JPH09104700A - 抗ヒト可溶性フィブリン抗体及びそれを用いた免疫学的測定法 - Google Patents
抗ヒト可溶性フィブリン抗体及びそれを用いた免疫学的測定法Info
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- JPH09104700A JPH09104700A JP7286331A JP28633195A JPH09104700A JP H09104700 A JPH09104700 A JP H09104700A JP 7286331 A JP7286331 A JP 7286331A JP 28633195 A JP28633195 A JP 28633195A JP H09104700 A JPH09104700 A JP H09104700A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】測定しようとする可溶性フィブリンに対する特
異的なモノクロナール抗体を作製する。不溶性担体に固
定した当該抗体感作試薬と、測定しようとする抗原を反
応容器の液体媒体中で反応させる。次いで、当該不溶性
担体と抗原との凝集反応の吸光度変化を測定する。 【効果】 フィブリンモノマーとフィブリノーゲンとの
複合体、及びフィブリンモノマーが互いに結合したフィ
ブリンポリマー、フィブリンモノマーとフィブリノーゲ
ン分解物Ｘ，Ｙ，Ｄ分画の複合体と反応することによ
り、通常のフィブリンモノマー測定試薬よりも測定特異
性を上昇させることができる。
異的なモノクロナール抗体を作製する。不溶性担体に固
定した当該抗体感作試薬と、測定しようとする抗原を反
応容器の液体媒体中で反応させる。次いで、当該不溶性
担体と抗原との凝集反応の吸光度変化を測定する。 【効果】 フィブリンモノマーとフィブリノーゲンとの
複合体、及びフィブリンモノマーが互いに結合したフィ
ブリンポリマー、フィブリンモノマーとフィブリノーゲ
ン分解物Ｘ，Ｙ，Ｄ分画の複合体と反応することによ
り、通常のフィブリンモノマー測定試薬よりも測定特異
性を上昇させることができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は血漿中の可溶性フィブリ
ンの検出に関する。詳しくは、血漿中の可溶性フィブリ
ン（酢酸可溶化フィブリンモノマーとフィブリノーゲ
ン、あるいは、フィブリノーゲンの分解物Ｘ，Ｙ，Ｄの
複合体）及びフィブリンポリマー（デスＡＡフィブリン
モノマーとデスＡＡＢＢフィブリンモノマーがそれぞれ
１つ以上結合した複合体で、かつ可溶性のもの）と特異
的に反応するモノクローナル抗体に関する。
ンの検出に関する。詳しくは、血漿中の可溶性フィブリ
ン（酢酸可溶化フィブリンモノマーとフィブリノーゲ
ン、あるいは、フィブリノーゲンの分解物Ｘ，Ｙ，Ｄの
複合体）及びフィブリンポリマー（デスＡＡフィブリン
モノマーとデスＡＡＢＢフィブリンモノマーがそれぞれ
１つ以上結合した複合体で、かつ可溶性のもの）と特異
的に反応するモノクローナル抗体に関する。
【０００２】
【技術的背景】人は健康な状態では、凝固と線溶という
２つの相反する活性が平衡に保たれている。凝固の亢進
とは凝固＞線溶、線溶の亢進とは凝固＜線溶の不等式で
表すことができる。トロンビンは、凝固亢進の中心的な
プロテアーゼであり、主にフィブリノーゲンに作用し
て、フィブリノーゲンのＡα鎖からフィブリノペプチド
Ａ、つづいてＢβ鎖からフィブリノペプチドＢを放出さ
せ、それぞれデスＡＡフィブリンモノマー及びデスＡＡ
ＢＢフィブリンモノマーを生成させる。これらのフィブ
リンモノマーの生成量及びどのような複合体を形成する
かは、トロンビンの量に依存する。それ故、凝固亢進の
様々な状態を反映して、血中には、様々な可溶性フィブ
リン、フィブンポリマーが存在することになる。従っ
て、これらを検出することにより、血栓形成を早期に予
測し、血栓形成の進展を早期に防止する処置を執ること
が出来る。かかる可溶性フィブリン、フィブリンポリマ
ーの検出は、フィブリノーゲンと反応しないで可溶性フ
ィブリン、フィブリンポリマーに対して特異的に反応性
を示す抗体を使用することにより達成することが出来
る。
２つの相反する活性が平衡に保たれている。凝固の亢進
とは凝固＞線溶、線溶の亢進とは凝固＜線溶の不等式で
表すことができる。トロンビンは、凝固亢進の中心的な
プロテアーゼであり、主にフィブリノーゲンに作用し
て、フィブリノーゲンのＡα鎖からフィブリノペプチド
Ａ、つづいてＢβ鎖からフィブリノペプチドＢを放出さ
せ、それぞれデスＡＡフィブリンモノマー及びデスＡＡ
ＢＢフィブリンモノマーを生成させる。これらのフィブ
リンモノマーの生成量及びどのような複合体を形成する
かは、トロンビンの量に依存する。それ故、凝固亢進の
様々な状態を反映して、血中には、様々な可溶性フィブ
リン、フィブンポリマーが存在することになる。従っ
て、これらを検出することにより、血栓形成を早期に予
測し、血栓形成の進展を早期に防止する処置を執ること
が出来る。かかる可溶性フィブリン、フィブリンポリマ
ーの検出は、フィブリノーゲンと反応しないで可溶性フ
