JPH09127091A - 糖化ヘモグロビンの測定方法 - Google Patents
糖化ヘモグロビンの測定方法Info
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- JPH09127091A JPH09127091A JP7285969A JP28596995A JPH09127091A JP H09127091 A JPH09127091 A JP H09127091A JP 7285969 A JP7285969 A JP 7285969A JP 28596995 A JP28596995 A JP 28596995A JP H09127091 A JPH09127091 A JP H09127091A
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- Japan
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- liquid chromatography
- packing material
- glycated hemoglobin
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 糖化ヘモグロビンを一層分離性良く短時間で
測定し得る液体クロマトグラフィー法による測定方法を
提供する。 【解決手段】 糖化ヘモグロビンを含有する試料を、カ
チオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤（Ａ）
（例、ＣＯＯＨ基をもつアクリル系ポリマー）と、上記
充填剤（Ａ）とは異なり、かつ上記充填剤（Ａ）の上記
糖化ヘモグロビンに対するクロマトグラムを改良し得る
カチオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤（Ｂ）
（例、ＳＯ3 Ｈ基をもつスチレン系ポリマー）とが一本
のカラムに充填されてなる液体クロマトグラフィー用カ
ラムに導入し、液体クロマトグラフィーを行うことを特
徴とする。
測定し得る液体クロマトグラフィー法による測定方法を
提供する。 【解決手段】 糖化ヘモグロビンを含有する試料を、カ
チオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤（Ａ）
（例、ＣＯＯＨ基をもつアクリル系ポリマー）と、上記
充填剤（Ａ）とは異なり、かつ上記充填剤（Ａ）の上記
糖化ヘモグロビンに対するクロマトグラムを改良し得る
カチオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤（Ｂ）
（例、ＳＯ3 Ｈ基をもつスチレン系ポリマー）とが一本
のカラムに充填されてなる液体クロマトグラフィー用カ
ラムに導入し、液体クロマトグラフィーを行うことを特
徴とする。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は液体クロマトグラフ
ィー法による糖化ヘモグロビンの測定方法に関する。
ィー法による糖化ヘモグロビンの測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】糖化ヘモグロビンは、赤血球中のヘモグ
ロビンが非酵素的に血液中のグルコースと反応して形成
される。糖化ヘモグロビンを測定することにより血液中
のグルコースの平均濃度がわかるため、糖化ヘモグロビ
ンの測定は糖尿病の診断に広く用いられている。この糖
化ヘモグロビンの測定は、主としてＨＰＬＣ（高速液体
クロマトグラフィー）によって行われている。このＨＰ
ＬＣでは、弱カチオン性イオン交換液体クロマトグラフ
ィー用充填剤が使用されており、例えば、特開昭５８−
２２１１６４号公報には、アクリル酸又はメタクリル酸
のエステルとアクリル酸又はメタクリル酸との共重合体
