JPH09107991A - 化学ルミネセンス型分析方法並びにそのための試薬及びキット - Google Patents
化学ルミネセンス型分析方法並びにそのための試薬及びキットInfo
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 酵素イムノアッセイにおけるバックグラウン
ドシグナルを減少させること。 【解決手段】 水性溶媒中でのルミノール又は置換ルミ
ノール及び過ホウ酸塩との反応において適当な触媒を使
用し、前記反応によって生じたルミネセンスを検出及び
測定する際、前記水性溶媒が、前記過ホウ酸塩中の電子
不足ホウ素原子をキレート化するための非ルミネセンス
型キレート化剤を含むことを特徴とする化学ルミネセン
ス型分析方法。
ドシグナルを減少させること。 【解決手段】 水性溶媒中でのルミノール又は置換ルミ
ノール及び過ホウ酸塩との反応において適当な触媒を使
用し、前記反応によって生じたルミネセンスを検出及び
測定する際、前記水性溶媒が、前記過ホウ酸塩中の電子
不足ホウ素原子をキレート化するための非ルミネセンス
型キレート化剤を含むことを特徴とする化学ルミネセン
ス型分析方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、生物学的流体中の
各種アナライトを検出するための分析及び診断化学法に
関する。詳細には、本発明は、化学ルミネセンス型アッ
セイにおいて有用なシグナル発生性組成物に、該組成物
を含有する試験キットに、そして該組成物及び試験キッ
トを使用することができる分析方法に関する。
各種アナライトを検出するための分析及び診断化学法に
関する。詳細には、本発明は、化学ルミネセンス型アッ
セイにおいて有用なシグナル発生性組成物に、該組成物
を含有する試験キットに、そして該組成物及び試験キッ
トを使用することができる分析方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ルミネセンス型及びルミノメトリー型の
アッセイは、目的のアナライトが存在する結果として発
光を生じるものである。この発光は、一般にはそれが測
定又は検出されることによりアナライトの分析が可能と
なるに十分な時間存続するものである。化学ルミネセン
ス型シグナルを利用してアナライトを有利に分析するこ
とができるアッセイ法には主なものとして数種類ある。 １）タンパク質、オリゴヌクレオチド、抗原、ハプテ
ン、ホルモン、核酸及びその他生物学的に重要な化合物
といった特異的結合性リガンドを直接標識するために化
学ルミネセンス型化合物を使用するアッセイ。標識され
たリガンドにペルオキシダーゼ及び酸化性物質を添加す
ることにより化学ルミネセンスを検出することができ
る。 ２）特異的結合性リガンドのための標識としてルミネセ
ンス反応の触媒又はコファクターを利用するアッセイ。
例えば、ペルオキシダーゼをリガンドに複合体化させて
使用し、化学ルミネセンス型シグナルを提供することが
できる。
アッセイは、目的のアナライトが存在する結果として発
光を生じるものである。この発光は、一般にはそれが測
定又は検出されることによりアナライトの分析が可能と
なるに十分な時間存続するものである。化学ルミネセン
ス型シグナルを利用してアナライトを有利に分析するこ
とができるアッセイ法には主なものとして数種類ある。 １）タンパク質、オリゴヌクレオチド、抗原、ハプテ
ン、ホルモン、核酸及びその他生物学的に重要な化合物
といった特異的結合性リガンドを直接標識するために化
学ルミネセンス型化合物を使用するアッセイ。標識され
たリガンドにペルオキシダーゼ及び酸化性物質を添加す
ることにより化学ルミネセンスを検出することができ
る。 ２）特異的結合性リガンドのための標識としてルミネセ
ンス反応の触媒又はコファクターを利用するアッセイ。
例えば、ペルオキシダーゼをリガンドに複合体化させて
使用し、化学ルミネセンス型シグナルを提供することが
できる。
【０００３】３）ペルオキシダーゼ以外の酵素標識が適
当な基質に作用することによって得られる生成物を測定
するために化学ルミネセンス型反応を利用するアッセ
イ。この種のアッセイの一例として、ペルオキシダーゼ
存在下で過酸化水素を発生させることによりグルコース
オキシダーゼ標識化特異的結合性リガンドを測定する方
法が挙げられる。 ４）非免疫反応体のアナライトの結果として発生した過
酸化水素のような酸化性物質又はペルオキシダーゼのよ
うな触媒を測定するための非イムノアッセイ。このよう
なアッセイ法のさらなる詳細については、米国特許第
４，７２９，９５０号明細書（Ｋｒｉｃｋａら）及びそ
の中に引用されている刊行物のような広範囲にわたる文
献に記載されている。
当な基質に作用することによって得られる生成物を測定
するために化学ルミネセンス型反応を利用するアッセ
イ。この種のアッセイの一例として、ペルオキシダーゼ
存在下で過酸化水素を発生させることによりグルコース