ィブリン、フィブリンポリマーに対して特異的に反応性
を示す抗体を使用することにより達成することが出来
る。
【０００３】
【従来の技術】この目的の為に、フィブリンに特異的な
抗体の調製法が報告されている。例えば、Scheefers-Bo
rchel らは〔Proc Natl Acad Sci USA (1985) 82:7091-
7095〕Ａα鎖から、フィブリノペプタイドＡが放出され
てフィブリンα鎖のアミノ基末端に出現する新しいエピ
トープに対するモノクローナル抗体を作成し、これを用
いた可溶性フィブリン測定の為の酸素免疫測定法（ＥＩ
Ａ）を構築した。しかし、このＥＩＡ法は、フィブリン
分解物をも検出してしまい、可溶性フィブリンに特異的
な測定法ということは出来ない。Schielen WJGら〔Proc
Natl Acad Sci USA(1989) 86:8951-8954 及び、Blood
(1991)77:2169-2173〕は、それぞれフィブリノーゲンが
フィブリンに変換した時に出現してくるＡα−〔１４８
−１６０〕、γ−〔３１２−３２４〕に対するモノクロ
ーナル抗体を作成し、それを用いたＥＩＡ法を構築し
た。しかし、これらの２種のモノクローナル抗体は、フ
ィブリン分解物とも反応し、可溶性フィブリンに特異的
ということは出来ない。
抗体の調製法が報告されている。例えば、Scheefers-Bo
rchel らは〔Proc Natl Acad Sci USA (1985) 82:7091-
7095〕Ａα鎖から、フィブリノペプタイドＡが放出され
てフィブリンα鎖のアミノ基末端に出現する新しいエピ
トープに対するモノクローナル抗体を作成し、これを用
いた可溶性フィブリン測定の為の酸素免疫測定法（ＥＩ
Ａ）を構築した。しかし、このＥＩＡ法は、フィブリン
分解物をも検出してしまい、可溶性フィブリンに特異的
な測定法ということは出来ない。Schielen WJGら〔Proc
Natl Acad Sci USA(1989) 86:8951-8954 及び、Blood
(1991)77:2169-2173〕は、それぞれフィブリノーゲンが
フィブリンに変換した時に出現してくるＡα−〔１４８
−１６０〕、γ−〔３１２−３２４〕に対するモノクロ
ーナル抗体を作成し、それを用いたＥＩＡ法を構築し
た。しかし、これらの２種のモノクローナル抗体は、フ
ィブリン分解物とも反応し、可溶性フィブリンに特異的
ということは出来ない。
【０００４】
【本発明の技術分野】本発明は、尿素処理したヒトフィ
ブリノーゲン及びヒトフィブリンモノマーとは反応する
が、無処理のヒトフィブリノーゲン、酸処理したヒトフ
ィブリノーゲイン及びヒトフィブリンモノマーとは反応
しないモノクローナル抗体であって、かかるモノクロー
ナル抗体を使用した可溶性フィブリン及びフィブリンポ
リマーの免疫学的測定方法に関する。本発明の免疫学的
測定法によれば、血漿検体中の可溶性フィブリンを迅速
かつ正確に免疫学的方法で測定できる。この測定方法
は、また、検体中に共存するフィブリノーゲンとその分
解物（Ｘ，Ｙ，Ｄ，Ｅ）及び安定化フィブリンの分解物
（ＤＤ／Ｅ，ＹＤ／ＤＹ，ＹＹ／ＤＸＤ，ＹＸＤ／ＤＸ
Ｙ 等）とは反応せず、かつそれらによって阻害されな
いで、可溶性フィブリンを特異的に検出定量できる。な
お、本明細書において『ヒト可溶性フィブリン』とは、
デスＡＡフィブリンモノマーとフィブリノーゲン、ある
いはその分解物（Ｘ，Ｙ，Ｄ）と結合した複合体、『フ
ィブリンポリマー』とは、デスＡＡフィブリンモノマー
が２つ以上結合した複合体、及びデスＡＡフィブリンモ
ノマーとデスＡＡＢＢフィブリンモノマーがそれぞれ１
つ以上結合した複合体で、かつ可溶性のものを意味して
いる。
ブリノーゲン及びヒトフィブリンモノマーとは反応する
が、無処理のヒトフィブリノーゲン、酸処理したヒトフ
ィブリノーゲイン及びヒトフィブリンモノマーとは反応
しないモノクローナル抗体であって、かかるモノクロー
ナル抗体を使用した可溶性フィブリン及びフィブリンポ
リマーの免疫学的測定方法に関する。本発明の免疫学的
測定法によれば、血漿検体中の可溶性フィブリンを迅速
かつ正確に免疫学的方法で測定できる。この測定方法
は、また、検体中に共存するフィブリノーゲンとその分
解物（Ｘ，Ｙ，Ｄ，Ｅ）及び安定化フィブリンの分解物
（ＤＤ／Ｅ，ＹＤ／ＤＹ，ＹＹ／ＤＸＤ，ＹＸＤ／ＤＸ
Ｙ 等）とは反応せず、かつそれらによって阻害されな
いで、可溶性フィブリンを特異的に検出定量できる。な
お、本明細書において『ヒト可溶性フィブリン』とは、
デスＡＡフィブリンモノマーとフィブリノーゲン、ある
いはその分解物（Ｘ，Ｙ，Ｄ）と結合した複合体、『フ
ィブリンポリマー』とは、デスＡＡフィブリンモノマー
が２つ以上結合した複合体、及びデスＡＡフィブリンモ
ノマーとデスＡＡＢＢフィブリンモノマーがそれぞれ１
つ以上結合した複合体で、かつ可溶性のものを意味して
いる。
【０００５】
【発明の開示】本発明者は、可溶性フィブリン、フィブ
リンポリマーを簡便に、正確に再現性よく測定する方法
を開発すべく鋭意研究した結果、デスＡＡフィブリンモ
