JPH0898685A - 新規アスパルチック・プロティナーゼ - Google Patents
新規アスパルチック・プロティナーゼInfo
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- JPH0898685A JPH0898685A JP6261661A JP26166194A JPH0898685A JP H0898685 A JPH0898685 A JP H0898685A JP 6261661 A JP6261661 A JP 6261661A JP 26166194 A JP26166194 A JP 26166194A JP H0898685 A JPH0898685 A JP H0898685A
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- JP
- Japan
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- tyr
- aspartic proteinase
- gly
- rhizopus
- val
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 リゾプス・ハンショウ (Rhizopus hangcho
w) が産生する新規なアスパルチック・プロティナー
ゼ。分子量約37,600（SDS-PAGE）、等電点4.5 、至適pH
３〜４、安定pH２〜７を示す。Ｎ末端アミノ酸配列；Se
r-Gly-Ser-Gly-Val-Val-Phe-Met-Thr-Asp-Tyr-Glu-Tyr-
Asp-Ile-Glu-Tyr-Tyr-Gly- 【効果】酸性領域で安定であり、この領域で蛋白質を分
解するのでペプシン、エンテロキナーゼ等の消化酵素の
代替品として有用である。また、αs −カゼインの分解
能を有するので新生児の牛乳アレルギーを予防した蛋白
質素材を製造する際に利用することができる他、食品ア
レルギーを引き起こす蛋白質の分解に利用することがで
きる。さらに、調味料、低アレルゲン化食品などを製造
する蛋白分解酵素として有用である。
w) が産生する新規なアスパルチック・プロティナー
ゼ。分子量約37,600（SDS-PAGE）、等電点4.5 、至適pH
３〜４、安定pH２〜７を示す。Ｎ末端アミノ酸配列；Se
r-Gly-Ser-Gly-Val-Val-Phe-Met-Thr-Asp-Tyr-Glu-Tyr-
Asp-Ile-Glu-Tyr-Tyr-Gly- 【効果】酸性領域で安定であり、この領域で蛋白質を分
解するのでペプシン、エンテロキナーゼ等の消化酵素の
代替品として有用である。また、αs −カゼインの分解
能を有するので新生児の牛乳アレルギーを予防した蛋白
質素材を製造する際に利用することができる他、食品ア
レルギーを引き起こす蛋白質の分解に利用することがで
きる。さらに、調味料、低アレルゲン化食品などを製造
する蛋白分解酵素として有用である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、リゾプス・ハンショウ
(Rhizopus hangchow) が産生するアスパルチック・プ
ロティナーゼに関する。
(Rhizopus hangchow) が産生するアスパルチック・プ
ロティナーゼに関する。
【０００２】
【従来の技術】アスパルチック・プロティナーゼは、作
用至適pHが酸性側にあり活性部位にアスパラギン酸残基
を有するプロティナーゼの総称で、消化薬や麹の補助剤
あるいは代替品として用いられたり、調味液やペプチド
などを製造する際に用いられたりしている。このアスパ
ルチック・プロティナーゼの起源としては、動物の胃液
中のペプシンや仔牛胃のレンニンなどが広く知られてい
る。また、アスペルギルス(Aspergillus) 属、ペニシリ
ウム(Penicillium) 属、リゾプス(Rhizopus)属、ムコー
ル(Mucor) 属、サッカロミセス(Saccharomyces) 属など
の微生物もアスパルチック・プロティナーゼの起源とし
て知られている。
用至適pHが酸性側にあり活性部位にアスパラギン酸残基
を有するプロティナーゼの総称で、消化薬や麹の補助剤
あるいは代替品として用いられたり、調味液やペプチド
などを製造する際に用いられたりしている。このアスパ
ルチック・プロティナーゼの起源としては、動物の胃液
中のペプシンや仔牛胃のレンニンなどが広く知られてい