でなる充填剤、特開平２−３０９２５３号公報には、疎
水性架橋重合体粒子の表面部分に、アクリル酸及び／又
はメタクリル酸（共）重合体の層が形成された被覆重合
体粒子からなる充填剤などが開示されている。
ロビンが非酵素的に血液中のグルコースと反応して形成
される。糖化ヘモグロビンを測定することにより血液中
のグルコースの平均濃度がわかるため、糖化ヘモグロビ
ンの測定は糖尿病の診断に広く用いられている。この糖
化ヘモグロビンの測定は、主としてＨＰＬＣ（高速液体
クロマトグラフィー）によって行われている。このＨＰ
ＬＣでは、弱カチオン性イオン交換液体クロマトグラフ
ィー用充填剤が使用されており、例えば、特開昭５８−
２２１１６４号公報には、アクリル酸又はメタクリル酸
のエステルとアクリル酸又はメタクリル酸との共重合体
でなる充填剤、特開平２−３０９２５３号公報には、疎
水性架橋重合体粒子の表面部分に、アクリル酸及び／又
はメタクリル酸（共）重合体の層が形成された被覆重合
体粒子からなる充填剤などが開示されている。
【０００３】血液を溶血した試料を、上記のクロマトグ
ラフィーに導入すると、糖化ヘモグロビンであるヘモグ
ロビンＡ1a（ＨｂＡ1a）、ヘモグロビンＡ1b（Ｈｂ
Ａ1b）、ヘモグロビンＦ（ＨｂＦ）及びヘモグロビンＡ
1c（ＨｂＡ1c）並びに非糖化ヘモグロビンであるヘモグ
ロビンＡ0 （ＨｂＡ0 ）などのピークが出現する。これ
らのピークのうち、ＨｂＡ1cの値が糖尿病の診断に有効
であり、ＨｂＡ1cの測定値は上記の全ピークの面積の和
に対する、ＨｂＡ1cのピークの面積の割合として表さ
れ、健常人では約４〜６％とされている。
ラフィーに導入すると、糖化ヘモグロビンであるヘモグ
ロビンＡ1a（ＨｂＡ1a）、ヘモグロビンＡ1b（Ｈｂ
Ａ1b）、ヘモグロビンＦ（ＨｂＦ）及びヘモグロビンＡ
1c（ＨｂＡ1c）並びに非糖化ヘモグロビンであるヘモグ
ロビンＡ0 （ＨｂＡ0 ）などのピークが出現する。これ
らのピークのうち、ＨｂＡ1cの値が糖尿病の診断に有効
であり、ＨｂＡ1cの測定値は上記の全ピークの面積の和
に対する、ＨｂＡ1cのピークの面積の割合として表さ
れ、健常人では約４〜６％とされている。
【０００４】そこで、上記に開示されたような充填剤を
使用すると、糖化ヘモグロビンを良好に測定し得、その
結果は糖尿病の診断に広く使用され得るが、より一層精
度を高めるために、各ピーク、特にＨｂＡ1cピークの分
離性などのクロマトグラムの更なる改良が望まれてい
た。
使用すると、糖化ヘモグロビンを良好に測定し得、その
結果は糖尿病の診断に広く使用され得るが、より一層精
度を高めるために、各ピーク、特にＨｂＡ1cピークの分
離性などのクロマトグラムの更なる改良が望まれてい
た。
【０００５】ＨＰＬＣにおいて、各ピークの分離性、各
ピークの保持時間の短縮等のクロマトグラムを改良した
い場合、その方法としては、溶離液種類、測定温度また
はカラムサイズの変更など種々あるが、特に充填剤の改
良が最も効果的である。しかし、目的にあった充填剤を
新たに製造し、それを用いてクロマトグラムを改良する
ことは、他の方法に比べると煩雑であり容易なことでは
ない。
ピークの保持時間の短縮等のクロマトグラムを改良した
い場合、その方法としては、溶離液種類、測定温度また
はカラムサイズの変更など種々あるが、特に充填剤の改
良が最も効果的である。しかし、目的にあった充填剤を
新たに製造し、それを用いてクロマトグラムを改良する
ことは、他の方法に比べると煩雑であり容易なことでは
ない。
【０００６】また、液体クロマトグラフィーの分析手法
を簡便に改良する一方法として、２種類の充填剤を一本
のカラムに充填されてなるカラムを用いた手法が開示さ
れている。例えば、特開平６−２７３４０１号公報に
は、陽イオン交換基を備えた充填剤と陰イオン交換基を
備えた充填剤を一本のカラムに充填し、移動相としてア
ルカリ性溶液および酸性溶液を用い、これら両溶液を切