ノマーがフィブリノーゲンあるいはその分解物（Ｘ，
Ｙ，Ｄ）と結合した可溶性フィブリン、及びデスＡＡフ
ィブリンモノマーとデスＡＡＢＢフィブリンモノマーが
様々な組み合わせで２個以上結合したフィブリンポリマ
ーと特異的に反応するが、ヒトフィブリノーゲンとは反
応しないモノクロナール抗体を見出した。
リンポリマーを簡便に、正確に再現性よく測定する方法
を開発すべく鋭意研究した結果、デスＡＡフィブリンモ
ノマーがフィブリノーゲンあるいはその分解物（Ｘ，
Ｙ，Ｄ）と結合した可溶性フィブリン、及びデスＡＡフ
ィブリンモノマーとデスＡＡＢＢフィブリンモノマーが
様々な組み合わせで２個以上結合したフィブリンポリマ
ーと特異的に反応するが、ヒトフィブリノーゲンとは反
応しないモノクロナール抗体を見出した。
【０００６】このモノクロナール抗体を用いて、血中の
可溶性ブィブリン及びフィブリンポリマーをフィブリノ
ーゲン及びその分解物、あるいはフィブリン分解物の妨
害を受けずに特異的に測定できる方法を見出した。従っ
て、本発明の目的は、前記の新規モノクロナール抗体及
びそのモノクロナール抗体を用いる免疫学的測定法を提
供することにある。
可溶性ブィブリン及びフィブリンポリマーをフィブリノ
ーゲン及びその分解物、あるいはフィブリン分解物の妨
害を受けずに特異的に測定できる方法を見出した。従っ
て、本発明の目的は、前記の新規モノクロナール抗体及
びそのモノクロナール抗体を用いる免疫学的測定法を提
供することにある。
【０００７】本発明は、ヒト可溶性フィブリン及びフィ
ブリンポリマーとは反応し、ヒトフィブリノーゲンとは
反応しないモノクロナール抗体に関する。
ブリンポリマーとは反応し、ヒトフィブリノーゲンとは
反応しないモノクロナール抗体に関する。
【０００８】また、本発明は、不溶性担体に固定化され
た前記モノクロナール抗体と被検試料とを接触させ、凝
集反応を観察することを特徴とするヒト可溶性フィブリ
ン及びブィブリンポリマーの測定方法に関する。
た前記モノクロナール抗体と被検試料とを接触させ、凝
集反応を観察することを特徴とするヒト可溶性フィブリ
ン及びブィブリンポリマーの測定方法に関する。
【０００９】本発明のモノクロナール抗体は、尿素処理
したフィブリノーゲンを免疫源として用いて作製するこ
とができる。尿素処理フィブリノーゲンは後記の方法に
より得られる。フィブリノーゲンは市販品を用いること
が好ましい。次に尿素処理フィブリノーゲンを用いて哺
乳動物（例えばマウス）を免疫する。具体的には、尿素
処理フィブリノーゲン溶液を等量のフロインド完全アジ
ュバンドと乳化するまで混合する。この混合液をマウス
に腹腔内投与する（第１回免疫）。一定の間隔（マウス
の場合は約３０日）で同様の操作を行い、通常は数回免
疫する。
したフィブリノーゲンを免疫源として用いて作製するこ
とができる。尿素処理フィブリノーゲンは後記の方法に
より得られる。フィブリノーゲンは市販品を用いること
が好ましい。次に尿素処理フィブリノーゲンを用いて哺
乳動物（例えばマウス）を免疫する。具体的には、尿素
処理フィブリノーゲン溶液を等量のフロインド完全アジ
ュバンドと乳化するまで混合する。この混合液をマウス
に腹腔内投与する（第１回免疫）。一定の間隔（マウス
の場合は約３０日）で同様の操作を行い、通常は数回免
疫する。
【００１０】最終免疫から数日後（マウスの場合は３日
後）に脾臓を無菌的に取り出し、還流法で脾臓から脾細
胞を調製し、以後の細胞融合に用いる。細胞融合の一方
の親細胞であるミエローマ細胞としては、ＮＳ１〔Eur
J Immunol (1976) 6:511-519〕を使用した。細胞融合法
は、Koehler と Milstein ら〔 Nature （1975) 256:49
5-497 〕の方法に準じて行うことが好ましい。
後）に脾臓を無菌的に取り出し、還流法で脾臓から脾細
胞を調製し、以後の細胞融合に用いる。細胞融合の一方
の親細胞であるミエローマ細胞としては、ＮＳ１〔Eur
J Immunol (1976) 6:511-519〕を使用した。細胞融合法
は、Koehler と Milstein ら〔 Nature （1975) 256:49
5-497 〕の方法に準じて行うことが好ましい。
【００１１】こうして得られた本発明のモノクロナール
抗体はヒト可溶性フィブリン及びフィブリンポリマーと
は反応しない。
抗体はヒト可溶性フィブリン及びフィブリンポリマーと
は反応しない。
【００１２】本発明のモノクロナール抗体は、尿素処理
したヒトフィブリノーゲン、ヒトフィブリンモノマー、
フィブリノーゲン分解物（Ｘ，Ｙ，Ｅ）及びフィブリン
分解物（ＤＤ／Ｅ，ＴＤ／ＤＹ，ＹＸＤ／ＤＸＹ）とは
反応するが、無処理のヒトフィブリノーゲン、フィブリ
ノーゲン分解物及びフィブリン分解物とは反応しないモ
ノクロナール抗体である。
したヒトフィブリノーゲン、ヒトフィブリンモノマー、
フィブリノーゲン分解物（Ｘ，Ｙ，Ｅ）及びフィブリン
分解物（ＤＤ／Ｅ，ＴＤ／ＤＹ，ＹＸＤ／ＤＸＹ）とは
反応するが、無処理のヒトフィブリノーゲン、フィブリ
ノーゲン分解物及びフィブリン分解物とは反応しないモ
ノクロナール抗体である。
