JPH087212B2 - ヒトおよび動物における骨および結合組織の疾患を検出する方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、医学および獣医学関連分野における診断の
方法に関する。より詳細には、コラーゲン分解により形
成される遊離の架橋を、尿のような生物学的液体中に検
出することによって骨および他の結合組織の代謝を評価
する方法に関連する。

背景技術 骨、軟骨、皮膚、腱、ぞうげ質、および他の様々な軟
部組織を含む多様な組織において、主要な構造成分とし
てコラーゲンが関連していることは、よく知られてい
る。コラーゲンの線維構造が、架橋によって安定化され
ていることもまた知られている。コラーゲン中の非還元
性架橋としての蛍光ピリジニウム環系の存在が、Fujimo
to,D.ら、J Biochem（1978）83:863−867によって報告
された。このFujimotoの論文は、ウシアキレス腱コラー
ゲンのプロナーゼ消化による蛍光ペプチドの単離を報告
した。この単離された、加水分解されたピリジノリン
（Pyd）は、ヒドロキシリシンを３残基含むと考えら
れ、このことから、加水分解の前にペプチド断片がピリ
ジノリン部分に付着していたことが理解された。特徴付
けに関するなおいっそうの研究が、Gunja−Smith,Z.
ら、Biochem J（1981）197:759−762によって加水分解
された尿を用いて行われ、そして尿中のピリジノリンの
存在を利用して、Robins,S.P.,Biochem J（1982）207:6
17−620は加水分解した尿から得られたピリジノリン
を、抗体を作るためにキャリアーと結合させた。そのあ
と、この抗体は加水分解された尿中のピリジノリン濃度
を決定するために、免疫アッセイで使用された。Robins
は、この方法による生理的液体の分析が、成熟したコラ
ーゲンのある型の分解の指標を与えるのに役立つと記述
している。

前述したもの全てで、加水分解物が全ピリジノリン量
を得るために用いられた。なぜなら、その架橋構造の多
くが、その形成の要因となるヒドロキシリシン残基の、
ペプチド延長部分を保持しているからであった。従っ
て、ピリジニウム環を含有する均一な調製物を得るため
に、予備的な加水分解の過程が必要であった。

1982年までに、これらの架橋が由来するテロペプチド
中にリジン残基、あるいはヒドロキシリシン残基のどち
らが存在するかに依存して、架橋形成に２つの経路が存
在することが確立された（Robins,S.P.,“Collagen in
Health and Disease"（1982）Weiss,J.B.ら編、160−17
8頁、Churchill Livingstone,Edinburgh）。それによる
と皮膚のような軟部組織では還元性アルジミン結合が酸
化リシン残基から形成され、一方、軟骨および骨ではこ
れらの結合は、最初にヒドロキシリシンアルデヒドから
形成され、自動的な再構成を受けてより安定なオミソイ
ミン架橋となる架橋の特異性となることが述べられてい
る。これらの結合は、さらに反応をうけて、３−ヒドロ
キシ−ピリジニウム架橋が形成される。ヘリックス部分
にヒドロキシリシンではなくてリシンを含む安定に架橋
しているピリジノリン類似体は、Ogawa,T.ら、Biochem
Biophys Res Commune（1982）107:1251−1257;Eyre,D.
R.ら、Anal Biochem（1984）137:380−388によって同定
および定量され、そしてデオキシピリジノリン（Dpd）
と命名された。その後この物質は、その含有量は種間で
様々であるけれども、骨コラーゲンに局在すると考えら
れた。

Robins,S.P.,Biochem J（1983）215:167−173による
いっそうの研究は、骨中にグリコシル化ピリジノリンが
存在する証拠を提出した。Robinsは、ヒドロキシリシン
の３つの残基からのピリジニウム環の誘導を示す化学構
造を提案し、さらに、コラーゲンのアルカリ加水分解物
が側鎖のヒドロキシ基の部位で置換されたＯ−ガラクト
ース誘導体を与えることを示した。この物質は、穏和な
酸処理にも非常に不安定なので、この物質は加水分解さ
れた組織または体液の試料中に存在しなかったであろ
う。

Fujimoto,D.ら、J Biochem（1983）94:1133−1136
が、加水分解されていない尿の試料をクロマトグラフィ
ーにかけ、そして３−ヒドロキシピリジニウム環部分が
かなりの割合で「遊離の」形で存在する、すなわち、そ
れを構成している３つのヒドロキシリシン由来の残基は
それ以上のペプチド延長部分を含まないことを示した。
アミノ酸分析では、コラーゲンの酸加水分解物から単離
されたピリジノリンは非対称のピークを描くが、他方、
尿中の「遊離の」ピリジノリンは対称のピークを描い
た。著者達は、これは加水分解の間にピリジノリンシス
テムのヒドロキシリシン部分がエピマー化により異性体
化されることによるものであると結論した。さらに、総
ピリジノリン量（加水分解後）のレベルと年齢との関係
が、これらの研究者達によって、クレアチニンレベルに
対する比率として決定された。この比率は小児の尿中で
高いが、成長期が終了するまで年齢とともに減少するこ
とが見出された。この比率が成人では相対的に一定であ
るが、高齢者では僅かに上昇することも、さらに見出さ
れた。著者達は、これは高齢者に観察される骨の量の減
少に対応し得ると推測している。

上述のペプチド延長部分の特質を明らかにする試みも
またなされた。Robins,S.P.ら、Biochem J（1983）215:
175−182は、軟骨由来のII型コラーゲン中で、ピリジノ
リンは２つのＣ末端のテロペプチド鎖を螺旋ペプチドの
単一の鎖に結合していることを提案した。さらにもう一
つのピリジノリン架橋が、即ち他のペプチドに誘導され
た環によって、２つのＮ末端の非螺旋ペプチドを分子の
螺旋部分の第三の鎖に結合していると考えられた。これ
らの研究は、CNBrを用いた特異的切断によって組織から
蛍光ピリジノリン架橋を単離することによってなされ、
従って環を形成するヒドロキシリシン残基の部分として
のペプチド配列を保持していた。この架橋は、これらの
延長部分のアミノ酸配列を決定することにより、コラー
ゲン線維中での位置が突き止められた。

Robins（上記）とアプローチにおいて類似している論
文の中で、Wu,J.J.ら、Biochemistry（1984）23:1850−
1857は、成熟型軟骨のCNBr切断をおこない、ピリジニウ
ム環に参与するヒドロキシリシンのペプチド延長部分の
残基の配列を決定した。彼らの結論は、Robinsの結論と
同様であった。

