシントリホスファターゼ（ＡＴＰアーゼ） ポンプによって誘導される。水は、浸透圧の勾配に応答して電解質と共に受動的 に流れ、Ｎａ⁺及びＣ１^-が水の吸収及び分泌中の主イオンである。少腸における 吸収及び分泌プロセスは分離している。通常、電解質および水は、陰窩エンテロ サイト（crypt enterocyte）から分泌され、再吸収が絨毛エンテロサイト（vill us enterocyte）を通じて起こる。一般的には、分泌及び吸収は釣り合いを保ち 、脱水を防 止している。ＬＴ及びＣＴによって引き起こされる下痢の応答は、ｃＡＭＰが介 在する活性分泌機構（即ち、ｃＡＭＰ経路）の剌激によって起こる。ＳＴによっ て引き起こされる下痢の応答は、ｃＧＭＰ経路の刺激によって起こる。ｃＡＭＰ 及びｃＧＭＰは、ＮａＣｌの吸収を阻害することによる絨毛細胞の吸収防止効果 を発揮し、さらに（塩素チャンネルを開口することによって）陰窩細胞による活 性塩素分泌を剌激する。分泌レベルが結腸が小腸から失われた水及び電解質を再 吸収する能力を超えて上昇した場合には、重度の脱水を引き起こし、究極の場合 には死に至り兼ねない下痢が起こる。 患者がＣＴ、ＬＴまたはＳＴによる感染後適度に水分を補給した際には、超微 細構造レベルでさえ、腸粘膜の試験では細菌の侵入、白血球の浸潤及び毛細管の 損傷が示されない。正常な形態と矛盾なく、栄養素の吸収プロセスは損れていな いように見える。 本発明をなすに至った実験によって、ユッシングチャンバーにおけるエックス ビボ（ex vivo）のウサギの腸組織モデルを用いることによって、ブロメライ ン及び同様に作用する酵素がＬＴ、ＣＴ及びＳＴの分泌効果を非常に阻害する； より詳しくは、ブロメラインはＣ１^-の正味陰イオンフラックス、つまりＬＴ及 びＣＴさらにはＳＴ等の毒素の分泌促進効果を完全に阻害することが示された。 刷子縁膜上に位置する毒素受容体の修飾によって毒素の付着を防止するというブ ロメラインの作用メカニズムが報告された。また、ブロメラインは、ブロスタグ ランジンＥ₂によっておよび細胞受容体と相互作用しない他の分泌促進物質、即 ちテオフィリン、８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ、８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ及びＣａ−イオノホ アによって誘導される分泌を阻害すると考えられるので、液体の分泌を阻害する メカニズムをさらに有するとも仮説される。 報告された研究によって、ブロメラインは環状ヌクレオチド経路に効 果を有すると考えられることが示され、上記理由としては、ブロメラインがＬＴ またはＳＴ型のいずれかの機構によって引き起こされる下痢を良好に治療および 予防することが挙げられる。 したがって、ブロメラインは環状ヌクレオチドが仲介する下痢以外の病気の治 療または予防にも有用であると考えられる。このような病気の例としては、癌、 炎症（ブロメラインが非ステロイド性の抗炎症作用を有することが知られている ）、アテローム性動脈硬化症及びコレラ、ジフテリアや百日ぜき等の細菌性の感 染症が挙げられる。 ブロメラインは、幾つかの上記したような症状の治療に有効であることはすで に知られているが、これがブロメラインが広範に使用できることを示唆する根本 的理由となるわけではない。環状ヌクレオチド経路へのブロメラインの作用によ ってブロメラインがすでに有用であることが知られている様々な広範な病気及び 症状に関する説明が得られると考えられる。 ブロメラインは、ブロメリアセア（Bromeliaceae）という植物の組織中で発見 されたタンパク質分解酵素の総称である。ブロメラインは、パイナップル（アナ ナス コモサス(Ananas comosus)）の茎由来の様々な部分の混合物である。また 、ブロメラインは少なくとも２つのタンパク質分解酵素を含むが、酸性ホスファ ターゼやペルオキシダーゼ等の非タンパク質分解酵素をも含む；ブロメラインは また、アミラーゼ及びセルラーゼ活性をも有する。さらに、様々な池の成分が存 在する。 薬剤として成分の混合物を使用することに関連して様々な問題が存在し、これ らとしては一つのまたは他の成分が患者に有益にならない望ましくない副作用を 生じるという事実が挙げられる。この問題は、環状ヌクレオチド経路へのブロメ ラインの活性に応答する混合物の単一の成分が発見されれば解決できる。さらに 、単一の成分が発見されれば、ブロ メライン混合物の活性部分のみを投与することが可能になるので、患者への薬剤 物質の投与量を減少することができる。 本発明者らは、環状ヌクレオチド経路への作用に応答すると考えられるブロメ ライン混合物の成分がステムブロメラインプロテアーゼ（stembromelain protea se）として既知の酵素であることを発見した。この酵素は以前にも記載されてい るが、このような使用を報告するものではなかった。 ステムブロメラインプロテアーゼは、リトンジャ（Ritonja）ら（エフイービ ーエス レターズ（FEBS Letters）、２４７巻、ページ４１９〜４２４（１９８ ９年））によって報告され、以下に記載のアミノ酸配列を有するものである（配 列番号１）： したがって、本発明の第一の概念によると、下痢の治療以外の医療に使用され る配列番号１の配列または上記と実質的に相同である配列を有する単離及び精製 されたステムブロメラインプロテアーゼを提供するものである。 「実質的に相同である」という言葉は、２つの配列が実質的に相同性があるか どうかを容易に決定することができる当業者にはよく理解されるものである。し かしながら、通常、アミノ酸配列は、これらの配列が少なくとも４０％の相同性 を有する際に、実質的に相同であると記載できるが、本発明の目的のためには、 配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％ 、９０％または９５％の相 同性を有する配列が好ましい。