【００１３】前記尿素処理とは、各抗原を５〜６Ｍの濃
度の尿素液で溶解することを意味し、詳しくは、尿素を
３〜１０Ｍ濃度となるよう生理食塩液又は緩衝液等に溶
解し、約１５〜４０℃に約３０分〜３時間保温する。本
発明による前記のモノクロナール抗体を、不溶性担体に
感作固定させ、そのモノクロナール抗体感作不溶性担体
を被検試料と接触させると、被検試料中のフィブリノー
ゲン、フィブリノーゲン分解物（Ｘ，Ｙ，Ｄ，Ｅ）、フ
ィブリン分解物（ＤＤ／Ｅ，ＴＤ／ＹＤ，ＹＹ／ＤＸ
Ｄ，ＹＸＤ／ＤＸＹ）とは凝集反応を起こさず、可溶性
フィブリン及びフィブリンポリマーとの間でのみ凝集反
応を起こさせることが可能な、免疫学的定量試薬を得る
ことができる。
度の尿素液で溶解することを意味し、詳しくは、尿素を
３〜１０Ｍ濃度となるよう生理食塩液又は緩衝液等に溶
解し、約１５〜４０℃に約３０分〜３時間保温する。本
発明による前記のモノクロナール抗体を、不溶性担体に
感作固定させ、そのモノクロナール抗体感作不溶性担体
を被検試料と接触させると、被検試料中のフィブリノー
ゲン、フィブリノーゲン分解物（Ｘ，Ｙ，Ｄ，Ｅ）、フ
ィブリン分解物（ＤＤ／Ｅ，ＴＤ／ＹＤ，ＹＹ／ＤＸ
Ｄ，ＹＸＤ／ＤＸＹ）とは凝集反応を起こさず、可溶性
フィブリン及びフィブリンポリマーとの間でのみ凝集反
応を起こさせることが可能な、免疫学的定量試薬を得る
ことができる。
【００１４】従って、本発明による前記の抗可溶性フィ
ブリン・フィブリンポリマー抗体を用いて、本発明の免
疫学的測定法を実施することができる。本発明の免疫学
的測定法に用いる被検試料は、血液、血漿、尿、脳脊髄
液等に制限される。
ブリン・フィブリンポリマー抗体を用いて、本発明の免
疫学的測定法を実施することができる。本発明の免疫学
的測定法に用いる被検試料は、血液、血漿、尿、脳脊髄
液等に制限される。
【００１５】凝集反応を利用する本発明の免疫学的測定
法において、不溶性担体としては、ラテックス粒子を挙
げることができる。モノクロナル抗体を不溶性担体に感
作させるには、公知の化学的結合法又は物理的吸着法を
用いることができる。凝集反応を利用する免疫学的測定
法としては、プレート法、反応セルを用いる光学的測定
法などを用いることができる。本発明のモノクロナル抗
体を固定化させる不溶性担体としては平均粒径０．１〜
１．０μのラテックス粒子が用いられる。ラテックス粒
子としては、スチロール又はスチロール−ブタジエン重
合体などが用いられる。モノクロナル抗体のラテックス
粒子への固定化は好ましくは緩衝液中でｐＨ２〜１０で
行うことができる。緩衝液としては、例えばグリシン緩
衝液、ホウ酸緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液等が用
いられる。抗体を固定化した不溶性担体と被検試料との
反応は、好ましくは０．１〜１．０％のラテックス試薬
と被検試料を公知の方法により反応させることができ
る。
法において、不溶性担体としては、ラテックス粒子を挙
げることができる。モノクロナル抗体を不溶性担体に感
作させるには、公知の化学的結合法又は物理的吸着法を
用いることができる。凝集反応を利用する免疫学的測定
法としては、プレート法、反応セルを用いる光学的測定
法などを用いることができる。本発明のモノクロナル抗
体を固定化させる不溶性担体としては平均粒径０．１〜
１．０μのラテックス粒子が用いられる。ラテックス粒
子としては、スチロール又はスチロール−ブタジエン重
合体などが用いられる。モノクロナル抗体のラテックス
粒子への固定化は好ましくは緩衝液中でｐＨ２〜１０で
行うことができる。緩衝液としては、例えばグリシン緩
衝液、ホウ酸緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液等が用
いられる。抗体を固定化した不溶性担体と被検試料との
反応は、好ましくは０．１〜１．０％のラテックス試薬
と被検試料を公知の方法により反応させることができ
る。
【００１６】
【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に
説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるもので
はない。
説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるもので
はない。
【００１７】実施例１ 尿素処理ヒトフィブリノーゲンの調製：免疫源として用
いる尿素処理ヒトフィブリノーゲンは、次の様な方法で
調製することができる。即ち、乾燥ヒトフィブリノーゲ
ン（Kabi社製）１ｇを１０ｍＭのＥＤＴＡ、６Ｍの尿素
を含む生理食塩液２００ｍｌに溶解し、３７℃で６０分
間保温した。この標品を免疫原又は免疫学的測定法の標
準品として用いた（以下、尿素処理フィブリノーゲンを
Ｕ−Ｆｇと記すことがある）。
いる尿素処理ヒトフィブリノーゲンは、次の様な方法で
調製することができる。即ち、乾燥ヒトフィブリノーゲ
ン（Kabi社製）１ｇを１０ｍＭのＥＤＴＡ、６Ｍの尿素
を含む生理食塩液２００ｍｌに溶解し、３７℃で６０分
