JPH0892287A - ハプトグロビンの製造方法 - Google Patents

ハプトグロビンの製造方法

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JPH0892287A
JPH0892287A JP6257334A JP25733494A JPH0892287A JP H0892287 A JPH0892287 A JP H0892287A JP 6257334 A JP6257334 A JP 6257334A JP 25733494 A JP25733494 A JP 25733494A JP H0892287 A JPH0892287 A JP H0892287A
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haptoglobin
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heparin
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Akimasa Omizu
章正 大水
Kazuo Takechi
和男 武智
Kazumi Mizumoto
一美 水本
Yasuaki Morisada
康明 森定
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 コーンの第II＋III 上清画分からのハプトグ
ロビンの回収・精製に有用である手段の提供。 【構成】 ハプトグロビン含有水溶液を固定化ヘパリン
で接触処理することを特徴とする精製ハプトグロビンの
製造方法、および蛋白比が０．５ｍｇ／Ａ280 以上であ
るハプトグロビン。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はハプトグロビンの製造方
法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ハプトグロビンは、分子量８万５千〜４
０万の血漿糖蛋白質であり、血中に遊離するヘモグロビ
ンの代謝に重要な役割を演ずる。ハプトグロビンはヘモ
グロビンと特異的に結合し、ハプトグロビン−ヘモグロ
ビン複合体を形成する特性を有する。血漿中のハプトグ
ロビンは、溶血により生じたヘモグロビンと複合体を形
成し、ヘモグロビンの正常な代謝経路である肝に運ばれ
るが、ヘモグロビン量がハプトグロビンとの結合量を上
回ったときは、余剰のヘモグロビンは遊離の状態で血漿
中に存在し、ヘモグロビン血症及び腎を経てヘモグロビ
ン尿症を引き起こす。従って、ハプトグロビンは、熱
傷、火傷、輸血、対外循環下開心術などの溶血反応に伴
うヘモグロビン血症、ヘモグロビン尿症の治療に有効と
されている。
【０００３】ハプトグロビンは通常、コーンの第IV、第
IV−１、第IV−４画分等から調製される。その製造方
法、即ち、精製方法としては、硫安分画、アクリノール
分画、陰イオン交換体処理（特開昭５０−７７５１
６）、コロイド珪酸処理（特開昭６３−１７８９９）等
が知られている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、上記の
事情を考慮して、ハプトグロビンの精製に有用な手段を
提供しようとさらに研究を重ねた結果、固定化ヘパリン
による処理がハプトグロビンの精製に有用であること、
特にコーンの第II＋III 上清画分からのハプトグロビン
の回収・精製に有用であることを見出して、本発明を完
成した。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明は、ハプトグロビ
ン含有水溶液を固定化ヘパリンで接触処理することを特
徴とするハプトグロビンの製造方法である。 出発原料 本発明の処理対象となる出発原料であるハプトグロビン
含有水溶液は、ハプトグロビンおよび夾雑物を含有する
水溶液であり、好適にはコーンの第II＋III 上清画分が
例示される。
【０００６】接触処理 本発明の接触処理は、ハプトグロビン含有水溶液を固定
化ヘパリンに接触させ、ハプトグロビンを固定化ヘパリ
ンに吸着させることにより行われる。固定化ヘパリンは
ヘパリンを不溶性担体に共有結合させたものである。こ
の不溶性担体としてはデキストラン系（商品名はセファ
デックス）、アガロース系（商品名はセファロース）、
セルロース系（商品名はセルロファイン）、親水性ビニ
ルポリマー系（商品名はトヨパール）、シリカゲル系等
が例示される。また、固定化ヘパリンは市販品を用いて
もよい。
【０００７】該固定化ヘパリンにおいて、ヘパリンの結
合率は、不溶性担体１ｍｌ容に対し、通常、０．１〜１
００ｍｇ程度である。また、固定化ヘパリンの使用量と
しては、ハプトグロビン１ｇに対し０．１〜１０リット
ル容（ゲル）の固定化ヘパリンを使用する。また、用い
られるヘパリンは分子量２万程度の酸性多糖類であり、
Ｄ−グルコサミン、Ｄ−グルクロン酸、硫酸基から構成
される多糖類の硫酸エステル体である。
【０００８】ハプトグロビン含有水溶液と固定化ヘパリ
ンの接触処理条件としては、ｐＨ６〜８程度、塩濃度は
０．２Ｍ以下、好ましくは、０．０１〜０．１５Ｍ程度
が例示される。また、エタノールが１０〜４０％、好ま
しくは、１５〜３０％程度共存することが好ましい。さ
らに、固定化ヘパリンに吸着したハプトグロビンの溶出
条件としては、ｐＨ６〜８程度、塩濃度０．５Ｍ以下、
好ましくは、０．１〜０．４Ｍ程度が例示される。本処
理はバッチ法、カラム法のいずれでも行ってもよい。
【０００９】 高度精製 本発明は、ハプトグロビンの公知の精製方法の一工程と
して導入することも可能である。例えば、限外濾過、陰
イオン交換体処理、硫安分画等の方法と組み合わせるこ