Robins,S.P.ら、Biochim Biophys Acta（1987）914:2
33−239は、Ｉ型コラーゲン構造中の架橋の位置を決定
するのに、骨由来コラーゲンのCNBr消化物を用いた。こ
れらの著者達は、リシン由来の架橋の比率およびヒドロ
キシリシン由来の比率は、単離されたペプチドの状態で
それぞれが同じ比率で存在すると結論した。彼らはま
た、これにより、これらの２つの架橋アナログがコラー
ゲン線維中で同じ位置を占めること、および、参与する
１つのリシンに明らかに由来するその形態は、ヘリック
ス中の適切なリシン残基の不完全な水酸化により生じる
ようであることを結論した。アミノ酸分析は、架橋がＮ
末端およびＣ末端のテロペプチド領域の両方を含む２つ
の箇所に位置するにちがいないことを示した。

Henkel,W.ら、Eur J Biochem（1987）165:427−436
は、大動脈から分離されるＩ型コラーゲン中の架橋と関
連するアミノ酸配列を決定した。これらの配列は、II型
コラーゲンで得られるものとは異なっている。同様の結
果がEyre,D.R.ら、FEBS（1987）２:337−341によって見
出された。彼らは、IX型とII型コラーゲンの架橋が、ピ
リジノリン架橋に付着する個別のペプチドを示すことを
明らかにした。

ワシントン研究財団へのPCT出願第WO89/04491号は、
骨コラーゲンに付随する、ペプチド延長部分によって特
徴づけられる特定の架橋を、尿中に検出することによ
る、骨の吸収を測定するための尿アッセイを提案してい
る。このアッセイは、ピリジニウム架橋を有するペプチ
ド断片が骨コラーゲンの吸収に由来している体液中の、
該ペプチド濃度の定量に基づいている。骨のコラーゲン
に付随すると推測されるペプチド延長部分を有する、２
つの特定の物質が記載されている。これらは、骨の形成
および破壊の速い速度をその病態に含んでいる、バジェ
ット病に履患している患者の尿から得られる。

Macek,Jら、Z Rheumatol（1987）46:237−240は、コ
ラーゲン分解からの架橋に付随するペプチドに基いた変
形性関節症のためのアッセイを提案した。このアプロー
チにおいて、尿試料は、10kd以上の分子量ペプチドを大
きさでふるい分けられ、これらのペプチドが次に、ピリ
ジニウム環による蛍光を有する画分を決定するための蛍
光検出機を用いて、HPLCにより分離された。変形性関節
症の患者から得られたスペクトラムを、健康な患者のも
のと比較した。そしてこの比較から、疾病状態と関連す
る複数の蛍光ピークが、健常者の相当位置で存在しない
ことが容易に明示し得た。さらに、疾患部の股関節を体
内型人工関節へ全置換後２週間の同じ患者の尿は、従っ
て変形性関節症からの生成物は減少しており、正常者の
スペクトラムにさらにより近い蛍光ピークのスペクトラ
ムを示した。さらに、変形性関節症のスペクトラムは、
慢性関節リューマチの患者から得られるスペクトラムと
も容易に区別された。慢性関節リューマチのスペクトラ
ムは正常対照群のスペクトラムとより高い類似性をも
ち、著者達によってこの類似は慢性関節リューマチにお
けるプロテアーゼの高い活性に起因すると考えられた。
このことはコラーゲン構造が、彼らのシステム中では検
出されない、より小さな断片に消化されることを推定し
ていた。

慢性関節リューマチ患者の加水分解された尿中におけ
る、３−ヒドロキシピリジン環架橋の全量のレベルの上
昇に関する研究もまた、この疾病を診断する方法として
Black,D.ら、Annals of Rheumatic Diseases（1989）4
8:641−644によって提案された。慢性関節リューマチ患
者の「加水分解された」架橋のレベル（この化合物のク
レアチニンに対する比率として表現されたもの）は、対
照群と比較して５倍にも上昇した。この方法では、ヒド
ロキシリシン由来の架橋は、リシン由来のものと区別し
得；ヒドロキシリシン由来の架橋のみが測定され得る上
昇を示した。加水分解された尿を用いた、より広範な研
究において、Seibelら、J Rheumatol（1989）16:964−9
70は、リューマチおよび変形性関節症の双方において、
骨特異的架橋の排泄が対照群と比較して有意に増大する
ことを示したが、しかしヒドロキシリシン由来のピリジ
ニウムについての最も顕著な増大は、慢性関節リューマ
チ患者においてであった。

コラーゲン由来の架橋の存在に関連する測定が、骨の
ものを含む特定のコラーゲン型の分解の指標として使用
されたが、逆に骨形成のマーカーを同定するための努力
がなされた。Delmas,P.D.ら、J Bone Mineral Res（198
6）１:333−337は、小児の骨形成のマーカーとして血清
中のGLA−タンパク質レベルを使用し；同じグループのB
rown,J.P.らは閉経後の骨粗鬆症の骨形成を評価するた
めに同様のアッセイを使用した（Lancet（1984）1091−
1093）。

ヒトおよび動物には、高レベルの骨吸収によって、お
よび骨形成と骨吸収との異常なバランスによって特徴づ
けられる多くの病気がある。これらの中で最も知られて
いるのが、骨粗鬆症とパジェット病である。しかし、骨
代謝の異常は、骨の良性および悪性腫瘍、および例えば
前立腺または乳房の最初の腫瘍から骨細胞へ転移する転
移性癌を含む、様々な他の病気で起こる。他の病気に
は、大理石骨病、骨軟化性疾患、くる病、小児の異常成
長、腎性骨形成異常、および薬物誘導型骨減少症が含ま
れる。骨代謝の異常は、またしばしば、甲状腺治療の副
作用でありおよび原発性甲状腺機能低下症および甲状腺
中毒症およびクッシング病のような甲状腺の病気それ自
身でもある。ここに列挙したような可能性のある選択肢
の中から正確な症候群を明かにしなくても、患者の病気
を骨代謝の異常として、容易に識別する診断法を有する
ことが有用であろう。これが診断で明かになる問題のう
ちの一部分であることが確証されたならば、既知の骨疾
患の範囲内で追加的な試験が行われ得る。

本発明はちょうどそのような、骨代謝異常に対する一
般的なスクリーニングテストを提供する。

発明の開示 本発明は、骨の形成および吸収の異常およびそれらの
間のバランスの異常によって特徴づけられる病気を持つ
患者を同定するための、直接的および、必要があれば非
侵襲的な、テストを提供する。このテストは、血清およ
び尿のような生物学的液体に存在する、コラーゲン分解
に由来する天然の遊離ピリジノリンまたはデオキシピリ
ジノリン架橋の定量に基づく。このテストは、コラーゲ
ン由来の架橋を構成する縮合リシル残基またはヒドロキ
シリシン残基に付随する付加的なアミノ酸配列とは独立
した形態にある、上記のような体液中に存在する架橋の
これらの片方または両方の形態に向けられている。