間保温した。この標品を免疫原又は免疫学的測定法の標
準品として用いた（以下、尿素処理フィブリノーゲンを
Ｕ−Ｆｇと記すことがある）。
【００１８】可溶性フィブリンモノマーの調製：ヒト可
溶性フィブリンモノマーは、Largo らの方法〔Blood(19
76)47:991-1002〕に従って調製した。即ち、乾燥ヒトフ
ィブリノーゲン（Kabi社製）１ｇを、１０ｍＭのＥＤＴ
Ａを含む生理食塩液１０００ｍｌに溶解し、１００ＮＩ
Ｈのトロンビンを添加した後、３７℃で１２０分間保温
した。生じたフィブリンクロットを生理食塩液２５０ｍ
ｌで、３回遠心洗浄した。洗浄後のフィブリンクロット
を６Ｍ尿素液５０ｍｌに溶解し、免疫学的測定法の標準
品として使用した。以下、尿素可溶化フィブリンモノマ
ーをＵ−ＦＭと記すことがある。前記のトロンビンを添
加した後に生じたフィブリンクロットを２０ｍＭ酢酸で
処理して可溶化した酸可溶化フィブリンモノマー（ある
いは、酸処理フィブリンモノマーとも記す）を調製し、
以下、上記と同様の目的で使用した。以下、酢酸可溶化
フィブリンモノマーをＡ−ＦＭと記すことがある。
溶性フィブリンモノマーは、Largo らの方法〔Blood(19
76)47:991-1002〕に従って調製した。即ち、乾燥ヒトフ
ィブリノーゲン（Kabi社製）１ｇを、１０ｍＭのＥＤＴ
Ａを含む生理食塩液１０００ｍｌに溶解し、１００ＮＩ
Ｈのトロンビンを添加した後、３７℃で１２０分間保温
した。生じたフィブリンクロットを生理食塩液２５０ｍ
ｌで、３回遠心洗浄した。洗浄後のフィブリンクロット
を６Ｍ尿素液５０ｍｌに溶解し、免疫学的測定法の標準
品として使用した。以下、尿素可溶化フィブリンモノマ
ーをＵ−ＦＭと記すことがある。前記のトロンビンを添
加した後に生じたフィブリンクロットを２０ｍＭ酢酸で
処理して可溶化した酸可溶化フィブリンモノマー（ある
いは、酸処理フィブリンモノマーとも記す）を調製し、
以下、上記と同様の目的で使用した。以下、酢酸可溶化
フィブリンモノマーをＡ−ＦＭと記すことがある。
【００１９】免疫化脾細胞の調製：尿素処理ヒトフィブ
リノーゲン（Ｕ−Ｆｇ）（Ａ280nm ＝０．２）を当量の
フロイド完全アジュバンドと乳化するまで混合し、その
混合液１００μｌをＢＡＬＡ／ｃ系マウスの腹腔内に投
与すにことにより免疫を行った。約３０日経過後、Ｕ−
Ｆｇ（Ａ280nm ＝０．２）を等量の生理食塩液で希釈し
て調製したＵ−Ｆｇ液１００μｌを、前記のマウスの腹
腔内に投与し、３日後、脾臓を無菌的にマウスから取り
出し、次の細胞融合工程に用いた。
リノーゲン（Ｕ−Ｆｇ）（Ａ280nm ＝０．２）を当量の
フロイド完全アジュバンドと乳化するまで混合し、その
混合液１００μｌをＢＡＬＡ／ｃ系マウスの腹腔内に投
与すにことにより免疫を行った。約３０日経過後、Ｕ−
Ｆｇ（Ａ280nm ＝０．２）を等量の生理食塩液で希釈し
て調製したＵ−Ｆｇ液１００μｌを、前記のマウスの腹
腔内に投与し、３日後、脾臓を無菌的にマウスから取り
出し、次の細胞融合工程に用いた。
【００２０】細胞融合：１５％ウシ胎児血清を含むDulb
ecco's Modified Eagle （ＤＭＥ）培地５ｍｌを入れた
ペトリ皿に前記の脾臓を入れた。次に、１５％ウシ胎児
血清を含むＤＭＥ培地１２ｍｌで前記脾臓より還流法で
脾細胞を流出し５０ｍｌの遠心管に集める。遠心後、上
清を捨て、ペレットに溶血促進溶液（１６０ｍＭ−ＮＨ
4 Ｃｌ，１０ｍＭ−ＫＨＣＯ3 ，１ｍＭ−Ｎａ2 ＥＤＴ
Ａ，ｐＨ７．０）５ｍｌを加え、懸濁した。５分間氷冷
後、遠点分離し、脾細胞数を数えた。一方、あらかじめ
培養しておいたマウスミエローマ細胞ＮＳ１の約１×１
０7個に前記脾細胞１×１０8 個を加え、遠心分離し
た。その上清を捨て、ペレットに４５％ポリエチレング
リコール１５００溶液（３７℃に保温）１．０ｍｌを加
え良く混合する。次に、３７℃に保温しておいたＤＭＥ
培地を１０ｍｌ加え、遠心分離する。上清を除去後、ペ
レットを１５％ウシ胎児血清を含むＨＡＴ培地（ＤＭＥ
培地にアミノプテリン４×１０-7Ｍ，チミジン１．６×
１０-5Ｍ，ヒポキサンチン１×１０-4Ｍになるように添
加したもの）で懸濁し、次いで、上記の培地で３回遠心
洗浄する。ＨＡＴ培地２０ｍｌに懸濁した細胞懸濁液を
９６穴細胞培養プレートの各ウェルに２００μｌずつ分
注し、５％ＣＯ2 Ａ含むＣＯ2 培養器で培養し、７日
後に、後述のＥＬＩＳＡ法により、抗可溶斉フィブリン
抗体産生ハイブリドーマをスクリーニングした。
ecco's Modified Eagle （ＤＭＥ）培地５ｍｌを入れた
ペトリ皿に前記の脾臓を入れた。次に、１５％ウシ胎児
血清を含むＤＭＥ培地１２ｍｌで前記脾臓より還流法で
脾細胞を流出し５０ｍｌの遠心管に集める。遠心後、上
清を捨て、ペレットに溶血促進溶液（１６０ｍＭ−ＮＨ
4 Ｃｌ，１０ｍＭ−ＫＨＣＯ3 ，１ｍＭ−Ｎａ2 ＥＤＴ
Ａ，ｐＨ７．０）５ｍｌを加え、懸濁した。５分間氷冷
後、遠点分離し、脾細胞数を数えた。一方、あらかじめ
培養しておいたマウスミエローマ細胞ＮＳ１の約１×１
０7個に前記脾細胞１×１０8 個を加え、遠心分離し