とにより、高度精製を行い純化したハプトグロビンを製
造できる。特に、固定化ヘパリンの接触処理の後、更に
限外濾過および陰イオン交換体処理を順次施し、蛋白比
（ハプトグロビン量／Ａ280 ）を０．５ｍｇ／Ａ280 以
上とすることが好ましい。ここで、蛋白比とは、単位容
量当たりのハプトグロビン量（重量）を２８０ｎｍでの
吸光度で除したものを意味する。限外濾過膜としては、
分画分子量１万〜３０万程度のものが使用され、陰イオ
ン交換体としては、陰イオン交換基を有する不溶性担体
であればいずれも使用することができる。陰イオン交換
基の例としては、ジエチルアミノエチル基（通称はＤＥ
ＡＥ）、四級アンモニウム基、例えば、ジエチル［２−
ヒドロキシプロピル］アミノエチル基（通称はＱＡ
Ｅ）、（ＣＨ3 ）3 Ｎ+ ＣＨ2 −（通称はＱ）、四級メ
チルアンモニウム基（ＱＭＡ）等が挙げられる。不溶性
担体の例としては、デキストラン（商品名、セファデッ
クス、ファルマシア社製）、アガロース（商品名、セフ
ァロース、ファルマシア社製）、ビニル系親水性ポリマ
ー（商品名、トヨパール、東ソー社製）、セルロース
（商品名、セルロファイン、生化学工業社製）、多孔性
シリカゲル（商品名、セファロシル、ＳＥＰＲＡＣＯＲ
社製）等があげられる。
【００１０】さらに公知の製剤化技術を組み合わせるこ
とにより、臨床上適用できるハプトグロビン製剤を提供
することができる。
【００１１】
【発明の効果】本発明の方法はハプトグロビンの精製に
有用であること、特にコーンの第II＋III 上清画分から
のハプトグロビンの回収・精製に有用である。本発明に
より精製されるハプトグロビンは０．５ｍｇ／Ａ280 以
上の蛋白比を有する。
【００１２】
【実施例】本発明をより詳細に説明するために、実施例
を挙げるが、本発明はこれにより何ら限定されるもので
はない。 実施例１ コーンの第II＋III 上清画分２０００ｍｌをヘパリン−
トヨパール６５０Ｍ（東ソー社製、不溶性担体部分：親
水性ビニルポリマー系、ヘパリン結合率：担体１ｍｌ容
当たり１５ｍｇ、カラムの大きさ：２００ｍｌ容）カラ
ムにアプライした後、２１％エタノール、０．１２Ｍ塩
化ナトリウムを含む１０ｍＭクエン酸Ｎａ塩緩衝液（ｐ
Ｈ６．８）で洗浄し、続いて０．４Ｍ塩化ナトリウムを
含む１０ｍＭクエン酸Ｎａ塩緩衝液（ｐＨ７．２）によ
りハプトグロビンを溶出させた。結果を表１に示す。
【００１３】
【表１】
【００１４】実施例２ 実施例１で得られたハプトグロビンの溶出液１０００ｍ
ｌを限外濾過（分画分子量１万）により、濃縮・透析し
た後、予め５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン
酸Ｎａ塩緩衝液（ｐＨ７）で平衡化したＤＥＡＥ−デキ
ストラン（商品名ＤＥＡＥ−セファデックスＡ−５０）
カラムにアプライし、上記緩衝液で洗浄し、続いて０．
１３Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸Ｎａ塩緩衝
液（ｐＨ７）で溶出させた。結果を表２に示す。
【００１５】
【表２】
【００１６】精製されたハプトグロビンは０．５７ｍｇ
／Ａ280 の蛋白比を有していた。また、セルロースアセ
テート膜電気泳動の結果、出発原料である第II＋III 上
清画分には存在していたβ画分蛋白が、精製ハプトグロ
ビンからは消失することが判明した。 実施例３ 実施例１で得られたハプトグロビンの溶出液を限外濾過
（分画分子量１０万）により、濃縮・脱塩した。
【００１７】実施例４ 実施例１および２に準じて、２度目の精製実験を行っ
た。その結果、精製されたハプトグロビンは０．６４ｍ
ｇ／Ａ280 の蛋白比を有していた。 実施例５ 実施例１および２で得られたハプトグロビンの溶出液に
グリシンを２０％（ｗ／ｖ）となるように添加し、ｐＨ
を７に調整した上で、６０℃、１０時間の液状加熱処理
を行った。処理後に透析を行った。その結果、ハプトグ
ロビンは加熱処理に対して極めて安定であり、濁りの生
成も観察されなかった。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 水本 一美 大阪府大阪市都島区都島中通３−５−44 株式会社ミドリ十字都島工場内 (72)発明者 森定 康明 大阪府大阪市都島区都島中通３−５−44 株式会社ミドリ十字都島工場内

Claims (4)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ハプトグロビン含有水溶液を固定化ヘパ
    リンに接触処理することを特徴とするハプトグロビンの
    製造方法。
  2. 【請求項２】 ハプトグロビン含有水溶液がコーンの第
    II＋III 上清画分である請求項１記載のハプトグロビン
    の製造方法。
  3. 【請求項３】 塩濃度０．２Ｍ以下、エタノール１０〜
    ４０％の共存下でハプトグロビンを固定化ヘパリンに吸
    着させ、塩濃度０．５Ｍ以下でハプトグロビンを溶出さ
    せる請求項１記載のハプトグロビンの製造方法。
  4. 【請求項４】 蛋白比が０．５ｍｇ／Ａ280 以上である
    ハプトグロビン。
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JP2003096095A (ja) * 2001-09-27 2003-04-03 Nihon Pharmaceutical Co Ltd 蛋白質の精製法
JP2008517046A (ja) * 2004-10-19 2008-05-22 エヌエイチエス ブラッド アンド トランスプラント ハプトグロビンの単離方法

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