さらに、比較する残基が実質的に相同性を有する ２つの配列においてちょうど同じ位置に存在する必要はなく、配列のうちの１つ が比較される配列に対して様々な挿入若しくは欠損アミノ酸残基または領域を有 するものであってもよい。 下痢の治療にステムブロメラインプロテアーゼを使用することは、ＷＯ−Ａ− ９４００１４７号に開示されており、この開示は本願と同じ優先権主張日を有す る。 ステムブロメラインプロテアーゼがブロメラインの活性成分であることが発見 されたので、本発明者らは、混合物の他の成分により望ましくない反応が生じる 患者にブロメラインの活性成分を投与することが可能であった。さらに、患者に は効果的な投与量の活性化合物を投与したまま、より少量の組成物を使用するこ とができる。 環状ヌクレオチド経路への作用に加えて、データによって、ステムブロメライ ンプロテアーゼが環状ヌクレオチドを必要としない因子による分泌をも阻害でき ることが示される。例えば、カルシウム依存経路に作用することによって分泌を 阻害することも可能であると考えられる。したがって、ステムブロメラインプロ テアーゼは、様々な環状ヌクレオチド経路自体にではなく、細胞表面にある経路 の最終段階で作用すると考えられる。 加えて、ステムブロメラインプロテアーゼが分泌を阻害すると共に分泌された 液体及び栄養素の吸収を促進するという事実もある。 他の実験モデルでは、他の生理学的に重要なレセプターに関するブロメライン の処理効果を試験した。アミノ酸、グルタミン酸、リシン及びロイシンの、およ びジペプチドであるグリシン−フェニルアラニンの流入を調査した。 流入に関する研究の結果から、グルコース、アミノ酸及びジペプチド の流入には干渉は起こらないことから、ブロメラインが栄養素の取り込みに重要 なレセプターに悪影響は及ぼさないことが示唆された。事実、ブロメラインは、 これらの栄養素の吸収を増加させると考えられた。 ステムブロメラインプロテアーゼの活性を説明する理論の一つとしては、ステ ムブロメラインプロテアーゼは、塩素または他のチャンネルに作用してチャンネ ルが開口するのを防止するまたはチャンネルを遮断することが挙げられる。これ らの作用のいずれかが環状ヌクレオチド経路へのステムブロメラインプロテアー ゼの作用を説明するのではないかと考えられるが、環状ヌクレオチドが仲介する 病気または症状の治療におけるステムブロメラインプロテアーゼの有効性が上記 報告の正確さによって変化するものではないことを強調しなければならない。ス テムブロメラインプロテアーゼが本当に塩素または他のチャンネルを遮断するな らば、これによりこの作用が細胞内作用ではないことが示される。 しかしながら、これらの観察に関する重要な点は、ステムブロメラインプロテ アーゼが環状ヌクレオチドが介する病気または症状に影響を与えるということで ある。 したがって、単離及び精製されたステムブロメラインプロテアーゼは、有効量 のステムブロメラインプロテアーゼを患者に投与することからなる、環状ヌクレ オチド経路が仲介する病気または症状の治療または予防方法に使用される。 本発明の第二の概念によると、下痢以外の環状ヌクレオチドが仲介する病気ま たは症状の治療または予防を目的とする薬剤の調製における単離及び精製された ステムブロメラインプロテアーゼの使用を提供するものである。 本発明は、塩素チャンネルまたは他のチャンネルの開口によって応答を誘導す る生物によって引き起こされる病気または症状を処置する（add ress）のに有効である。さらに、ステムブロメラインプロテアーゼは、シグナル 経路、即ちｃＡＭＰ、ｃＧＭＰまたはカルシウム依存経路のいずれかを活性化す ることによって分泌を仲介する感染性のあるいは非感染性の物質に対して有効で あると考えられる。処置可能な病気または症状の例としては、癌、炎症（ブロメ ラインが非ステロイド性の抗炎症作用を有することが知られている）、アテロー ム性動脈硬化症及びコレラ、ジフテリアや百日ぜき等の細菌性の感染症が挙げら れる。 ステムブロメラインプロテアーゼは、経口、経鼻（nasal administration）、 経頬（buccal administration）若しくは経肛門（anal administration）投与等 の腸管内投与、および静脈内或いは筋肉内注射による等の腸管外投与など、様々 な経路によって投与される。しかしながら、経口投与が好ましい。 したがって、本発明の第三の概念によると、単離されたステムブロメラインプ ロテアーゼおよび製薬上使用できる賦形剤または担体からなる薬剤組成物を提供 するものである。 経口投与される際に胃からステムブロメラインプロテアーゼ活性を維持するの を助けるために、腸まで保護する（enteric-protected）調製物中に酵素を配合 することが望ましい。他の経口投与可能な配合物としては、シロップ、エリキシ ル剤および硬質及び軟質ゼラチンカプセルが挙げられ、これらは腸で溶解するよ うに被覆されて（enteric-coated）いてもよい。 ブロメライン活性は広いｐＨの範囲（ｐＨ２〜９）で安定である。したがって 、胃の酸性条件からステムブロメラインプロテアーゼを腸まで保護する（enteri c-proiect）（または腸で溶解するように被覆する（enteric-coat））必要はな い。しかしながら、腸の酸性プロテアーゼによる消化から酵素を保護する必要が ある。したがって、ステムブロメライン プロテアーゼは、例えば重炭酸塩等の緩衝剤と共に投与されてもよい。 好ましいデリバリーシステムは、確実に腸の受容体部位を完全に除去しおよび ／またはタンパク質分解酵素にすべてのエンテロサイト（enterocyte）が接触で きるように、酵素の放出を制御するシステムである。回腸に至るまでは保護（消 化及び吸収を防止するための）と放出とを組み合わせることが望ましい。 