た。その上清を捨て、ペレットに４５％ポリエチレング
リコール１５００溶液（３７℃に保温）１．０ｍｌを加
え良く混合する。次に、３７℃に保温しておいたＤＭＥ
培地を１０ｍｌ加え、遠心分離する。上清を除去後、ペ
レットを１５％ウシ胎児血清を含むＨＡＴ培地（ＤＭＥ
培地にアミノプテリン４×１０-7Ｍ，チミジン１．６×
１０-5Ｍ，ヒポキサンチン１×１０-4Ｍになるように添
加したもの）で懸濁し、次いで、上記の培地で３回遠心
洗浄する。ＨＡＴ培地２０ｍｌに懸濁した細胞懸濁液を
９６穴細胞培養プレートの各ウェルに２００μｌずつ分
注し、５％ＣＯ2 Ａ含むＣＯ2 培養器で培養し、７日
後に、後述のＥＬＩＳＡ法により、抗可溶斉フィブリン
抗体産生ハイブリドーマをスクリーニングした。
【００２１】ハイブリドーマの確立：ハイブリドーマ培
養液の上清中の抗体の有無は、ＥＬＩＳＡ法により測定
した。９６穴ＥＬＩＳＡ用プレート（住友化学）の各ウ
ェルに前記の可溶性フィブリンモノマー（Ｕ−ＦＭ）溶
液（Ａ280nm ＝０．０１）１００μｌずつ分注し、４℃
で１６時間放置した。次に、０．０１％ウシ血清アルブ
ミン（ＢＳＡ）−生理食塩液で３回洗浄した後、各ウェ
ルに培養上清１００μｌを加え、２５℃で１時間反応さ
せた。次に、Ｔｗｅｅｎ ８０−生理食塩液で１０００
倍に希釈したペルオキシダーゼ結合抗マウス抗体（ＤＡ
ＫＯ社、デンマーク）１００μｌを各ウェルに加えた。
反応終了後、０．０１％ＢＳＡ−生理食塩液で各ウェル
を３回洗浄し、ペルオキシダーゼの基質を加えた。その
結果、９６穴中、１２ウェルに抗体産生が認められた。
その１２ウェルのハイブリドーマを２４ウェルのプレー
トに移し、５日間培養後、再度ＥＬＩＳＡ法により、抗
Ｕ−ＦＭ抗体の産生の有無を確認し、次に、無処置のフ
ィブリノーゲン（Ｆｇ）、尿素処理フィブリノーゲン
（Ｕ−Ｆｇ）、酸性可溶化フィブリンモノマー（Ａ−Ｆ
Ｍ）との反応性を上記と同様のＥＬＩＳＡ法によって検
討した。その結果、ＦｇとＡ−ＦＭに反応しないで、Ｕ
−ＦｇとＵ−ＦＭに反応するクローン１種（ＳＦ−１）
を確立した。他の１１種は、すべてＦｇとも反応したの
で以下の研究から削除した。ハイブリドーマＳＦ−１が
産生するモノクロナール抗体ＳＦ−１のフィブリン分解
物、フィブリノーゲン分解物との詳細な反応も、上記と
同様のＥＬＩＳＡ法によって検討した。
養液の上清中の抗体の有無は、ＥＬＩＳＡ法により測定
した。９６穴ＥＬＩＳＡ用プレート（住友化学）の各ウ
ェルに前記の可溶性フィブリンモノマー（Ｕ−ＦＭ）溶
液（Ａ280nm ＝０．０１）１００μｌずつ分注し、４℃
で１６時間放置した。次に、０．０１％ウシ血清アルブ
ミン（ＢＳＡ）−生理食塩液で３回洗浄した後、各ウェ
ルに培養上清１００μｌを加え、２５℃で１時間反応さ
せた。次に、Ｔｗｅｅｎ ８０−生理食塩液で１０００
倍に希釈したペルオキシダーゼ結合抗マウス抗体（ＤＡ
ＫＯ社、デンマーク）１００μｌを各ウェルに加えた。
反応終了後、０．０１％ＢＳＡ−生理食塩液で各ウェル
を３回洗浄し、ペルオキシダーゼの基質を加えた。その
結果、９６穴中、１２ウェルに抗体産生が認められた。
その１２ウェルのハイブリドーマを２４ウェルのプレー
トに移し、５日間培養後、再度ＥＬＩＳＡ法により、抗
Ｕ−ＦＭ抗体の産生の有無を確認し、次に、無処置のフ
ィブリノーゲン（Ｆｇ）、尿素処理フィブリノーゲン
（Ｕ−Ｆｇ）、酸性可溶化フィブリンモノマー（Ａ−Ｆ
Ｍ）との反応性を上記と同様のＥＬＩＳＡ法によって検
討した。その結果、ＦｇとＡ−ＦＭに反応しないで、Ｕ
−ＦｇとＵ−ＦＭに反応するクローン１種（ＳＦ−１）
を確立した。他の１１種は、すべてＦｇとも反応したの
で以下の研究から削除した。ハイブリドーマＳＦ−１が
産生するモノクロナール抗体ＳＦ−１のフィブリン分解
物、フィブリノーゲン分解物との詳細な反応も、上記と
同様のＥＬＩＳＡ法によって検討した。
【００２２】実施例２ モノクロナール抗体の製造：プリスタン（２，６，１
０，１４−テトラメチルペンタデカン）０．５ｍｌを１
０週令以上のＢＡＬＢ／ｃ系雄マウスの腹腔内に投与
し、それからマウスの腹腔内にハイブリドーマＳＦ−１
をマウス１匹当り２×１０6 個になるように接種した。
１匹のマウスから約５〜１２ｍｌの腹水が得られた。そ
の抗体濃度は５〜１０ｍｇ／ｍｌであった。腹水中おモ
ノクロナール抗体の精製は、プロテインＡセファロース
４Ｂカラム（Pharmacia,スエーデン）により行った。
０，１４−テトラメチルペンタデカン）０．５ｍｌを１
０週令以上のＢＡＬＢ／ｃ系雄マウスの腹腔内に投与
し、それからマウスの腹腔内にハイブリドーマＳＦ−１
をマウス１匹当り２×１０6 個になるように接種した。
１匹のマウスから約５〜１２ｍｌの腹水が得られた。そ
の抗体濃度は５〜１０ｍｇ／ｍｌであった。腹水中おモ
ノクロナール抗体の精製は、プロテインＡセファロース
４Ｂカラム（Pharmacia,スエーデン）により行った。
【００２３】実施例３ モノクロナール抗体ＳＦ−１のイソタイプ及び特異性：
抗可溶性フィブリンモノクロナール抗体ＳＦ−１のイソ
タイプ及び特異性の同定は、それぞれイムノブロッテン
