JPH0881499A - 抗サイモシンα１モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ - Google Patents
抗サイモシンα１モノクローナル抗体産生ハイブリドーマInfo
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- JPH0881499A JPH0881499A JP6215747A JP21574794A JPH0881499A JP H0881499 A JPH0881499 A JP H0881499A JP 6215747 A JP6215747 A JP 6215747A JP 21574794 A JP21574794 A JP 21574794A JP H0881499 A JPH0881499 A JP H0881499A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 ミエローマ細胞と抗サイモシンα１抗体産生
細胞を融合させてハイブリドーマを作製し、該ハイブリ
ドーマからサイモシンα１の構造のＮ端を認識するモノ
クローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択するこ
とにより得られることを特徴とするハイブリドーマ。 【効果】 サイモシンα１を特異的かつ高感度に測定で
きる。
細胞を融合させてハイブリドーマを作製し、該ハイブリ
ドーマからサイモシンα１の構造のＮ端を認識するモノ
クローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択するこ
とにより得られることを特徴とするハイブリドーマ。 【効果】 サイモシンα１を特異的かつ高感度に測定で
きる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、抗サイモシンα１モノ
クローナル抗体産生ハイブリドーマおよびそれが産生す
る抗体ならびに該抗体を用いる免疫学的サンドイッチ法
によるサイモシンα１の測定法に関する。
クローナル抗体産生ハイブリドーマおよびそれが産生す
る抗体ならびに該抗体を用いる免疫学的サンドイッチ法
によるサイモシンα１の測定法に関する。
【０００２】
【従来の技術】サイモシンα１（Thymosin α1)は、胸
腺組織で産生される胸腺因子の一つで、免疫機能の維持
に重要な役割を果たしているＴ細胞の分化誘導作用を有
するポリペプチドである。このようなポリペプチドはヒ
トのみならずウシにおいても見出されており、ヒトサイ
モシンα１と全く同じアミノ酸配列である。サイモシン
α１は２８アミノ酸残基からなり、Ｎ末端の１番目のＳ
ｅｒ〔１〕がアセチル化されている。
腺組織で産生される胸腺因子の一つで、免疫機能の維持
に重要な役割を果たしているＴ細胞の分化誘導作用を有
するポリペプチドである。このようなポリペプチドはヒ
トのみならずウシにおいても見出されており、ヒトサイ
モシンα１と全く同じアミノ酸配列である。サイモシン
α１は２８アミノ酸残基からなり、Ｎ末端の１番目のＳ
ｅｒ〔１〕がアセチル化されている。
【０００３】サイモシンα１の測定法としては、既に抗
血清を用いたラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）が確立さ
れている（特開昭５５−１６０８５６; 特開昭５７−１
６８５０; International Journal of Immunopharmacol
ogy 14, 1267-1278, 1992; Journal of Immunological
Methods 110, 261-265, 1988; Molecular Immunology2
3, 701-707, 1986; Journal of Immunological Methods
89, 9-17, 1986; Journal of Immunological Methods
80, 45-53, 1985)。これらの、サイモシンα１を認識す
るモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を利用
した免疫学的測定法は、すべて標識抗原を用いた競合法
ＲＩＡもしくは競合法エンザイムイムノアッセイ（ＥＩ
Ａ）であった。これらのサイモシンα１の免疫学的測定
法においては、放射性もしくは非放射性の標識体で標識
されたサイモシンα１と生体中のサイモシンα１とで
は、抗サイモシンα１抗体に対する免疫反応性が全く同
等とはいえない。また、競合法の免疫学的測定法の場合
はサイモシンα１だけではなくサイモシンα１の分解断
片やその他アミノ酸配列が類似したペプチドも一緒に測
り込む危険性があるので、サイモシンα１に対して特異
性が高いとは言えない。また感度の点からも満足できる
ものではなかった。
血清を用いたラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）が確立さ
れている（特開昭５５−１６０８５６; 特開昭５７−１
６８５０; International Journal of Immunopharmacol
ogy 14, 1267-1278, 1992; Journal of Immunological
Methods 110, 261-265, 1988; Molecular Immunology2
3, 701-707, 1986; Journal of Immunological Methods
89, 9-17, 1986; Journal of Immunological Methods
80, 45-53, 1985)。これらの、サイモシンα１を認識す
るモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を利用
した免疫学的測定法は、すべて標識抗原を用いた競合法
ＲＩＡもしくは競合法エンザイムイムノアッセイ（ＥＩ
Ａ）であった。これらのサイモシンα１の免疫学的測定
法においては、放射性もしくは非放射性の標識体で標識
されたサイモシンα１と生体中のサイモシンα１とで
は、抗サイモシンα１抗体に対する免疫反応性が全く同
等とはいえない。また、競合法の免疫学的測定法の場合
はサイモシンα１だけではなくサイモシンα１の分解断
片やその他アミノ酸配列が類似したペプチドも一緒に測
り込む危険性があるので、サイモシンα１に対して特異
性が高いとは言えない。また感度の点からも満足できる
ものではなかった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】上記の測定法に用いら
れている抗サイモシンα１モノクローナル抗体や抗サイ
モシンα１ポリクローナル抗体は、サイモシンα１の一
部分しか認識しない。そこでサイモシンα１のＮ端側、
特に生理学的に重要なアセチル化されたＳｅｒ〔１〕を
特異的に認識する抗体とＣ端側を特異的に認識する抗体
が得られれば、そのような２種の抗体を用いたサンドイ
ッチ法による免疫学的測定が可能になる。サンドイッチ
法は、競合法に比べ感度の点からも特異性の点からも有
利である。従って本発明はサイモシンα１のＮ端側を特
異的に認識する抗体とＣ端側を認識する抗体を用いたサ
ンドイッチ法を特徴とする高感度で特異性の高い免疫学
的測定法およびその試薬を提供するものである。
れている抗サイモシンα１モノクローナル抗体や抗サイ
モシンα１ポリクローナル抗体は、サイモシンα１の一
部分しか認識しない。そこでサイモシンα１のＮ端側、
特に生理学的に重要なアセチル化されたＳｅｒ〔１〕を
特異的に認識する抗体とＣ端側を特異的に認識する抗体
が得られれば、そのような２種の抗体を用いたサンドイ
ッチ法による免疫学的測定が可能になる。サンドイッチ
法は、競合法に比べ感度の点からも特異性の点からも有
利である。従って本発明はサイモシンα１のＮ端側を特
異的に認識する抗体とＣ端側を認識する抗体を用いたサ
ンドイッチ法を特徴とする高感度で特異性の高い免疫学
的測定法およびその試薬を提供するものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らはサイモシン
α１のＮ端断片を特異的に認識する親和性の高いモノク
ローナル抗体を創製すべく鋭意研究を行った結果、サイ
モシンα１のアセチル化されたＳｅｒ〔１〕を含むＮ端
を認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドー
マを得て、そのモノクローナル抗体を利用するサイモシ
ンα１の高感度測定法を完成するに至った。
α１のＮ端断片を特異的に認識する親和性の高いモノク
ローナル抗体を創製すべく鋭意研究を行った結果、サイ
モシンα１のアセチル化されたＳｅｒ〔１〕を含むＮ端
を認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドー
マを得て、そのモノクローナル抗体を利用するサイモシ
ンα１の高感度測定法を完成するに至った。
【０００６】（１）免疫原の調製 サイモシンα１は２８アミノ酸残基からなるポリペプチ
ドであり、比較的低分子であるため抗体の産生を誘起す
る能力（免疫原性）が低いハプテンと呼ばれるものであ
る。そのため、抗原として用いるためには牛血清アルブ
ミン（ＢＳＡ）、牛チログロブリンなどのキャリヤータ
ンパク質と結合させる。一般に、ハプテンをキャリヤー
タンパク質と結合させる公知な方法としては、グルタル
アルデヒド架橋法、カルボジイミド法、ホモ２価性架橋
試薬である１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベン
ゼンを用いたＤＦＤＮＢ法〔Marfey, S.P. and Tsai,
K.H. Biochem. Biophys. Res. Commun. 65, 31 (197
5)〕が従来からよく用いられているが、過重合体や不均
一なハプテン複合体ができやすいので免疫原として望ま
しくない場合が多い。特にサイモシンα１では２８アミ
ノ酸配列内にＬｙｓが４残基、Ａｓｐが３残基、Ｇｌｕ
が６残基も存在するので、サイモシンα１分子の分子内
架橋や分子間架橋、さらにはキャリヤータンパク質との
過剰な架橋が形成されてしまう。事実、我々はサイモシ
ンα１とＢＳＡ、サイモシンα１と牛チログロブリンの
ハプテン複合体を作成すべく、グルタルアルデヒド法、
カルボジイミド法、ＤＦＤＮＢ法を用いて免疫原を調製
し、それをアジュバントと混合したものをマウスやウサ
ギに繰り返し免疫を試みたが、抗体力価・感度に関して
満足できるものではなかった。
ドであり、比較的低分子であるため抗体の産生を誘起す
る能力（免疫原性）が低いハプテンと呼ばれるものであ
る。そのため、抗原として用いるためには牛血清アルブ
ミン（ＢＳＡ）、牛チログロブリンなどのキャリヤータ
ンパク質と結合させる。一般に、ハプテンをキャリヤー
タンパク質と結合させる公知な方法としては、グルタル
アルデヒド架橋法、カルボジイミド法、ホモ２価性架橋
試薬である１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベン
ゼンを用いたＤＦＤＮＢ法〔Marfey, S.P. and Tsai,
K.H. Biochem. Biophys. Res. Commun. 65, 31 (197
5)〕が従来からよく用いられているが、過重合体や不均
一なハプテン複合体ができやすいので免疫原として望ま
しくない場合が多い。特にサイモシンα１では２８アミ
ノ酸配列内にＬｙｓが４残基、Ａｓｐが３残基、Ｇｌｕ
が６残基も存在するので、サイモシンα１分子の分子内
架橋や分子間架橋、さらにはキャリヤータンパク質との
過剰な架橋が形成されてしまう。事実、我々はサイモシ
ンα１とＢＳＡ、サイモシンα１と牛チログロブリンの
ハプテン複合体を作成すべく、グルタルアルデヒド法、
カルボジイミド法、ＤＦＤＮＢ法を用いて免疫原を調製
し、それをアジュバントと混合したものをマウスやウサ
ギに繰り返し免疫を試みたが、抗体力価・感度に関して
満足できるものではなかった。
【０００７】このため我々は、ヘテロ２価性架橋剤であ
るスルホサクシイミジル４−〔Ｎ−マレイミドメチル〕
シクロヘキサン−１−カルボキシレート（Sulfo-SMCC）
を利用したマレイミド法〔Yositake, S., et al., J. B
iochem. 92, 1413, (1982 ）〕を用いてハプテン−タン
パク質複合体を調製し、それを動物に免疫すると良好な
結果を得ることができることを見出した。
るスルホサクシイミジル４−〔Ｎ−マレイミドメチル〕
シクロヘキサン−１−カルボキシレート（Sulfo-SMCC）
を利用したマレイミド法〔Yositake, S., et al., J. B
iochem. 92, 1413, (1982 ）〕を用いてハプテン−タン
パク質複合体を調製し、それを動物に免疫すると良好な
結果を得ることができることを見出した。
【０００８】（２）モノクローナル抗体産生ハイブリド
ーマの調製 マレイミド法で得られた免疫原は、フロイントの完全ア
ジュバント等の適当なアジュバントに乳濁させ、マウス
の免疫に用いる。免疫は、上記乳濁液を数週間おきにマ
ウスの腹腔に数回繰り返し接種することにより行う。最
終免疫後３日後に脾臓を取り出し、抗体産生細胞として
使用する。この時同時に抗体産生細胞と融合させてハイ
ブリドーマを得るための親細胞として、ヒポキサンチン
−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損
（ＨＧＰＲＴ-)あるいはチミジンキナーゼ欠損（ＴＫ-)
のような適切なマーカーを持つミエローマ細胞株を用意
し、これと抗体産生細胞とを融合させてハイブリドーマ
を作製する。
ーマの調製 マレイミド法で得られた免疫原は、フロイントの完全ア
ジュバント等の適当なアジュバントに乳濁させ、マウス
の免疫に用いる。免疫は、上記乳濁液を数週間おきにマ
ウスの腹腔に数回繰り返し接種することにより行う。最
終免疫後３日後に脾臓を取り出し、抗体産生細胞として
使用する。この時同時に抗体産生細胞と融合させてハイ
ブリドーマを得るための親細胞として、ヒポキサンチン
−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損
（ＨＧＰＲＴ-)あるいはチミジンキナーゼ欠損（ＴＫ-)
のような適切なマーカーを持つミエローマ細胞株を用意
し、これと抗体産生細胞とを融合させてハイブリドーマ
を作製する。
【０００９】ハイブリドーマ作製における培地として
は、ＲＰＭＩ−１６４０などの通常良く使用されている
ものに、適宜約１０％の牛血清（ＣＳ、calf serum）を
加えて用いることができる。例えば、親細胞であるミエ
ローマと脾細胞を約４：１０の割合で用意する。融合剤
としては５０％のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を
用いるのが融合率が高いとされている。融合細胞はＨＡ
Ｔ選択法により選択しうる。生じるハイブリドーマのス
クリーニングは、培養上清を用いてＲＩＡ法など既知の
方法により行い、目的の免疫グロブリンを分泌している
ハイブリドーマのクローンを選択することができる。ま
た、スクリーニングは二段階で行い、アセチル化された
Ｓｅｒ〔１〕を持つサイモシンα１〔１−２８〕を認識
する免疫ブロブリンを分泌しているハイブリドーマを１
段階目で選抜し、１段階目で選抜されたハイブリドーマ
の中から、アセチル化されていないＳｅｒ〔１〕をＮ末
端に持つデスアセチル−サイモシンα１〔１−２８〕を
認識しない免疫グロブリンを分泌しているハイブリドー
マだけを選抜する。
は、ＲＰＭＩ−１６４０などの通常良く使用されている
ものに、適宜約１０％の牛血清（ＣＳ、calf serum）を
加えて用いることができる。例えば、親細胞であるミエ
ローマと脾細胞を約４：１０の割合で用意する。融合剤
としては５０％のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を
用いるのが融合率が高いとされている。融合細胞はＨＡ
Ｔ選択法により選択しうる。生じるハイブリドーマのス
クリーニングは、培養上清を用いてＲＩＡ法など既知の
方法により行い、目的の免疫グロブリンを分泌している
ハイブリドーマのクローンを選択することができる。ま
た、スクリーニングは二段階で行い、アセチル化された
Ｓｅｒ〔１〕を持つサイモシンα１〔１−２８〕を認識
する免疫ブロブリンを分泌しているハイブリドーマを１
段階目で選抜し、１段階目で選抜されたハイブリドーマ
の中から、アセチル化されていないＳｅｒ〔１〕をＮ末
端に持つデスアセチル−サイモシンα１〔１−２８〕を
認識しない免疫グロブリンを分泌しているハイブリドー
マだけを選抜する。
【００１０】ハイブリドーマの単一性を吟味するため、
例えば９６穴のマイクロウエルにハイブリドーマを１穴
に１個より多くならないように蒔き、生育してくるクロ
ーンについて再びスクリーニングを行う。このようなサ
ブクローニングを繰り返すことにより、単一性のハイブ
リドーマを得る。このようにして後記実施例で得られた
ハイブリドーマは、ＭＴＨ３３Ｇ２と命名され、工業技
術院生命工学工業技術研究所に平成６（１９９４）年８
月５日に、ＭＴＨ３３Ｇ２（ＦＥＲＭ Ｐ−１４４６
１）として寄託されている。
例えば９６穴のマイクロウエルにハイブリドーマを１穴
に１個より多くならないように蒔き、生育してくるクロ
ーンについて再びスクリーニングを行う。このようなサ
ブクローニングを繰り返すことにより、単一性のハイブ
リドーマを得る。このようにして後記実施例で得られた
ハイブリドーマは、ＭＴＨ３３Ｇ２と命名され、工業技
術院生命工学工業技術研究所に平成６（１９９４）年８
月５日に、ＭＴＨ３３Ｇ２（ＦＥＲＭ Ｐ−１４４６
