JPH0892298A - マウスＩｇＧ１の精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】ウシIgG を含む培養上清から、マウスIgG1を効
率よく精製することができる方法を提供する。 【構成】ウシIgG を含む血清培養上清を第１のプロティ
ンＡカラム１に通液し、低塩濃度・中性pH条件下でウシ
IgG を選択的に吸着させて除去する。その後、、カラム
通過液に高塩濃度・高pHの緩衝液を混合し、高塩濃度・
高pH条件下で第２のプロティンＡカラム２によりマウス
IgG1を選択的に吸着させ、酸性溶液で溶離、回収する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、血清培養上清を生産原
液とするマウスIgG1の精製方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】有用蛋白質の一つであるモノクローナル
抗体は、ガン、妊娠などの診断に用いられている他、各
種生理活性物質の分離精製や分析のために大量に使用さ
れている。抗体には様々な動物種があるが、診断用途に
はマウスIgG がよく使用されている。なおマウスIgG の
サブクラスはマウスIgG1、IgG2a 、IgG2b、IgG3の４種
であるが、存在比率としてはマウスIgG1が最も多く、商
品化されているモノクローナル抗体もマウスIgG1が主流
となっている。

【０００３】抗体の生産原液は、生産方法の違いからマ
ウス腹水と細胞培養上清の２つに大別され、細胞培養上
清からの抗体精製では、硫安塩析による濃縮を兼ねた粗
分画を行った後、イオン交換などの各種クロマトグラフ
ィーにより精製が行われている。この場合、高純度で抗
体を精製することが求められているため、プロティンＡ
や抗原等の抗体と特異的親和性を有するリガンドを固定
化したアフィニティクロマトグラフィーが近年多用され
ている。

【０００４】このアフィニティクロマトグラフィーで
は、精製する目的物質は不溶性担体に固定化されたリガ
ンド（目的物質と親和性のある物質）に特異的に吸着さ
れ、次に回収されて精製される。抗体の精製に最もよく
用いられるリガンドは前記したプロティンＡである。プ
ロティンＡは様々な動物由来のIgG のFc領域と特異的に
結合する性質を持っており、血清、細胞培養上清、腹水
等からのIgG精製に用いられている。

【０００５】さて、抗体産生細胞であるハイブリドーマ
の培養には、基本培地にウシ胎児血清（FCS)を添加した
培地が頻繁に使用されている。このFCS には細胞増殖促
進作用があり、それに伴う抗体産生を増加させるためで
ある。しかしFCSにはウシIgG が多量に含まれており、
ロットによってはハイブリドーマの産生する抗体量と同
等以上のウシIgG が含まれることがある。

【０００６】このため、これら牛血清成分を含む培地で
培養されたマウスIgG1産生細胞の培養上清からマウスIg
G1を精製しようとした場合、通常行われているプロティ
ンＡをリガンドとしたアフィニティクロマトグラフィー
を用いて吸着、洗浄、溶離のアフィニティ操作により精
製を行うと、血清中のウシIgG が多量に混入し、精製物
中の有用なマウスIgG1の比活性が低くなるという問題が
あった。

【０００７】また、プロティンＡゲルにマウスIgG1とウ
シIgG の両方が結合し、さらにウシIgG の方がマウスIg
G1よりも結合力が強く、高濃度で含まれているために、
マウスIgG1吸着容量がウシIgG により妨害されて変動を
受け、マウスIgG1の収率に影響を及ぼし再現性のよい精
製結果を得ることができなかった。すなわち、精製物中
に混入されるウシIgG の量が一定せず、抗体の比活性に
バラツキを生じさせる原因となっていた。

【０００８】なお、最近では血清を含まない無血清培地
が開発されているが、この培地では増殖しない細胞も多
くあまり頻繁には使用されていない。また血清培地と無
血清培地の中間的なものとして、牛血清中の成長因子を
抽出してきたギット培地（日本製薬製）が市販されてい
るが、このギット培地中にはウシIgG が約0.2mg/mlの高
濃度で含まれているため、やはり同様の問題があった。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】本発明は上記した従来
の問題点を解決して、ウシIgG を含む培養上清からマウ
スIgG1を効率よく精製することができるマウスIgG1の精
製方法を提供するためになされたものである。