る。また、アスペルギルス(Aspergillus) 属、ペニシリ
ウム(Penicillium) 属、リゾプス(Rhizopus)属、ムコー
ル(Mucor) 属、サッカロミセス(Saccharomyces) 属など
の微生物もアスパルチック・プロティナーゼの起源とし
て知られている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、微生物
を起源とする種々の酵素について鋭意研究を行っていた
ところ、リゾプス・ハンショウ (Rhizopus hangchow)
がアスパルチック・プロティナーゼを産生することを見
出し、本発明をなすに至った。したがって、本発明は、
リゾプス・ハンショウ (Rhizopus hangchow) が産生す
るアスパルチック・プロティナーゼを提供することを課
題とする。
を起源とする種々の酵素について鋭意研究を行っていた
ところ、リゾプス・ハンショウ (Rhizopus hangchow)
がアスパルチック・プロティナーゼを産生することを見
出し、本発明をなすに至った。したがって、本発明は、
リゾプス・ハンショウ (Rhizopus hangchow) が産生す
るアスパルチック・プロティナーゼを提供することを課
題とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明は、アスパルチッ
ク・プロティナーゼ産生能を有するリゾプス・ハンショ
ウ (Rhizopus hangchow) を培養し、菌体中にアスパル
チック・プロティナーゼを生成、蓄積させた後、分離、
精製することにより得られるアスパルチック・プロティ
ナーゼであり、分子量約37,600（SDS-PAGE）を有し、次
のＮ末端アミノ酸配列を有する。 Ser-Gly-Ser-Gly-Val-Val-Phe-Met-Thr-Asp-Tyr-Glu-Ty
r-Asp-Ile-Glu-Tyr-Tyr-Gly-
ク・プロティナーゼ産生能を有するリゾプス・ハンショ
ウ (Rhizopus hangchow) を培養し、菌体中にアスパル
チック・プロティナーゼを生成、蓄積させた後、分離、
精製することにより得られるアスパルチック・プロティ
ナーゼであり、分子量約37,600（SDS-PAGE）を有し、次
のＮ末端アミノ酸配列を有する。 Ser-Gly-Ser-Gly-Val-Val-Phe-Met-Thr-Asp-Tyr-Glu-Ty
r-Asp-Ile-Glu-Tyr-Tyr-Gly-
【０００５】次に、本発明のアスパルチック・プロティ
ナーゼの製造法について説明する。本発明のアスパルチ
ック・プロティナーゼの製造に用いるリゾプス・ハンシ
ョウ (Rhizopus hangchow) は、本発明のアスパルチッ
ク・プロティナーゼを産生するものであればいずれの菌
株でも良く、例えばその菌株として、リゾプス・ハンシ
ョウ (Rhizopus hangchow) IFO-4749株を挙げることが
できる。このIFO-4749株は財団法人発酵研究所(Institu
te for Fermentation, Osaka) で何らの制限を受けるこ
と無く入手することができる。
ナーゼの製造法について説明する。本発明のアスパルチ
ック・プロティナーゼの製造に用いるリゾプス・ハンシ
ョウ (Rhizopus hangchow) は、本発明のアスパルチッ
ク・プロティナーゼを産生するものであればいずれの菌
株でも良く、例えばその菌株として、リゾプス・ハンシ
ョウ (Rhizopus hangchow) IFO-4749株を挙げることが
できる。このIFO-4749株は財団法人発酵研究所(Institu
te for Fermentation, Osaka) で何らの制限を受けるこ
と無く入手することができる。
【０００６】本発明のアスパルチック・プロティナーゼ
を製造する際に行うリゾプス・ハンショウ (Rhizopus
hangchow) の培養に用いる培地は、通常のリゾプス・ハ
ンショウ (Rhizopus hangchow) の培養に用いる培地で
あれば良く、液体培地を用いることもできるし、固体培
地を用いることもできる。また、本発明のアスパルチッ
ク・プロティナーゼを産生させるための誘導物質は特に
必要としない。なお、培養温度は25℃前後が好ましく、
培養時間は４日程度で良い。
を製造する際に行うリゾプス・ハンショウ (Rhizopus
hangchow) の培養に用いる培地は、通常のリゾプス・ハ