１）として寄託されている。
【００１１】（３）モノクローナル抗体の産生 次に、本発明のモノクローナル抗体を製造するために、
上記で得られたハイブリドーマを培養容器中（in vitr
o）または動物体内（in vivo)で培養する。in vitro系
で培養する場合、培地は先に述べた通常培地にＣＳを添
加したものでよく、この培地で３〜５日培養の後、培養
上清からモノクローナル抗体を得ることができる。in v
ivo 系の培養では、ハイブリドーマをマウスの腹腔に接
種し、７〜１４日後に腹水を採取し、これよりモノクロ
ーナル抗体を得ることができる。invivo 系での培養の
場合、in vitro系での培養に比べて遥かに大量の抗体を
効率的に取得しうるので好ましい。
上記で得られたハイブリドーマを培養容器中（in vitr
o）または動物体内（in vivo)で培養する。in vitro系
で培養する場合、培地は先に述べた通常培地にＣＳを添
加したものでよく、この培地で３〜５日培養の後、培養
上清からモノクローナル抗体を得ることができる。in v
ivo 系の培養では、ハイブリドーマをマウスの腹腔に接
種し、７〜１４日後に腹水を採取し、これよりモノクロ
ーナル抗体を得ることができる。invivo 系での培養の
場合、in vitro系での培養に比べて遥かに大量の抗体を
効率的に取得しうるので好ましい。
【００１２】こうして得られた培養上清または腹水から
のモノクローナル抗体の精製は、陰イオン交換カラムク
ロマトグラフィー、プロテインＡセファロースカラムク
ロマトグラフィー等の既知の方法を適宜組み合わせて、
例えば後記実施例に記載したようにして行うことができ
る。
のモノクローナル抗体の精製は、陰イオン交換カラムク
ロマトグラフィー、プロテインＡセファロースカラムク
ロマトグラフィー等の既知の方法を適宜組み合わせて、
例えば後記実施例に記載したようにして行うことができ
る。
【００１３】本発明で得られたハイブリドーマ細胞ＭＴ
Ｈ３３Ｇ２の産生するモノクローナル抗体ＭＴＨ３３Ｇ
２は、後記実施例に示すとおり、アセチル化されたＮ末
端Ｓｅｒ〔１〕を含むサイモシンα１〔１−２８〕を特
異的に認識し、アセチル化されていないＮ末端Ｓｅｒ
〔１〕を持つデスアセチル−サイモシンα１〔１−２
８〕やＣ端側半分のサイモシンα１〔１６−２８〕とは
反応しないことから、そのエピトープはサイモシンα１
のＮ端、詳細にはエピトープ解析の結果からアセチルＳ
ｅｒ〔１〕からＶａｌ〔５〕に含まれる部分を認識して
いるものと推定した。
Ｈ３３Ｇ２の産生するモノクローナル抗体ＭＴＨ３３Ｇ
２は、後記実施例に示すとおり、アセチル化されたＮ末
端Ｓｅｒ〔１〕を含むサイモシンα１〔１−２８〕を特
異的に認識し、アセチル化されていないＮ末端Ｓｅｒ
〔１〕を持つデスアセチル−サイモシンα１〔１−２
８〕やＣ端側半分のサイモシンα１〔１６−２８〕とは
反応しないことから、そのエピトープはサイモシンα１
のＮ端、詳細にはエピトープ解析の結果からアセチルＳ
ｅｒ〔１〕からＶａｌ〔５〕に含まれる部分を認識して
いるものと推定した。
【００１４】（４）ウサギ抗サイモシンα１〔１６−２
８〕血清 公知の方法で化学合成したサイモシンα１〔１６−２
８〕をマレイミド法によってサイモシンα１〔１６−２
８〕−牛チログロブリン複合体を作成する。そのサイモ
シンα１〔１６−２８〕−牛チログロブリン複合体とフ
ロイントの完全アジュバントを乳濁させ、それをウサギ
に投与して数回免疫し、最終免疫から１０〜１４日後に
採血してウサギ抗サイモシンα１〔１６−２８〕血清を
調製する。こうして得られたウサギ抗サイモシンα１血
清をＭＣＲ０５７７と命名した。
８〕血清 公知の方法で化学合成したサイモシンα１〔１６−２
８〕をマレイミド法によってサイモシンα１〔１６−２
８〕−牛チログロブリン複合体を作成する。そのサイモ
シンα１〔１６−２８〕−牛チログロブリン複合体とフ
ロイントの完全アジュバントを乳濁させ、それをウサギ
に投与して数回免疫し、最終免疫から１０〜１４日後に
採血してウサギ抗サイモシンα１〔１６−２８〕血清を
調製する。こうして得られたウサギ抗サイモシンα１血
清をＭＣＲ０５７７と命名した。
【００１５】上記のポリクローナル抗体はウサギ由来の
ものであるが、これに限定されるものではなく、例えば
馬、ヤギ、ニワトリなどの動物に免疫して得られる特異
抗血清でもよい。
ものであるが、これに限定されるものではなく、例えば
馬、ヤギ、ニワトリなどの動物に免疫して得られる特異
抗血清でもよい。
【００１６】（５）抗体の固相化法 抗体（Ａ）を固相化する固相としては、通常の免疫測定
法に使用される市販の抗原抗体反応用担体、例えば、ガ
ラスまたは合成樹脂製の粒状物（ビーズ）あるいは球状
物（ボール）、チューブ、プレートなどを用いることが
できる。これらの担体に、サイモシンα１のＮ端側また
はＣ端側を認識する抗体を吸着させる。吸着は通常リン
酸緩衝液中pH６〜１０、好ましくは中性付近で室温下に
一夜放置することにより行う。抗体を吸着した抗体は、
アジ化ナトリウムの存在下のリン酸緩衝液中または乾燥
して冷所に保存する。
法に使用される市販の抗原抗体反応用担体、例えば、ガ
ラスまたは合成樹脂製の粒状物（ビーズ）あるいは球状
物（ボール）、チューブ、プレートなどを用いることが
できる。これらの担体に、サイモシンα１のＮ端側また
はＣ端側を認識する抗体を吸着させる。吸着は通常リン
酸緩衝液中pH６〜１０、好ましくは中性付近で室温下に
一夜放置することにより行う。抗体を吸着した抗体は、
アジ化ナトリウムの存在下のリン酸緩衝液中または乾燥
して冷所に保存する。
【００１７】（６）標識化物質（Ｃ）の調製 本発明における抗体（Ｂ）を認識する標識化された物質
とは、１つは標識物質を結合した特異抗体であり、該特
異抗体とは、上記モノクローナル抗体またはポリクロー
ナル抗体を得る動物種の抗体を、それ自体既知の通常用
いられる方法で他種の動物に免疫して得られる特異抗血
清もしくはこれを精製して得られる抗体あるいはモノク
ローナル抗体である。該特異抗体としては、抗体（Ａ）
に使用される上記モノクローナル抗体を得る動物種の正
常血清に結合する抗体を除去したものであってもよい。
とは、１つは標識物質を結合した特異抗体であり、該特
異抗体とは、上記モノクローナル抗体またはポリクロー
ナル抗体を得る動物種の抗体を、それ自体既知の通常用
いられる方法で他種の動物に免疫して得られる特異抗血
清もしくはこれを精製して得られる抗体あるいはモノク
ローナル抗体である。該特異抗体としては、抗体（Ａ）
に使用される上記モノクローナル抗体を得る動物種の正
常血清に結合する抗体を除去したものであってもよい。
【００１８】抗体の標識物質としては、非放射性物質ま
たは放射性物質のいずれでもよい。非放射性物質として
はホースラディッシュパーオキシターゼ（ＨＲＰ）、ア
ルカリホスファターゼ、グルコースオキシターゼなどが
挙げられる。放射性物質としては、α線、β線、γ線な
どの放射線を出す放射性同位元素が挙げられるが、通
常、免疫学的測定法においてはヨウ素１２５(125Ｉ）で
標識化したものがよく用いられる。本発明の実施例にお
いてもヨウ化ナトリウム（Ｎａ 125Ｉ）とクロラミンＴ
で 125Ｉ標識した抗体を用いた。
たは放射性物質のいずれでもよい。非放射性物質として
はホースラディッシュパーオキシターゼ（ＨＲＰ）、ア
ルカリホスファターゼ、グルコースオキシターゼなどが
挙げられる。放射性物質としては、α線、β線、γ線な
どの放射線を出す放射性同位元素が挙げられるが、通
常、免疫学的測定法においてはヨウ素１２５(125Ｉ）で
標識化したものがよく用いられる。本発明の実施例にお
いてもヨウ化ナトリウム（Ｎａ 125Ｉ）とクロラミンＴ
で 125Ｉ標識した抗体を用いた。
【００１９】サイモシンα１を測定する免疫学的測定試
薬の調製における抗体の組合わせとしては、サイモシン
α１のＮ端側を認識する抗体（Ａ）を固相化した場合に
はＣ端側を認識する抗体（Ｂ）に対する特異抗体を標識
抗体（Ｃ）とし、Ｃ端側を認識する抗体（Ａ）を固相化
した場合にはＮ端側を認識する抗体（Ｂ）に対する特異
抗体を標識抗体（Ｃ）とすればよい。一般には、固相化
には比較的大量の抗体（Ａ）が必要であるため、安定的
に大量の抗体が得られるモノクローナル抗体（例えば、
本発明のＭＴＨ３３Ｇ２）が固相化に適している。液相
の抗体（Ｂ）は、モノクローナル抗体、ポリクローナル
抗体のいずれでもよく、固相化した抗体（Ａ）が認識す
るのとは異なる部位を認識するものであればよい。例え
ば、固相化抗体として本発明のＭＴＨ３３Ｇ２を用いた
場合には、液相抗体として上述の抗血清ＭＣＲ０５７７
が適用できる。当然、固相化する抗体としてサイモシン
α１のＣ端側を認識するモノクローナル抗体が、液相抗
体としてＮ端を認識するモノクローナル抗体および抗血
清も本発明に適用できる。
薬の調製における抗体の組合わせとしては、サイモシン
α１のＮ端側を認識する抗体（Ａ）を固相化した場合に