【００１０】

【課題を解決するための手段】上記の課題を解決するた
めになされた本発明は、牛血清成分を含有する培地でマ
ウスIgG1産生細胞を培養して得られる血清培養上清を被
処理液とし、この被処理液を第１のプロティンＡカラム
に通液し、低塩濃度・中性pH条件下で被処理液中のウシ
IgG を選択的に吸着させて除去する第１工程と、カラム
通過液に高塩濃度・高pHの緩衝液を混合する第２工程
と、この混合液を予め高塩濃度・高pHの緩衝液で平衡化
した第２のプロティンＡカラムに供給して混合液中のマ
ウスIgG1を選択的に吸着させる第３工程と、カラム内を
上記緩衝液で洗浄した後、酸性溶液で溶離、回収する第
４工程とからなることを特徴とするものである。

【００１１】上記のように、本発明ではまず血清培養上
清（低塩濃度・中性pH）を通常の吸着緩衝液であるPBS
(pH7.4)等により予め平衡化した第１のプロティンＡカ
ラムに通液し、ウシIgG のみを選択的に結合させ、除去
する。これは、マウスIgG1とプロティンＡとの結合はPB
S の低塩濃度・中性pHの条件下では生じず、高塩濃度、
高pHの緩衝液中で生ずることを利用したものである。な
お、第１のプロティンＡカラムの容積は、ウシIgG の破
過寸前までのゲル１ml当りの吸着容量を測定することに
より定めるものとする。

【００１２】このようにして第１のプロティンＡカラム
を通過したマウスIgG1を含有する液を、高塩濃度・高pH
の緩衝液と混合し、予め高塩濃度・高pHの緩衝液で平衡
化した第２のプロティンＡカラムに供給する。この第２
のプロティンＡカラムにおいては、ウシIgG に影響され
ることなくマウスIgG1が選択的に吸着される。その結
果、精製物中のマウスIgG1の含有率が高い再現性のよい
精製結果が得られることとなる。なお高収率でマウスIg
G1を回収するために、第２のプロティンＡカラムの容積
はマウスIgG1の10％破過吸着容量を測定することにより
定めるものとする。

【００１３】リガンドを固定化する支持体としては、ア
ガロースなどの天然多糖類が従来から使われている。た
だしこれらの充填剤はゲル母体が柔らかいため、高速で
通液すると通液圧力で充填剤の粒子が変形して分離効率
が大幅に低下する欠点がある。また、細胞培養上清（被
処理液）を直接アフィニティクロマトグラフィー用カラ
ムに通液して使用する場合、通常吸着されている物質を
すべて除去して次の分離工程に備える必要がある。本発
明では、分離対象物質の吸着工程の時間を短くする以外
に、洗浄、再生工程での時間を短くするために、高流速
での通液が可能な耐圧強度の大きいポリマーやシリカゲ
ルを素材とした高速アフィニティクロマトグラフィー用
充填剤を使用することが好ましい。

【００１４】マウスIgG1とプロティンＡとの結合のため
の吸着液としては、高塩濃度、高pHで塩化ナトリウムと
硫酸アンモニウムを含む緩衝液を使用することが好まし
い。ここで高塩濃度、高pHとは、塩濃度が１〜４Ｍ、pH
が8.5 〜9.5 であることを意味する。この条件を外れる
とマウスIgG1とプロティンＡとの結合が行われなくな
る。またマウスIgG1結合用緩衝剤としては、例えば1.5
Ｍグリシン，３ＭNaCl (pH8.9)や、１Ｍ（NH₄)₂SO₄（pH
9.0)などが用いられる。

【００１５】図１は上記した10％破過吸着容量の説明図
である。アフィニティ充填剤を充填したカラムに目的物
を含む原料液を供給すると、吸着体はカラム入口付近か
ら順次飽和されて行き、カラム内で吸着が進行している
部分（吸着帯）がカラム下端に達すると、図１に示すよ
うに流出液中に目的物質が現れ始める。この様子を示す
破過曲線において、流出液濃度が入口濃度の10％に達す
る点が10％破過点である。この10％破過点までの吸着容
量を有効吸着容量とし、この値をO.D.280nm による紫外
線吸収値もしくはELISA 法で実測することにより、１サ
イクル当りのサンプル負荷量を決定することができる。

【００１６】

【作用】本発明によれば、マウスIgG1とプロティンＡと
の結合が高塩濃度、高pH条件下でのみ行われることを利
用し、第１のプロティンＡカラムにおいて低塩濃度・中
性pH条件下で被処理液中のウシIgG を選択的に吸着させ
て除去し、カラム通過液を第２のプロティンＡカラムに
供給して混合液中のマウスIgG1を高塩濃度、高pH条件下
で選択的に吸着させる。このため、被処理液中に含有さ
れるウシIgG に影響されることなく、マウスIgG1を効率
よく精製することができる。