オキシダーゼ標識化特異的結合性リガンドを測定する方
法が挙げられる。 ４）非免疫反応体のアナライトの結果として発生した過
酸化水素のような酸化性物質又はペルオキシダーゼのよ
うな触媒を測定するための非イムノアッセイ。このよう
なアッセイ法のさらなる詳細については、米国特許第
４，７２９，９５０号明細書（Ｋｒｉｃｋａら）及びそ
の中に引用されている刊行物のような広範囲にわたる文
献に記載されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】一般に、ルミネセンス
型反応に関与する過酸化水素源は過ホウ酸塩であり、そ
の過酸化作用の基質はルミノールのような２，３−ジヒ
ドロ−１，４−フタラジンジオンである。水溶液中でル
ミノールと過ホウ酸塩を混合すると低レベルの自然発光
が観測される。このような「バックグラウンド」発光
は、ルミノールの酸化を制御して得られる光を測定して
反応の終点を決定する化学系（例、化学ルミネセンス型
イムノアッセイ）においては望ましくないものである。
従って、酵素イムノアッセイを設計する際にはこのよう
な「バックグラウンド」発光をできる限り減少させるこ
とが重要である。
型反応に関与する過酸化水素源は過ホウ酸塩であり、そ
の過酸化作用の基質はルミノールのような２，３−ジヒ
ドロ−１，４−フタラジンジオンである。水溶液中でル
ミノールと過ホウ酸塩を混合すると低レベルの自然発光
が観測される。このような「バックグラウンド」発光
は、ルミノールの酸化を制御して得られる光を測定して
反応の終点を決定する化学系（例、化学ルミネセンス型
イムノアッセイ）においては望ましくないものである。
従って、酵素イムノアッセイを設計する際にはこのよう
な「バックグラウンド」発光をできる限り減少させるこ
とが重要である。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明によると、水性溶
媒中でのルミノール又は置換ルミノール及び過ホウ酸塩
との反応においてペルオキシダーゼ酵素のような適当な
触媒を使用し、その反応によって生じたルミネセンスを
検出及び測定する際、該水性溶媒が、該過ホウ酸塩中の
電子不足ホウ素原子をキレート化するための非ルミネセ
ンス型キレート化剤を含むことを特徴とする化学ルミネ
センス型分析方法が提供される。
媒中でのルミノール又は置換ルミノール及び過ホウ酸塩
との反応においてペルオキシダーゼ酵素のような適当な
触媒を使用し、その反応によって生じたルミネセンスを
検出及び測定する際、該水性溶媒が、該過ホウ酸塩中の
電子不足ホウ素原子をキレート化するための非ルミネセ
ンス型キレート化剤を含むことを特徴とする化学ルミネ
センス型分析方法が提供される。
【０００６】さらに本発明によると、水性溶媒中に過ホ
ウ酸イオンを含み、該水性溶媒が、該過ホウ酸イオン中
の電子不足ホウ素原子をキレート化するための非ルミネ
センス型キレート化剤をさらに含むことを特徴とする、
化学ルミネセンス型分析方法に有用な試薬が提供され
る。さらに本発明によると、水溶液中にルミノール又は
置換ルミノールを含む第一の試薬と水溶液中に過ホウ酸
イオンを含む第二の試薬とを含み、該第二の試薬が該過
ホウ酸イオン中の電子不足ホウ素原子をキレート化する
ための非ルミネセンス型キレート化剤をさらに含むこと
を特徴とする、化学ルミネセンス型分析方法に有用なキ
ットが提供される。
ウ酸イオンを含み、該水性溶媒が、該過ホウ酸イオン中
の電子不足ホウ素原子をキレート化するための非ルミネ
センス型キレート化剤をさらに含むことを特徴とする、
化学ルミネセンス型分析方法に有用な試薬が提供され
る。さらに本発明によると、水溶液中にルミノール又は
置換ルミノールを含む第一の試薬と水溶液中に過ホウ酸
イオンを含む第二の試薬とを含み、該第二の試薬が該過
ホウ酸イオン中の電子不足ホウ素原子をキレート化する
ための非ルミネセンス型キレート化剤をさらに含むこと
を特徴とする、化学ルミネセンス型分析方法に有用なキ
ットが提供される。
【０００７】本発明のキットの第一の試薬と第二の試薬
とは一緒に又は別個に提供されることができ、後者の場
合には、使用前に混合されるか、又はルミネセンス型反
応の他の化合物へ同時に若しくは逐次的に添加される。
蛍光分光分析法でルミノール／過ホウ酸塩溶液を分析す
ることにより、関与している分子の一部は溶液中に錯体
として共存していることが示された。錯体形成の確から
しい機構は、電子不足の過ホウ酸塩のホウ素原子がルミ
ノールによってキレート化されているというものであ
る。本発明者らは、形成された錯体が不安定であり、し
かも発光を伴う分解によってバックグラウンドルミネセ
ンスに寄与しているものと考える。
とは一緒に又は別個に提供されることができ、後者の場
合には、使用前に混合されるか、又はルミネセンス型反
応の他の化合物へ同時に若しくは逐次的に添加される。
蛍光分光分析法でルミノール／過ホウ酸塩溶液を分析す
ることにより、関与している分子の一部は溶液中に錯体