り替えてカラム内に流通させて各イオン種を別々に溶出
させて分析を行う、イオン交換液体クロマトグラフィー
による陽イオンおよび陰イオンの分析方法が開示されて
いるが、これは、カラムを交換することなく両方のイオ
ン種を分析して手法の簡便化を図るものであり、測定対
象試料のクロマトグラムの改良はなされていないし、ま
た、糖化ヘモグロビンのクロマトグラフィー測定に適用
されてもいない。
を簡便に改良する一方法として、２種類の充填剤を一本
のカラムに充填されてなるカラムを用いた手法が開示さ
れている。例えば、特開平６−２７３４０１号公報に
は、陽イオン交換基を備えた充填剤と陰イオン交換基を
備えた充填剤を一本のカラムに充填し、移動相としてア
ルカリ性溶液および酸性溶液を用い、これら両溶液を切
り替えてカラム内に流通させて各イオン種を別々に溶出
させて分析を行う、イオン交換液体クロマトグラフィー
による陽イオンおよび陰イオンの分析方法が開示されて
いるが、これは、カラムを交換することなく両方のイオ
ン種を分析して手法の簡便化を図るものであり、測定対
象試料のクロマトグラムの改良はなされていないし、ま
た、糖化ヘモグロビンのクロマトグラフィー測定に適用
されてもいない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記問題点
に鑑みてなされたものであり、その目的は、糖化ヘモグ
ロビンを一層分離性良く短時間で測定し得る液体クロマ
トグラフィー法による測定方法を提供することにある。
に鑑みてなされたものであり、その目的は、糖化ヘモグ
ロビンを一層分離性良く短時間で測定し得る液体クロマ
トグラフィー法による測定方法を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】請求項１記載の糖化ヘモ
グロビンの測定方法（以下、請求項１記載の発明を本発
明１という）は、糖化ヘモグロビンを含有する試料を、
カチオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤（Ａ）
と、上記充填剤（Ａ）とは異なり、かつ上記充填剤
（Ａ）の上記糖化ヘモグロビンに対するクロマトグラム
を改良し得るカチオン交換液体クロマトグラフィー用充
填剤（Ｂ）とが一本のカラムに充填されてなる液体クロ
マトグラフィー用カラムに導入し、液体クロマトグラフ
ィーを行うことを特徴とする。
グロビンの測定方法（以下、請求項１記載の発明を本発
明１という）は、糖化ヘモグロビンを含有する試料を、
カチオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤（Ａ）
と、上記充填剤（Ａ）とは異なり、かつ上記充填剤
（Ａ）の上記糖化ヘモグロビンに対するクロマトグラム
を改良し得るカチオン交換液体クロマトグラフィー用充
填剤（Ｂ）とが一本のカラムに充填されてなる液体クロ
マトグラフィー用カラムに導入し、液体クロマトグラフ
ィーを行うことを特徴とする。
【０００９】本発明１でいうクロマトグラムの改良と
は、例えば、各ピークの分離性、各ピークの保持時間の
短縮、ピークのシャープさなどを言う。
は、例えば、各ピークの分離性、各ピークの保持時間の
短縮、ピークのシャープさなどを言う。
【００１０】本発明１で使用される充填剤（Ａ）は、糖
化ヘモグロビンの分離に主に作用する充填剤であり、カ
チオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤に限定され
る。
化ヘモグロビンの分離に主に作用する充填剤であり、カ
チオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤に限定され
る。
【００１１】上記充填剤（Ａ）としては、カチオン交換
液体クロマトグラフィー用充填剤であれば特に制限はな
く、公知のいずれもが使用可能である。カチオン交換液