従ってある面で、本発明は、骨代謝異常を伴う疾患の
存在を診断する方法に向けられ、そしてその方法は、患
者の生物学的液体中にある天然の遊離架橋のレベルを評
価することを包含する。このレベルは次に、正常人の天
然の遊離架橋のレベルと比較される。天然の遊離架橋の
レベルの上昇は、上述のような異常の存在を示す。

この方法は、これらの分解産物のレベルを骨形成の指
標と比較して評価することによって、細かく調節され得
る。生物学的液体中の天然の遊離架橋の存在により特徴
づけられる骨吸収のレベルと、指標のレベルにより特徴
づけられる骨形成のレベルとの間の差異が、正常人のそ
の差異と同じかあるいは異なるかということが見いださ
れれば、患者の状態に関する追加の情報をさらに得るこ
とができる。一般に、骨格構造を消耗する疾患を患って
いる人々は、吸収が勝っており、吸収と形成の速度の間
の大きな差異によって特徴づけられる。

従って、本発明のもっと進んだ面は、上述した代謝異
常の存在を診断する方法に向けられており、これは生物
学的液体中にある骨形成の指標のレベルを、その同じ個
体の生物学的液体中にある天然の遊離架橋のレベルと比
較すること、およびこれらのレベル間の差異と、正常人
で見出されるこの差異との間で比較することを含む。骨
吸収と骨形成との間の差異の上昇は、骨格の本来の姿を
維持するのに問題があることを示す。

組織あるいは生物学的液体から酸処理により得られる
加水分解された遊離の架橋に結合する抗体は、天然の遊
離架橋とは、リシル側鎖を有するものかあるいはヒドロ
キシリシル側鎖を有するもののいずれとも交差反応しな
いことが、本発明者によって見出された。しかしなが
ら、これらの遊離の架橋に対して、特異的な抗体を作成
し得る。これらの抗体は加水分解型とは交差反応し得
ず；生物学的試料を直接に評価する目的のためには、加
水分解型が存在しないので、これは問題にならない。所
望するなら、リシルおよびヒドロキシリシルの側鎖を含
む天然の遊離架橋型の間を区別するように、これらの抗
体を調製し得る。加水分解されたピリジノリンに対する
ポリクローナル抗体をつかった以前の研究からみて、こ
の抗体は天然のペプチド含有型から遊離型のものを区別
し得るようである。

従って、本発明の他の面は、天然の遊離架橋あるい
は、天然の遊離架橋のリシルまたはヒドロキシリシルど
ちらかの型、またはそれらのグリコシル化された型に対
して、特異的に免疫応答する抗体に向けられる。

本発明の他の面は、軟骨を含む他の結合組織の分解を
測定することにより、関節炎疾患のサブセットを同定す
る方法であり、そしてこの方法は、患者の生物学的液体
中にあるヒドロキシリシル側鎖架橋の、リシル側鎖架橋
に対する比率（Pyd/Dpd）を測定すること、および該比
率を正常対照群の比率と比較すること包含し、ここで正
常対照群に対する該患者の該比率の上昇は、該患者にお
ける軟骨の分解を示している。

もう一つの面は、遊離の架橋のレベルとの組み合わせ
で、患者の代謝状態の評価を提供する、結合組織形成の
指標の存在を測定する方法である。

さらに他の面は、生物学的液体中にある天然の遊離架
橋の量あるいは濃度を免疫アッセイ測定するためのキッ
トの提供であり、該架橋は遊離の架橋全体あるいは、Py
d、Dpd、Gal−PydおよびGlc.Gal−Pydからなる群から選
択される架橋として測定し得る。このキットは、一組の
容器を含み、少なくともそのうちの１個は、天然の遊離
全架橋、あるいはPyd、Dpd、Gal−PydまたはGlc.Gal−P
ydのうちの一つあるいはそれ以上と特異的に免疫応答す
る抗体を内容物として含んでおり、そして少なくともそ
のうちの１つは、アッセイを行うための説明と一緒に、
標識のような免疫アッセイを行うための付加的な試薬を
含む。好ましくは、この生物学的液体は血清または尿で
ある。次に、この遊離の架橋は天然の遊離全架橋として
測定し得る。しかしながら、この遊離の架橋は、リシル
側鎖架橋（Dpd）として、あるいはヒドロキシリシル側
鎖架橋（Pyd）として、あるいはグリコシル化されたPyd
として、あるいはこれらの任意の組み合わせとして個々
に測定し得る。

さらに他の面で、本発明は、検出されるべき架橋の特
異的試薬として本発明の抗体あるいはその断片を含む、
アッセイキットの使用に向けられる。

図面の簡単な説明 図１は、尿から加水分解なしに得られたピリジノリン
のトレースの上に重ね合わされた、酸加水分解物から得
られたピリジノリンのクロマトグラフィーのトレースを
示す。この図はさらに、蛍光により測定される溶出パタ
ーンと、加水分解物から調製された抗ピリジノリン抗体
との反応から測定される溶出パターンとを比較する。

発明を実施するための形態 本発明は、コラーゲン代謝の異常によって特徴づけら
れる骨疾患あるいは他の疾患を診断するための現在使用
されている方法に対して改良を提供する。本発明の方法
は、これらの異常の指標として、生物学的液体中にある
コラーゲン由来のピリジニウム架橋のレベルの多様性を
利用する。従来の技術による方法は、試料、典型的には
尿、の加水分解を含んでいるので、ペプチド側鎖のな
い、加水分解された架橋形態で分析物が提供され、そし
て次にこれは、この加水分解された架橋に対して作られ
た抗体を使用する免疫アッセイで定量し得る。この方法
は有益な情報を提供するけれども、要求される事前の加
水分解が、この分析法が未処理の生物学的試料に対して
直接行われる単純な臨床アッセイになるこのを妨げてい
る。

ピリジニウム架橋の加水分解型に対して作られた抗体
は、尿または他の生物学的液体中に存在する遊離の架
橋、あるいは加水分解前の、ペプチドと複合しているこ
れらの架橋のどちらとも交差反応しないことが、本発明
者らによって見出されている。従って、当該分野で現在
利用可能な抗体は、未処理の生物学的試料に直接には使
用し得ない。