ンショウ (Rhizopus hangchow) の培養に用いる培地で
あれば良く、液体培地を用いることもできるし、固体培
地を用いることもできる。また、本発明のアスパルチッ
ク・プロティナーゼを産生させるための誘導物質は特に
必要としない。なお、培養温度は25℃前後が好ましく、
培養時間は４日程度で良い。
【０００７】このようにリゾプス・ハンショウ (Rhizop
us hangchow) の菌体中に生成、蓄積させたアスパルチ
ック・プロティナーゼの精製は、酵素の精製に通常用い
られる方法を適宜組み合わせることにより行われる。例
えば、液体培養においては、濾過や遠心分離などの処理
により培養物から菌体を分離した後、酵素処理や物理的
処理により菌体を破砕し、アスパルチック・プロティナ
ーゼを溶出させて粗酵素画分を得る。また、固体培養に
おいては、緩衝液などの溶媒を用いてアスパルチック・
プロティナーゼの粗酵素画分を抽出する。そして、この
粗酵素画分は、硫安分画、イオン交換クロマトグラフィ
ー、ゲル濾過クロマトグラフィーなどの処理により精製
される。
us hangchow) の菌体中に生成、蓄積させたアスパルチ
ック・プロティナーゼの精製は、酵素の精製に通常用い
られる方法を適宜組み合わせることにより行われる。例
えば、液体培養においては、濾過や遠心分離などの処理
により培養物から菌体を分離した後、酵素処理や物理的
処理により菌体を破砕し、アスパルチック・プロティナ
ーゼを溶出させて粗酵素画分を得る。また、固体培養に
おいては、緩衝液などの溶媒を用いてアスパルチック・
プロティナーゼの粗酵素画分を抽出する。そして、この
粗酵素画分は、硫安分画、イオン交換クロマトグラフィ
ー、ゲル濾過クロマトグラフィーなどの処理により精製
される。
【０００８】次に、本発明のアスパルチック・プロティ
ナーゼの理化学的性質を示す。 (1) 分子量：SDS-PAGEで37,600であり、Superoseを用い
たファースト・プロテイン・リキッド・クロマトグラフ
(FPLC)で36,000である。 (2) 等電点：等電点電気泳動で 4.5である。 (3) 基質特異性：インシュリンＢ鎖中の Leu15-Tyr16及
び Tyr16-Leu17の二つのペプチド結合を初期に切断し、
さらに、 Leu11-Val12、 Ala14-Leu15及び Phe24-Phe25
を切断する。また、トリプシノーゲンをpH２〜５の領域
で活性化する。 (4) 至適pH：pH３〜４である（図１参照）。 (5) 熱安定性：pH 3.0で45℃、５分間の処理により酵素
活性は減少し、pH 3.0で50℃、５分間の処理により酵素
活性は完全に消失する。 (6) pH安定性：pH２〜７で極めて安定である（図２参
照）。また、pH 9.0で、５℃、一夜の処理により酵素活
性の約50％が減少する。 (7) 阻害剤：１μM のペプスタチンＡにより酵素活性は
完全に消失し、14℃、40分間のN-ジアゾアセチルノルロ
イシンメチル エステル(N-diazoacetylnorleucinemeth
yl ester)(DAN)処理により酵素活性の約56％が減少す
る。 (8) Ｎ末端アミノ酸配列：Ser-Gly-Ser-Gly-Val-Val-Ph
e-Met-Thr-Asp-Tyr-Glu-Tyr-Asp-Ile-Glu-Tyr-Tyr-Gly- (9) 構造：円偏光二色性スペクトルの測定（図３参照）
により、約90％のβ−構造を有する。
ナーゼの理化学的性質を示す。 (1) 分子量：SDS-PAGEで37,600であり、Superoseを用い
たファースト・プロテイン・リキッド・クロマトグラフ
(FPLC)で36,000である。 (2) 等電点：等電点電気泳動で 4.5である。 (3) 基質特異性：インシュリンＢ鎖中の Leu15-Tyr16及
び Tyr16-Leu17の二つのペプチド結合を初期に切断し、
さらに、 Leu11-Val12、 Ala14-Leu15及び Phe24-Phe25
を切断する。また、トリプシノーゲンをpH２〜５の領域
で活性化する。 (4) 至適pH：pH３〜４である（図１参照）。 (5) 熱安定性：pH 3.0で45℃、５分間の処理により酵素
活性は減少し、pH 3.0で50℃、５分間の処理により酵素
活性は完全に消失する。 (6) pH安定性：pH２〜７で極めて安定である（図２参
照）。また、pH 9.0で、５℃、一夜の処理により酵素活
性の約50％が減少する。 (7) 阻害剤：１μM のペプスタチンＡにより酵素活性は