体クロマトグラフィー用充填剤とは、前述のカチオン交
換液体クロマトグラフィーに使用される充填剤のことで
あり、例えば、官能基として、−ＣＯＯＨ、−ＳＯ3Ｈ
などをもつ充填剤が挙げられる。充填剤（Ａ）の骨格の
素材としても、特に限定されず、有機系、無機系のいず
れも使用可能であり、有機系のものとしては、合成系、
天然系のいずれでもよい。上記合成系の素材としては、
例えば、アクリル系、スチレン系の高分子が挙げられ、
上記天然系の素材としては、例えば、セルロース系、キ
トサン系、ポリアミノ酸などが挙げられ、更に無機系の
ものとしては、例えば、シリカ、ジルコニア等が挙げら
れる。
液体クロマトグラフィー用充填剤であれば特に制限はな
く、公知のいずれもが使用可能である。カチオン交換液
体クロマトグラフィー用充填剤とは、前述のカチオン交
換液体クロマトグラフィーに使用される充填剤のことで
あり、例えば、官能基として、−ＣＯＯＨ、−ＳＯ3Ｈ
などをもつ充填剤が挙げられる。充填剤（Ａ）の骨格の
素材としても、特に限定されず、有機系、無機系のいず
れも使用可能であり、有機系のものとしては、合成系、
天然系のいずれでもよい。上記合成系の素材としては、
例えば、アクリル系、スチレン系の高分子が挙げられ、
上記天然系の素材としては、例えば、セルロース系、キ
トサン系、ポリアミノ酸などが挙げられ、更に無機系の
ものとしては、例えば、シリカ、ジルコニア等が挙げら
れる。
【００１２】本発明１で使用される充填剤（Ｂ）は、上
記充填剤（Ａ）とは異なり、かつ上記充填剤（Ａ）の糖
化ヘモグロビンに対するクロマトグラムを改良し得るカ
チオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤に限定され
る。上記充填剤（Ｂ）の選択範囲としては、上記のよう
に限定された範囲内のものであれば、公知のカチオン交
換液体クロマトグラフィー用充填剤のいずれの充填剤も
使用可能であり、具体的には、上述の充填剤（Ａ）に例
示されたものが挙げられる。また、充填剤（Ｂ）は、２
種以上混合されて使用されてもよい。
記充填剤（Ａ）とは異なり、かつ上記充填剤（Ａ）の糖
化ヘモグロビンに対するクロマトグラムを改良し得るカ
チオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤に限定され
る。上記充填剤（Ｂ）の選択範囲としては、上記のよう
に限定された範囲内のものであれば、公知のカチオン交
換液体クロマトグラフィー用充填剤のいずれの充填剤も
使用可能であり、具体的には、上述の充填剤（Ａ）に例
示されたものが挙げられる。また、充填剤（Ｂ）は、２
種以上混合されて使用されてもよい。
【００１３】充填剤（Ａ）と充填剤（Ｂ）の組合せとし
ては、充填剤（Ａ）と充填剤（Ｂ）の官能基が相違する
組合せがあり、具体的には、ＣＯＯＨ基をもつ充填剤と
ＳＯ 3 Ｈ基をもつ充填剤の組合せ、また、充填剤（Ａ）
と充填剤（Ｂ）の基本骨格が相違する組合せがあり、具
体的には、ＣＯＯＨ基をもつ高分子系充填剤とＣＯＯＨ
基をもつシリカ系充填剤との組合せ、ＣＯＯＨ基をもつ
アクリル系高分子充填剤とＣＯＯＨ基をもつスチレン系
高分子充填剤の組合せ、ＣＯＯＨ基をもつアクリル系高
分子充填剤同士の組合せにおいて、アクリル系高分子が
アクリル酸由来の高分子と、メタクリル酸由来の高分子
の組合せからなるものなどが挙げられる。
ては、充填剤（Ａ）と充填剤（Ｂ）の官能基が相違する
組合せがあり、具体的には、ＣＯＯＨ基をもつ充填剤と
ＳＯ 3 Ｈ基をもつ充填剤の組合せ、また、充填剤（Ａ）
と充填剤（Ｂ）の基本骨格が相違する組合せがあり、具
体的には、ＣＯＯＨ基をもつ高分子系充填剤とＣＯＯＨ
基をもつシリカ系充填剤との組合せ、ＣＯＯＨ基をもつ
アクリル系高分子充填剤とＣＯＯＨ基をもつスチレン系
高分子充填剤の組合せ、ＣＯＯＨ基をもつアクリル系高
分子充填剤同士の組合せにおいて、アクリル系高分子が