ブロメラインの投与量は、従来、ローレル単位（Rorer unit）、ＦＩＰ単位、 ＢＴＵ（bromelaim trypsine unit）（ブロメライントリプシン単位）、ＣＤＵ （casein digestion unit）（カゼイン消化単位）、ＧＤＵ（gelatin digestion unit）（ゼラチン消化単位）またはＭＣＵ（milk clotting unit）（ミルク凝 集単位）で測定される。タンパク質分解酵素活性の１ローレル単位は、２８０ｎ ｍにおける吸光度が０．００００１／分増加するようなｐＨ７及び２５℃で標準 化カゼイン基質を加水分解する酵素量として規定される。ブロメライン活性のＩ ＦＩＰ単位は、１μモルのチロシンと同等の２７５ｎｍにおける吸光度を呈する １分当たりの量のペプチドが、特殊なタンパク質沈殿試薬によって沈殿せずに、 遊離するような初期速度で標準的な条件下でカゼイン（ＦＩＰ制御された）の適 当な調製物を加水分解するような量の標準調製物中に含まれるものをいう。ＢＴ Ｕ、ＣＤＵ、ＧＤＵおよびＭＣＵは、文献において定義されている通りであり、 以下に説明する： ＢＴＵ １ブロメライントリプシン単位は、検定の条件下（例えば、ｐＨ５、３０℃で 酸で変性されたヘモグロビン基質の消化後）で１分当たり１μモルのチロシンを 遊離するような酵素量である。 ＣＤＵ ｐＨ７．０で標準的なカゼイン基質から３７℃で１分間消化後１μｇ のチロシンを遊離するような酵素量である。 ＧＤＵ ４５℃、ｐＨ４．５で２０分間消化後標準ゼラチン溶液から１ｍｇ（１０^-3ｇ ）のアミノニトロゲン（amino nitrogen）を遊離する酵素活性をいう。 1,100 BTU/g=750 CDU/mg=1,200 GDU/g 正確な投与量は医師または臨床医のコントロール下で行われるが、一日当たり の投与量が５０〜４，０００ＧＤＵ／日が適当であり、例えば、１００〜１，０ ００ＧＤＵ／日であることが知られている。一日の投与は、一日に１回以上、例 えば、一日に２、３回若しくは４回等のアリコートに分けて投与されてもよい。 本発明を、以下の実施例によってさらに説明する。実施例は、以下に示される 添付図を参照するものである： 図１は、ウサギの回腸のＩ_scに関する精製ＬＴの効果を示すものである。シン ボルは４匹の動物での各時間における平均値を表わす。ＬＴ（２．５μｇ／ｍｌ ）またはＰＢＳ（１５μ１）を０時間に粘膜浸漬溶液（mucosal bathing soluti on）に添加した。矢印は、５ｍＭのテオフィリンを漿膜浸漬溶液（serosal bath ing solution）に添加した時間を示すものである。 図２は、回腸のI_scに関するブロメラインの効果を示すものである。カラムは 、ＬＴ（２．５μｇ／ｍｌ）を添加してから９０〜１００分後の、およびテオフ ィリン（５ｍＭ）を添加してから５分後の平均値を表わす。４匹の動物の回腸組 織は、毒素を添加する前に３０分間ブロメライン（ｂｒｏｍ）で予め処理した。 コントロールチャンバーは、ブロメラインに抗体を加えたもの（Ｂ／Ａｎｔｉ− Ｂ）、抗体（Ａｎｔｉ−Ｂ）またはＰＢＳのみで予め処理した。 図３は、Ｉ_scに関するＰＢＳまたはブロメライン（１５μｇ／ｍｌ）による回 腸組織の予備処理効果を示すものである。ＣＴ（１μｇ／ｍｌ）を０時間に粘膜 浸漬溶液（mucosal bathing solutlon）に添加した。試験した動物数は９匹であ った。バー付きのシンボルは選択時間における９匹の動物に関する平均値±ＳＥ を表わす。矢印は、Ｉ_sc値がプラトーに到達した後に５ｍＭのテオフィリンを漿 膜浸漬溶液（serosal bathing solullon）に添加した時間を示すものである。 図４は、Ｉ_scに関するＰＢＳまたはブロメライン（１５μｇ／ｍｌ）による回 腸組織の予備処理効果を示すものである。ＳＴ（３００単位）を０時間に粘膜浸 漬溶液に添加した。試験した動物数は６匹であった。バー付きのシンボルは選択 時間における平均値±ＳＥを表わす。矢印は、Ｉ_sc値がプラトーに到達した後に ０．２ｍＭの８−ブロモ−ｃＧＭＰ（8 bromo cGMP）を漿膜浸漬溶液に添加した 時間を示すものである。 図５は、８−ブロモ−ｃＡＭＰ（8-bromo-cAMP）によって生じたＩ_sc及びＰＤ の変化に関するＰＢＳ、ステムブロメラインプロテアーゼ及びブロメラインによ る回腸組織の予備処理効果を示すものである。 図６は、８−ブロモ−ｃＧＭＰ（8-bromo-cGMP）によって生じたＩ_sc及びＰＤ の変化に関するＰＢＳ、ステムブロメラインプロテアーゼ及びブロメラインによ る回腸組織の予備処理効果を示すものである。 図７は、テオフィリン及びＰＥ₂によって生じたＩ_scの変化に関するＰＢＳま たはブロメラインによる回腸組織の予備処理効果を示すものである。 図８は、カルシウム−イオノホア Ａ２３１８７によって生じたＩ_SCの変化に 関するＰＢＳまたはブロメラインによる回腸組織の予備処理効果を示すものであ る。 図９は、分泌の外因性メディエイタによって生じたＩ_SCの変化に関す るＰＢＳまたはブロメラインによる回腸組織の予備処理効果およびブロメライン の吸収刺激能を示すものである。実施例１：ユッシングチャンバーにおけるＬＴ作用に関するタンパク質分解酵素 による粘膜組織の予備処理の調査 ユッシングチャンバー（ユッシング（Ussing）及びゼラーン（Zerahn）、アク タ フィズ スカンジナヴ（Acta，Phys．Scandinav.）、２３巻、ページ１１０ 〜１２７（１９５１年））にのせたウサギの腸組織を使用は、腸の組織の輸送プ ロセスを研究するための古典的な技術である。このエックス ビボ（ex vivo） のモデルの使用はまた、エンテロトキシンの作用メカニズムの研究に非常に重要 であることが知られている。ＣＴまたはＬＴを含む溶液は、のせた組織の粘膜側 に添加されると、イン ビボ（in vivo）でウサギの回腸にＣＴまたはＬＴを灌 流させた際に観察される分泌反応と同様の細胞からの分泌反応を誘導する。