として共存していることが示された。錯体形成の確から
しい機構は、電子不足の過ホウ酸塩のホウ素原子がルミ
ノールによってキレート化されているというものであ
る。本発明者らは、形成された錯体が不安定であり、し
かも発光を伴う分解によってバックグラウンドルミネセ
ンスに寄与しているものと考える。
【０００８】ここで本発明者らは、ルミノール／過ホウ
酸塩溶液のバックグラウンドルミネセンスを、適当な分
子形状を有する非ルミネセンス型キレート化剤、すなわ
ち過ホウ酸イオンにおける電子不足ホウ素原子をキレー
ト化するための非ルミネセンス型キレート化剤を添加す
ることによって、低減できることを見い出した。本発明
者らは、添加されたキレート化剤が過ホウ酸塩との結合
についてルミノールと競争することにより、不安定なル
ミノール／過ホウ酸塩錯体の形成が最小限に抑えられる
ものと考える。
酸塩溶液のバックグラウンドルミネセンスを、適当な分
子形状を有する非ルミネセンス型キレート化剤、すなわ
ち過ホウ酸イオンにおける電子不足ホウ素原子をキレー
ト化するための非ルミネセンス型キレート化剤を添加す
ることによって、低減できることを見い出した。本発明
者らは、添加されたキレート化剤が過ホウ酸塩との結合
についてルミノールと競争することにより、不安定なル
ミノール／過ホウ酸塩錯体の形成が最小限に抑えられる
ものと考える。
【０００９】二種の好ましいキレート化剤を用いたバッ
クグラウンドルミネセンスを低減するものと考えられる
本発明による機構を、下記に提案した相互作用経路１及
び２に示す。経路１におけるキレート化剤はグリシンで
あり、また経路２におけるキレート化剤はスルホサリチ
ル酸（ＳＳＡ）である。どちらの相互作用経路において
も、ルミノールは、過ホウ酸イオンの電子不足ホウ素原
子に酸素原子及び窒素原子を介してゆるく結合すること
により不安定な過ホウ酸塩との錯体を形成する。キレー
ト化剤（経路１ではグリシン、経路２ではＳＳＡ）の存
在下では、これらのキレート化剤が上記錯体からルミノ
ールを置換するのに適した分子形状を有するため、代わ
りとなる別の錯体が形成される。このため、本発明者ら
は、バックグラウンドルミネセンスを実質的に低減でき
るものと考える。 １）過ホウ酸塩、ルミノール及びグリシンの間の相互作
用（提案）
クグラウンドルミネセンスを低減するものと考えられる
本発明による機構を、下記に提案した相互作用経路１及
び２に示す。経路１におけるキレート化剤はグリシンで
あり、また経路２におけるキレート化剤はスルホサリチ
ル酸（ＳＳＡ）である。どちらの相互作用経路において
も、ルミノールは、過ホウ酸イオンの電子不足ホウ素原
子に酸素原子及び窒素原子を介してゆるく結合すること
により不安定な過ホウ酸塩との錯体を形成する。キレー
ト化剤（経路１ではグリシン、経路２ではＳＳＡ）の存
在下では、これらのキレート化剤が上記錯体からルミノ
ールを置換するのに適した分子形状を有するため、代わ
りとなる別の錯体が形成される。このため、本発明者ら
は、バックグラウンドルミネセンスを実質的に低減でき
るものと考える。 １）過ホウ酸塩、ルミノール及びグリシンの間の相互作
用（提案）
【００１０】
【化１】
【００１１】２）過ホウ酸塩、ルミノール及びスルホサ
リチル酸（ＳＳＡ）の間の相互作用（提案）
リチル酸（ＳＳＡ）の間の相互作用（提案）
【００１２】
【化２】
【００１３】本発明の方法は、ペルオキシダーゼのよう
な適当な触媒を用いて水性溶媒中でルミノール又は置換
ルミノール及び過ホウ酸塩と反応させた後にそのルミネ
センスを検出し測定するものであれば、いずれの化学ル
ミネセンス分析法に対しても何ら特別な制限もなく適用
することができる。触媒はペルオキシダーゼ酵素である
ことが好ましい。この酵素は標識性物質として周知であ
り、また免疫学的反応や核酸ハイブリダイゼーション技
法に基づくアッセイ法で広く用いられている。例えば、
ペルオキシダーゼを標的特異的結合性試薬により標的に
結合させることができ、そのペルオキシダーゼが結合し
た標的を単離し、水性溶媒中でルミノール及び過ホウ酸
塩と反応させる。この水性溶媒中のルミノール又は置換
ルミノールはシグナル試薬と呼ばれる。
な適当な触媒を用いて水性溶媒中でルミノール又は置換
ルミノール及び過ホウ酸塩と反応させた後にそのルミネ
センスを検出し測定するものであれば、いずれの化学ル
ミネセンス分析法に対しても何ら特別な制限もなく適用
することができる。触媒はペルオキシダーゼ酵素である
ことが好ましい。この酵素は標識性物質として周知であ
り、また免疫学的反応や核酸ハイブリダイゼーション技
法に基づくアッセイ法で広く用いられている。例えば、
ペルオキシダーゼを標的特異的結合性試薬により標的に
結合させることができ、そのペルオキシダーゼが結合し
た標的を単離し、水性溶媒中でルミノール及び過ホウ酸
塩と反応させる。この水性溶媒中のルミノール又は置換
ルミノールはシグナル試薬と呼ばれる。
【００１４】本明細書中の用語「標的特異的結合性試