グ法及びＥＬＩＳＡ法により行った。イソタイプは、Ｉ
ｇＧ2a（κ）であった。また、特異性は表１及び表２に
示すとおりであった。
抗可溶性フィブリンモノクロナール抗体ＳＦ−１のイソ
タイプ及び特異性の同定は、それぞれイムノブロッテン
グ法及びＥＬＩＳＡ法により行った。イソタイプは、Ｉ
ｇＧ2a（κ）であった。また、特異性は表１及び表２に
示すとおりであった。
【００２４】
【表１】
【００２５】上記において使用した抗原は、各々２００
μｇ／ｍｌの濃度で、３７℃３０分間処理し、その遠心
上清を、９６穴のＥＬＩＳＡ用プレートに吸着させた。
μｇ／ｍｌの濃度で、３７℃３０分間処理し、その遠心
上清を、９６穴のＥＬＩＳＡ用プレートに吸着させた。
【００２６】
【表２】
【００２７】上記において、酢酸可溶化フィブリンモノ
マー（Ａ−ＦＭ）溶液（１０μｇ／ｍｌ，ｐＨ３．５）
に４０倍のモル数のフィブリノーゲンフラグメント
Ｘ，Ｙ，Ｄ，Ｅをそれぞれ添加し、ｐＨ Ａ７．５に調
整した後３７℃で３０分間保温した。９６穴のＥＬＩＳ
Ａ用プレートに、それらの調製抗原を前記の如く吸着さ
せ、前記と同様のＥＬＩＳＡ法でＳＡ−１との反応性を
検討したものである。
マー（Ａ−ＦＭ）溶液（１０μｇ／ｍｌ，ｐＨ３．５）
に４０倍のモル数のフィブリノーゲンフラグメント
Ｘ，Ｙ，Ｄ，Ｅをそれぞれ添加し、ｐＨ Ａ７．５に調
整した後３７℃で３０分間保温した。９６穴のＥＬＩＳ
Ａ用プレートに、それらの調製抗原を前記の如く吸着さ
せ、前記と同様のＥＬＩＳＡ法でＳＡ−１との反応性を
検討したものである。
【００２８】以上の結果は、モノクロナール抗体ＳＡ−
１が尿素処理されたフィブリノーゲン、フィブリンモノ
マー、フィブリノーゲン／フィブリンフラグメント
Ｘ，Ｙ，Ｅと反応することから、尿素処理によって露出
してくるエピトープを認識していることを示している。
さらに、このエピトープは、酢酸可溶化フィブリンモノ
マーが、他のフィブリンモノマー分子、フィブリノーゲ
ン、フィブリノーゲンフラグメント Ｘ，Ｙ，Ｄと複合
体を形成した場合にも露出してくる。因みに、Ａ−ＦＭ
単独では、表１に示した如くＳＦ−１モノクロナール抗
体とは反応しない。
１が尿素処理されたフィブリノーゲン、フィブリンモノ
マー、フィブリノーゲン／フィブリンフラグメント
Ｘ，Ｙ，Ｅと反応することから、尿素処理によって露出
してくるエピトープを認識していることを示している。
さらに、このエピトープは、酢酸可溶化フィブリンモノ
マーが、他のフィブリンモノマー分子、フィブリノーゲ
ン、フィブリノーゲンフラグメント Ｘ，Ｙ，Ｄと複合
体を形成した場合にも露出してくる。因みに、Ａ−ＦＭ
単独では、表１に示した如くＳＦ−１モノクロナール抗
体とは反応しない。
【００２９】実施例４ 抗体感作ラテックスの調製：モノクロナール抗体ＳＦ−
１のＦ（ａｂ’）2 分画（１．０ｍｇ／ｍｌ）を含む溶
液５ｍｌと、ラテックス溶液（２％、日本合成ゴム社：
粒径２１２ｎｍ）５ｍｌとを混合し約１時間強く攪拌し
た。遠心後、ペレットをＢＳＡ溶液（２ｍｇ／ｍｌ）に
懸濁し、約１時間強く攪拌した。遠心後、ペレットを５
０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁して、約
１時間強く攪拌した。かくして、モノクロナールＳＦ−
１のＦ（ａｂ’）2 感作ラテックス液を得た。
１のＦ（ａｂ’）2 分画（１．０ｍｇ／ｍｌ）を含む溶
液５ｍｌと、ラテックス溶液（２％、日本合成ゴム社：
粒径２１２ｎｍ）５ｍｌとを混合し約１時間強く攪拌し
た。遠心後、ペレットをＢＳＡ溶液（２ｍｇ／ｍｌ）に
懸濁し、約１時間強く攪拌した。遠心後、ペレットを５
０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁して、約
１時間強く攪拌した。かくして、モノクロナールＳＦ−
１のＦ（ａｂ’）2 感作ラテックス液を得た。
【００３０】実施例５ 分光学的方法による可溶化フィブリンの定量 実施例４で調製したＳＦ−１のＦ（ａｂ’）2 感作ラテ
ックス液と、調製した可溶化フィブリンとの凝集反応の
速度を分光学的方法で測定した。その結果は、図１のよ
うに、可溶化フィブリン０〜３００μｇ／ｍｌまで測定
可能であった。ここで使用した可溶化フィブリンは、フ
ィブリノーゲン２分子と酢酸可溶化フィブリンモノマー
１分子が結合した複合体である。
ックス液と、調製した可溶化フィブリンとの凝集反応の
速度を分光学的方法で測定した。その結果は、図１のよ
うに、可溶化フィブリン０〜３００μｇ／ｍｌまで測定
可能であった。ここで使用した可溶化フィブリンは、フ
ィブリノーゲン２分子と酢酸可溶化フィブリンモノマー
１分子が結合した複合体である。
【００３１】
【発明の効果】本発明のモノクロナール抗体を用いれ
ば、血漿中の可溶化フィブリン（酢酸可溶化フィブリン
モノマーとフィブリノーゲン、あるいは、フィブリノー
ゲンの分解物 Ｘ，Ｙ，Ｄの複合体）及びフィブリンポ
リマー（デスＡＡフィブリンモノマーが２つ以上結合し
た複合体、及びデスＡＡフィブリンモノマーとデスＡＡ
ＢＢフィブリンモノマーがそれぞれ１つ以上結合した複