本発明はこの不利益を、加水分解前に存在するジアス
テレオマーとして遊離形態で存在する架橋を測定するた
めに、生物学的試料と直接反応し得る試薬を提供するこ
とによって、克服する。以下の実施例で示されるよう
に、これらの遊離および加水分解されていない架橋の直
接的な測定は、現在使用できる、より複雑なアッセイに
よってのみ得られるデータと比較し得るデータを提供す
る。

関与する架橋構造に関する幾つかの背景情報が役立ち
得る： 架橋の性質 略語DpdおよびPydは、本願中では、単離された架橋そ
れ自身の２つの既知の形態を表す。Pydあるいはピリジ
ノリンは、環のＮがリシル残基のε−アミノ基であるよ
うに形成された架橋のことを言い;Dpdまたはデオキシピ
リジノリンは、環のＮがヒドロキシリシル残基のε−ア
ミノ基であるように形成された架橋のことを言う。（こ
れらの多様性を表す様々な方法が使用されてきた；例え
ば、HPは「ヒドロキシリシン」型を示すために使用さ
れ、そしてLPは「リシル」型を示すために使用されてき
た。） 特に、Dpdは下記式の化合物を表すと考えられてい
る： およびPydは下記式の化合物を示すものと考えられて
いる。

架橋の両方の型は共に、1,4,5に三置換された３−ヒ
ドロキシピリジニウム残基であることがわかる。Pyd
は、側鎖にグリコシル化し得る遊離のヒドロキシル基を
有し、そして幾つかの組織ではグリコシル化されている
のが知られている。このグリコシル化は酸に不安定であ
り、そして塩基に対しても不安定であるが、その程度は
少し軽い。PydはDpd−Pydとして生じることが示されて
いる；本発明者は、尿中でのGlc.Gal−Pydの存在もまた
実証している（PCT出願第WO89/00715号参照）。遊離のP
ydのこれらの型は、側鎖のヒドロキシルに共役している
アセタールをそれぞれ持つ。

Dpdは、側鎖上の３つのα−アミノ部位にあたる、３
つのキラル中心を含む。Pydは、側鎖のハイドロキシ部
位にさらに一つのキラル中心があるので、４つのそのよ
うな中心を含む。たぶん、加水分解されない試料では、
ペプタイドに更に誘導体化されているか否かにかかわら
ず、この３つのα−アミノ基は天然に生じるＬ−鏡像異
性体に由来し、そしてこのOHもまた、生物学的システム
によって決定される立体的配置にある。

上記の背景技術部分で説明したように、尿中に存在す
る架橋の相当な部分（成人では約40％）は、「遊離の」
架橋の形態であり、即ち、たとえ試料の加水分解が行わ
れる前であっても、上に示されるようなPyd、グリコシ
ル化されたPydあるいはDpd構造にはペプチド鎖が複合し
ていない。従って、上に示される化学式の化合物が、
「遊離の」架橋を意味する。

PydおよびDpdに関して、キラル中心のキラリティー
は、特定されていないことを言及しておく。従って、用
語「遊離の」は、加水分解条件に供したか否かに関わら
ず、これらの架橋のことを言う。ここでの仕事は、これ
らの「遊離の」架橋を「天然の」形態で得た場合、それ
らの「加水分解された」形態と比較して、キラリティー
が異なっていることを示す。本願中で使用するとき、
「天然に遊離の」架橋は、生物学的試料中に遊離型とし
て存在するようなDpdあるいはPydあるいはそれらのグリ
コシル化型のことを言う；「加水分解された遊離の」架
橋は、加水分解物中に生じるようなこれらの構造のこと
を言う。もちろん、グリコシド結合は加水分解条件に不
安定であるので、「加水分解された遊離の」架橋は、糖
を含まない。

天然の遊離架橋は、生物学的システムの産物であるの
で、生物学的に好まちしキラリティーがすべての３つあ
るいは４つのキラリ中心で生じることが仮定される。た
ぶん、側鎖のα−アミノ基によって表される３つのキラ
リ中心は、天然に存在するアミノ酸としてのＬ型の立体
的配置にあり、そしてPydの側鎖のヒドロキシルを含ん
でいる炭素のキラリティーもまた単一の立体的配置を表
す。このことは、図１に示された結果によって確認され
る。図の中で、点線はクエン酸ナトリウムで平衡化され
たスルホン化ポリスチレンビーズ（７μ）を用いて、予
め単離された天然の遊離型のPydについて行われた、イ
オン交換クロマトグラフィーの結果を表している。図１
に示されるように、尿から直接単離されたPydは単一の
ピークで溶出される。これは、ただ一種類のジアステレ
オマーの存在と、一致している。

しかし、加水分解の後には、図１の実線で示されるよ
うに、加水分解された遊離Pydは混合物として溶出され
た。これは、もはやクロマトグラフィーで同一の挙動を
示さないジアステレオマーの混合物を得るような、キラ
リ中心でのラセミ化と一致している。同様な結果が天然
の遊離Dpdを加水分解された遊離Dpdと比較することから
得られる。

「天然の遊離の」架橋は、このように架橋の加水分解
された遊離型とは異なっている。従来の酸加水分解の間
に、いくらかの分子の立体的配置を変化させるラセミ化
が生じると思われる。しかしながら、また、生物学的試
料中での「天然の遊離の」架橋の全収量の促進は、全て
の本来のDpdおよびPydをタンパク分解処理して「天然の
遊離の」架橋の型を遊離することによって、得られ得
る。なおその上、架橋それ自体は種間で同一であり、ヒ
ト以外の種が、アッセイ系にあるいは免疫原として使用
する天然の遊離架橋の標準を調製するのに使用し得る。
特に、ブタの尿は多量の天然の遊離架橋を含む。生物学
的に重要なジアステレオマーの任意の発生源が使用され
得る。

本発明者は、加水分解の結果として生じた遊離のPyd
に対して作成された抗体は−−−即ち、ペプチド結合を
破壊するように濃い酸で生物学的液体や組織を処理し、
そしてPydをDpdから分離することによって、免疫原が得
られる−−−、DpdあるいはPydのどちらの天然の遊離型
とも、ほんの少しかあるいは何の交叉反応も示さないこ
とを示した。さらに、加水分解物から作成されたPydに
対して作成された抗体は、このように作成されたDpdと
わずかしか交叉反応しない。骨あるいは軟骨の酸加水分
解物から得られたPydに対して作成された抗体は、酸加
水分解後の尿中架橋と交叉反応する。