毒素 を添加することによって、正味陰イオン分泌フラックスの剌激による回腸粘膜の 経上皮電位差（transepitherial electrical potential difference）（ＰＤ） 及び短回路電流（short circuit current）（Ｉ_sc）が上昇する。これによって 、漿膜側が管腔側に比例してよりプラス（positive）になる。陰電荷の正味フラ ックスが、高インピーダンス電位差計（high impedance potentiometer）に連結 されたマッチド参考電極（matched reference electrode）からなる電気機器に よって電気化学的に検出できる。 ユッシングチャンバーモデルは毒素作用のモニターに有用であるため、多くの 抗下痢剤の毒素の分泌作用の逆転に関する有効性が試験されてきた。本実施例は 、ＬＴ毒素分泌活性の阻害へのタンパク質分解酵素の使用を観察できるように設 計された実験に関するものである。同時に、グルコース−Ｎａ⁺能動共輸送機能 に関する効果が組織の生存能の指示体として検出される。 ファサノ（Fasano）ら（プロック ナショル アカデ サイ ユーエスエー（ Proc．Natl．Acad．Sci．USA）、８８巻、ページ５２４２〜５２４６（１９９１ 年））によって記載された修飾が施されたフィールド（Field）ら（アム ジェ ー フィジオル（Am．j．Physio1.）、２２０巻、ページ１３８８〜１３９６（ １９７１年））にしたがって、実験を行った。雄の成体ニュージーランドホワイ トラビット（２〜３ｋg）をメトキシフルランの吸入によって麻酔をかけた後、 空気塞栓によって殺した。回腸末端の１５ｃｍの断片を素早く切り出し、腸間膜 縁に沿って切開した。次に、回腸を洗浄し管腔内容物を洗いだし、短い太針によ る切開（blunt dissection）によって筋肉層及び漿膜層を取り除いた。粘膜の能 動輸送プロセスは、上記層を取り除かれない回腸より取り除かれた回腸の方が良 好に維持されることが報告されている（フィールド（Field）ら、１９７１年、 上記参照）。このようにして得られた調製物は、上皮、粘膜固有層及び粘膜筋板 から構成された。１匹の動物から４つの粘膜断片を同様にして調製し、これらを １．１２ｃｍ²の開口を有するルシットのユッシングチャンバー（Lucite Ussing chamber）にのせた。組織の各表面を、ＮａＣｌ（５３ｍＭ）、ＫＣｌ（５ｍＭ ）、Ｎａ₂ＳＯ₄（３０．５ｍＭ）、マンニトール（３０．５ｍＭ）、Ｎａ₂ＨＰ Ｏ₄（１．６９ｍＭ）、ＮａＨ₂ＰＯ₄（０．３ｍＭ）、ＣａＣｌ₂（１．２５ｍＭ ）、ＭｇＣｌ₂（１．１ｍＭ）及びＮａＨＣＯ₃（２５ｍＭ）を含む新たに調製し たリンガー緩衝液（Ringers buffer）中に浸漬し続けた（１表面当たり１０ｍｌ ）。この浸漬溶液は、恒温循環ポンプに連結された水ジャケット付きの水槽（wa ter-jacketed reservoir）で３７℃に維持され、９５％Ｏ₂／５％ＣＯ₂が流され た。 さらに、ＰＤ（組織の漿膜側に対する粘膜側で測定された電圧差）およびＩ_SC （ＰＤを０にするのに必要な電流量）を前記（フィールド（Fie ld）ら、１９７１年、上記参照）したようにして測定した。ＰＤがプラス（posi tive）であることから、漿膜側の電位は管腔の電位より高い、即ち、粘膜（Ｍ） から漿膜（Ｓ）への正味フラックスがプラスであることが示された。各動物の組 織の抵抗（Ｒ）もまた、個々の動物間の結果を比較できるように、オームの法則 （Ｉ_SC＝ＰＤ／Ｒ）によって計算した。組織をのせる前に、液体の抵抗（Ｒ_f） を測定し、計算式に導入した。組織をのせた直後でかつ実験に入る前、組織が安 定状態になるまで約１０分間隔でＩ_SCを測定した。同一の動物からの４組織断片 を同時にのせ、各実験に用いた。回腸組織の穿孔によるシステムの漏れを試験す るため、２００μｌのリンガー液で希釈した０．５ｍＭのグルコース及びマンニ トールの溶液を実験の前にそれぞれ漿膜及び粘膜側に添加した。 組織が平衡に達した（時間０）直後、試験物質（０〜１００μｌ）を粘膜側に 加えた。等容のサンプルを漿膜側に添加し、浸透圧の均衡を維持した。次に、Ｉ_SC 、ＰＤ及びＲの変化を５〜１０分おきに記録した。各実験が終了した際、２０ ０μｌの０．５Ｍのグルコース溶液を各チャンバーの粘膜側に加えた。グルコー スに応答してＩ_scが上昇した組織（組織の生存能を示す）のみを分析した。グル コースを添加した際のＩ_SCの上昇は、細胞中へのグルコースとのＮａ⁺の起電性 共役転移（electrogenic coupled transfer）に介されたＮａ⁺吸収の促進による ものである。 ３０分間所定の濃度範囲（０〜１，０００μｇ／ｍl）のブロメラインにさら したウサギの回腸断片を光学顕微鏡及び電子顕微鏡によって調べた。ＰＢＳのみ にさらされた組織を比較として用いた。 光学顕微鏡では、組織を中性の緩衝化ホルマリン中で固定し、ヘマトキシリン ／エオジン及び組織のグラム染色によって染色した。電子顕微鏡では、組織は３ ％（ｖ／ｖ）のグルタルアルデヒド／０．１Ｍ カコ ジル酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）中に固定し、必要になるまで４℃で保存 した。 １ａ 光学顕微鏡 組織を試験するときには、腸絨毛及び刷子縁内層（lining）における形態学的 及び構造学的変化に特に注意した。 １，０００μｇ／ｍｌのブロメラインにさらした組織サンプルは処理期間終了 時のグルコース添加に反応しなかったことから、組織はもはや生存していないこ とが示された。これらのサンプルを光学顕微鏡で調べたところ、顕著な目立つ空 胞変性が認められた。絨毛構造がなく、絨毛の残存物が並んだそれぞれの上皮細 胞の凝固壊死があった。 ５０μｇ／ｍlのブロメラインで処理された回腸組織はグルコース添加後も生 存していた；しかしながら、Ｉ_SCの応答が最大ではないことから、ある程度の組 織の壊死があることが示された。光学顕微鏡によって上記所見が確認され、サン プルはある程度の管腔上皮細胞の凝固壊死および空胞変性を示すことから、死ん でいるまたは死にかけている細胞があることが分かった。しかしながら、これら の組織調製物の絨毛構造はそのまま維持されていた。 １０μｇ／ｍｌのブロメラインで処理された組織には、背の高い柱状の上皮が 並んだ絨毛を有する粘膜がそのままあった。一般的には組織は正常であるように 見えるが、凝固壊死を示している細胞もあった。ブロメライン処理してから３０ 分後のグルコース添加に対して大きな反応を示したことから、健常な生存してい る組織であることが示された。したがって、ブロメライン処理によって影響を及 ぼされた組織によっては、組織の吸収能に悪影響を及ぼされたとは考えられない ものもあった。 １ｂ 電子顕微鏡 １０μｇ／ｍｌのブロメラインで処理された組織を透過電子顕微鏡に よって調べたところ、微絨毛には形態学的な変化は示されなかった。糖衣または 粘液の重墨（overlay）はそのままであるように見えた。 １ｃ 回腸粘膜のＩ_SCに関するＬＴの効果 回腸粘膜の管腔側への２５μｇの精製ＬＴ（最終濃度は２．５μｇ／ｍｌであ った）の添加によって生じるＩ_SCの変化を図１に示す。Ｉ_SCは毒素の添加後４０ 〜５０分で上昇し始めた。組織をＰＢＳのみにさらしたチャンバーでは、ほとん どＩ_SCの変化はなかった。研究によって、ＣＴ添加後４０〜６０分で最大効果ま で徐々に上昇し、この最大効果はさらに数時間にわたって生じた。すべての遊離 毒素を除去してもこの効果は持続した。組織に接触させる前に加熱処理した毒素 は効果がなかった。さらに、組織の漿膜側に接触させた毒素はＩ_SCに関して効果 がなかったことから、刷子縁膜上に位置する受容体に結合した後にのみ作用する ことが示された。 メチルキサンチンである、テオフィリンを組織の漿膜側に加え、ｃＡＭＰによ るＩ_SCの変化を観察した。テオフィリンは、環状ヌクレオチドホスホジエステラ ーゼを阻害するため、ＡＭＰから５´−ＡＭＰへの変換を阻害することによって ｃＡＭＰ値を上昇させる。Ｎａ及びＣｌフラックスに関するテオフィリン、ｃＡ ＭＰ単独および飽和量のＣＴの効果は同様である。しかしながら、フラックスに 関するテオフィリンの効果はたった数分後に生じる。 毒素処理した組織の漿膜側にテオフィリン（最終濃度 ５ｍＭ）を添加するこ とによって、Ｉ_SCはさらに上昇した。ＰＢＳで処理した粘膜に関するテオフィリ ンによるＩ_SCの上昇は、毒素とテオフィリンを合わせて処理することによる最終 的なＩ_SCと等しかった。これによって、ＬＴ添加によるＩ_SCの変化はcＡＭＰの 毒素作用によるものであり、他のメカニズムによるものではないことが示された 。Ｉ_SCの同様の変化によっ て、本実験において使用された毒素量、従ってその活性が最大でなかったことも 示された。すなわち、最大量のｃＡＭＰ、従ってＩ_SCを発現するためにはすべて の受容体を占有するために、より多くの毒素が必要であった。 実験が終了した際に、グルコースをチャンバーの管腔側に添加した。これによ ってＩ_SCがさらに上昇したから、この組織は生存していることが示された。 １ｄ 大腸菌の熱に不安定な毒素（ＬＴ）によって引き起こされる分泌作用に関 するブロメラインの効果 ＰＢＳで希釈したブロメライン（最終濃度 １０μｇ／ｍｌ）を組織の粘膜及 び漿膜側の両方に加えた。コントロールチャンバーには、ブロメライン（１００ μｇ／１０μｌ）をチャンバーに添加する前に等容の抗ブロメライン抗体（Ｉｇ Ｇ）（０．５ｍｇ／ｍｌ）と共に初めに予めインキュベート（３７℃で３０分） したものを用いた。他のチャンバーは、抗体またはＰＢＳ単独を含んでいた。次 に、すべてのチャンバーを３０分間インキュベートし、粘膜組織を十分にブロメ ラインで予備処理した。毒素を添加する前に、チャンバーから完全にリンガー液 （上記参照）を除き、２回洗浄して抗体及びブロメラインを完全に除去した。さ らに、チャンバーを新たなリンガー液で再度満たし、組織を安定化した。さらに 、ＬＴ（２．５μｇ／ｍｌ）を粘膜側に加え、実験を上記と同様にして終了した 。 図２は、ＬＴの添加前にブロメラインまたはコントロール物質で組織を予備処 理することによって生じるＩ_SCの変化を示すものである。すべてのコントロール チャンバーでは、Ｉ_SCは、上記したように毒素の添加後４０〜５０分で上昇し始 めた。この結果から、抗ブロメラインＩｇＧ及び抗体と共に予めインキュベート されたブロメラインはＬＴの作用に 何等影響を及ぼさないことが示される。また、リンガー緩衝液の交換は組織に何 等影響を及ぼさないことも示される。 ブロメラインで予め処理されたチャンバーでは、６０分後でもＩ_SCは変化しな かったことから、ブロメラインはＬＴの分泌作用を完全に阻害していることが示 された。コントロールチャンバーにテオフィリンを加えることによって４０〜５ ０％のＩ_SCがさらに上昇した。比較として、ブロメラインで処理したチャンバー にテオフィリンを加えると、同様のＩ_SCの上昇を示したのみであった。したがっ て、Ｉ_SCの最終的な変化は、コントロールチャンバーにおけるＬＴ及びテオフィ リンの合わせた効果のものより４０％〜５０％少なかった。これから、液体の分 泌を阻害するブロメラインの他の作用メカニズムが存在すると考えられる。ブロ メラインは、ｃＡＭＰの産生を阻害することが知られている、ブロスタグランジ ンの合成を阻害することが報告されている（タウッシング(Taussing)およびバト キン(Batkin)、１９８８年）。アスピリン、インドメタシン及びイブプロフェン 等のプロスタグランジンの合成を阻害する他の分子は、細菌毒素によって誘導さ れる腸の液体の分泌を阻害することも示された（ゴッツ(Gots)ら、１９７４年； フィンチ(Finch)及びカッツ(Katz)、１９７２年；ピーターソン(Peterson)ら、 １９８８年）。 