合体で、かつ可溶性のもの）を特異的、簡便かつ迅速に
凝集法により測定できる。
ば、血漿中の可溶化フィブリン（酢酸可溶化フィブリン
モノマーとフィブリノーゲン、あるいは、フィブリノー
ゲンの分解物 Ｘ，Ｙ，Ｄの複合体）及びフィブリンポ
リマー（デスＡＡフィブリンモノマーが２つ以上結合し
た複合体、及びデスＡＡフィブリンモノマーとデスＡＡ
ＢＢフィブリンモノマーがそれぞれ１つ以上結合した複
合体で、かつ可溶性のもの）を特異的、簡便かつ迅速に
凝集法により測定できる。
【図１】実施例５で調製したＳＦ−１のＦ（ａｂ’）2
感作ラテックスと可溶化フィブリンとの凝集反応を、吸
光度変化と可溶化フィブリン濃度との関係で示した図で
ある。
感作ラテックスと可溶化フィブリンとの凝集反応を、吸
光度変化と可溶化フィブリン濃度との関係で示した図で
ある。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/02 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (4)
- 【請求項１】 尿素処理したヒトフィブリノーゲン及び
ヒトフィブリンモノマー（デスＡＡフィブリンモノマ
ー、デスＡＡＢＢフィブリンモノマー）と反応するが、
無処理のヒトフィブリノーゲン、酸処理したヒトフィブ
リノーゲン及びヒトフィブリンモノマーとは反応しない
モノクローナル抗体。 - 【請求項２】 ヒト可溶性フィブリン及びフィブリンポ
リマーと反応するが、ヒトフィブリノーゲンと反応しな
い請求項１に記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項３】 フィブリノーゲンのＡα鎖ペプチド１７
−２６、１４８−１６０及びγ鎖ペプチド３１２−３２
４と反応しない、請求項２に記載のモノクローナル抗
体。 - 【請求項４】 不溶性担体に固定化された、請求項１に
記載のモノクローナル抗体を使用して、凝集反応を観察
することにより、被検試料中のヒト可溶性フィブリン及
びフィブリンポリマーを測定する方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7286331A JPH09104700A (ja) | 1995-10-09 | 1995-10-09 | 抗ヒト可溶性フィブリン抗体及びそれを用いた免疫学的測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7286331A JPH09104700A (ja) | 1995-10-09 | 1995-10-09 | 抗ヒト可溶性フィブリン抗体及びそれを用いた免疫学的測定法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09104700A true JPH09104700A (ja) | 1997-04-22 |
Family
ID=17703008
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7286331A Pending JPH09104700A (ja) | 1995-10-09 | 1995-10-09 | 抗ヒト可溶性フィブリン抗体及びそれを用いた免疫学的測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH09104700A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2014133093A1 (ja) | 2013-02-28 | 2014-09-04 | 独立行政法人国立がん研究センター | 不溶性フィブリンに対する抗体 |
| CN119775405A (zh) * | 2025-01-22 | 2025-04-08 | 北京赛科希德科技股份有限公司 | 可溶性纤维蛋白sf抗体及其应用 |
-
1995
- 1995-10-09 JP JP7286331A patent/JPH09104700A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2014133093A1 (ja) | 2013-02-28 | 2014-09-04 | 独立行政法人国立がん研究センター | 不溶性フィブリンに対する抗体 |
| US9429584B2 (en) | 2013-02-28 | 2016-08-30 | National Cancer Center | Antibody against insoluble fibrin |
| EP3339327A2 (en) | 2013-02-28 | 2018-06-27 | National Cancer Center | Antibody against insoluble fibrin |
| CN119775405A (zh) * | 2025-01-22 | 2025-04-08 | 北京赛科希德科技股份有限公司 | 可溶性纤维蛋白sf抗体及其应用 |
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