典型的な一組の結果を表１に示す。表１は、骨から単
離したPyd加水分解物を用いた免疫で得た抗血清を使
い、ELISAアッセイを行った結果を表す。ELISAは、抗原
としてこの加水分解物を使用し、そして結果は、抗血清
への加水分解抗原の結合を候補の架橋が阻害する能力と
して表現した。この基準を用いると、軟骨または骨の酸
加水分解物から単離されたPydに対するウサギの免疫で
得られた抗体は、尿から単離された、精製された天然の
遊離架橋の酸加水分解後のPydとは、完全に交叉反応す
るけれども、尿からの天然の遊離型Pyd（Ｕ−Pyd）とは
たった５％しか交叉反応性しない。これらの抗体は、さ
らに、同じ骨の加水分解物から単離したDpdとは20％の
交叉反応性があり、尿からの天然の遊離型Dpd（Ｕ−Dp
d）とは１％より少ない交叉反応性しかない；この抗体
との反応性の約70％がこの天然の遊離型を酸加水分解後
に回復した（表１）。

このことはさらに、前述したように、クエン酸ナトリ
ウムで平衡化したスルホン化ポリスチレンビーズ（７
μ）でのイオン交換クロマトグラフィーの結果を表す図
１に、示されている。尿の遊離のPydおよび酸加水分解
産物の溶出パターンは、蛍光で測定した。酸加水分解物
に対して作成された抗体は、加水分解物とのみ有意に反
応することが示されている。２つの主要な加水分解物の
ピークの反応性の相違は、これら２つの分画の異なる免
疫原性に起因している。

天然の遊離架橋に対する抗体の調製 抗体は、天然の遊離架橋を全分画として、あるいは好
ましくは、この分画のそれぞれの要素のいずれかに対し
て調製される。タンパク質を含むフラグメントからの
「遊離の」型のピリジニウム結合の大ざっばな分離は、
例えば、Fujimoto,D.,J Biochem（1983）94:1133−1136
（上記）の方法によって行い得る。この調製法におい
て、尿の濃縮物がセファデックスＧ−10カラムにかけら
れ、そして全ピリジウム含有分画が溶出される。この溶
出液は、その後、クエン酸ナトリウムで平衡化されたホ
スホセルロースのカラムにかけられ、そして塩で溶出さ
れる。このかなり単純な過程の結果、「遊離の」架橋が
単一ピークとして得られる。この試料が加水分解条件に
さらされないならば、このピークはDpdおよびPyd型だけ
でなく上述したように、Gal−PydおよびGlc.Gal−Pydを
含むグリコシル化されたPydをも含む。この天然の遊離
架橋分画のなお一層の分離は、その後、標準的な方法、
例えば、上述したようなスルホン化されたポリスチレン
ビーズによるイオン交換の使用、あるいはHPLCの使用、
によって都合よく行われる。この分離の典型的なプロト
コールは、例えば、Black,D.,ら、Anal Biochem（198
8）169:197−203;Seibel,M.J.,ら、J Rheumatol（198
9）16:964−970の中に見いだせる。

抗体の調製は、ウサギあるいはマウスのような適切な
哺乳類の材料に担体を複合された混合物あるいは個々の
成分を、当該技術分野で一般に知られている免疫学的な
プロトコールに従って注射することを包含する通常の技
術による。材料は、免疫原性を促進させるために、標準
的な複合方法を使用してBSAあるいは破傷風トキソイド
のような担体と複合された。抗原に対する抗体の形成を
決定するために、血清を力価測定する。もし望むなら
ば、所望の成分と免疫反応するモノクローナル抗体の継
続的な産生が可能な細胞の培養を作り出すために、脾臓
細胞あるいは末梢血リンパ球が、採集され、そして不死
化される。これらの調製物は個々の成分に対してより高
い特異性を有している。

このようにして、生物学的液体中、特に尿中、に存在
する天然の遊離型の架橋に特異的な免疫反応性をもつ、
ポリクローナル抗血清を得ることができる。その血清が
生物学的液体中の天然の遊離架橋結合型に、該液体中の
他の物質と比較して、免疫アッセイで天然の遊離型が測
定され得るに十分に高い親和性をもって複合体を形成し
得ることを、「特異的な免疫反応性」によって意味させ
る。天然の遊離型の混合物に対してかあるいは個々の成
分に対してのどちらかで作成されるポリクローナル抗血
清のある部分は、ペプチド鎖の付着した天然型と交叉反
応し得る；アッセイは、このような交叉反応をしないモ
ノクローナル抗体調製物によるか、この交叉反応性を清
算するような標準化のどちらかによって、標準化され得
る。

モノクローナル抗体調製物を得る慣例的な技術を利用
することによって、所望の特異性を有する抗体の再現性
のある再製が可能である。従って、判定基準として例え
ば天然の遊離Pydとは免疫反応するが、天然の遊離Dpdか
またはさらにペプチドと結合した架橋型かのいずれかと
は反応しないような、不死化細胞上清の能力を利用した
スクリーニング法を使用することによって、天然の遊離
Pydとだけ反応する信頼できる抗体の産生源を得ること
ができる。逆に言えば、生物学的試料の評価において
は、全ての天然の遊離型が測定されるようにこれらの固
有の特異性を持つ抗体をカクテルで用いることが有利で
ある。

所望の特異性の抗体を分泌する不死化細胞株は、当該
技術分野で周知の哺乳動物細胞技術をつかって、所望の
モノクローナルの実用的な量の産生のためにin vitroで
培養され得る。このような培養の技術は、現在、商業規
模で利用できる。なおその上、不死化細胞株はマウスに
注射され、そしてモノクローナルのいくらか粗雑な調製
物が腹水として単離される。抗体調製物は、望むならば
抗原をアフィニティーリガンドとして使用して、アフィ
ティー精製もされ得る。

コラーゲン由来の架橋の加水分解された遊離型に対し
て作成した抗体が、天然の遊離型と反応しなかったこと
が明かであるかぎり、その逆が真であるかどうかは重要
ではないということに注意すべきである。なぜなら、加
水分解されていない生物学的試料中には加水分解型は存
在しないからである。従って、この交叉反応性の無いこ
とを確実にするスクリーニング手順は、不必要である。

免疫アッセイの実施 従って、上記のように調製された抗体を用いる免疫ア
ッセイを使用することによって、事前の分画あるいは加
水分解なしに生物学的液体試料をアッセイすることが可
能である。天然の遊離PydあるいはDpdあるいは両者の所
望の形態に対する特異性は、抗体調製によってもたらさ
れる。