アクリル酸由来の高分子と、メタクリル酸由来の高分子
の組合せからなるものなどが挙げられる。
【００１４】充填剤（Ａ）と充填剤（Ｂ）の組合せとし
ては、さらに充填剤（Ａ）と充填剤（Ｂ）の官能基が同
じであり、基本骨格も同じであり、ただ充填剤（Ａ）と
充填剤（Ｂ）が同一物でない場合も含まれる。このよう
な場合としては、例えば、用いる素材が同一のもので
も、その使用量が異なる場合、或いはポリマー系の素材
の場合であって重合条件（重合温度、時間など）が異な
る場合など、処方が異なれば同一物でなく、このような
ものを組み合わせて充填剤（Ａ）のクロマトグラムを充
填剤（Ｂ）によって改良し得る場合である。
ては、さらに充填剤（Ａ）と充填剤（Ｂ）の官能基が同
じであり、基本骨格も同じであり、ただ充填剤（Ａ）と
充填剤（Ｂ）が同一物でない場合も含まれる。このよう
な場合としては、例えば、用いる素材が同一のもので
も、その使用量が異なる場合、或いはポリマー系の素材
の場合であって重合条件（重合温度、時間など）が異な
る場合など、処方が異なれば同一物でなく、このような
ものを組み合わせて充填剤（Ａ）のクロマトグラムを充
填剤（Ｂ）によって改良し得る場合である。
【００１５】充填剤（Ａ）と充填剤（Ｂ）の使用量の比
率は、用いる充填剤の種類により異なるが、通常、充填
剤（Ａ）と充填剤（Ｂ）の合計量中の充填剤（Ｂ）の含
有量は、５０重量％以下が好ましい。
率は、用いる充填剤の種類により異なるが、通常、充填
剤（Ａ）と充填剤（Ｂ）の合計量中の充填剤（Ｂ）の含
有量は、５０重量％以下が好ましい。
【００１６】本発明１で用いられるカラムは、従来から
液体クロマトグラフィー用カラムとして用いられている
ものであれば、特に制限されないが、直径１〜１０ｍ
ｍ、長さ２０〜１００ｍｍのステンレス管が好ましい。
液体クロマトグラフィー用カラムとして用いられている
ものであれば、特に制限されないが、直径１〜１０ｍ
ｍ、長さ２０〜１００ｍｍのステンレス管が好ましい。
【００１７】本発明１で用いられる液体クロマトグラフ
ィー用カラムを製造するには、一本のカラムに充填剤
（Ａ）と充填剤（Ｂ）を充填すればよい。充填順序とし
ては、充填剤（Ａ）及び充填剤（Ｂ）を混合してから充
填してもよいし、別々に充填（この場合は充填剤が多層
状態でカラム内に存在することになる）してもよい。ま
た、充填方法としては湿式充填法が好ましい。具体的に
は、分析に使用する溶離液等に、カラムサイズに見合っ
た量の充填剤を分散させてパッカーに移し、パッカーの
入口側にポンプ、出口側にカラムを接続し、定流量又は
定圧送液して充填する方法が挙げられる。
ィー用カラムを製造するには、一本のカラムに充填剤
（Ａ）と充填剤（Ｂ）を充填すればよい。充填順序とし
ては、充填剤（Ａ）及び充填剤（Ｂ）を混合してから充
填してもよいし、別々に充填（この場合は充填剤が多層
状態でカラム内に存在することになる）してもよい。ま
た、充填方法としては湿式充填法が好ましい。具体的に
は、分析に使用する溶離液等に、カラムサイズに見合っ
た量の充填剤を分散させてパッカーに移し、パッカーの
入口側にポンプ、出口側にカラムを接続し、定流量又は
定圧送液して充填する方法が挙げられる。
【００１８】本発明１で測定される糖化ヘモグロビンを
含有する試料としては、血液を溶血した試料が挙げられ
る。試料の採取方法としては、例えば、血液を抗凝固剤
を用いて採血後、界面活性剤を含む溶血試薬にて溶血さ
せる方法が挙げられる。また、通常、血液を溶血した試
料には、ヘモグロビンＡ1cとして、安定型ヘモグロビン
Ａ1cの他に不安定型ヘモグロビンＡ1cが含まれるが、ヘ
モグロビンＡ1cを糖尿病の指標として利用するために
は、不安定型ヘモグロビンＡ1cの混入は精度上好ましく
ないので、これを除去することができる。不安定型ヘモ
グロビンＡ1cの除去は、ポリリン酸水溶液のような不安