これらのデータによって、ブロメラインがＣ１^-の正味陰イオンフラックス、 従ってＬＴの分泌作用を完全に阻害したことが示される。これらのデータから、 ブロメラインは、腸の受容体への毒素の結合の阻害能以外にも、液体の分泌を阻 害するメカニズムをさらに有することも示される。プロスタグランジン（実施例 ２ｂを参照）またはテオフィリンと組み合わせてブロメラインで処理した組織中 の全Ｉ_SC値はコントロール組織と同等のレベルには到達しなかったという観察は 、上記仮説を支持するものである。 実験の最後にグルコースを添加することによってＩ_SCがさらに上昇したことか ら、グルコース−Ｎａ⁺輸送が影響を受けなかったことが示された。Ｎａ吸収の 促進はタンパク質分解酵素による組織の予備処理によって実質的に影響を受けな いと考えられるため、ブロメラインは粘膜に広範な生理学的な損傷を与えないと 考えられる。 上記結果は、上記したように光学顕微鏡を用いた研究によって、さらには実施 例７ｂに記載された流入に関する研究によって、確認される。実施例２：ユッシングチャンバーにおけるＣＴ作用に関するタンパク質分解酵素 による粘膜組織の予備処理の調査 ２ａ コレラ毒素（ＣＴ）によって引き起こされる分泌作用に関するブロメライ ンの効果 実施例１ｄに記載された実験と同様の実験において、ＰＢＳで希釈されたブロ メライン（最終濃度 １５μｇ／ｍｌ）を回腸組織の粘膜及び漿膜側の両方に加 えた。コントロール組織はＰＢＳ単独で処理した。チャンバーを３０分間インキ ュベートし、上記と同様にして洗浄した。次に、ＣＴ（１０μg）を粘膜側に添 加し、前記と同様にして実験を終了した。 図３は、ＰＢＳまたはブロメラインで組織を予め処理することによって生じる Ｉ_SCの変化を示すものである。データから、ブロメラインはＩ_SC及びＰＤの変化 、従ってＣＴによって生じた分泌作用を抑制したことが示される。ブロメライン によって誘導されたＩ_SC及びＰＤ値の減少率は、それぞれ６０％（ｐ＝０．００ １）および７０％（ｐ＝０．００２）であった。表１にユッシングチャンバーデ ータを示す。 Ｉ_SC及びＰＤ値がプラトーに達した際にテオフィリンを組織の漿膜側に添加す ると、毒素の最大の効果が示された。実験終了時にテオフィリンを加えると、実 施例１において記載したＬＴ実験において観察されたのと同様にして、ブロメラ インで処理およびＰＢＳで処理した両方の組織のＩ_SC及びＰＤが同等に上昇した 。この上昇によって、コントロール組織と比較した場合、ブロメラインで処理し た組織における全Ｉ_SC及びＰＤ（毒素及びテオフィリンの効果の合計）は最終的 に４４％減少した（表１）。この観察によって、液体の分泌を阻害する他のメカ ニズムが存在することが示唆される。 ２ｂ ブロメライン処理された組織におけるＩ_SCに関するプロスタグランジンＥ ₂（ＰＥ₂）の効果 ブロメライン処理した組織における全Ｉ_SC値の減少がプロスタグランジン量が 減少した結果としてのｃＡＭＰの細胞内の量が減少したことによるものであるか どうかを観察するために、Ｉ_SC及びＰＤ値がプラトーに達した際に、外因性のプ ロスタグランジンをチャンバーの漿膜側に加えた。ＰＥ₂（１×１０⁵Ｍ）をテオ フィリンの代わりに添加した。表１のユッシングチャンバーデータ中に示された データから、コントロール（ＰＢＳ処理）チャンバーにおけるＣＴ及びＰＥ₂の 合計した効果と比較すると、ブロメライン及びＣＴで処理した組織における全Ｉ_SC 及びＰＤがそれぞれ４８％及び６４％減少していることが示される。 これらのデータによって、ブロメラインが液体の分泌を抑制する他のメカニズ ムが報告されたプロスタグランジンの合成の阻害能によって完全には説明できな いことが指摘される。実施例３：大腸菌の熱に安定な毒素（ＳＴ）による分泌作用に関するブロメライ ンの効果 ＬＴ（実施例１ｄ）及びＣＴ（実施例２ａ）を用いた実験と同様にし て実験を行った。ＰＢＳで希釈したブロメライン（最終濃度 １５μｇ／ｍｌ） を回腸組織の粘膜及び漿膜側の両方に添加した。コントロール組織はＰＢＳ単独 で処理した。チャンバーを３０分間インキュベートし、上記したのと同様にして 洗浄した。次に、ＳＴ（３００単位）を粘膜側に加え、前記したのと同様にして 実験を終了させた。 図４は、ＰＢＳまたはブロメラインで組織を予備処理することによって生じた Ｉ_SCの変化を示すものである。データから、ブロメラインはＩ_SC及びＰＤの変化 、従ってＳＴによって生じる分泌作用を抑制することが示される。ブロメライン によって誘導されたＩ_SC及びＰＤ値の減少は、それぞれ３４％（ｐ＝０．０３１ ３）及び３３％（ｐ＝０．０６）であり、この結果を表１に示す。 ｃＧＭＰの生産を剌激することが知られているｃＧＭＰの類似体である、８− ブロモグアノシン−３´，５´−サクリックーリン酸（8-bromoguanosine-3′,5 ′-cyclic monophosphate）（最終濃度 ０．２ｍＭ）を、ＰＤ及びＩ_SC値がプ ラトー（ＳＴによる最大の応答性）に達した際に、組織の漿膜側に添加した。ブ ロメライン処理およびＰＢＳ処理した両方の組織のＩ_SC及びＰＤがさらに同様に 上昇したことは、ｃＧＭＰ添加の結果であると考えられ、ブロメライン処理した 組織における最終的な全Ｉ_SC及びＰＤ値はコントロール組織の値よりかなり小さ かった。上記結果を図４及び表１に示す。 組織をＣＴまたはＬＴを添加する前にブロメラインで処理すると、先の実験で 観察されたように、全ＰＤ及びＩ_SC値はかなり減少した。毒素で処理した後にテ オフィリンまたはＰＥ₂を添加したコントロール組織の最終的なＩ_SC及びＰＤの 合計は、ブロメラインで予め処理した組織の値に比べてかなり高かった。 ブロメラインが、腸の受容体への毒素の結合能を阻害する以外に、液 体の分泌を阻害するさらなるメカニズムを有すると仮説される。