完全に消失し、14℃、40分間のN-ジアゾアセチルノルロ
イシンメチル エステル(N-diazoacetylnorleucinemeth
yl ester)(DAN)処理により酵素活性の約56％が減少す
る。 (8) Ｎ末端アミノ酸配列：Ser-Gly-Ser-Gly-Val-Val-Ph
e-Met-Thr-Asp-Tyr-Glu-Tyr-Asp-Ile-Glu-Tyr-Tyr-Gly- (9) 構造：円偏光二色性スペクトルの測定（図３参照）
により、約90％のβ−構造を有する。
【０００９】なお、アスパルチック・プロティナーゼ活
性は、以下のようにして測定した。0.1Mクエン酸緩衝液
(pH 3.0)で希釈した酵素液１mlに２％ミルクカゼイン溶
液１mlを加え、30℃で10分間反応させた。0.4Mトリクロ
ロ酢酸２mlを加えて反応を停止させた後、20分間以上放
置し、トーヨー濾紙 NO.2 で濾過した。この濾液１mlに
0.4M炭酸ナトリウム５mlを加えて充分撹拌した後、６倍
希釈 Folin-Ciocalteu試薬１mlを加えて30℃で30分間放
置し、吸光度 660nmを測定した。これとは別に予め失活
させておいた酵素液を用い盲検を行った。酵素活性は、
30℃、pH 3.0で２％ミルクカゼイン水溶液を基質として
酵素反応を行った際に、１秒間にチロシン１mole相当の
280nmの吸光度と同等のトリクロロ酢酸可溶性分解物を
遊離させる酵素量を１katal とした。また、酵素蛋白質
１kg当たりの katal数で比活性を示した。
性は、以下のようにして測定した。0.1Mクエン酸緩衝液
(pH 3.0)で希釈した酵素液１mlに２％ミルクカゼイン溶
液１mlを加え、30℃で10分間反応させた。0.4Mトリクロ
ロ酢酸２mlを加えて反応を停止させた後、20分間以上放
置し、トーヨー濾紙 NO.2 で濾過した。この濾液１mlに
0.4M炭酸ナトリウム５mlを加えて充分撹拌した後、６倍
希釈 Folin-Ciocalteu試薬１mlを加えて30℃で30分間放
置し、吸光度 660nmを測定した。これとは別に予め失活
させておいた酵素液を用い盲検を行った。酵素活性は、
30℃、pH 3.0で２％ミルクカゼイン水溶液を基質として
酵素反応を行った際に、１秒間にチロシン１mole相当の
280nmの吸光度と同等のトリクロロ酢酸可溶性分解物を
遊離させる酵素量を１katal とした。また、酵素蛋白質
１kg当たりの katal数で比活性を示した。
【００１０】以下、実施例により、本発明をさらに詳細
に説明する。
に説明する。
【実施例１】粗酵素の調製 小麦ふすま1,800gに水 1,500mlを加えて殺菌した後、リ
ゾプス・ハンショウ (Rhizopus hangchow) IFO-4749株
を接種し、25℃で４日間培養した。培養後、得られた麹
に20mMリン酸緩衝液(pH7.0) 10,000mlを加え、低温室に
て一夜抽出を行い、粗酵素液 7,350mlを得た。この粗酵
素液を遠心分離した後、ホローファイバー（AIL-1010、
旭化成社製) を用いて濃縮し、凍結乾燥して粗酵素粉末
15.5gを得た。このアスパルチック・プロティナーゼ粗
酵素粉末の比活性は 7.9×10-3katal/kg蛋白質であっ
た。また、アスパルチック・プロティナーゼ活性の収率
は68％であった。
ゾプス・ハンショウ (Rhizopus hangchow) IFO-4749株
を接種し、25℃で４日間培養した。培養後、得られた麹
に20mMリン酸緩衝液(pH7.0) 10,000mlを加え、低温室に
て一夜抽出を行い、粗酵素液 7,350mlを得た。この粗酵
素液を遠心分離した後、ホローファイバー（AIL-1010、
旭化成社製) を用いて濃縮し、凍結乾燥して粗酵素粉末
15.5gを得た。このアスパルチック・プロティナーゼ粗
酵素粉末の比活性は 7.9×10-3katal/kg蛋白質であっ
た。また、アスパルチック・プロティナーゼ活性の収率
は68％であった。
【００１１】アスパルチック・プロティナーゼの精製 上記のようにして得られた粗酵素粉末 10gを２mM酢酸カ
ルシウム含有10mMクエン酸緩衝液(pH 5.2) 100mlに懸濁
し、２時間撹拌して溶解した後、遠心分離 (15,000×
ｇ、20分) し、得られた上清を同緩衝液に対して透析し
た。透析後、遠心分離 (15,000×ｇ、20分) し、その上
清を粗酵素液とした。この上清に35％濃度となるよう硫
安を穏やかに加え、遠心分離 (10,000×ｇ、20分) し、