はＣ端側を認識する抗体（Ｂ）に対する特異抗体を標識
抗体（Ｃ）とし、Ｃ端側を認識する抗体（Ａ）を固相化
した場合にはＮ端側を認識する抗体（Ｂ）に対する特異
抗体を標識抗体（Ｃ）とすればよい。一般には、固相化
には比較的大量の抗体（Ａ）が必要であるため、安定的
に大量の抗体が得られるモノクローナル抗体（例えば、
本発明のＭＴＨ３３Ｇ２）が固相化に適している。液相
の抗体（Ｂ）は、モノクローナル抗体、ポリクローナル
抗体のいずれでもよく、固相化した抗体（Ａ）が認識す
るのとは異なる部位を認識するものであればよい。例え
ば、固相化抗体として本発明のＭＴＨ３３Ｇ２を用いた
場合には、液相抗体として上述の抗血清ＭＣＲ０５７７
が適用できる。当然、固相化する抗体としてサイモシン
α１のＣ端側を認識するモノクローナル抗体が、液相抗
体としてＮ端を認識するモノクローナル抗体および抗血
清も本発明に適用できる。
【００２０】
【実施例】次に、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説
明する。しかしながら、下記の実施例は、本発明の具体
的な認識を得る一助とみなすべきものであり、本発明の
範囲を何ら制限するものではない。免疫原の調製 （１）サイモシンα１〔１−２８〕へのマレイミド基の
導入 合成サイモシンα１〔１−２８〕（５．３mg）を２８０
μl の０．１M リン酸ナトリウム緩衝液（pH７．２）に
溶解し、これにスルホサクシイミジル４−〔Ｎ−マレイ
ミドメチル〕シクロヘキサン−１−カルボキシレート
（Sulfo-SMCC; ピアス社製）５．９mgを加え、３０℃で
３０分間撹拌した。次いで、反応混合物を０．１M リン
酸ナトリウム緩衝液（pH７．２）で平衡化したセファデ
ックスＧ−２５カラム（ＮＡＰ−５カラム；ファルマシ
ア製）に通すことによって、過剰の試薬を除去した。
明する。しかしながら、下記の実施例は、本発明の具体
的な認識を得る一助とみなすべきものであり、本発明の
範囲を何ら制限するものではない。免疫原の調製 （１）サイモシンα１〔１−２８〕へのマレイミド基の
導入 合成サイモシンα１〔１−２８〕（５．３mg）を２８０
μl の０．１M リン酸ナトリウム緩衝液（pH７．２）に
溶解し、これにスルホサクシイミジル４−〔Ｎ−マレイ
ミドメチル〕シクロヘキサン−１−カルボキシレート
（Sulfo-SMCC; ピアス社製）５．９mgを加え、３０℃で
３０分間撹拌した。次いで、反応混合物を０．１M リン
酸ナトリウム緩衝液（pH７．２）で平衡化したセファデ
ックスＧ−２５カラム（ＮＡＰ−５カラム；ファルマシ
ア製）に通すことによって、過剰の試薬を除去した。
【００２１】（２）ＢＳＡへのチオール基の導入（メル
カプトサクシニルＢＳＡ） ＢＳＡ２００mgとＳ−アセチルメルカプトサクシニック
アンヒドリド５０mgを、０．１M リン酸ナトリウム緩衝
液（pH７．０）５ml中で、ときどきかき混ぜながら３０
℃で３０分間保温した。この間、１N ＮａＯＨを加えて
反応液のpHを７．０に保つようにする。反応液を０．１
M リン酸ナトリウム緩衝液（pH７．０）で透析すること
によって、未反応の試薬を除去し、アセチルメルカプト
サクシニルＢＳＡを得た。
カプトサクシニルＢＳＡ） ＢＳＡ２００mgとＳ−アセチルメルカプトサクシニック
アンヒドリド５０mgを、０．１M リン酸ナトリウム緩衝
液（pH７．０）５ml中で、ときどきかき混ぜながら３０
℃で３０分間保温した。この間、１N ＮａＯＨを加えて
反応液のpHを７．０に保つようにする。反応液を０．１
M リン酸ナトリウム緩衝液（pH７．０）で透析すること
によって、未反応の試薬を除去し、アセチルメルカプト
サクシニルＢＳＡを得た。
【００２２】次に上記で得られたアセチルメルカプトサ
クシニルＢＳＡ １０mgを０．１Mヒドロキシルアミン
を含む０．１M リン酸ナトリウム緩衝液（pH７．２）
０．２mlに溶かし、室温で３０分間処理して脱アセチル
化し、５mMＥＤＴＡを含む０．１M リン酸ナトリウム緩
衝液（pH６．０）で平衡化したセファデックスＧ−２５
カラム（ＮＡＰ−５カラム；ファルマシア製）に通し
て、過剰の試薬を除去することによってメルカプトサク
シニルＢＳＡを得た〔北川ら、「免疫実験操作法IX」、
日本免疫学会編、p.３５２９（１９８２）〕。
クシニルＢＳＡ １０mgを０．１Mヒドロキシルアミン
を含む０．１M リン酸ナトリウム緩衝液（pH７．２）
０．２mlに溶かし、室温で３０分間処理して脱アセチル
化し、５mMＥＤＴＡを含む０．１M リン酸ナトリウム緩
衝液（pH６．０）で平衡化したセファデックスＧ−２５
カラム（ＮＡＰ−５カラム；ファルマシア製）に通し
て、過剰の試薬を除去することによってメルカプトサク
シニルＢＳＡを得た〔北川ら、「免疫実験操作法IX」、
日本免疫学会編、p.３５２９（１９８２）〕。
【００２３】（３）サイモシンα１〔１−２８〕−ＢＳ
Ａ複合体の作製 （１）で得たマレイミド化したサイモシンα１〔１−２
８〕５．３mgを、（２）で得られたメルカプトサクシニ
ルＢＳＡ ４．５mgを含む０．１M リン酸ナトリウム緩
衝液（pH６．０）０．７mlにかき混ぜながら滴下し、さ
らに２時間室温に保温した。この溶液を、生理食塩水３
L に対して５回、２４時間透析した。この透析物を分注
して−２０℃で保存した。
Ａ複合体の作製 （１）で得たマレイミド化したサイモシンα１〔１−２
８〕５．３mgを、（２）で得られたメルカプトサクシニ
ルＢＳＡ ４．５mgを含む０．１M リン酸ナトリウム緩
衝液（pH６．０）０．７mlにかき混ぜながら滴下し、さ
らに２時間室温に保温した。この溶液を、生理食塩水３
L に対して５回、２４時間透析した。この透析物を分注
して−２０℃で保存した。
【００２４】（４）免疫エマルジョンの調製 上記の分注保存した溶液（サイモシンα１〔１−２８〕
−ＢＳＡ複合体２mgを含む）に生理食塩水を加えて１ml
とし、これをフロイントの完全アジュバント１mlに乳濁
した。
−ＢＳＡ複合体２mgを含む）に生理食塩水を加えて１ml
とし、これをフロイントの完全アジュバント１mlに乳濁
した。
【００２５】ハイブリドーマの調製 上記の免疫エマルジョンをＢＡＬＢ／ｃ雌マウスの腹腔
に注射し（１匹当り１００μl)、さらに２週間後に同じ
方法で追加免疫した。２週間おきに追加免疫を繰り返
し、１０週間後の、血液中の抗体を測定し、最も強く免
疫応答を示した１匹のマウスの尾静脈にサイモシンα１
〔１−２８〕を含む生理食塩水（１００μl)をさらに追
加免疫した。その３日後、マウスから細胞融合のために
脾臓細胞を採集した。
に注射し（１匹当り１００μl)、さらに２週間後に同じ
方法で追加免疫した。２週間おきに追加免疫を繰り返
し、１０週間後の、血液中の抗体を測定し、最も強く免
疫応答を示した１匹のマウスの尾静脈にサイモシンα１
〔１−２８〕を含む生理食塩水（１００μl)をさらに追
加免疫した。その３日後、マウスから細胞融合のために
脾臓細胞を採集した。
【００２６】採集した脾臓細胞（１．０×１０8 個）と
ミエローマ細胞Ｐ３ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１（ＡＴＣＣ Ｃ
ＲＬ １９５７）（４×１０7 個）をＲＰＭＩ−１６４
０培地（シグマ社製）中で混合し、１，１５０rpm 、４
℃で５分間遠沈した。得られたペレットを３７℃に加温
した後、５０％ＰＥＧ４０００（ＰＥＧ １g ／ＲＰＭ
Ｉ−１６４０ １ml）１mlを３７℃で１分間かけて滴下
し、続けて１分間撹拌した。さらに３７℃のＲＰＭＩ−
１６４０ １mlを１分間かけて滴下し、続けて１分間撹
拌した後、３７℃のＲＰＭＩ−１６４０ ７mlを３分間
かけて加え希釈し、４℃で１０％ＣＳ添加ＲＰＭＩ−１
６４０で遠心洗浄した。
ミエローマ細胞Ｐ３ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１（ＡＴＣＣ Ｃ
ＲＬ １９５７）（４×１０7 個）をＲＰＭＩ−１６４
０培地（シグマ社製）中で混合し、１，１５０rpm 、４
℃で５分間遠沈した。得られたペレットを３７℃に加温
した後、５０％ＰＥＧ４０００（ＰＥＧ １g ／ＲＰＭ
Ｉ−１６４０ １ml）１mlを３７℃で１分間かけて滴下
し、続けて１分間撹拌した。さらに３７℃のＲＰＭＩ−
１６４０ １mlを１分間かけて滴下し、続けて１分間撹
拌した後、３７℃のＲＰＭＩ−１６４０ ７mlを３分間
かけて加え希釈し、４℃で１０％ＣＳ添加ＲＰＭＩ−１
６４０で遠心洗浄した。
【００２７】得られた細胞を９６穴プレートに蒔き、Ｈ
ＡＴ培地（シグマ社製）中で２週間培養した。後述のス
クリーニング法によってハイブリドーマを選抜し、最も
高い抗体価を示したウエルの細胞を限界希釈法等により
クローン化した。このクローニングによって、安定に大
量の抗体を産生するクローンを選抜し、ＭＴＨ３３Ｇ２
と命名した。
ＡＴ培地（シグマ社製）中で２週間培養した。後述のス