免疫アッセイそれ自身は、当該技術分野で一般に知ら
れている種々の標準的アッセイのプロトコールを使用し
て行われる。一般的に理解されるように、アッセイは特
定の抗体と、その特異性にあう所望の分析物との間の相
互作用を信頼するように、そして分析物および抗体で形
成される複合体を検出するためになんらかの方法を使用
するように、構成されている。複合体形成は、抗体それ
自身あるいはその免疫学的に反応性の断片、例えばFab,
Fab′またはＦ（ab′）_２断片、の間でも存在する。抗
体あるいはその免疫学的に反応性の断片は、固形支持体
に複合させて、分析物の捕捉抗体として使われ得る。こ
のプロトコールは、分析物／抗体複合体の形式が、蛍
光、放射活性、あるいは酵素の標識によって検出され
る、直接的な形態で行われることもあり得、あるいは標
識された標準物質が抗体に対して分析物と競合する競争
的形式で行われることもあり得る。この形式は、凝集分
析のようにも構成し得、即ち、反応混合物に適切な沈澱
剤を添加することによってこの複合体を沈澱させ得る。
免疫アッセイのプロトコールの特定の設計は、多種類の
選択に対して開かれており、そして当該技術分野で利用
可能な臨床分析機器およびプロトコールはおびただしい
数にのぼる。

抗体および、標準的な検出プロトコール−−即ち、例
えば放射性同位元素標識、蛍光標識、あるいは直接ある
いは競合的形式のどちらかのELISA−−をつかった免疫
アッセイを実施するための試薬は、アッセイのために必
要な成分および指示書を含むキットとして都合よく供給
され得る。

抗体は、種々の型を含む天然の遊離架橋の型に対し
て、特異的に作成され得るので、これらの成分の比率が
それらの個々のレベルおよび全体と同様に測定され得
る。

従って、アッセイは天然の遊離架橋全体の測定、また
は天然の遊離、Pyd,Dpd,Gal−PydあるいはGlc.Gal−Pyd
あるいはそれらの任意の所望の組合わせの測定にいたる
ように、抗体またはその免疫学的に反応性の断片を包含
して設計し得る。種々の組織においてPydおよびDpdの架
橋のレベルが測定され得るので、これらの相対的な量の
相互変化は、問題とされれている特定の組織に対する分
解の指標として使用し得る。例えば、大部分の正常な成
人では、Pyd/Dpdの比率は成人後一定である。骨は4/1の
Pyd/Dpd比であり、そして遊離されるDpdの主要な産生源
であると思われるので、Dpd/Pyd比の上昇は骨の分解を
示し得る。（大動脈もまたDpdを含むけれども、その代
謝回転率は低い。）または生物学的液体中のDpdレベル
の評価もまた、比較的骨特異的であるという結果をもた
らす。しかしながら、骨疾患が考えられる多くの例にお
いては、追加の情報が存在する時には、天然の遊離架橋
全体のレベル（Dpd＋Pyd）が測定としてまた使用し得る
ようである。慢性関節リュウマチのように症候が軟骨の
病気を示唆しない時、生物学的液体中に遊離型で存在す
る過剰の架橋の大部分は、実際に、骨の吸収による。

軟骨のような他の結合組織ではその大部分としてDpd
ではなくPydだけを含むので、Pyd/Dpd比の上昇はこのよ
うな障害を伴った疾患を示す。

本発明の抗体を使用する免疫アッセイは便利であるけ
れども、天然の遊離PydおよびDpdの架橋はまた種々の方
法によっても測定され得る。ピリジノリン結合が蛍光性
であるので、当該技術分野で記載のあるように生物学的
液体の試料の直接クロマトグラフィーはPydおよびグリ
コシル化型PydからのDpdの分離の結果を得ることができ
る、そして得られたピークの蛍光強度は定量化の指標を
提供する。

それ故に本発明の方法では、天然の遊離架橋がクロマ
トグラフィーにかけられた材料の蛍光強度を測定するこ
とによって、グループあるいは個々のどちらとしてでも
測定され得る。

上で参照したPCT出願第WO89/04491号に説明されてい
るように、架橋の量はその環系に対して適切な酸化還元
電位の特定の電極をつかってもまた測定され得る。

骨の吸収の指標としての天然の遊離架橋の使用に加え
て、同一人からの同じかあるいは他の適切な生物学的液
体中の骨の形成に対するマーカーの測定をこの測定に組
合わせることによって、骨の代謝のバランスが有利に測
定される。例えば、このような骨形成のマーカーには、
以下のものが含まれる；プロコラーゲンＩ型、骨オステ
オカルシン（骨GLAタンパク質あるいはBGPとしても知ら
れている）；プロ骨GLAタンパク質、マトリックスGLAタ
ンパク質（MGP）、骨特異的タンパク質、例えば骨特異
的シアル酸タンパク質、燐酸タンパク質、アルカリフォ
スファターゼ、オステオネクチンあるいは他の非コラー
ゲン性骨タンパク質。これらのマーカーの測定方法は、
当該技術分野ではよく知られている。これらのマーカー
の測定のための適切な方法は、例えば、GLAについてはD
elmas,P.D.,ら、J Bone Min Res（1986）１:333−337
（上記）に見いだし得る。

分解が生じた時にコラーゲン由来の架橋を発生する組
織の代謝状態を測定するための指標を与える上述したア
ッセイは、様々な状況において役立つ。まず第一にそれ
は、例えば過剰な骨の吸収を示すことで患者の異常な状
態を評価する方法である。これは例えば、骨粗鬆症状態
の存在あるいは不幸な悪性腫瘍の進行を示す。過剰な骨
の吸収によって特徴づけられる他の既知の状態は、パジ
ェット病および上皮小体亢進症を含む。患者の病気を継
続して観察し得るので、これらのアッセイの適用は、こ
れらまたは他の病気を治療するために施した治療の進展
をモニターするためにもまた使い得る。このアッセイは
また、しばしば組織の分解をおこす毒性物質の投与にお
いて毒性の測定としても使用し得る。

従って、このアッセイは、コラーゲン架橋を含む組織
の代謝状態が、病状、処置、あるいは患者に直接投与さ
れた物質あるいは患者が環境で曝される物質の効果、の
指標として使用され得るあらゆる状況に適用され得る。