その上清を35％硫安画分上清とした。比活性は 8.7×10
-3katal/kg蛋白質であった。
ルシウム含有10mMクエン酸緩衝液(pH 5.2) 100mlに懸濁
し、２時間撹拌して溶解した後、遠心分離 (15,000×
ｇ、20分) し、得られた上清を同緩衝液に対して透析し
た。透析後、遠心分離 (15,000×ｇ、20分) し、その上
清を粗酵素液とした。この上清に35％濃度となるよう硫
安を穏やかに加え、遠心分離 (10,000×ｇ、20分) し、
その上清を35％硫安画分上清とした。比活性は 8.7×10
-3katal/kg蛋白質であった。
【００１２】この35％硫安画分上清を予め35％硫安濃度
の２mM酢酸カルシウム含有10mMクエン酸緩衝液(pH 5.2)
で平衡化したButyl-TOYOPEARL 650M (東ソー株式会社
製) に供した。そして、35〜０％硫安濃度直線濃度勾配
により活性画分を溶出し、その溶出液をButyl-TOYOPEAR
L 650M溶出活性画分とした。比活性は 9.1×10-3katal/
kg蛋白質であった。
の２mM酢酸カルシウム含有10mMクエン酸緩衝液(pH 5.2)
で平衡化したButyl-TOYOPEARL 650M (東ソー株式会社
製) に供した。そして、35〜０％硫安濃度直線濃度勾配
により活性画分を溶出し、その溶出液をButyl-TOYOPEAR
L 650M溶出活性画分とした。比活性は 9.1×10-3katal/
kg蛋白質であった。
【００１３】このButyl-TOYOPEARL 650M溶出活性画分を
２mM酢酸カルシウム含有10mMクエン酸緩衝液(pH 5.0)に
対して充分透析した後、同緩衝液で平衡化したDEAE-TOY
OPEARL 650S(東ソー株式会社製) に供した。そして、０
〜0.5M塩化ナトリウム直線濃度勾配により活性画分を溶
出し、その溶出液をDEAE-TOYOPEARL 650S 溶出活性画分
とした。比活性は15.8×10-3katal/kg蛋白質であった。
２mM酢酸カルシウム含有10mMクエン酸緩衝液(pH 5.0)に
対して充分透析した後、同緩衝液で平衡化したDEAE-TOY
OPEARL 650S(東ソー株式会社製) に供した。そして、０
〜0.5M塩化ナトリウム直線濃度勾配により活性画分を溶
出し、その溶出液をDEAE-TOYOPEARL 650S 溶出活性画分
とした。比活性は15.8×10-3katal/kg蛋白質であった。
【００１４】このDEAE-TOYOPEARL 650S 溶出活性画分を
２mM酢酸カルシウム含有10mMクエン酸緩衝液(pH 3.0)に
対して十分透析した後、同緩衝液で平衡化したSP-TOYOP
EARL650M(東ソー株式会社製) に供した。そして、０〜
0.75M 塩化ナトリウム直線濃度勾配により活性画分を溶
出し、その溶出液をSP-TOYOPEARL 650M 溶出活性画分と
した。
２mM酢酸カルシウム含有10mMクエン酸緩衝液(pH 3.0)に
対して十分透析した後、同緩衝液で平衡化したSP-TOYOP
EARL650M(東ソー株式会社製) に供した。そして、０〜
0.75M 塩化ナトリウム直線濃度勾配により活性画分を溶
出し、その溶出液をSP-TOYOPEARL 650M 溶出活性画分と
した。
【００１５】このSP-TOYOPEARL 650M 溶出活性画分をミ
リＱ水に対して十分透析し、凍結乾燥して精製アスパル
チック・プロティナーゼ 212mgを得た。このようにして
得られた精製アスパルチック・プロティナーゼは、電気
泳動的に単一であり、比活性は11×10-3katal/kg蛋白質
であった。また、アスパルチック・プロティナーゼ活性
の収率は８％であった。
リＱ水に対して十分透析し、凍結乾燥して精製アスパル
チック・プロティナーゼ 212mgを得た。このようにして
得られた精製アスパルチック・プロティナーゼは、電気
泳動的に単一であり、比活性は11×10-3katal/kg蛋白質
であった。また、アスパルチック・プロティナーゼ活性
の収率は８％であった。
【００１６】
【試験例１】実施例１で得られたアスパルチック・プロ
ティナーゼのトリプシノーゲン活性化反応を調べた。
2.5mM塩酸に0.5mg/ml濃度となるようトリプシノーゲン
を溶解した溶液25μl 、10mMクエン酸ナトリウム緩衝液
(pH 3.0)50μl 、酵素液25μlを混合し、30℃で活性化
反応を行った後、0.3Mトリス−塩酸緩衝液(pH 8.3) 0.5