定型ヘモグロビンＡ1c除去試薬を試料に添加し、加温す
ることにより短時間で効率よく行うことができる。
含有する試料としては、血液を溶血した試料が挙げられ
る。試料の採取方法としては、例えば、血液を抗凝固剤
を用いて採血後、界面活性剤を含む溶血試薬にて溶血さ
せる方法が挙げられる。また、通常、血液を溶血した試
料には、ヘモグロビンＡ1cとして、安定型ヘモグロビン
Ａ1cの他に不安定型ヘモグロビンＡ1cが含まれるが、ヘ
モグロビンＡ1cを糖尿病の指標として利用するために
は、不安定型ヘモグロビンＡ1cの混入は精度上好ましく
ないので、これを除去することができる。不安定型ヘモ
グロビンＡ1cの除去は、ポリリン酸水溶液のような不安
定型ヘモグロビンＡ1c除去試薬を試料に添加し、加温す
ることにより短時間で効率よく行うことができる。
【００１９】本発明１の糖化ヘモグロビンの測定方法
は、測定に使用するカラムとして、上述の液体クロマト
グラフィー用カラムを使用することの他は、従来の液体
クロマトグラフィー法による糖化ヘモグロビンの測定方
法と同様である。以下、本発明１の糖化ヘモグロビンの
測定方法について詳述する。
は、測定に使用するカラムとして、上述の液体クロマト
グラフィー用カラムを使用することの他は、従来の液体
クロマトグラフィー法による糖化ヘモグロビンの測定方
法と同様である。以下、本発明１の糖化ヘモグロビンの
測定方法について詳述する。
【００２０】図１は、上述の液体クロマトグラフィー用
カラムを使用して糖化ヘモグロビンの分析をする際の装
置の構成の一例である。液体クロマトグラフィー用カラ
ム１に移動相２を送液ポンプ３により供給しながら、サ
ンプラー４から糖化ヘモグロビンを含有する試料を導入
する。液体クロマトグラフィー用カラム１によって分離
された試料は、検出器５よって検出され、その結果が記
録計６に記録される。
カラムを使用して糖化ヘモグロビンの分析をする際の装
置の構成の一例である。液体クロマトグラフィー用カラ
ム１に移動相２を送液ポンプ３により供給しながら、サ
ンプラー４から糖化ヘモグロビンを含有する試料を導入
する。液体クロマトグラフィー用カラム１によって分離
された試料は、検出器５よって検出され、その結果が記
録計６に記録される。
【００２１】上記移動相としては、ｐＨ５〜８の緩衝液
が好ましく、無機酸（リン酸など）、有機酸（クエン酸
など）及び／又はこれらの塩よりなる緩衝液などが用い
られ、緩衝液のｐＨ及びイオン強度を適当に調節するこ
とにより最良のクロマトグラムが得られる。移動相の通
液する速度（流速）は、一般に０．５〜５ｍｌ／ｍｉｎ
程度が選ばれる。
が好ましく、無機酸（リン酸など）、有機酸（クエン酸
など）及び／又はこれらの塩よりなる緩衝液などが用い
られ、緩衝液のｐＨ及びイオン強度を適当に調節するこ
とにより最良のクロマトグラムが得られる。移動相の通
液する速度（流速）は、一般に０．５〜５ｍｌ／ｍｉｎ
程度が選ばれる。
【００２２】上記の分離については、適当濃度の移動相
により、糖化ヘモグロビンがＨｂＡ 1a、ＨｂＡ1b、Ｈｂ
Ｆ、ＨｂＡ1cの順で、さらに非糖化ヘモグロビンである
ＨｂＡ0 が溶出されるが、ＨｂＡ1cより後の溶出物は、
糖尿病診断においては、不要なので、高濃度又は高ｐＨ
の移動相に切り替えて一度に溶出させてもよい。
により、糖化ヘモグロビンがＨｂＡ 1a、ＨｂＡ1b、Ｈｂ
Ｆ、ＨｂＡ1cの順で、さらに非糖化ヘモグロビンである
ＨｂＡ0 が溶出されるが、ＨｂＡ1cより後の溶出物は、
糖尿病診断においては、不要なので、高濃度又は高ｐＨ
の移動相に切り替えて一度に溶出させてもよい。
【００２３】上記の検出については、通常、４１５ｎｍ
の吸光度測定により行われる。
の吸光度測定により行われる。
【００２４】請求項２記載の糖化ヘモグロビンの測定方
法（以下、請求項２記載の発明を本発明２という）は、
本発明１において使用された液体クロマトグラフィー用