以下の実施例は、説明を意図したものであり、本発明
を限定しようとするものではない。

実施例１ 尿中の天然の遊離架橋のアッセイ A.U−PydおよびＵ−Dpdの単離：尿の試料は、パジェッ
ト病または上皮小体亢進症（これには遊離の架橋レベル
の上昇が含まれる）の患者および成長期の子供（正常成
人に比較して約10倍甲濃度の架橋が存在する）から採取
した。ロータリーエバポレーターで10倍に濃縮した後、
何回分もの尿（20リッター）を、移動相としてブタノー
ル：酢酸：水（4:1:1v/v/v）を使ってセルロースCF1の
分配クロマトグラフィーに各回ごとにかけた。水によっ
て固定相より溶出されたピリジニウム架橋を含む分画
を、0.2M酢酸によって溶出されるセファデックスＧ−10
のカラム（3.2×150cm）でクロマトグラフィーにかけ
た。架橋を含むプールされた分画は、その後Na⁺が67mM
にされ、そしてpH2.75の67mMクエン酸ナトリウム緩衝液
で平衡化されたDowex 50X−X8イオン交換樹脂のカラム
（1.7×35cm）にかけた。カラムの温度を60℃に上昇さ
せた後、67mMクエン酸ナトリウムの溶出は500mlにわた
るpH2.75から5.50への直線的なpH勾配でおこなった。カ
ラムの溶出液は、蛍光（励起光325nm/測定放出光400n
m）でモニターし、そして、Ｕ−Pyd（364−377ml）およ
びＵ−Dpd（397−416ml）を含むプールされた分画はセ
ファデックスＧ−10のゲル濾過によって脱塩され、そし
て蒸発乾固させた。尿20リットルからの収量は、2.5μm
ol U−Pydおよび0.6μmol U−Dpdであった。

B.結果：パラグラフＡで説明したこの試料の単離方法
は、個々の患者からの尿の試料に適用され、そしてＵ−
PydおよびＵ−Dpdの量は当該技術分野で知られているよ
うに、蛍光測定をつかってクレアチニンとの比較により
定量された（上記）。正常なヒトおよび骨疾患および関
節炎疾患をもつ７人の患者から得られた値を、表２に示
す。数値は、平均値±SEM（各群はｎ＝６）で示されて
いる。

これらの結果は、結合組織の過剰な分解によって特徴
づけられる疾患にかかっていることが知られている患者
における、遊離の架橋レベルの上昇を劇的に示してい
る。

表３は、様々な患者グループにおいて加水分解後に測
定された全架橋に対するパーセントとして表されたＵ−
PydおよびＵ−Dpdの割合を示す。

＊は以下のように計算された:U−Pyd/全Pyd）×100お
よび（Ｕ−Dpd/全Pyd）×100。全てのグループを一緒に
して（ｎ＝36）、Ｕ−Pydと全Pydとの間の相関係数は0.
929（ｐ＜0.0001）であり、Ｕ−Dpdと全Dpdとの間では
0.952（ｐ＜0.0001）であった。

表３に示したように、Ｕ−PydおよびＵ−Dpdは異常な
状態である患者においても対照と比較して比較的変化し
ないので、尿中の遊離の架橋の濃度は対照と比較して尿
の加水分解後に測定された架橋全体についても同一の病
気におけるコラーゲン分解の増大を反映している。

それゆえに、Ｕ−PydおよびＵ−Dpdは、結合組織代謝
の異常を含む疾患の診断および観察を促進するための、
コラーゲン分解の実行可能な指標を与える。

C.免疫アッセイ：本実施例のパラグラフＡに記述された
方法によって単離される天然の遊離架橋は、抗原の調製
に使用される。Ｕ−PydおよびＵ−Dpdは、アミノ酸分析
機（Locarte Co.LTD.,London,UK）の高分解能樹脂カラ
ムを使用して、pH4.25の67mMクエン酸ナトリウム緩衝液
を用いたイオン交換クロマトグラフィーでさらに精製さ
れる。

免疫感作のために、単離された架橋は、カルボジイミ
ドおよび当該技術分野でよく知られた方法を使用してウ
シ血清アルブミンに共有結合的に付けられる。

モノクローナルおよびポリクローナルの両方の抗体
が、尿の架橋構造成分に対して作成された。モノクロー
ナル抗体の産生には、Balb/cマウスが尿の架橋−BSA複
合体で免疫され、そしてハイブリドーマ細胞株が脾臓あ
るいはリンパ節からの細胞とAg8ミエローマ細胞との融
合の後、標準の技術をつかって調製された。ポリクロー
ナル抗体は、ウサギで作成される。抗血清およびハイブ
リドーマ細胞液の両方のスクリーニングは、Robins,Bio
chem J（1982）217:617−620に記載のように調製される
適切な尿の架橋ゼラチン複合体でコートされたマイクロ
タイタープレートを使用するELISA法によって行われ
た。

尿中に遊離型で存在するそれぞれの架橋成分のアッセ
イは、阻害ELISAによって以下のように行われる： 尿の試料（５あるいは20μｌ）あるいは参照基準とし
て0.2〜20pmolの精製した尿の架橋を含む溶液は、0.05
％のTween−20界面活性剤を含むリン酸緩衝溶液（PBS−
Ｔ）で110μｌに希釈され、そして第一抗体、免疫活性
な断片、あるいはPBS−Ｔで1:5000〜1:20000に希釈され
た抗血清を110μｌ加える。それぞれの試料は、丸底の9
6穴マイクロタイタープレートに三反復ずつ用意し、そ
の後このプレートを室温で一晩反応させる。

試料の一部（200μｌ）を、適切な尿の架橋成分を含
むゼラチン複合体で予めコートした平底のマイクロタイ
タープレートに移す。30分後、プレートをPBS−Ｔ（３
回）で洗い、そして結合抗体は、第一抗体の種類に対し
て調製したストレプトアビチン−ペロキシダーゼと結合
させたビオチン標識化抗体およびペロキシダーゼ基質検
出系を用いる標準の技術によって検出される。呈色は自
動マイクロタイタープレート読み取り装置を用いて492n
mで測定する。分析物を含む試料はプレートへの第一抗
体の結合を減少させ、そしてその結果発色の濃度を弱め
た。試料中の遊離の架橋の量は、log−logプロットをつ
かって計算された各プレートに含まれる標準曲線に当て
はめて定量化される。

上記のアッセイは、平底のマイクロタイタープレート
を抗原を含有することが疑われる試料でコートし、そし
て標識された第一抗体を直接ウェルに加えることによっ
て直接的に行うように作り変え得る。

実施例２ 天然の遊離架橋の発生源 本発明のアッセイに標準として使われ得る天然の遊離
架橋の発生源を確かめるために、多種の大型動物の尿を
分析した。ウシの尿では、約15％のみが遊離の架橋でPy
d/Dpd比は12±２である；ヒツジの値は、約20〜25％の
みが遊離の架橋である以外は同様である。ブタの尿で
は、Pyd/Dpdの比は約５±１であり、そして全体に対す
る相対的な遊離の架橋の割合は42±５％である。遊離の
架橋の濃度は、Pydでは約380nMおよびDpdでは70nMであ
る。