ml、水 0.9mlを加えて反応を停止した。そして、この溶
液に10mM Bz-Arg-MCA ５μl を加えて30℃で反応させた
後、Fluorescence Spectrophotometer F-3000(株式会社
日立製作所製) を用いて励起波長 360nm、蛍光波長 440
nmにて蛍光強度を測定した。この条件において、１秒間
にトリプシノーゲン１moleを活性化するのに必要な酵素
量を１katal とした。その結果、本発明のアスパルチッ
ク・プロティナーゼのトリプシノーゲン活性化反応にお
ける比活性は13.9×10-3katal/kg蛋白質であった。
ティナーゼのトリプシノーゲン活性化反応を調べた。
2.5mM塩酸に0.5mg/ml濃度となるようトリプシノーゲン
を溶解した溶液25μl 、10mMクエン酸ナトリウム緩衝液
(pH 3.0)50μl 、酵素液25μlを混合し、30℃で活性化
反応を行った後、0.3Mトリス−塩酸緩衝液(pH 8.3) 0.5
ml、水 0.9mlを加えて反応を停止した。そして、この溶
液に10mM Bz-Arg-MCA ５μl を加えて30℃で反応させた
後、Fluorescence Spectrophotometer F-3000(株式会社
日立製作所製) を用いて励起波長 360nm、蛍光波長 440
nmにて蛍光強度を測定した。この条件において、１秒間
にトリプシノーゲン１moleを活性化するのに必要な酵素
量を１katal とした。その結果、本発明のアスパルチッ
ク・プロティナーゼのトリプシノーゲン活性化反応にお
ける比活性は13.9×10-3katal/kg蛋白質であった。
【００１７】
【試験例２】実施例１で得られたアスパルチック・プロ
ティナーゼのアレルゲン蛋白質に対する分解能を調べ
た。２％αS −カゼイン(pH 3.0)５μl 及び２％β−ラ
クトグロブリン(pH 3.0)５μl を基質とし、酵素溶液(p
H 3.0)５μl をそれぞれ加え30℃で反応させた後、0.8M
トリクロロ酢酸５μl を加えることにより反応を停止さ
せた。この反応液を30℃で20分間以上放置した後、遠心
分離 (15,000×ｇ、20分) して沈澱物を得た。そして、
この沈澱物を SDS化した後、SDS-PAGEに供して分解の様
子を見た。その結果を図４に示す。本発明のアスパルチ
ック・プロティナーゼは、αS −カゼインは分解する
が、β−ラクトグロブリンは分解しないことが判った。
ティナーゼのアレルゲン蛋白質に対する分解能を調べ
た。２％αS −カゼイン(pH 3.0)５μl 及び２％β−ラ
クトグロブリン(pH 3.0)５μl を基質とし、酵素溶液(p
H 3.0)５μl をそれぞれ加え30℃で反応させた後、0.8M
トリクロロ酢酸５μl を加えることにより反応を停止さ
せた。この反応液を30℃で20分間以上放置した後、遠心
分離 (15,000×ｇ、20分) して沈澱物を得た。そして、
この沈澱物を SDS化した後、SDS-PAGEに供して分解の様
子を見た。その結果を図４に示す。本発明のアスパルチ
ック・プロティナーゼは、αS −カゼインは分解する
が、β−ラクトグロブリンは分解しないことが判った。
【００１８】
【試験例３】実施例１で得られたアスパルチック・プロ
ティナーゼの酸化インシュリンＢ鎖に対する基質特異性
を調べた。酸化インシュリンＢ鎖 (シグマ社製) を HPL
C TSK-gel ODS-120Tに供して精製したものを基質として
用い、30℃、pH 3.0で酵素反応を行った。25％アンモニ
ア水を1/10量加えることによって反応を停止した後、減
圧乾固し 0.1％TFA に溶解して試料とした。この試料を
HPLC TSK-gel ODS-120Tに供してピークを分取し、各ピ
ークのアミノ酸配列をペプチドシークェンサー(Applied
Biosystems 477A Protein sequencer;アプライド・バ
イオシステムズ社製) で分析して、切断点及び切断の順
序を決定した。本発明のアスパルチック・プロティナー
ゼは、 Leu15-Tyr16及び Tyr16-Leu17の二つのペプチド
結合を初期に切断し、さらに、 Leu11-Val12、 Ala14-L
eu15及び Phe24-Phe25を切断することが判った。
ティナーゼの酸化インシュリンＢ鎖に対する基質特異性
を調べた。酸化インシュリンＢ鎖 (シグマ社製) を HPL
C TSK-gel ODS-120Tに供して精製したものを基質として
用い、30℃、pH 3.0で酵素反応を行った。25％アンモニ