ブロメラインが 腸の細胞への毒素の付着を防止するのみであるとすると、すべての細胞内の生化 学経路は影響を及ぼされない。ブロメライン処理した組織における全Ｉ_SC及びＰ Ｄ値は二次メッセンジャー（即ち、８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ、ＰＥ₂若しくはテオフ ィリン）を添加した後ＰＢＳで処理した組織と同等のレベルに到達しないという 観察結果から、ブロメラインは細胞内の内部シグナルには影響を与えないと考え られる。ブロメラインの８−Ｂｒ−ｃＧＭＰによって誘導された全Ｉ_SC及びＰＤ の変化の減少能は、環状ヌクレオチドが生成した後の効果を含むものである。例 えば、クロルプロマジン及びインドメタシン等の、他の分子は、細胞内プロセス に影響を及ぼすが、これらの分子は毒素（ＳＴ）のサブマキシマルな（submaxim al）投与量に対してのみ活性があると思われる。さらに、これらの分子は、望ま しくない副作用があるため下痢に対する臨床使用には適切ではないことが分かっ た。これに対して、ブロメラインは、毒素の最大投与量に対しても有効であり、 臨床的にも安全であることが示された。 上記したすべての実験によって、ブロメラインは細菌のエンテロトキシンによ って誘導された分泌を有効に阻害し、さらには他の分泌促進物質（内部シグナル に対する二次メッセンジャー）と組み合わせた細菌の毒素によって誘導された分 泌をも有効に阻害することが示される。 以下の一連の実施例（実施例４から実施例７）では、細菌毒素を添加せずに、 二次メッセンジャーのみによって誘導された分泌のブロメライン及びステムブロ メラインによる阻害能を記載する。実施例はまた、ブロメラインが分泌の外因性 メディエイタによって誘導された（つまり、ホルモンまたは神経伝達物質または 栄養素によって誘導された）分泌を阻害できることを示すものである。実施例４：環状ヌクレオチドによって誘導された分泌に関する未精製ブロメライ ンおよび精製ステムブロメラインブロテアーゼの効果 細菌毒素を使用しないこと以外は実施例１から３に記載された実験と同様にし て実験を行った。ＰＢＳで希釈したブロメラインまたはステムブロメライン（最 終濃度 １５μｇ／ｍｌ）を回腸組織の両側に加えた。コントロール組織はＰＢ Ｓのみで処理した。チャンバーを３０分間インキュベートし、上記したのと同様 にして洗浄した。次に、ｃＡＭＰ及びｃＧＭＰの類似体（８−ブロモ−ｃＡＭＰ 及び８−ブロモ−ｃＧＭＰ；０．２ｍｌＭ）を組織の漿膜測に加えた。これらの 類似体は、環状ヌクレオチドの上昇レベルを剌激することによって分泌を誘導す る。 図５および図６は、ＰＢＳ、ブロメラインまたはステムブロメラインのいずれ かで組織を予め処理することによって生じるＩ_SC及びＰＤの変化を示すものであ る。データによって、ブロメライン及びステムブロメラインは、ＰＤ及びＩ_SC、 従って８−ブロモ−ｃＡＭＰ及び８−ブロモ−ｃＧＭＰの両方によって誘導され た分泌を抑制するのに等しく有効であることが示される。 記載されたデータによってまた、ブロメライン及びステムブロメラインは環状 ヌクレオチドの細胞内レベルが上昇することによって生じる分泌を有効に阻害す ることも示される。上記発見は、ステムブロメラインプロテアーゼがブロメライ ンの抗下痢作用に応答できることを指摘するものである。実施例５：テオフィリンおよびプロスタグランジンＥ₂によって引き起こされる 分泌に関するブロメラインの効果 実施例４に記載された実験と同様にして実験を行った。ＰＢＳで希釈したブロ メライン（最終濃度 １５μｇ／ｍｌ）を回腸組織の両側に加えた。コントロー ル組織はＰＢＳのみで処理した。チャンバーを３０分 間インキュベートし、上記したのと同様にして洗浄した。テオフィリン（９ｍｇ ）及びプロスタグランジンＥ₂（１×１０^-5Ｍ）を組織の漿膜側に加えた。これ らの分子は、ｃＡＭＰ経路の作用による分泌を刺激する。 図７は、ＰＢＳまたはブロメラインのいずれかで組織を予め処理することによ って生じるＩ_SCの変化を示すものである。データによって、ブロメラインは、Ｉ_SC 、従ってテオフィリン及びプロスタグランジンによって引き起こされる分泌を 抑制するのに有効であることが示される。実施例６：カルシウム依存経路によって引き起こされる分泌に関するブロメライ ンの効果 実施例４に記載された実験と同様にして実験を行った。ＰＢＳで希釈したブロ メライン（最終濃度 １５μｇ／ｍｌ）を回腸組織の両側に加えた。コントロー ル組織はＰＢＳのみで処理した。チャンバーを３０分間インキュベートし、上記 したのと同様にして洗浄した。カルシウムイオノホア（Ａ２３１８７）（最終濃 度 ５×１０^-7Ｍ）を組織の漿膜側に加えた。Ｃａ−イオノホアは、小胞体にお ける貯蔵物からカルシウムを放出させる。細胞内のＣａ²⁺レベルの上昇によって 、Ｃａ²⁺−依存経路の作用による分泌が剌激される。 図８は、ＰＢＳまたはブロメラインのいずれかで組織を予め処理することによ って生じるＩ_SCの変化を示すものである。データによって、ブロメラインは、Ｉ_SC 、従ってＣａ−依存経路によって引き起こされる分泌を抑制するのに有効であ ることが示される。実施例７：腸の正常な機能に関する未精製ブロメラインの効果 ７ａ 液体の吸収促進 実施例４に記載された実験と同様にして実験を行った。ＰＢＳで希釈したブロ メライン（最終濃度 １５μｇ／ｍｌ）を回腸組織の両側に加 えた。コントロール組織はＰＢＳのみで処理した。チャンバーを３０分間インキ ュベートし、上記したのと同様にして洗浄した。組織をリンガー液中に９０分間 浸漬し続けた。９０分間のＩ_SCの変化を監視し、分泌の外囚性メディエイタ（例 えば、ホルモン、神経伝達物質及び栄養素）の効果および組織が吸収または分泌 しているかどうかを観察した。 図９は、ＰＢＳまたはブロメラインのいずれかで組織を予め処理することによ って生じるＩ_SCの変化を示すものである。