薬」とは、分析対象の標的に対して特異的に結合しうる
物質を意味する。標的には生理学的に活性なペプチド、
ホルモン、核酸及び類似物質が含まれうる。分析対象の
標的が抗原として作用しうる場合には、抗体（ポリクロ
ーナル抗体、モノクローナル抗体、抗体フラグメント、
等を含む）が標的特異的結合性試薬となりうる。分析対
象の標的が核酸である場合には、その相補的（一本鎖）
核酸又は核酸フラグメントが標的特異的結合性試薬とな
りうる。
薬」とは、分析対象の標的に対して特異的に結合しうる
物質を意味する。標的には生理学的に活性なペプチド、
ホルモン、核酸及び類似物質が含まれうる。分析対象の
標的が抗原として作用しうる場合には、抗体（ポリクロ
ーナル抗体、モノクローナル抗体、抗体フラグメント、
等を含む）が標的特異的結合性試薬となりうる。分析対
象の標的が核酸である場合には、その相補的（一本鎖）
核酸又は核酸フラグメントが標的特異的結合性試薬とな
りうる。
【００１５】本発明におけるキレート化剤としては、適
当な分子形状を有するいずれの非ルミネセンス型キレー
ト化剤、すなわち過ホウ酸イオンにおける電子不足ホウ
素原子をキレート化するいずれの非ルミネセンス型キレ
ート化剤でも使用することができる。好適なキレート化
剤は、配位座数又はデンティシティー(denticity) が２
以上である化合物である。好適な結合配置は二座配位で
あり、中でもキレート環の大きさが５員又は６員である
ものが特に好ましい。これらの系の内部の結合につい
て、少なくとも一つの配位子基は陰性電荷を有すること
が好ましい。多座配位子又は巨大環状配位子は過ホウ酸
塩が脱離する可能性を低下させるので、好ましい系とな
る。好適なキレート化剤はグリシン及びスルホサリチル
酸(SSA) であるが、他にも使用できるものはある。典型
的なシグナル試薬中に好適に存在するキレート化剤の濃
度は４〜１５ミリモル／Ｌの範囲内にあるが、この濃度
は他のシグナル試薬成分によって多少は変動する。キレ
ート化剤は、シグナル試薬中の過ホウ酸塩及びルミノー
ルの両方よりも化学量論的に過剰に存在することが好適
である。典型的なシグナル試薬では、キレート化剤は、
試薬中に存在するルミノール及び過ホウ酸塩のモル量の
２〜１０倍のモル量で存在する。
当な分子形状を有するいずれの非ルミネセンス型キレー
ト化剤、すなわち過ホウ酸イオンにおける電子不足ホウ
素原子をキレート化するいずれの非ルミネセンス型キレ
ート化剤でも使用することができる。好適なキレート化
剤は、配位座数又はデンティシティー(denticity) が２
以上である化合物である。好適な結合配置は二座配位で
あり、中でもキレート環の大きさが５員又は６員である
ものが特に好ましい。これらの系の内部の結合につい
て、少なくとも一つの配位子基は陰性電荷を有すること
が好ましい。多座配位子又は巨大環状配位子は過ホウ酸
塩が脱離する可能性を低下させるので、好ましい系とな
る。好適なキレート化剤はグリシン及びスルホサリチル
酸(SSA) であるが、他にも使用できるものはある。典型
的なシグナル試薬中に好適に存在するキレート化剤の濃
度は４〜１５ミリモル／Ｌの範囲内にあるが、この濃度
は他のシグナル試薬成分によって多少は変動する。キレ
ート化剤は、シグナル試薬中の過ホウ酸塩及びルミノー
ルの両方よりも化学量論的に過剰に存在することが好適
である。典型的なシグナル試薬では、キレート化剤は、
試薬中に存在するルミノール及び過ホウ酸塩のモル量の
２〜１０倍のモル量で存在する。
【００１６】本発明の分析方法に用いられ且つそのシグ
ナル試薬中に存在する水性溶媒は、一般には水又は緩衝
液である。好適な緩衝液には、生化学反応に通常用いら
れる緩衝液が含まれ、具体的にはリン酸系緩衝液やホウ
酸系緩衝液が挙げられる。ホウ酸系緩衝液及び過酸化水
素の存在下では経路１及び２に記載した錯体が形成され
うることに着目できる（J. Flanagan et al., J. Chem.
Soc., Dalton Trans., 1651, 1989: B.N. Chernyshov,
Russian J. Inorg. Chem., 35(9), 1333, 1990)。緩衝
液のｐＨは５〜１２、好ましくは７〜１１の範囲にある
ことが好適である。５未満のｐＨ値はペルオキシダーゼ
酵素の至適ｐＨ範囲を外れているため、得られるルミネ
センスは低下する。１２よりも高いｐＨ値もこの酵素の
至適範囲を外れているが、この場合には、ペルオキシダ
ーゼの活性によらない比較的強いルミネセンス、すなわ
ち非特異的ルミネセンスをもたらしてしまう。
ナル試薬中に存在する水性溶媒は、一般には水又は緩衝
液である。好適な緩衝液には、生化学反応に通常用いら
れる緩衝液が含まれ、具体的にはリン酸系緩衝液やホウ
酸系緩衝液が挙げられる。ホウ酸系緩衝液及び過酸化水
素の存在下では経路１及び２に記載した錯体が形成され
うることに着目できる（J. Flanagan et al., J. Chem.