クリーニング法によってハイブリドーマを選抜し、最も
高い抗体価を示したウエルの細胞を限界希釈法等により
クローン化した。このクローニングによって、安定に大
量の抗体を産生するクローンを選抜し、ＭＴＨ３３Ｇ２
と命名した。
【００２８】上記の、免疫マウスの抗血清およびハイブ
リドーマ培養上清中の抗体価は下記のようにして測定し
た。免疫マウスの抗血清またはハイブリドーマの培養上
清をサンプルとし、該サンプル希釈液１００μl 、アッ
セイバッファー〔０．１M リン酸ナトリウム（pH７．
４）、０．１５M ＮａＣｌ、１．０mg/ml ＢＳＡ、０．
５mg/ml Tween ２０、０．２mg/ml アジ化ナトリウム〕
１００μl 、 125Ｉ−〔Ｔｙｒ29〕−サイモシンα１
〔１−２８〕（１０，０００cpm)５０μl の混合液を４
℃で２４時間反応させた。これをウサギ抗マウスＩｇＧ
抗体、ＰＥＧ６０００、アビセルを含む第２抗体溶液２
５０μl と混合し、４℃で３０分間反応させた。その
後、４℃で２０分間、３，０００rpm にて遠心し、その
沈澱の放射活性をγ−カウンター（アロカ ＡＲＣ−６
００）で測定することにより、サンプル希釈液中の抗体
価を求めた。
リドーマ培養上清中の抗体価は下記のようにして測定し
た。免疫マウスの抗血清またはハイブリドーマの培養上
清をサンプルとし、該サンプル希釈液１００μl 、アッ
セイバッファー〔０．１M リン酸ナトリウム（pH７．
４）、０．１５M ＮａＣｌ、１．０mg/ml ＢＳＡ、０．
５mg/ml Tween ２０、０．２mg/ml アジ化ナトリウム〕
１００μl 、 125Ｉ−〔Ｔｙｒ29〕−サイモシンα１
〔１−２８〕（１０，０００cpm)５０μl の混合液を４
℃で２４時間反応させた。これをウサギ抗マウスＩｇＧ
抗体、ＰＥＧ６０００、アビセルを含む第２抗体溶液２
５０μl と混合し、４℃で３０分間反応させた。その
後、４℃で２０分間、３，０００rpm にて遠心し、その
沈澱の放射活性をγ−カウンター（アロカ ＡＲＣ−６
００）で測定することにより、サンプル希釈液中の抗体
価を求めた。
【００２９】上記 125Ｉ−〔Ｔｙｒ29〕−サイモシンα
１〔１−２８〕はクロラミンＴ法によって調製した。即
ち、〔Ｔｙｒ29〕−サイモシンα１〔１−２８〕（４．
８μg)とＮａ 125Ｉ（０．５mCi)を混合し、３μl のク
ロラミンＴ（１．０mg/ml)を加え、３０秒後に２５μl
のアスコルビン酸（０．７mg/ml)を加えた。さらに、
０．２g/mlヨウ化カリウム溶液１００μl を加え、ＯＤ
Ｓ−１２０Ｔカラム（TOSO社製）で精製した。
１〔１−２８〕はクロラミンＴ法によって調製した。即
ち、〔Ｔｙｒ29〕−サイモシンα１〔１−２８〕（４．
８μg)とＮａ 125Ｉ（０．５mCi)を混合し、３μl のク
ロラミンＴ（１．０mg/ml)を加え、３０秒後に２５μl
のアスコルビン酸（０．７mg/ml)を加えた。さらに、
０．２g/mlヨウ化カリウム溶液１００μl を加え、ＯＤ
Ｓ−１２０Ｔカラム（TOSO社製）で精製した。
【００３０】モノクローナル抗体の調製 ０．５mlのプリスタンを腹腔注射後、２週間経たＢＡＬ
Ｂ／ｃマウスの腹腔に、ＲＰＭＩ−１６４０に懸濁した
ハイブリドーマＭＴＨ３３Ｇ２を注射した。得られた腹
水をプロテインＡ−セファロースＣＬ−４Ｂカラム（フ
ァルマシア社製）で精製し、モノクローナル抗体ＭＴＨ
３３Ｇ２を得た。
Ｂ／ｃマウスの腹腔に、ＲＰＭＩ−１６４０に懸濁した
ハイブリドーマＭＴＨ３３Ｇ２を注射した。得られた腹
水をプロテインＡ−セファロースＣＬ−４Ｂカラム（フ
ァルマシア社製）で精製し、モノクローナル抗体ＭＴＨ
３３Ｇ２を得た。
【００３１】ＭＴＨ３３Ｇ２の諸性状 本モノクローナル抗体のアイソタイプの決定は、マウス
モノクローナル抗体サブタイピングキット（BioRad社
製）に従って行い、ＩｇＧ1 サブクラスに属するものと
決定した。親和性はスキャッチャードプロットを作成す
ることにより求め、その結果はＫａ＝４．０×１０7M-1
であった。
モノクローナル抗体サブタイピングキット（BioRad社
製）に従って行い、ＩｇＧ1 サブクラスに属するものと
決定した。親和性はスキャッチャードプロットを作成す
ることにより求め、その結果はＫａ＝４．０×１０7M-1
であった。
【００３２】エピトープは、種々のサイモシンα１関連
ペプチドに対する交差反応性をＲＩＡで調べることによ
り決定した。すなわちハイブリドーマＭＴＨ３３Ｇ２を
注射したマウスから得られた腹水をアッセイバッファー
〔０．１M リン酸ナトリウム（pH７．４）、０．１５M
ＮａＣｌ、１．０mg/ml ＢＳＡ、０．５mg/ml Tween２
０、０．２mg/ml アジ化ナトリウム〕で１，０００倍希
釈した。その腹水希釈液１００μｌとアッセイバッファ
ーで希釈したサイモシンαｌ標準溶液（４種類のペプチ
ド）１００μｌ、125 Ｉ−〔Ｔｙｒ29〕−サイモシンα
１〔１−２８〕（１０，０００cpm ）５０μｌの混合液
を４℃で２４時間反応させた。これをウサギ抗マウスＩ
ｇＧ抗体、ＰＥＧ６０００、アビセルを含む第２抗体溶
液２５０μｌと混合し、４℃で３０分間反応させた。そ
の後、４℃で２０分間、３，０００rpm にて遠心し、そ
の沈殿の放射活性をγ−カウンター（アロカ ＡＲＣ−
６００）で測定した。標準曲線の作製には、既知量のサ
イモシンα１存在下における結合放射活性をサイモシン
α１の非存在下における結合放射活性で割った値（Ｂ／
Ｂ０）を計算した。その結果を図１に示す。Ｎ端がアセ
チル化されていないデスアセチル−サイモシンα１〔１
−２８〕とサイモシンα１〔１６−２８〕には殆ど反応
しないことから、エピトープはサイモシンα１〔１−１
５〕に含まれると推定した。またサイモシンα１のＮ端
アセチル基を認識し、逆にＮ端がアセチル化されていな
いサイモシンα１は認識しなかった。
ペプチドに対する交差反応性をＲＩＡで調べることによ
り決定した。すなわちハイブリドーマＭＴＨ３３Ｇ２を
注射したマウスから得られた腹水をアッセイバッファー
〔０．１M リン酸ナトリウム（pH７．４）、０．１５M
ＮａＣｌ、１．０mg/ml ＢＳＡ、０．５mg/ml Tween２
０、０．２mg/ml アジ化ナトリウム〕で１，０００倍希
釈した。その腹水希釈液１００μｌとアッセイバッファ
ーで希釈したサイモシンαｌ標準溶液（４種類のペプチ
ド）１００μｌ、125 Ｉ−〔Ｔｙｒ29〕−サイモシンα
１〔１−２８〕（１０，０００cpm ）５０μｌの混合液
を４℃で２４時間反応させた。これをウサギ抗マウスＩ
ｇＧ抗体、ＰＥＧ６０００、アビセルを含む第２抗体溶
液２５０μｌと混合し、４℃で３０分間反応させた。そ
の後、４℃で２０分間、３，０００rpm にて遠心し、そ
の沈殿の放射活性をγ−カウンター（アロカ ＡＲＣ−
６００）で測定した。標準曲線の作製には、既知量のサ
イモシンα１存在下における結合放射活性をサイモシン
α１の非存在下における結合放射活性で割った値（Ｂ／
Ｂ０）を計算した。その結果を図１に示す。Ｎ端がアセ
チル化されていないデスアセチル−サイモシンα１〔１
−２８〕とサイモシンα１〔１６−２８〕には殆ど反応
しないことから、エピトープはサイモシンα１〔１−１
５〕に含まれると推定した。またサイモシンα１のＮ端
アセチル基を認識し、逆にＮ端がアセチル化されていな
いサイモシンα１は認識しなかった。
【００３３】モノクローナル抗サイモシンα１被覆ポリ
スチレンボールの調製 ポリスチレンボール（直径６．３５mm、イムノケミカル
社製）５００個を０．０５M リン酸カリウム緩衝液（pH
７．２）１５０mlに入れ、これにモノクローナル抗サイ
モシンα１−ＩｇＧ1 （ＭＴＨ３３Ｇ２）７５０μg を
加え、室温で一夜放置した。このポリスチレンボールを
０．０５M リン酸カリウム緩衝液（pH７．２）で洗浄
し、乾燥してから、冷蔵庫中で保存した。
スチレンボールの調製 ポリスチレンボール（直径６．３５mm、イムノケミカル
社製）５００個を０．０５M リン酸カリウム緩衝液（pH
７．２）１５０mlに入れ、これにモノクローナル抗サイ
モシンα１−ＩｇＧ1 （ＭＴＨ３３Ｇ２）７５０μg を
加え、室温で一夜放置した。このポリスチレンボールを
０．０５M リン酸カリウム緩衝液（pH７．２）で洗浄
し、乾燥してから、冷蔵庫中で保存した。
【００３４】サイモシンα１〔１６−２８〕−牛チログ
ロブリンの作製 サイモシンα１〔１６−２８〕ペプチドのＮ末端にＣｙ
ｓを付加した〔Ｃｙｓ〕−サイモシンα１〔１６−２
８〕をマレイミド基を導入した牛チログロブリンと結合
させた。
ロブリンの作製 サイモシンα１〔１６−２８〕ペプチドのＮ末端にＣｙ
ｓを付加した〔Ｃｙｓ〕−サイモシンα１〔１６−２
８〕をマレイミド基を導入した牛チログロブリンと結合
させた。
【００３５】牛チログロブリンへのマレイミド基の導入
は以下にように行った。牛チログロブリン（５０mg）を
０．１M リン酸ナトリウム緩衝液（pH７．０）５mlに溶