カラムの代わりに、カチオン交換液体クロマトグラフィ
ー用充填剤（Ａ）と、上記充填剤（Ａ）の糖化ヘモグロ
ビンに対するクロマトグラムを改良し得る、アニオン交
換液体クロマトグラフィー用充填剤、逆相分配液体クロ
マトグラフィー用充填剤、順相分配液体クロマトグラフ
ィー用充填剤及びヒドロキシアパタイトからなる群より
選ばれる少なくとも一種である液体クロマトグラフィー
用充填剤（Ｃ）とが一本のカラムに充填されてなる液体
クロマトグラフィー用カラムが使用されることの他は、
本発明１と同様である。
法（以下、請求項２記載の発明を本発明２という）は、
本発明１において使用された液体クロマトグラフィー用
カラムの代わりに、カチオン交換液体クロマトグラフィ
ー用充填剤（Ａ）と、上記充填剤（Ａ）の糖化ヘモグロ
ビンに対するクロマトグラムを改良し得る、アニオン交
換液体クロマトグラフィー用充填剤、逆相分配液体クロ
マトグラフィー用充填剤、順相分配液体クロマトグラフ
ィー用充填剤及びヒドロキシアパタイトからなる群より
選ばれる少なくとも一種である液体クロマトグラフィー
用充填剤（Ｃ）とが一本のカラムに充填されてなる液体
クロマトグラフィー用カラムが使用されることの他は、
本発明１と同様である。
【００２５】上記アニオン交換液体クロマトグラフィー
用充填剤としては、公知のアニオン交換液体クロマトグ
ラフィー用充填剤であれば、特に限定されず、例えば、
官能基として−ＮＲ2 、−ＮＲ3 、−ＮＲ4 （Ｒは水素
原子又はアルキル基）などをもつ充填剤が挙げられる。
用充填剤としては、公知のアニオン交換液体クロマトグ
ラフィー用充填剤であれば、特に限定されず、例えば、
官能基として−ＮＲ2 、−ＮＲ3 、−ＮＲ4 （Ｒは水素
原子又はアルキル基）などをもつ充填剤が挙げられる。
【００２６】上記逆相分配液体クロマトグラフィー用充
填剤としては、公知の逆相分配液体クロマトグラフィー
用充填剤であれば、特に限定されず、例えば、官能基と
してオクチル基、オクタデシル基のような直鎖アルキル
基をもつものや、フェニル基などをもつ充填剤が挙げら
れる。
填剤としては、公知の逆相分配液体クロマトグラフィー
用充填剤であれば、特に限定されず、例えば、官能基と
してオクチル基、オクタデシル基のような直鎖アルキル
基をもつものや、フェニル基などをもつ充填剤が挙げら
れる。
【００２７】上記順相分配液体クロマトグラフィー用充
填剤としては、公知の順相分配液体クロマトグラフィー
用充填剤であれば、特に限定されず、例えば、官能基と
して−ＮＨ2 、−ＣＮ、−ＯＨなどをもつ充填剤が挙げ
られる。
填剤としては、公知の順相分配液体クロマトグラフィー
用充填剤であれば、特に限定されず、例えば、官能基と
して−ＮＨ2 、−ＣＮ、−ＯＨなどをもつ充填剤が挙げ
られる。
【００２８】上記ヒドロキシアパタイトとしては、液体
クロマトグラフィー用として使用される公知のヒドロキ
シアパタイトであれば、特に限定されない。
クロマトグラフィー用として使用される公知のヒドロキ
シアパタイトであれば、特に限定されない。
【００２９】上記充填剤（Ｃ）の骨格の素材としても、
特に限定されず、例えば、前述の充填剤（Ａ）の骨格の
素材として例示したものが例示される。また、充填剤
（Ｃ）は、２種以上混合されて使用されてもよい。
特に限定されず、例えば、前述の充填剤（Ａ）の骨格の
素材として例示したものが例示される。また、充填剤
（Ｃ）は、２種以上混合されて使用されてもよい。
【００３０】本発明２においては、充填剤（Ａ）として
２種以上のカチオン交換液体クロマトグラフィー用充填
剤を使用することも可能であり、充填剤（Ａ）と充填剤
（Ｃ）の組合せの具体例として、ＣＯＯＨ基をもつアク
リル系ポリマーの充填剤とＣＯＯＨ基をもつスチレン系
ポリマーの充填剤とヒドロキシアパタイト充填剤の組合
せも可能である。
２種以上のカチオン交換液体クロマトグラフィー用充填
剤を使用することも可能であり、充填剤（Ａ）と充填剤