Soc., Dalton Trans., 1651, 1989: B.N. Chernyshov,
Russian J. Inorg. Chem., 35(9), 1333, 1990)。緩衝
液のｐＨは５〜１２、好ましくは７〜１１の範囲にある
ことが好適である。５未満のｐＨ値はペルオキシダーゼ
酵素の至適ｐＨ範囲を外れているため、得られるルミネ
センスは低下する。１２よりも高いｐＨ値もこの酵素の
至適範囲を外れているが、この場合には、ペルオキシダ
ーゼの活性によらない比較的強いルミネセンス、すなわ
ち非特異的ルミネセンスをもたらしてしまう。
【００１７】好ましい触媒はペルオキシダーゼ酵素であ
るが、ＭＰ１１（ミクロペルオキシダーゼ）のようなポ
ルフィリンをはじめとした他の触媒を使用してもよい。
標識性物質として用いられるペルオキシダーゼ酵素は、
西洋ワサビの塩基性イソ酵素（西洋ワサビペルオキシダ
ーゼ又はＨＲＰ）であることが好適である。好適な西洋
ワサビペルオキシダーゼのイソ酵素には、Sigma Chemic
al, Poole, Dorset から市販されているタイプ VI 及び
タイプ IX が含まれるが、本発明ではタイプ VI を使用
することが好ましい。
るが、ＭＰ１１（ミクロペルオキシダーゼ）のようなポ
ルフィリンをはじめとした他の触媒を使用してもよい。
標識性物質として用いられるペルオキシダーゼ酵素は、
西洋ワサビの塩基性イソ酵素（西洋ワサビペルオキシダ
ーゼ又はＨＲＰ）であることが好適である。好適な西洋
ワサビペルオキシダーゼのイソ酵素には、Sigma Chemic
al, Poole, Dorset から市販されているタイプ VI 及び
タイプ IX が含まれるが、本発明ではタイプ VI を使用
することが好ましい。
【００１８】標的特異的結合性試薬とペルオキシダーゼ
酵素の間の結合（すなわち、結合性試薬に酵素を標識す
ること）は、適当ないずれの方法によっても達成するこ
とができる。結合性試薬とペルオキシダーゼ標識は、M.
Brinkley, Bioconj. Chem.,3, p. 2, (1992)に記載さ
れている方法又は同様な技法によって直接結合して一緒
にすることができる。別法として、標的特異的結合性試
薬にビオチニル基のような第一の化学基を導入した後、
その第一の化学基と反応する第二の化学基、例えばアビ
ジン又はストレプトアビジン残基を含有するペルオキシ
ダーゼと反応させることで、結合性試薬を間接的に標識
化してもよい。
酵素の間の結合（すなわち、結合性試薬に酵素を標識す
ること）は、適当ないずれの方法によっても達成するこ
とができる。結合性試薬とペルオキシダーゼ標識は、M.
Brinkley, Bioconj. Chem.,3, p. 2, (1992)に記載さ
れている方法又は同様な技法によって直接結合して一緒
にすることができる。別法として、標的特異的結合性試
薬にビオチニル基のような第一の化学基を導入した後、
その第一の化学基と反応する第二の化学基、例えばアビ
ジン又はストレプトアビジン残基を含有するペルオキシ
ダーゼと反応させることで、結合性試薬を間接的に標識
化してもよい。
【００１９】本発明において使用するルミノールはルミ
ノールナトリウム(sodium luminol)であることが好適で
ある。用いる過ホウ酸塩は過ホウ酸ナトリウムであるこ
とが好ましい。これは、ペルオキシダーゼ酵素の基質で
ある過酸化水素の発生源として存在する。
ノールナトリウム(sodium luminol)であることが好適で
ある。用いる過ホウ酸塩は過ホウ酸ナトリウムであるこ
とが好ましい。これは、ペルオキシダーゼ酵素の基質で
ある過酸化水素の発生源として存在する。
【００２０】シグナル試薬は、米国特許第４，８４２，
９９７号及び同第５，２７９，９４０号明細書に記載さ
れているもののような化学ルミネセンスを増強すること
ができる化合物を含有することが好ましい。本発明にお
いては、（過ホウ酸塩由来の）過酸化水素からペルオキ
シダーゼを介してルミノールに至る電子移動を促進し且
つ増強作用を示しうるものであればいずれのエンハンサ
ーでも使用することができる。好適なエンハンサーとし
て、４−ヨードフェノール、４−ブロモフェノール、４
−クロロフェノール、４−フェニルフェノール、２−ク
ロロ−４−フェニルフェノール、６−ヒドロキシベンゾ
チアゾール、４−〔４1 −（２1 −メチル）チアゾリ
ル〕フェノール、４−〔２1 −（４1 −メチル）チアゾ
リル〕フェノール、４−（２1 −ベンゾチアゾリル）フ
ェノール、３−（１０−フェノチアジル）−ｎ−プロピ
ルスルホネート及び３−クロロ−４−ヒドロキシアセト
アニリドが挙げられる。ペルオキシダーゼによるルミノ
ールと過酸化水素の間の反応を好適なエンハンサーの存
在下で起こさせると、該酵素による酸化速度がエンハン
サーによって高められる。
９９７号及び同第５，２７９，９４０号明細書に記載さ
れているもののような化学ルミネセンスを増強すること
ができる化合物を含有することが好ましい。本発明にお
いては、（過ホウ酸塩由来の）過酸化水素からペルオキ
シダーゼを介してルミノールに至る電子移動を促進し且
つ増強作用を示しうるものであればいずれのエンハンサ
ーでも使用することができる。好適なエンハンサーとし
て、４−ヨードフェノール、４−ブロモフェノール、４
−クロロフェノール、４−フェニルフェノール、２−ク
ロロ−４−フェニルフェノール、６−ヒドロキシベンゾ
チアゾール、４−〔４1 −（２1 −メチル）チアゾリ
ル〕フェノール、４−〔２1 −（４1 −メチル）チアゾ
リル〕フェノール、４−（２1 −ベンゾチアゾリル）フ
ェノール、３−（１０−フェノチアジル）−ｎ−プロピ
ルスルホネート及び３−クロロ−４−ヒドロキシアセト
アニリドが挙げられる。ペルオキシダーゼによるルミノ
ールと過酸化水素の間の反応を好適なエンハンサーの存
在下で起こさせると、該酵素による酸化速度がエンハン
サーによって高められる。
【００２１】ルミノールとの競争反応のためにシグナル
試薬に含まれる非ルミネセンス型キレート化剤に加え
て、望ましくない金属イオンの除去や別の目的のため
に、他のキレート化剤を含有させてもよい。
試薬に含まれる非ルミネセンス型キレート化剤に加え
て、望ましくない金属イオンの除去や別の目的のため
に、他のキレート化剤を含有させてもよい。
【００２２】
【実施例】本発明を下記の実施例によってさらに説明す
る。これらの結果は、図１及び図２にグラフで示されて