ア水を1/10量加えることによって反応を停止した後、減
圧乾固し 0.1％TFA に溶解して試料とした。この試料を
HPLC TSK-gel ODS-120Tに供してピークを分取し、各ピ
ークのアミノ酸配列をペプチドシークェンサー(Applied
Biosystems 477A Protein sequencer;アプライド・バ
イオシステムズ社製) で分析して、切断点及び切断の順
序を決定した。本発明のアスパルチック・プロティナー
ゼは、 Leu15-Tyr16及び Tyr16-Leu17の二つのペプチド
結合を初期に切断し、さらに、 Leu11-Val12、 Ala14-L
eu15及び Phe24-Phe25を切断することが判った。
【００１９】
【試験例４】実施例１で得られたアスパルチック・プロ
ティナーゼの凝乳活性を調べた。１レーン当たり 0.1μ
g 、 0.5μg 、 1.0μg となるよう酵素を供し、15V/cm
で２時間、アガロース電気泳動を行った。泳動後、ゲル
を 0.15M酢酸緩衝液(pH 5.3)に浸漬し、30分間、室温に
放置した後、スキムミルク−アガロースプレートに載せ
た。37℃で２時間反応させた後、0.02％ amido blackを
加えて20分間染色し、水洗した後、５％ glycerol を含
む 0.01M酢酸緩衝液(pH 5.8)で脱色した。また、比較例
として、アスペルギルス・サイトイ(Aspergillus sait
oi) 由来のアスパルチック・プロティナーゼについても
同様の試験を行った。その結果を図５に示す。本発明の
アスパルチック・プロティナーゼは、アスペルギルス・
サイトイ(Aspergillus saitoi) 由来のアスパルチック
・プロティナーゼよりも強い凝乳活性を有することが判
った。
ティナーゼの凝乳活性を調べた。１レーン当たり 0.1μ
g 、 0.5μg 、 1.0μg となるよう酵素を供し、15V/cm
で２時間、アガロース電気泳動を行った。泳動後、ゲル
を 0.15M酢酸緩衝液(pH 5.3)に浸漬し、30分間、室温に
放置した後、スキムミルク−アガロースプレートに載せ
た。37℃で２時間反応させた後、0.02％ amido blackを
加えて20分間染色し、水洗した後、５％ glycerol を含
む 0.01M酢酸緩衝液(pH 5.8)で脱色した。また、比較例
として、アスペルギルス・サイトイ(Aspergillus sait
oi) 由来のアスパルチック・プロティナーゼについても
同様の試験を行った。その結果を図５に示す。本発明の
アスパルチック・プロティナーゼは、アスペルギルス・
サイトイ(Aspergillus saitoi) 由来のアスパルチック
・プロティナーゼよりも強い凝乳活性を有することが判
った。
【００２０】
【発明の効果】本発明のアスパルチック・プロティナー
ゼは、pH２〜７で安定であり、酸性領域で蛋白質を良好
に分解することから、胃液で分泌されるペプシンの代替
品として有用であると共に、pH３〜４で膵臓由来のトリ
プシノーゲンを活性化することから、十二指腸で分泌さ
れるエンテロキナーゼの代替品としても有用である。ま
た、本発明のアスパルチック・プロティナーゼは、ペプ
シンとエンテロキナーゼの二つの機能を有する消化酵素
であり、αS −カゼインの分解能を有するので、消化管
が未成熟な新生児のための消化剤として用いることによ
り、新生児にとって問題となる乳や卵などのアレルギー
を予防することが可能となる。さらに、本発明のアスパ
ルチック・プロティナーゼは、雑菌に汚染され難い酸性
領域で高い活性を示すので、調味料や低アレルゲン化食
品などの食品素材を製造する際に用いる蛋白質分解酵素
としても最適である。
ゼは、pH２〜７で安定であり、酸性領域で蛋白質を良好
に分解することから、胃液で分泌されるペプシンの代替
品として有用であると共に、pH３〜４で膵臓由来のトリ
プシノーゲンを活性化することから、十二指腸で分泌さ
れるエンテロキナーゼの代替品としても有用である。ま
た、本発明のアスパルチック・プロティナーゼは、ペプ
シンとエンテロキナーゼの二つの機能を有する消化酵素
であり、αS −カゼインの分解能を有するので、消化管
が未成熟な新生児のための消化剤として用いることによ
り、新生児にとって問題となる乳や卵などのアレルギー
を予防することが可能となる。さらに、本発明のアスパ
ルチック・プロティナーゼは、雑菌に汚染され難い酸性
領域で高い活性を示すので、調味料や低アレルゲン化食