解し、これにスルホサクシイミジル４−〔Ｎ−マレイミ
ドメチル〕シクロヘキサン−１−カルボキシレート（Su
lfo-SMCC; ピアス社製）１０mgを加え、３０℃で１時間
撹拌した。次いで、反応混合物を５mM ＥＤＴＡを含む
０．１M リン酸ナトリウム緩衝液（pH６．０）で平衡化
したセファデックスＧ−２５カラムに通すことによっ
て、過剰の試薬を除去した。
は以下にように行った。牛チログロブリン（５０mg）を
０．１M リン酸ナトリウム緩衝液（pH７．０）５mlに溶
解し、これにスルホサクシイミジル４−〔Ｎ−マレイミ
ドメチル〕シクロヘキサン−１−カルボキシレート（Su
lfo-SMCC; ピアス社製）１０mgを加え、３０℃で１時間
撹拌した。次いで、反応混合物を５mM ＥＤＴＡを含む
０．１M リン酸ナトリウム緩衝液（pH６．０）で平衡化
したセファデックスＧ−２５カラムに通すことによっ
て、過剰の試薬を除去した。
【００３６】マレイミド基が導入された牛チログロブリ
ン５０mgが溶解している５mM ＥＤＴＡを含む０．１M
リン酸ナトリウム緩衝液（pH６．０）７mlに〔Ｃｙｓ〕
−サイモシンα１〔１６−２８〕を加え、３０℃で１時
間撹拌した。この反応液を生理食塩水１５L に対して４
℃で３回透析したのち、分注して−２０℃で保存した。
ン５０mgが溶解している５mM ＥＤＴＡを含む０．１M
リン酸ナトリウム緩衝液（pH６．０）７mlに〔Ｃｙｓ〕
−サイモシンα１〔１６−２８〕を加え、３０℃で１時
間撹拌した。この反応液を生理食塩水１５L に対して４
℃で３回透析したのち、分注して−２０℃で保存した。
【００３７】免疫ならびに採血 上記サイモシンα１〔１６−２８〕−牛チログロブリン
複合体をフロイントの完全アジュバンドに懸濁して家兎
の背部２０ケ所以上に皮下注射した。これを２週間毎に
１０回繰り返し、耳静脈から採血して抗血清ＭＣＲ０５
７７を得た。
複合体をフロイントの完全アジュバンドに懸濁して家兎
の背部２０ケ所以上に皮下注射した。これを２週間毎に
１０回繰り返し、耳静脈から採血して抗血清ＭＣＲ０５
７７を得た。
【００３８】抗サイモシンα１ウサギＩｇＧの調製 抗サイモシンα１血清（ＭＣＲ０５７７）は、サイモシ
ンα１〔１−２８〕をセファロースに固相化したイムノ
アフィニティカラムで精製した。
ンα１〔１−２８〕をセファロースに固相化したイムノ
アフィニティカラムで精製した。
【００３９】サイモシンα１〔１−２８〕セファロース
カラムの作成は次のように行った。まず活性化ＣＨセフ
ァロース４Ｂ（ファルマシア社製）１g を氷冷した１mM
ＨＣｌ １５ml中で１５分間静置させてゲルを膨潤させ
た。膨潤したゲルを１mMＨＣｌ １００mlで素早く洗浄
した。洗浄したゲルを０．５M ＮａＣｌ ４．５mlを含
む０．１M 炭酸ナトリウム緩衝液（pH８．０）に懸濁
し、サイモシンα１〔１−２８〕３０μg を加えて、室
温で２時間緩やかに撹拌した。ゲルと結合していないサ
イモシンα１〔１−２８〕を洗い流すため、０．５M Ｎ
ａＣｌを含む０．１M 炭酸ナトリウム緩衝液（pH８．
０）９０mlでゲルを洗浄した。さらに０．５M ＮａＣｌ
を含む０．１M 酢酸ナトリウム（pH４．０）１５mlで洗
浄し、続いて０．５M ＮａＣｌを含む０．１M トリス塩
酸（pH８．０）１５mlで洗浄した。洗浄したゲルはアジ
化ナトリウムを含むダルベッコＰＢＳ緩衝液中で保存し
た。
カラムの作成は次のように行った。まず活性化ＣＨセフ
ァロース４Ｂ（ファルマシア社製）１g を氷冷した１mM
ＨＣｌ １５ml中で１５分間静置させてゲルを膨潤させ
た。膨潤したゲルを１mMＨＣｌ １００mlで素早く洗浄
した。洗浄したゲルを０．５M ＮａＣｌ ４．５mlを含
む０．１M 炭酸ナトリウム緩衝液（pH８．０）に懸濁
し、サイモシンα１〔１−２８〕３０μg を加えて、室
温で２時間緩やかに撹拌した。ゲルと結合していないサ
イモシンα１〔１−２８〕を洗い流すため、０．５M Ｎ
ａＣｌを含む０．１M 炭酸ナトリウム緩衝液（pH８．
０）９０mlでゲルを洗浄した。さらに０．５M ＮａＣｌ
を含む０．１M 酢酸ナトリウム（pH４．０）１５mlで洗
浄し、続いて０．５M ＮａＣｌを含む０．１M トリス塩
酸（pH８．０）１５mlで洗浄した。洗浄したゲルはアジ
化ナトリウムを含むダルベッコＰＢＳ緩衝液中で保存し
た。
【００４０】抗サイモシンα１抗血清（ＭＣＲ０５７
７）を上記で作成したサイモシンα１〔１−２８〕セフ
ァロースカラムに通した後、ダルベッコＰＢＳ緩衝液で
カラムを洗浄し、カラムに残っている非特異的吸着物を
洗い流した。カラムからの溶出は０．２M グリシン塩酸
緩衝液（pH２．５）で行い、溶出液に１M トリス塩酸
（pH８．０）を加えて中和した。
７）を上記で作成したサイモシンα１〔１−２８〕セフ
ァロースカラムに通した後、ダルベッコＰＢＳ緩衝液で
カラムを洗浄し、カラムに残っている非特異的吸着物を
洗い流した。カラムからの溶出は０．２M グリシン塩酸
緩衝液（pH２．５）で行い、溶出液に１M トリス塩酸
（pH８．０）を加えて中和した。
【００４１】〔 125Ｉ〕−抗ウサギＩｇＧヤギ抗体標識
体の調製 抗ウサギＩｇＧヤギＩｇＧ（DAKO社製）２５μg を含ん
だ０．５M リン酸緩衝液５０μl に１mCi のＮａ 125Ｉ
を加えて、クロラミンＴ（２．０mg/ml)５μlを加え、
５分後にアスコルビン酸（２．０mg/ml)２０μl を加え
た。さらに、０．２g/mlヨウ化カリウム溶液２０μl を
加え、Superose１２カラム（ファルマシア社製）で精製
した。
体の調製 抗ウサギＩｇＧヤギＩｇＧ（DAKO社製）２５μg を含ん
だ０．５M リン酸緩衝液５０μl に１mCi のＮａ 125Ｉ
を加えて、クロラミンＴ（２．０mg/ml)５μlを加え、
５分後にアスコルビン酸（２．０mg/ml)２０μl を加え
た。さらに、０．２g/mlヨウ化カリウム溶液２０μl を
加え、Superose１２カラム（ファルマシア社製）で精製
した。
【００４２】血漿の前処理 被験者の肘前静脈より採血する。血液はテルモ社製のＥ
ＤＴＡ採血管で採血し、遠心分離機で血漿を分離した。
分離した血漿はＳｅｐ−Ｐａｋ Ｃ１８（Waters社製）
で２５％アセトニトリルで抽出した。
ＤＴＡ採血管で採血し、遠心分離機で血漿を分離した。
分離した血漿はＳｅｐ−Ｐａｋ Ｃ１８（Waters社製）
で２５％アセトニトリルで抽出した。
【００４３】サンドイッチ法（ＩＲＭＡ： Immuno Radi
ometric Assay ）によるサイモシンα１の測定法 モノクローナル抗サイモシンα１−ＩｇＧ1(ＭＴＨ３３
Ｇ２）被覆ポリスチレンボール１個と、アフィニティク
ロマトグラフィーにより精製したウサギ抗サイモシンα
１〔１６−２８〕５ngと、０．１M リン酸カリウム緩衝
液（pH７．２；１．０mg/ml ＢＳＡ、１．０mg/ml Twee
n ２０、０．５mg/ml アジ化ナトリウムを含む）５０μ
l とを混合し、サイモシンα１〔１−２８〕標準溶液ま
たは血漿のＳｅｐ−Ｐａｋ抽出物（総容量２００μl)に
加え、室温で４時間振盪した。サイモシンα１標準溶液
は０．１M リン酸カリウム緩衝液（pH７．２；１．０mg
/ml ＢＳＡ、１．０mg/ml Tween ２０、０．５mg/ml ア
ジ化ナトリウムを含む）で最終容量が２００μl となる
ように希釈した。また、血漿をＳｅｐ−Ｐａｋで抽出
し、０．１M リン酸カリウム緩衝液（pH７．２；１．０
mg/ml ＢＳＡ，１．０mg/ml Tween ２０、０．５mg/ml
アジ化ナトリウムを含む）で溶解した。
ometric Assay ）によるサイモシンα１の測定法 モノクローナル抗サイモシンα１−ＩｇＧ1(ＭＴＨ３３
Ｇ２）被覆ポリスチレンボール１個と、アフィニティク
ロマトグラフィーにより精製したウサギ抗サイモシンα
１〔１６−２８〕５ngと、０．１M リン酸カリウム緩衝
液（pH７．２；１．０mg/ml ＢＳＡ、１．０mg/ml Twee
n ２０、０．５mg/ml アジ化ナトリウムを含む）５０μ
l とを混合し、サイモシンα１〔１−２８〕標準溶液ま
たは血漿のＳｅｐ−Ｐａｋ抽出物（総容量２００μl)に
加え、室温で４時間振盪した。サイモシンα１標準溶液
は０．１M リン酸カリウム緩衝液（pH７．２；１．０mg
/ml ＢＳＡ、１．０mg/ml Tween ２０、０．５mg/ml ア
ジ化ナトリウムを含む）で最終容量が２００μl となる
ように希釈した。また、血漿をＳｅｐ−Ｐａｋで抽出
し、０．１M リン酸カリウム緩衝液（pH７．２；１．０
mg/ml ＢＳＡ，１．０mg/ml Tween ２０、０．５mg/ml
アジ化ナトリウムを含む）で溶解した。
【００４４】反応混合物から溶液部分を除き、ポリスチ
レンボールは精製水３mlで３回洗浄後、〔 125Ｉ〕−抗
ウサギＩｇＧヤギ抗体標識体（２００，０００cpm)と
０．１M リン酸カリウム緩衝液（pH７．２；２０mg/ml