【００１７】

【実施例】以下に本発明の実施例を示す。牛血清（FCS)
を５％含有する細胞培養上清中のウシIgG 、マウスIgG1
濃度をELISA 法により測定したところ、それぞれ0.12mg
−ウシIgG/ml、0.032mg −マウスIgG1/ml であった。図
２に示される第１のプロティンＡカラム１に、ポリスチ
レンとジビニルベンゼンのコポリマーを素材としたパー
フュージョンクロマトグラフィー用担体にプロティンＡ
を結合させたプロティンＡゲルを充填した。

【００１８】このプロティンＡゲルにおいて、ウシIgG
の破過寸前までの吸着容量を測定した結果、流速60カラ
ム容積/hr において15mg/ml ゲルであった。従って、血
清培養上清３リットル（ウシIgG 360mg)を処理するため
のプロティンゲル量は24mlであり、第１のプロティンＡ
カラム１の容積を24mlとした。また第２のプロティンＡ
カラム２については、プロティンＡゲルのマウスIgG1の
10％破過吸着容量が10mg/ml-ゲルであったので、その容
量を10mlとした。

【００１９】この第１のプロティンＡカラム１を予めPB
S 緩衝液 (pH7.4)で平衡化したのち、0.45μm のフィル
ターで濾過した血清培養上清を60カラム容積/hrの高流
速で供給した。これによって血清培養上清中のウシIgG
は選択的に吸着され除去される（第１工程）。次に第２
のプロティンＡカラム２を３ＭNaClを含む1.5 Ｍグリシ
ン（pH8.9)溶液で平衡化し（第２工程）、第１のプロテ
ィンＡカラム１を通過した培養上清に1.5 Ｍグリシン，
３ＭNaCl（pH8.9)を１：２の割合で混合し、第２のプロ
ティンＡカラム２に連続的に供給した（第３工程）。供
給後、280nm での紫外線吸収がベースラインまで下がっ
たことをUV検出器３で確認してから、0.1 Ｍクエン酸
（pH6.0)により第２のプロティンＡカラム２からマウス
IgG1を溶離し、回収した（第４工程）。

【００２０】得られた精製物中のウシIgG 含有率は４
％、マウスIgG1の含有率は92％であった。これに対して
従来法によるときは精製物中のウシIgG 含有率は62％、
マウスIgG1の含有率は33％であり、本発明により精製物
中のウシIgG の混入をきわめて低く抑えられることが確
認された。また本発明により得られたマウスIgG1の比活
性をELISA 法により測定したところ、従来よりも２〜３
倍高いことが確認された。

【００２１】上記のように、本実施例ではポリマー系の
パーフュージョンクロマトグラフィー用アフィニティ充
填剤を使用した。この充填剤は、流速（カラム容量/hr)
を一定にすれば線速度（単位カラム断面積当りの流量）
の影響を受けることなく10％破過吸着容量を基準として
カラム容量を大きくして行くことで、スケールアップが
容易に行える利点がある。これに対して従来のアガロー
ス担体は機械的強度の点から線速度の最大は１cm/minで
あり、この最大操作線速度はスケールアップとともに低
下するので、スケールアップが容易ではない。

【００２２】

【発明の効果】以上に説明したように、本発明によれば
ウシIgG を含む培養上清から、マウスIgG1を効率よくか
つ再現性よく精製することができる利点があり、しかも
工業的規模へのスケールアップも容易であるから、その
価値はきわめて大である。

【図面の簡単な説明】

【図１】10％破過吸着容量を説明するグラフである。

【図２】実施例に用いた装置のブロック図である。

【符号の説明】

１ 第１のプロティンＡカラム、２ 第２のプロティン
Ａカラム、３ UV検出器

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 馬島 剛 愛知県名古屋市瑞穂区須田町２番56号 日 本碍子株式会社内

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 牛血清成分を含有する培地でマウスIgG1
   産生細胞を培養して得られる血清培養上清を被処理液と
   し、この被処理液を第１のプロティンＡカラムに通液
   し、低塩濃度・中性pH条件下で被処理液中のウシIgG を
   選択的に吸着させて除去する第１工程と、カラム通過液
   に高塩濃度・高pHの緩衝液を混合する第２工程と、この
   混合液を予め高塩濃度・高pHの緩衝液で平衡化した第２
   のプロティンＡカラムに供給して混合液中のマウスIgG1
   を選択的に吸着させる第３工程と、カラム内を上記緩衝
   液で洗浄した後、酸性溶液で溶離、回収する第４工程と
   からなることを特徴とするマウスIgG1の精製方法。