いる。実施例１ クエン酸と３−クロロ−４−ヒドロキシアセトアニリド
（化学ルミネセンスエンハンサー）を含有するホウ酸系
緩衝液中、ｐＨ８．５においてルミノール過ホウ酸ナト
リウムにグリシンを添加した。試薬組成 化合物 濃度（ミリモル／１Ｌの水） ホウ酸 ５７．５ 四ホウ酸ナトリウム １７．５ 過ホウ酸ナトリウム ２．００ クエン酸三ナトリウム ４．６５ クエン酸 ２．１５ 塩化カリウム １００．０ ３−クロロ−４−ヒドロキシアセトアニリド ０．１５ ルミノールナトリウム １．００ グリシン ０〜１５．００
る。これらの結果は、図１及び図２にグラフで示されて
いる。実施例１ クエン酸と３−クロロ−４−ヒドロキシアセトアニリド
（化学ルミネセンスエンハンサー）を含有するホウ酸系
緩衝液中、ｐＨ８．５においてルミノール過ホウ酸ナト
リウムにグリシンを添加した。試薬組成 化合物 濃度（ミリモル／１Ｌの水） ホウ酸 ５７．５ 四ホウ酸ナトリウム １７．５ 過ホウ酸ナトリウム ２．００ クエン酸三ナトリウム ４．６５ クエン酸 ２．１５ 塩化カリウム １００．０ ３−クロロ−４−ヒドロキシアセトアニリド ０．１５ ルミノールナトリウム １．００ グリシン ０〜１５．００
【００２３】グリシン濃度を高くするにつれて、バック
グラウンドの化学ルミネセンスの低下が認められた。グ
リシン濃度が４ミリモル／Ｌを上回ると、バックグラウ
ンド光の出力はその初期レベルの約４０％において安定
化した。２５０μＬの化学ルミネセンス組成物に約１０
０アトモル（１０-16 モル）の西洋ワサビペルオキシダ
ーゼを添加することによって触媒したルミネセンスに
は、グリシンの存在による影響はなかった。むしろ、グ
リシンの存在によりシグナル／ノイズ比が増加するため
有用となる（図１を参照のこと）。ルミネセンスの測定
は、「Ａｍｅｒｌｉｔｅ」（登録商標：Johnson & John
son Clinical Diagnostics Limited (J&JCDL), Amersha
m, UK の分析装置）を用いて白色のマイクロタイターウ
ェルで実施した。
グラウンドの化学ルミネセンスの低下が認められた。グ
リシン濃度が４ミリモル／Ｌを上回ると、バックグラウ
ンド光の出力はその初期レベルの約４０％において安定
化した。２５０μＬの化学ルミネセンス組成物に約１０
０アトモル（１０-16 モル）の西洋ワサビペルオキシダ
ーゼを添加することによって触媒したルミネセンスに
は、グリシンの存在による影響はなかった。むしろ、グ
リシンの存在によりシグナル／ノイズ比が増加するため
有用となる（図１を参照のこと）。ルミネセンスの測定
は、「Ａｍｅｒｌｉｔｅ」（登録商標：Johnson & John
son Clinical Diagnostics Limited (J&JCDL), Amersha
m, UK の分析装置）を用いて白色のマイクロタイターウ
ェルで実施した。
【００２４】実施例２ 実施例１に記載したグリシンを含まない又は５ミリモル
／Ｌ含有する化学ルミネセンス組成物に代わって、Ｊ＆
ＪＣＤＬ (Amersham, UK) より市販されている「Ａｍｅ
ｒｌｉｔｅ」 TSH-30 超高感度イムノアッセイキット(T
SHはヒトチロイド刺激性ホルモンである) における化学
ルミネセンス試薬を使用した。公開されているアッセイ
プロトコルによって以下の結果が得られた。
／Ｌ含有する化学ルミネセンス組成物に代わって、Ｊ＆
ＪＣＤＬ (Amersham, UK) より市販されている「Ａｍｅ
ｒｌｉｔｅ」 TSH-30 超高感度イムノアッセイキット(T
SHはヒトチロイド刺激性ホルモンである) における化学
ルミネセンス試薬を使用した。公開されているアッセイ
プロトコルによって以下の結果が得られた。
【００２５】
【表１】
【００２６】＊アッセイ感度は、零標準の光シグナルよ
りも（零標準の２０個の反復測定で得られた）標準偏差
の２倍分高い値に相当するＴＳＨ濃度として定義した。
グリシンを含有すると、非特異的バックグラウンド化学
ルミネセンスが低下するため、零標準のシグナルの低下
が観測された。その結果、第一のアッセイと第二のアッ
セイの標準間のシグナル比（Ｂ／Ａ比）が増加した。こ
れら二つの標準間の投与−応答特性が線形であると仮定
した統計分析から、ＴＳＨの検出下限値（アッセイ感
度）はグリシンの存在によって０．００２３から０．０
０１４ミリ国際単位／リットルに向上したことが示され
た。このことは、低濃度のＴＳＨを分析することができ
るアッセイ能力が高くなっていること、すなわちこの種
の試験における顕著な利点を意味している。他のアッセ
イ性能変数には、グリシンの添加による影響はなかった
（図２を参照のこと）。
りも（零標準の２０個の反復測定で得られた）標準偏差
の２倍分高い値に相当するＴＳＨ濃度として定義した。
グリシンを含有すると、非特異的バックグラウンド化学
ルミネセンスが低下するため、零標準のシグナルの低下
が観測された。その結果、第一のアッセイと第二のアッ
セイの標準間のシグナル比（Ｂ／Ａ比）が増加した。こ
れら二つの標準間の投与−応答特性が線形であると仮定
した統計分析から、ＴＳＨの検出下限値（アッセイ感
度）はグリシンの存在によって０．００２３から０．０
０１４ミリ国際単位／リットルに向上したことが示され
た。このことは、低濃度のＴＳＨを分析することができ
るアッセイ能力が高くなっていること、すなわちこの種
の試験における顕著な利点を意味している。他のアッセ
イ性能変数には、グリシンの添加による影響はなかった
（図２を参照のこと）。
【図１】実施例１におけるバックグラウンドルミネセン
スとシグナル／ノイズ比に対するグリシン添加による効
果を示すグラフである。
スとシグナル／ノイズ比に対するグリシン添加による効
果を示すグラフである。
【図２】実施例２におけるＴＳＨイムノアッセイの投与
−応答曲線に対するグリシン添加による効果を示すグラ
フである。
−応答曲線に対するグリシン添加による効果を示すグラ
フである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 グラハム デリスル イヤーウッド イギリス国，ロンドン エヌ11 ２ティー エックス，バウンズ グリーン，ウォーウ ィック ロード，テュークスバリー コー ト，９ (72)発明者 トレーシー ミシェル ブース イギリス国，エイチピー９ １エーゼッ ト，バッキンガムシャー，チェシャム，ホ ワイト ヒル，153
Claims (10)
