JPH089974A - プロテアーゼの安定化方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】酵素を医薬、化粧品、洗剤その他の工業的用途
に有用に利用するうえで安定化、安全化、機能変換の目
的から酵素の化学的修飾が行われている。このなかで特
に安定性に優れるプロテアーゼを得る目的で高分子によ
る修飾や架橋性試薬による修飾が行われてきたが、修飾
に伴う活性低下や不溶化が問題となっていた。本発明
は、プロテアーゼの活性の低下を伴うことなく安定化す
ることを目的とした。 【構成】プロテアーゼをジカルボン酸の無水物で化学修
飾する。 【効果】プロテアーゼ原体の活性を損ねることなく安定
性を向上させ得る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、プロテアーゼの安定化
方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】酵素は、洗剤、繊維製品の精錬、油脂や
澱粉などの分解、食品加工、医薬品、臨床検査、バイオ
センサー、化粧品、さらに有用物質の転換・製造など各
種の産業分野に広く用いられている。こうした利用を計
る上での問題点は、酵素の安定性が一般的に低く、その
要求に対し、満足できない場合が多いことである。即
ち、熱を加えられたり、極端に高いｐＨ条件下、界面活
性剤や有機溶媒などの混合物の共存か、更に長期保存に
よって殆どの酵素は、容易に変性して失活する。特にプ
ロテアーゼの場合、水分率の高い媒体や、水溶液などの
剤形中では変性の他に自己消化分解が起こり、室温で保
存する間に速やかに失活するため安定な商品を供給する
ことが難しいという問題がある。

【０００３】こうした問題に対処する方法として酵素の
化学修飾が試みられている。例えば、治療用酵素として
用いられる、ウリカーゼ、アスパラギナーゼ、ストレプ
トキナーゼ等をポリエチレングリコールで修飾し、血中
でのクリアランスや、抗原性を改善する方法（特公昭６
１ー４２５５８号、特開昭５７ー１１８７８９号公報）
スーパーオキシドジスムターゼを多糖類、ポリエチレン
グリコールで修飾し、抗原性抑制や熱安定性向上を図る
方法（特開昭５８ー１６６８５号公報）、あるいは、キ
モトリプシンに分子内架橋を与えるような修飾を施し、
安定化を計る方法（Biochimica et Biophisica Acta 52
2,277-283(1978),ibid 485,1-12(1977)）などが提案さ
れている。特にプロテアーゼの場合、ポリエチレングリ
コールやデキストランといった高分子で修飾して安定化
を計ろうとすると、基質となるタンパク質も高分子であ
るため一般に活性が大幅に損なわれる場合が多い。ま
た、グルタルアルデヒドで代表される架橋試薬の場合、
高分子量化による活性低下や不溶化などが生じたるた
め、期待された効果が発揮できない場合が多い。

【０００４】本発明者らは高活性を維持しつつ皮膚感作
性抑制と水系安定化の双方の目的を同時に達成する方法
を検討した結果、トリアジン環を介して多糖類で修飾し
たプロテアーゼ及びその製造法（特開平２−２１９５７
２号公報，特開平４−２７３８８号公報，特開平４−８
８９８２号公報等）を提案し、適切な条件でプロテアー
ゼに化学修飾を施すと活性、安定性、安全性及び水溶性
等の物性面で優れた修飾酵素が得られることを報告して
いる。

【０００５】しかしながら、この修飾プロテア−ゼは医
薬、化粧料への応用を目的として開発されており、安全
性を重視している。このため、少なからず活性を犠牲に
しており、有用物質の転換、製造などへの応用には、さ
らに高活性で安定化した酵素の開発が望まれていた。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、未修
飾のプロテアーゼに比較して、全く活性を低下させるこ
となく、水溶液中での安定性を向上させた修飾プロテア
ーゼを提供することにある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく鋭意検討した結果、プロテアーゼをジカル
ボン酸を用いて修飾する事によって、活性を損ねること
なく安定化することに成功し、本発明を完成した。

【０００８】本発明に係るプロテアーゼとしては、トリ
プシン、キモトリプシン等の動物由来のプロテアーゼ、
微生物由来のプロテアーゼ等が挙げられる。中でも、バ
チルス族由来のプロテアーゼを用いることが安定性の点
で好ましい。

【０００９】本発明に用いるジカルボン酸としては、特
に限定されないが、水溶液での使用を目的とする場合、
シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン
酸、マレイン酸などの水溶性の高いジカルボン酸を用い
ることが好ましい。

【００１０】ジカルボン酸を酵素と反応させる方法とし
ては、一般に広く用いられる活性エステル法、ジアルデ
ヒド法、酸塩化物法、酸無水物法などを用いることがで
きるが、分子間架橋の発生確率が低い酸無水物を用いる
方法が好ましく、中でも無水コハク酸、無水グルタル酸
は反応操作が簡便で容易に入手できるので好ましい。