子供の尿は成人の尿よりもDpdのよりよい収量をもた
らす。ブタの尿からのDpdの優先的な損失が、精製の過
程でCF−１セルロースが使われる時にいくらか生じ、そ
してPydに対する全回収量はPydでは40〜50％であるがＵ
−Dpdではたった20％である。最初の物質として子供の
尿を使用すると、両方の架橋の回収量は約55％である。

それゆえに、子供およびブタの尿は両者とも遊離の架
橋の標準として好適な源となる。

上述したように、天然の遊離架橋の特徴とするジアス
テレオマー型の架橋の収量は、エキソペプチダーゼおよ
びグリコシダーゼの使用のように酵素的加水分解過程に
よってこれらの発生源における全架橋を遊離させること
により促進され得る。

実施例３ ヒト組織におけるPyd/Dpd 異なった組織の一連の分析は、骨皮質の架橋の含有量
が、Pyd/Dpd比が約4.2の骨海綿質よりも若干高いことを
示している。Dpdは軟骨では検出されなかったけれど
も、この架橋は大動脈および靭帯で存在した。これらの
結果は、表４にまとめられている。

PydおよびDpdの両者とも正常な皮膚のコラーゲンには
完全に存在せず、また未成熟あるいは新しく合成された
コラーゲンのいずれにも存在しない。

実施例４ 骨粗鬆症患者の尿中の遊離型架橋の測定 脊椎骨折（Ｉ型骨粗鬆症）をもつ53歳から74歳（平均
±SD、64±５歳）までの閉経後の64人の女性を研究し
た。全女性は、２光子吸光光度定量法で測定された腰椎
骨の無機物密度が骨折閾値0.98g/cm²を下回り、そして
脊椎のＸ線写真は３ヶ所あるいはそれ以上のグレード１
の骨折あるいは１ヶ所あるいはそれ以上のグレード２の
骨折を示した。骨粗鬆症についての他の２次的な原因
は、何も見いだされなかった。

対照の群として、平均（±SD）65±６歳（範囲50歳か
ら79歳）の閉経後の67人の女性を研究した。全女性は、
正常な脊椎のＸ線写真を有し、そして２光子吸光光度定
量法で測定された腰椎骨の無機物密度は年齢相応の正常
な範囲であった。誰一人として、何らかの疾病にかかっ
ていたりあるいは骨の代謝への影響が知られている薬物
を摂取したりしていなかった。

ヒドロキシプロリン測定のために、被検者は研究に先
だつ３日間はゼラチンなしの特別食を維持した。尿の試
料は採集され、そして試料の一部は分析まで−70℃で保
存された。全架橋は、既知の方法（Black,D.,ら、Anal
Biochem（1988）169:197−203;Seibel,M.J.,ら、J Rheu
matol（1989）16:964−970）に主に従って測定された。
加水分解されない尿中のＵ−PydおよびＵ−Dpdの測定の
ために、0.5mlの部分はCF1セルロースでの分配クロマト
グラフィーによって直接処理された（この処理は、HPLC
工程に先立ち遊離型をペプチド誘導型から分離する;HPL
Cは、加水分解された試料について行った）。尿の酸加
水分解物中のヒドロキシプロリンは、HPLCで測定された
（Dawson,C.,ら、Clin Chem（1988）34:1572−1574）。

対照および骨粗鬆症群における尿中の天然の遊離ピリ
ジニウム架橋および全ヒドロキシプロリンの測定を表５
に示す。この結果は、骨特異的な架橋であるＵ−Dpdの
排出は、対照群と比較して骨粗鬆症群において有意に高
かったことを示している。

相違に、Ｕ−Pydについてはあまり顕著ではない；グ
リコシル化誘導体、Ｕ−Pyd.Gal.Glcについての値に
は、統計学的な相違はなかった。直線回帰分布は、クレ
アチニン比として表された値と24時間全排出量として表
現された値との間に、Ｕ−Pyd（ｒ＝0.80）およびＵ−D
pd（ｒ＝0.82）両者共に高くて有意な相関があることを
示した。この観察は、健康な男性と女性の志願者での架
橋排出において有意な日内変動が無いという事実と一致
している（A.M.McLaren and S.P.Robins,未発表データ
ー）。

Ｕ−Dpdとヒドロコキシプロリンとの間には有意な相
関があり、それは対照群（ｒ＝0.21;N.S.）においてよ
りも骨粗鬆症群（ｒ＝0.53;p＜0.001）でより顕著であ
る。Ｕ−Dpdとヒドロキシプロリンとの関係もこれに類
似であり、相関係数は骨粗鬆症群および対照群において
それぞれｒ＝0.45（ｐ＜0.001）およびｒ＝0.34（ｐ＜
0.001）であった。

遊離のおよび全部の架橋が共に測定された試料では、
これら両者の値の間には高くて有意な相関があった。デ
オキシピリジノリンについては、骨粗鬆症群（ｎ＝25）
および対照群（ｎ＝24）の相関係数が、それぞれ0.90お
よび0.84であった；ピリジノリンについての対応する相
関係数は、ｒ＝0.96およびｒ＝0.85であった。

フロントページの続き (56)参考文献 国際公開89／12824（ＷＯ，Ａ) Ａｎｕａｌｓｏｆ ｔｈｅ Ｒｈｅｕｍ ａｔｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，48，641− 644（1989) Ｃａｌｃｉｆｉｅｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｉ ｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，44，343− 347，（1989) Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ｉｓｔｒｙ，169，197−203（1988) Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｒｈｅ ｕｍａｔｏｌｏｇｙ，16（７），964− 970，（1989)

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】骨粗鬆症、上皮小体亢進症、慢性関節リュ
   ーマチ、変形性関節症またはパジェット病に特徴的な骨
   組織の代謝異常の存在をスクリーニングする方法であっ
   て、 該方法が、 ヒト被検体から得られた加水分解されていない尿試料中
   の、ペプチドフリーの非グリコシル化ピリジノリン（Ｕ
   −Pyd）／クレアチニンまたはペプチドフリーのデオキ
   シピリジノリン（Ｕ−Dpd）／クレアチニンの比率を測
   定する工程、および、 正常被検体で、同様にして測定された比率を、該比率と
   比較する工程、 を包含し、 高い測定された比率が、骨組織の代謝異常を示す、方
   法。
2. 【請求項２】測定された前記比率が、Ｕ−Pyd/クレアチ
   ニンの比率である、請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】測定された前記比率が、Ｕ−Dpd/クレアチ
   ニンの比率である、請求項１に記載の方法。