- 【請求項１】 水性溶媒中でのルミノール又は置換ルミ
ノール及び過ホウ酸塩との反応において適当な触媒を使
用し、前記反応によって生じたルミネセンスを検出及び
測定する際、前記水性溶媒が、前記過ホウ酸塩中の電子
不足ホウ素原子をキレート化するための非ルミネセンス
型キレート化剤を含むことを特徴とする化学ルミネセン
ス型分析方法。 - 【請求項２】 前記触媒がペルオキシダーゼ酵素である
ことを特徴とする、請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 前記非ルミネセンス型キレート化剤が２
以上のデンティシティーを有する化合物であることを特
徴とする、請求項１又は２に記載の方法。 - 【請求項４】 キレート環の大きさが５員又は６員であ
ることを特徴とする、請求項３に記載の方法。 - 【請求項５】 前記非ルミネセンス型キレート化剤がグ
リシン又はスルホサリチル酸であることを特徴とする、
請求項４に記載の方法。 - 【請求項６】 前記キレート化剤が、存在するルミノー
ル又は置換ルミノール及び過ホウ酸塩のモル量の２〜１
０倍のモル量で存在することを特徴とする、請求項１〜
５のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項７】 水性溶媒中に過ホウ酸イオンを含み、前
記水性溶媒が、前記過ホウ酸イオン中の電子不足ホウ素
原子をキレート化するための非ルミネセンス型キレート
化剤をさらに含むことを特徴とする試薬。 - 【請求項８】 前記非ルミネセンス型キレート化剤がグ
リシン又はスルホサリチル酸であることを特徴とする、
請求項７に記載の試薬。 - 【請求項９】 前記非ルミネセンス型キレート化剤が試
薬中の過ホウ酸塩よりも化学量論的に過剰に存在するこ
とを特徴とする、請求項７又は８に記載の試薬。 - 【請求項１０】 水溶液中にルミノール又は置換ルミノ
ールを含む第一の試薬と水溶液中に過ホウ酸イオンを含
む第二の試薬とを一体又は二以上の部分として含み、前
記第二の試薬が前記過ホウ酸イオン中の電子不足ホウ素
原子をキレート化するための非ルミネセンス型キレート
化剤をさらに含むことを特徴とする、化学ルミネセンス
型分析方法に有用なキット。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GBGB9514594.2A GB9514594D0 (en) | 1995-07-17 | 1995-07-17 | Chemiluminescent analytical method |
| GB9514594:2 | 1995-07-17 | ||
| US08/685,399 US5846756A (en) | 1995-07-17 | 1996-07-23 | Chemiluminescent analytical method |
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|---|---|---|---|
| JP2006151541A Division JP2006242966A (ja) | 1995-07-17 | 2006-05-31 | 化学ルミネセンス型分析方法並びにそのための試薬及びキット |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09107991A true JPH09107991A (ja) | 1997-04-28 |
| JP3863223B2 JP3863223B2 (ja) | 2006-12-27 |
Family
ID=26307417
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP18632096A Expired - Lifetime JP3863223B2 (ja) | 1995-07-17 | 1996-07-16 | 化学ルミネセンス型分析方法並びにそのための試薬及びキット |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2006151541A Pending JP2006242966A (ja) | 1995-07-17 | 2006-05-31 | 化学ルミネセンス型分析方法並びにそのための試薬及びキット |
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| Country | Link |
|---|---|
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| EP (1) | EP0754761B1 (ja) |
| JP (2) | JP3863223B2 (ja) |
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| CA (1) | CA2181131C (ja) |
| DE (1) | DE69629880T2 (ja) |
| DK (1) | DK0754761T3 (ja) |
| ES (1) | ES2205001T3 (ja) |
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| SI (1) | SI0754761T1 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005080963A1 (ja) * | 2004-02-25 | 2005-09-01 | Fiamo Corporation | サンプル中の元素を定量又は半定量的に測定可能なフロー分析システム |
| KR20180137338A (ko) * | 2017-06-16 | 2018-12-27 | 대한민국(경찰청장) | 혈흔 탐지용 조성물 |
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|---|---|---|---|---|
| MXPA05013865A (es) * | 2003-07-25 | 2006-02-28 | Wyeth Corp | Formulaciones liofilizadas de cci-779. |