データによって、組織のブロメライン 処理は、分泌の外因性メディエイタによって誘導されたＩ_SCを減少するのに有効 であり、さらに効果的に吸収を剌激することが示される。これらのデータによっ て、ブロメラインは非感染性下痢に対しても有効であることも示される。ブロメ ラインが分泌を阻害し吸収を促進できるという事実はまた、ブロメラインが有効 に下痢を治療及び予防することが示されるという点ですばらしい発見である。 ７ｂ 栄養素の吸収促進 栄養素の取込みに必要である他の生理学的に重要な受容体に関するブロメライ ンの効果を示すために、実験を行った。これらの研究によって、ブロメラインは 栄養素の吸収をも促進することが発見できた。 流入実験：本発明者らは、ブロメラインの存在下および非存在下でのグルコー スの流入（インキュベーション培地から上皮へのグルコースの初期の一方向流入 率）を試験した（グアンダリーニ(Guandalini)、エス ファサノ(S Fasano)、エ ー アルビビ(A Albibi)、エフ マーチェサノ(F Marchesano)、ジー ノセリノ (G Nocerino)、エー デ カルティス(A De Curtis)、エム ルアルテリ(M Rual telli)、エフ エフ ペッテナッツォ(F F Pettenazzo)、エー アンド ルビノ ，エー(A & Rubino，A)（１９８８年）、ガット(Gut)、２９巻、ページ３６６〜 ３７１）。グルタミン酸、リシン、ロイシンのアミノ酸およびグリシン−フ ェニルアラニンのジペプチドの流入もまた調べた。 ニュージーランドホワイトラビットをクロロホルムを吸入させることによって 殺した。２５ｃｍの回腸断片を切り出し、腸間膜縁に沿って切開し、さらに、腸 の内容物を冷リンガー液によって洗浄除去した。１０ｃｍの２回腸断片を素早く ルシットの流入チャンバー（lucite influx chamber）にのせ、粘膜側の近接し ている４部分（０．２８ｃｍ²の表面積）を３７℃で３０分間予備インキュベー ション溶液に接触させ（expose）、９５％Ｏ₂／５％ＣＯ₂を流した。予備インキ ュベーション溶液は、グルコースの流入を調べるためには１ｍｇ／ｍｌのブロメ ライン、およびアミノ酸及びジペプチドの流入を調べるためには１５μｇ／ｍｌ のブロメラインを含ませた。コントロール組織は、リンガー液単独でインキュベ ートした。予備インキュベーション溶液を、Ｃ¹⁴で標識した栄養素及びＨ³−イ ヌリンを細胞外空間のマーカーとして存在させること以外、同じ組成の溶液と置 換した際に、研究を開始した。上記溶液において４５〜５０秒間インキュベート した後、標識を含む溶液を素早く除去し、冷却した０．３Ｍマンニトール溶液を 添加することによってインキュベーションを停止させた。次に、各接触組織片に 穴をあけ、濾紙上にゆっくりブロッティグ（blot）し、１０％トリクロロ酢酸中 に均質化し、遠心して粒状物を沈殿させた。上清のアリコートについて、ベック マン エルエス ７５００ ベーターカウンター（Beckman LS 7500 Beta-count er）で、エッチピービー ベックマン シンチレーション液（Hpb Beckman scin tillation fluid）を用いて放射能を測定した。前記したのと同様にして計算し た（ルビノ(Rubino)、エー フィールド(AField)、エム アンド シュワックマ ン， エッチ(M & Schwachmann，H)（１９７１年）、ジェー バイオル ケム(j ．Biol．Chem.)、２４６巻、ページ３５４２〜３５４８）。 表２は、栄養素の流入に関するブロメラインの効果を示すものである。これら のデータによって、グルコース及びアミノ酸の流入は干渉されないことから、栄 養素の取込みに重要な他の受容体には悪影響を及ぼさないことが示される。また 、データから、腸組織を処理することによって栄養素の吸収が向上することも明 らかである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ， ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ， ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，Ｓ Ｅ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．下痢の治療以外の医療に使用する配列番号１のアミノ酸配列または上記と実 質的に相同である配列を有する単離及び精製されたステムブロメラインプロテア ーゼ。 ２．環状ヌクレオチド経路が仲介する下痢以外の病気または症状の治療に使用す る配列番号１のアミノ酸配列または上記と実質的に相同である配列を有する単離 及び精製されたステムブロメラインプロテアーゼ。 ３．下痢以外の環状ヌクレオチド経路が仲介する病気または症状の治療または予 防を目的とする薬剤の調製への配列番号１のアミノ酸配列または上記と実質的に 相同である配列を有する単離及び精製されたステムブロメラインプロテアーゼの 使用。 ４．該病気または症状が癌、炎症、アテローム性動脈硬化症またはコレラ、ジフ テリアや百日ぜき等の細菌性の感染症である、請求の範囲第４項に記載の使用。 ５．配列番号１のアミノ酸配列または上記と実質的に相同である配列を有する単 離及び精製されたステムブロメラインプロテアーゼおよび製薬上使用できる賦形 剤または担体からなる薬剤組成物。 ６．経口、経頬、経鼻、経肛門投与、または静脈内若しくは筋肉内注射等の腸管 外投与用に配合された、請求の範囲第５項に記載の薬剤組成物。 ７．経口投与用でありかつ腸まで保護される、請求の範囲第６項に記載の薬剤組 成物。 ８．放出が遅延した組成物（delayed release composition）である、請求の範 囲第６項または第７項に記載の薬剤組成物。