【００１１】

【発明の効果】本発明によれば、水溶性を殆ど低下させ
ることなくプロテアーゼを安定化することが可能であ
り、しかも比活性は全く低下しないばかりか寧ろ比活性
は増大する場合がある。以下、実施例を用いて効果を説
明する。

【００１２】

【酵素活性の測定方法】３０℃において、酵素溶液０．
５ｍｌに２．５ｍｌの０．６％乳性カゼイン溶液（４０
ｍＭリン酸緩衝液，ｐＨ８）を添加し、１０分間反応さ
せた後ＴＣＡ溶液２．５ｍｌを添加して反応を停止す
る。３０分後、遠心分離し、上澄み１ｍｌに対し、０．
５５Ｍ炭酸ナトリウム溶液２．５ｍｌと１Ｎフェノール
試薬０．５ｍｌを加えて３０℃、３０分間放置した後６
６０ｎｍに於ける吸光度を測定する。酵素反応をする前
に停止液を加えた試料を対照として、吸光度差（ΔＡ）
より１分間にチロシン１μｍｏｌｅに相当する吸光度差
を与える活性を１単位とする。

【００１３】

【修飾率の測定方法】酵素原末、修飾酵素の蛋白質あた
りのアミノ基量を算出し、その変化量を酵素原末の総ア
ミノ基量に対する百分率で表した。

【００１４】プロテアーゼ溶液の蛋白質含有量の測定
法：牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を基準としてＬｏｗｒ
ｙらの方法（Ｌｏｗｒｙ，Ｏ．Ｈ．， ｅｔ．ａｌ，
Ｊ．Ｂｉｏｌ．， Ｃｈｅｍ．，１９３，２６５）によ
り定量した。

【００１５】プロテアーゼのアミノ基量の測定法：ハイ
ンズらの方法（Ｈａｙｎｅｓ．Ｒ．ｅｔａｌ．，Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６，５４１（１９６７））により
トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）の反応によ
る発色を用いて測定する。但し、これには用いたプロテ
アーゼに混在する蛋白質等に由来するアミノ基も含む。

【００１６】

【実施例１】好アルカリ性のバチルス属菌由来のプロテ
アーゼ（ノボ・ノルディスク社製，エスペラーゼ^TM）１
００ｍｇを０．１Ｍほう酸緩衝液（ｐＨ８）２５ｍｌに
溶解し、１Ｎ ＮａＯＨでｐＨ８に保ちつつ無水コハク
酸１００ｍｇを５回に分けて加え、２時間反応させた。
反応後、ｐＨ７の０．１Ｍリン酸緩衝液に対して透析を
繰り返した後、同緩衝液で５０ｍｌにしてスクシニル化
エスペラーゼ溶液を調製した。比活性は１２８％、活性
収率は１２０％、修飾率は７８％であった。

【００１７】

【実施例２】好アルカリ性のバチルス属菌由来のプロテ
アーゼ（ノボ・ノルディスク社製，エスペラーゼ^TM）１
００ｍｇを０．１Ｍほう酸緩衝液（ｐＨ８）２５ｍｌに
溶解し、１Ｎ ＮａＯＨでｐＨ８に保ちつつ無水グルタ
ル酸１００ｍｇを５回に分けて加え、２時間反応させ
た。反応後、ｐＨ７の０．１Ｍリン酸緩衝液に対して透
析を繰り返した後、同緩衝液で５０ｍｌにしてグルタリ
ル化エスペラーゼ溶液を調製した。比活性は１２１％、
活性収率は１１５％、修飾率は８０％であった。

【００１８】

【実施例３】エスペラーゼ原末、実施例１および実施例
２で調製した修飾プロテアーゼ溶液を各々２０００単位
／ｍｌとなるようにｐＨ７の０．１Ｍリン酸緩衝液で調
製し、５０℃、３０分後に於ける残存性率を評価したと
ころ、各々２５％，４５％、４３％であった。

【実施例４】エスペラーゼ原末、実施例１および実施例
２で調製した修飾プロテアーゼ溶液を各々１００単位／
ｍｌとなるようにｐＨ７の０．１Ｍリン酸緩衝液で調製
し、５０℃、６時間後に於ける残存性率を評価したとこ
ろ、各々６０％，９０％、８５％であった。

【００１９】このように、本発明方法による修飾プロテ
アーゼは、比活性の低下を伴わず（寧ろ増大する）、酵
素の安定性を向上させることができる。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 蛋白質分解酵素（プロテアーゼ）のアミ
   ノ基をジカルボン酸で化学修飾する事を特徴とするプロ
   テアーゼの安定化方法。
2. 【請求項２】 ジカルボン酸が次の構造式で表される、
   請求項１に記載の安定化方法。 構造式：ＨＯＯＣ−（ＣＨ2 ）n −ＣＯＯＨ （ｎ＜４）
3. 【請求項３】 ジカルボン酸の無水物を用いることを特
   徴とする請求項１に記載の安定化方法。
4. 【請求項４】 プロテアーゼがバチルス属菌由来のアル
   カリプロテアーゼであることを特徴とする請求項１に記
   載の安定化方法。