| CN112326636A (zh) * | 2020-10-26 | 2021-02-05 | 通山县金瑞生物科技研发中心 | 一种高灵敏度的ecl试剂盒及其制备方法 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU558939B2 (en) * | 1982-03-03 | 1987-02-12 | British Technology Group Limited | Enhanced luminescent and luminometric assay |
| EP0116454B1 (en) * | 1983-02-11 | 1987-04-29 | National Research Development Corporation | Enhanced luminescent or luminometric assay |
| GB8420053D0 (en) * | 1984-08-07 | 1984-09-12 | Secr Social Service Brit | Enhanced luminescent/luminometric assay |
| DE3545398A1 (de) * | 1985-12-20 | 1987-06-25 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur steigerung der quanten-ausbeute bei der oxidation von luminol durch peroxide in gegenwart von peroxidase |
| JP2558450B2 (ja) * | 1986-03-13 | 1996-11-27 | 和光純薬工業株式会社 | キサンチンオキシダ−ゼの安定化方法 |
| FR2602592B1 (fr) * | 1986-08-06 | 1989-06-30 | Alain Baret | Utilisation du systeme enzymatique xanthine-oxydase en immuno-analyse, procedes de dosage correspondants et coffrets de reactifs necessaires pour la mise en oeuvre de ces procedes. |
| GB9209571D0 (en) * | 1992-05-02 | 1992-06-17 | Kodak Clinical Diagnostics Ltd | Signal generating reagent |
| US5340714A (en) * | 1992-05-08 | 1994-08-23 | Monitor Diagnostics, Inc. | Use of nonmetallic tetrapyrrole molecules and novel signal solutions in chemiluminescent reactions and assays |
| US5279940A (en) * | 1992-08-03 | 1994-01-18 | Eastman Kodak Company | Chemiluminescent composition containing cationic surfactants or polymers and 4'-hydroxyacetanilide, test kits and their use in analytical methods |
| US5552298A (en) * | 1992-10-23 | 1996-09-03 | Lumigen, Inc. | Enzyme-catalyzed chemiluminescence from hydroxyaryl cyclic diacylhydrazide compounds |
| US5512451A (en) * | 1993-04-01 | 1996-04-30 | British Technology Group Limited | Enhancement of chemiluminescent reactions |
-
1995
- 1995-07-17 GB GBGB9514594.2A patent/GB9514594D0/en active Pending
-
1996
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- 1996-07-16 ES ES96305212T patent/ES2205001T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-07-16 DK DK96305212T patent/DK0754761T3/da active
- 1996-07-16 EP EP96305212A patent/EP0754761B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-07-16 JP JP18632096A patent/JP3863223B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1996-07-16 AT AT96305212T patent/ATE249519T1/de active
- 1996-07-16 DE DE69629880T patent/DE69629880T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-07-16 SI SI9630653T patent/SI0754761T1/xx unknown
- 1996-07-16 PT PT96305212T patent/PT754761E/pt unknown
- 1996-07-23 US US08/685,399 patent/US5846756A/en not_active Expired - Lifetime
-
2006
- 2006-05-31 JP JP2006151541A patent/JP2006242966A/ja active Pending
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| PT754761E (pt) | 2004-02-27 |
| EP0754761B1 (en) | 2003-09-10 |
| EP0754761A3 (en) | 1998-07-01 |
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