ＢＳＡ、０．５mg/ml 牛−γグロブリン、１．０mg/ml
Tween ２０、０．５mg/ml アジ化ナトリウムを含む）２
００μl とを混合し、４℃で１８時間静置した。溶液部
分を除去し、ポリスチレンボールを上記と同様３回洗浄
した後、γ−カウンター（アロカＡＲＣ−６００）で放
射能を測定した。
レンボールは精製水３mlで３回洗浄後、〔 125Ｉ〕−抗
ウサギＩｇＧヤギ抗体標識体（２００，０００cpm)と
０．１M リン酸カリウム緩衝液（pH７．２；２０mg/ml
ＢＳＡ、０．５mg/ml 牛−γグロブリン、１．０mg/ml
Tween ２０、０．５mg/ml アジ化ナトリウムを含む）２
００μl とを混合し、４℃で１８時間静置した。溶液部
分を除去し、ポリスチレンボールを上記と同様３回洗浄
した後、γ−カウンター（アロカＡＲＣ−６００）で放
射能を測定した。
【００４５】特異性 この方法によるサンドイッチ法におけるサイモシンα１
の標準希釈曲線を図２に示す。サイモシンα１のＮ端認
識のモノクローナル抗体とＣ端側認識のポリクローナル
抗体を用いたサンドイッチ法なので、末端のサイモシン
α１〔１−１５〕フラグメントおよびサイモシンα１
〔１６−２８〕フラグメントとは反応しない。またＮ末
端側アセチル基が欠如しているデスアセチル−サイモシ
ンα１〔１−２８〕も全く反応しない。これらの結果
は、使用した抗体の特異性と一致する。ポリスチレンボ
ールに固相化したマウス・モノクローナルＩｇＧ1 は、
サイモシンα１のアセチル化されたＳｅｒ〔１〕を含む
Ｎ末端側に特異性を示し、ウサギ抗サイモシンα１−Ｉ
ｇＧは、サイモシンα１〔１６−２８〕に特異性を示
す。
の標準希釈曲線を図２に示す。サイモシンα１のＮ端認
識のモノクローナル抗体とＣ端側認識のポリクローナル
抗体を用いたサンドイッチ法なので、末端のサイモシン
α１〔１−１５〕フラグメントおよびサイモシンα１
〔１６−２８〕フラグメントとは反応しない。またＮ末
端側アセチル基が欠如しているデスアセチル−サイモシ
ンα１〔１−２８〕も全く反応しない。これらの結果
は、使用した抗体の特異性と一致する。ポリスチレンボ
ールに固相化したマウス・モノクローナルＩｇＧ1 は、
サイモシンα１のアセチル化されたＳｅｒ〔１〕を含む
Ｎ末端側に特異性を示し、ウサギ抗サイモシンα１−Ｉ
ｇＧは、サイモシンα１〔１６−２８〕に特異性を示
す。
【００４６】サンドイッチ法の感度 サイモシンα１の測定限界は１チューブ当たり１．０pg
であるので、測定サンプル２００μl を用いたときのサ
イモシンα１の感度は５．０pg/ml(１．６fm）である。
この感度は、既存のＲＩＡ（特開昭５７−１６８５０;
InternationalJournal of Immunopharmacology 14, 126
7-1278, 1992; Journal of Immunological Methods 11
0, 261-265, 1988; Molecular Immunology 23, 701-70
7, 1986;Journal of Immunological Methods 89, 9-17,
1986; Journal of Immunological Methods 80, 45-53,
1985)と比較して、１桁以上感度が高い。
であるので、測定サンプル２００μl を用いたときのサ
イモシンα１の感度は５．０pg/ml(１．６fm）である。
この感度は、既存のＲＩＡ（特開昭５７−１６８５０;
InternationalJournal of Immunopharmacology 14, 126
7-1278, 1992; Journal of Immunological Methods 11
0, 261-265, 1988; Molecular Immunology 23, 701-70
7, 1986;Journal of Immunological Methods 89, 9-17,
1986; Journal of Immunological Methods 80, 45-53,
1985)と比較して、１桁以上感度が高い。
【００４７】健常人および胸腺腫患者の血漿中サイモシ
ンα１値 本発明サイモシンα１測定試薬により測定した健常人お
よび胸腺腫患者の血漿中サイモシンα１値は、下記表１
のとおりであった。
ンα１値 本発明サイモシンα１測定試薬により測定した健常人お
よび胸腺腫患者の血漿中サイモシンα１値は、下記表１
のとおりであった。
【００４８】
【表１】
【００４９】
【発明の効果】本発明のモノクローナル抗体を用いたサ
イモシンα１の免疫学的測定試薬を用いれば、Ｎ端のア
セチル化されたＳｅｒ〔１〕を含むインタクトなサイモ
シンα１を測定できる。このサイモシンα１の測定法の
確立により、胸腺腫、免疫欠損疾患、自己免疫疾患に対
する有用な診断試験法を提供し、またこのホルモンの血
中濃度を追跡することにより薬物療法におけるサイモシ
ンα１のモニタリングが可能になった。
イモシンα１の免疫学的測定試薬を用いれば、Ｎ端のア
セチル化されたＳｅｒ〔１〕を含むインタクトなサイモ
シンα１を測定できる。このサイモシンα１の測定法の
確立により、胸腺腫、免疫欠損疾患、自己免疫疾患に対
する有用な診断試験法を提供し、またこのホルモンの血
中濃度を追跡することにより薬物療法におけるサイモシ
ンα１のモニタリングが可能になった。
【図１】サイモシンα１〔１−２８〕（○）、デスアセ
チル−サイモシンα１〔１−２８〕（サイモシンα１
〔de１−２８〕）（△）、およびサイモシンα１断片
（サイモシンα１〔１−１５〕（□）、サイモシンα１
〔１６−２８〕（●））と本発明のモノクローナル抗体
ＭＴＨ３３Ｇ２との交差反応性を示す。
チル−サイモシンα１〔１−２８〕（サイモシンα１
〔de１−２８〕）（△）、およびサイモシンα１断片
（サイモシンα１〔１−１５〕（□）、サイモシンα１
〔１６−２８〕（●））と本発明のモノクローナル抗体
ＭＴＨ３３Ｇ２との交差反応性を示す。
【図２】ＩＲＭＡによるサイモシンα１〔１−２８〕の
標準曲線（○）と、デスアセチル−サイモシンα１〔１
−２８〕〔サイモシンα１（de１−２８）（△）〕およ
びサイモシンα１断片（サイモシンα１〔１−１５〕
（□）、サイモシンα１〔１６−２８〕（●））の交差
反応性を示す。
標準曲線（○）と、デスアセチル−サイモシンα１〔１
−２８〕〔サイモシンα１（de１−２８）（△）〕およ
びサイモシンα１断片（サイモシンα１〔１−１５〕
（□）、サイモシンα１〔１６−２８〕（●））の交差
反応性を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 33/577 Ｂ // Ｃ１２Ｎ 15/02 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (8)
- 【請求項１】 ミエローマ細胞と抗サイモシンα１抗体
産生細胞を融合させてハイブリドーマを作製し、該ハイ
ブリドーマからサイモシンα１の構造のＮ端を認識する
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択す
ることにより得られることを特徴とするハイブリドー
マ。 - 【請求項２】 該モノクローナル抗体が、サイモシンα
１のアセチル化されたＮ端Ｓｅｒ〔１〕を含む部分を認
識する、請求項１記載のハイブリドーマ。 - 【請求項３】 ハイブリドーマが、ＭＴＨ３３Ｇ２（Ｆ
ＥＲＭ Ｐ−１４４６１）である請求項２記載のハイブ
リドーマ。 - 【請求項４】 ミエローマ細胞が、ヒポキサンチン−グ
アニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損または
チミジンキナーゼ欠損細胞である、請求項１記載のハイ
ブリドーマ。 - 【請求項５】 抗体産生細胞が、サイモシンα１で免疫
されたマウスの脾臓由来である、請求項１記載のハイブ
リドーマ。 - 【請求項６】 請求項１〜５のいずれかに記載のハイブ
リドーマが産生するモノクローナル抗体。 - 【請求項７】 サイモシンα１と、請求項６記載のモノ
クローナル抗体（Ａ）と、該モノクローナル抗体と異な
る認識部位を持つ抗サイモシンα１ポリクローナル抗体
（Ｂ）との３元複合体を形成し、該複合体を形成するモ
ノクローナル抗体またはポリクローナル抗体と特異的に
結合する標識化された物質（Ｃ）との４元複合体を形成
し、該４元複合体の標識物質を定量することを特徴とす
るサイモシンα１の測定法。 - 【請求項８】 モノクローナル抗体が固相上に結合され
たモノクローナル抗体である、請求項７記載の方法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21574794A JP3853384B2 (ja) | 1994-09-09 | 1994-09-09 | 抗サイモシンα１モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ |
| US08/412,564 US5643735A (en) | 1994-09-09 | 1995-03-29 | Anti-thymosin α1 monoclonal antibody-producing hybridoma |
| CA002145905A CA2145905A1 (en) | 1994-09-09 | 1995-03-30 | Anti-thymosin .alpha.1 monoclonal antibody-producing hybridoma |
| EP95105775A EP0700993A1 (en) | 1994-09-09 | 1995-04-18 | Anti-thymosin alpha 1 monoclonal antibody-producing hybridoma |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21574794A JP3853384B2 (ja) | 1994-09-09 | 1994-09-09 | 抗サイモシンα１モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0881499A true JPH0881499A (ja) | 1996-03-26 |
| JP3853384B2 JP3853384B2 (ja) | 2006-12-06 |
Family
ID=16677548
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP21574794A Expired - Fee Related JP3853384B2 (ja) | 1994-09-09 | 1994-09-09 | 抗サイモシンα１モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ |
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| Country | Link |
|---|---|
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| EP (1) | EP0700993A1 (ja) |
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| US6884597B1 (en) * | 1998-01-20 | 2005-04-26 | Medical & Biological Laboratories, Co., Ltd. | Method for detecting acetyltransferase and deacetylase activities and method for screening inhibitors or enhancers of these enzymes |
| CA2328501A1 (en) * | 1998-05-15 | 1999-11-25 | Aphton Corporation | Prevention and treatment of hypergastrinemia |
| US20030068326A1 (en) * | 1998-05-15 | 2003-04-10 | Aphton Corporation | Method for the treatment of gastroesophageal reflux disease |
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| JP2004536835A (ja) * | 2001-07-09 | 2004-12-09 | アフトン コーポレーション | 肝臓、肺および食道の癌性ならびに前癌性状態の治療および防止 |
| US6810583B2 (en) * | 2001-08-07 | 2004-11-02 | International Business Machines Corporation | Coupling of conductive vias to complex power-signal substructures |
| CA2520010C (en) | 2003-03-28 | 2012-07-10 | Aphton Corporation | Gastrin hormone immunoassays |
| JP5576592B2 (ja) * | 2004-03-29 | 2014-08-20 | キャンサー アドヴァンシズ インコーポレイテッド | ガストリンホルモンに対するモノクローナル抗体 |
| KR101333168B1 (ko) * | 2004-09-22 | 2013-11-28 | 리셉터 바이오로직스 인크 | 프로가스트린에 대한 모노클로날 항체 |
| BRPI0601479A (pt) * | 2006-05-03 | 2007-12-18 | Johnson & Johnson Ind Ltda | bandagem adesiva |
| GB0820786D0 (en) * | 2008-11-13 | 2008-12-24 | Nordic Bioscience As | Assessment of protein degradation by measurement of collagen fragments |
| US12150978B2 (en) | 2017-06-15 | 2024-11-26 | Cancer Advances Inc. | Compositions and methods for preventing tumors and cancer |
| JP7469225B2 (ja) | 2017-06-15 | 2024-04-16 | キャンサー アドヴァンシーズ インク． | 腫瘍及び癌に対する体液性及び細胞性免疫を誘発するための組成物及び方法 |
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|---|---|---|---|---|
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| US4427783A (en) * | 1981-12-14 | 1984-01-24 | Hoffmann-La Roche Inc. | Immunoassay of thymosin α1 |
| US4950590A (en) * | 1986-01-13 | 1990-08-21 | Board Of Governors Of Wayne State University | Method and kit for assay for measurement of serum thymosin alpha1 |
| US4983387A (en) * | 1986-05-19 | 1991-01-08 | Viral Technologies Inc. | HIV related peptides, immunogenic antigens, and use therefor as subunit vaccine for AIDS virus |
| DK643188A (da) * | 1987-11-24 | 1989-05-25 | Smithkline Biolog | Ekspression af hiv-proteiner i e.coli og s.cerevisiae |
| US5273963A (en) * | 1991-03-29 | 1993-12-28 | The George Washington University | Compositions and methods for treating small cell and nonsmall cell lung cancers |
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1994
- 1994-09-09 JP JP21574794A patent/JP3853384B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1995
- 1995-03-29 US US08/412,564 patent/US5643735A/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-03-30 CA CA002145905A patent/CA2145905A1/en not_active Abandoned
- 1995-04-18 EP EP95105775A patent/EP0700993A1/en not_active Ceased
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