品などの食品素材を製造する際に用いる蛋白質分解酵素
としても最適である。
【図１】本発明のアスパルチック・プロティナーゼのト
リプシノーゲン活性化に対するpHの影響を示す。
リプシノーゲン活性化に対するpHの影響を示す。
【図２】本発明のアスパルチック・プロティナーゼのト
リプシノーゲン活性化に対するpHの安定性を示す。
リプシノーゲン活性化に対するpHの安定性を示す。
【図３】本発明のアスパルチック・プロティナーゼの円
偏光二色性スペクトルの測定結果を示す。
偏光二色性スペクトルの測定結果を示す。
【図４】本発明のアスパルチック・プロティナーゼによ
るアレルゲン蛋白質（αs −カゼイン、β−ラクトグロ
ブリン）の加水分解を示す。
るアレルゲン蛋白質（αs −カゼイン、β−ラクトグロ
ブリン）の加水分解を示す。
L-L 1 , 6 ：マーカー蛋白質 L-L 2 , 3 , 4 ：αs −カゼイン L-L 7 , 8 , 9 ,10 ：β−ラクトグロブリン
【図５】本発明のアスパルチック・プロティナーゼ及び
アスペルギルス・サイトイ(Aspergillus Saitoi) から
得られるアスパルチック・プロティナーゼの凝乳活性を
示す。
アスペルギルス・サイトイ(Aspergillus Saitoi) から
得られるアスパルチック・プロティナーゼの凝乳活性を
示す。
L-L 1 , 2 , 3 ：本発明のアスパルチック・プロティナ
ーゼの凝乳活性 L-L 4 , 5 , 6 ：アスペルギルス・サイトイのアスパル
チック・プロティナーゼの凝乳活性
ーゼの凝乳活性 L-L 4 , 5 , 6 ：アスペルギルス・サイトイのアスパル
チック・プロティナーゼの凝乳活性
フロントページの続き (72)発明者 宿野部 幸孝 埼玉県川越市古谷上6883−８ Ｂ２−205 (72)発明者 平野 賢一 愛知県岩倉市稲荷町稲荷西212番地11 (72)発明者 伊藤 浩史 愛知県岩倉市稲荷町221番地
Claims (2)
- 【請求項１】 リゾプス・ハンショウ (Rhizopus hang
chow) が産生し、分子量約37,600（SDS-PAGE）を有し、
次のＮ末端アミノ酸配列を有するアスパルチック・プロ
ティナーゼ。 Ser-Gly-Ser-Gly-Val-Val-Phe-Met-Thr-Asp-Tyr-Glu-Ty
r-Asp-Ile-Glu-Tyr-Tyr-Gly- - 【請求項２】 リゾプス・ハンショウ (Rhizopus hang
chow) が、リゾプス・ハンショウ (Rhizopus hangcho
w) IFO-4749株である請求項１記載のアスパルチック・
プロティナーゼ。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26166194A JP3547021B2 (ja) | 1994-09-30 | 1994-09-30 | 新規アスパルチック・プロティナーゼ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26166194A JP3547021B2 (ja) | 1994-09-30 | 1994-09-30 | 新規アスパルチック・プロティナーゼ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0898685A true JPH0898685A (ja) | 1996-04-16 |
| JP3547021B2 JP3547021B2 (ja) | 2004-07-28 |
Family
ID=17365009
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP26166194A Expired - Fee Related JP3547021B2 (ja) | 1994-09-30 | 1994-09-30 | 新規アスパルチック・プロティナーゼ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3547021B2 (ja) |
-
1994
- 1994-09-30 JP JP26166194A patent/JP3547021B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3547021B2 (ja) | 2004-07-28 |
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