（Ｃ）の組合せの具体例として、ＣＯＯＨ基をもつアク
リル系ポリマーの充填剤とＣＯＯＨ基をもつスチレン系
ポリマーの充填剤とヒドロキシアパタイト充填剤の組合
せも可能である。
【００３１】充填剤（Ａ）と充填剤（Ｃ）の使用量の比
率は、用いる充填剤の種類により異なるが、通常、充填
剤（Ａ）と充填剤（Ｃ）の合計量中の充填剤（Ｃ）の含
有量は、５０重量％以下が好ましい。
率は、用いる充填剤の種類により異なるが、通常、充填
剤（Ａ）と充填剤（Ｃ）の合計量中の充填剤（Ｃ）の含
有量は、５０重量％以下が好ましい。
【００３２】本発明２で用いられるカラムは、上述の本
発明１のものと同様である。
発明１のものと同様である。
【００３３】本発明２で用いられる液体クロマトグラフ
ィー用カラムを製造するには、上述の本発明１で用いら
れる液体クロマトグラフィー用カラムの製造における、
充填剤（Ｂ）に代えて、充填剤（Ｃ）を用いることの他
は、本発明１と同様に行えばよい。
ィー用カラムを製造するには、上述の本発明１で用いら
れる液体クロマトグラフィー用カラムの製造における、
充填剤（Ｂ）に代えて、充填剤（Ｃ）を用いることの他
は、本発明１と同様に行えばよい。
【００３４】本発明２で測定される糖化ヘモグロビンを
含有する試料としては、本発明１のものと同様である。
含有する試料としては、本発明１のものと同様である。
【００３５】本発明２の糖化ヘモグロビンの測定方法
は、測定に使用するカラムとして、本発明１で使用され
る液体クロマトグラフィー用カラムの代わりに、上述の
本発明２で使用される液体クロマトグラフィー用カラム
を使用することの他は、本発明１と同様である。
は、測定に使用するカラムとして、本発明１で使用され
る液体クロマトグラフィー用カラムの代わりに、上述の
本発明２で使用される液体クロマトグラフィー用カラム
を使用することの他は、本発明１と同様である。
【００３６】本発明２で使用される移動相及び検出法に
ついても本発明１と同様である。
ついても本発明１と同様である。
【００３７】
【発明の実施の形態】以下、本発明の実施例を説明す
る。実施例における測定装置は、前記図１のように構成
して行った。なお、各装置は、以下のものを使用した。 送液ポンプ３：島津製作所社製、ＬＣ−９Ａ。 サンプラー４：オートサンプラー。積水化学工業社製、
ＡＳＵ−４２０。 検出器５：紫外可視分光光度計。島津製作所社製、ＳＰ
Ｄ−６ＡＶ。
る。実施例における測定装置は、前記図１のように構成
して行った。なお、各装置は、以下のものを使用した。 送液ポンプ３：島津製作所社製、ＬＣ−９Ａ。 サンプラー４：オートサンプラー。積水化学工業社製、
ＡＳＵ−４２０。 検出器５：紫外可視分光光度計。島津製作所社製、ＳＰ
Ｄ−６ＡＶ。
【００３８】実施例において使用した充填剤は、以下の
通りである。 充填剤 カチオン−１ 以下のように、特開平２−３０９２５３号公報の方法に
よりカチオン交換充填剤を製造した。ジエチレングリコ
ールジメタクリレート（新中村化学社製）２００ｇにベ
ンゾイルパーオキサイド（重合開始剤、和光純薬社製）
１ｇを溶解し、３重量％ポリビニルアルコール（日本合
成社製）水溶液に添加した。攪拌しながら窒素を導入
し、８０℃で２時間重合した。室温まで冷却した後、ア
クリル酸４０ｇを添加して再び８０℃に加熱して２時間
重合した。得られた粒子を水およびアセトンで順次、洗
浄し、乾燥した後、空気分級機（日鉄鉱業社製）で分級
して６〜８μｍの粒子を集め、これを充填剤カチオン−
１とした。充填剤カチオン−１は、官能基として−ＣＯ
ＯＨを有する。
通りである。 充填剤 カチオン−１ 以下のように、特開平２−３０９２５３号公報の方法に
よりカチオン交換充填剤を製造した。ジエチレングリコ
ールジメタクリレート（新中村化学社製）２００ｇにベ
ンゾイルパーオキサイド（重合開始剤、和光純薬社製）
１ｇを溶解し、３重量％ポリビニルアルコール（日本合
成社製）水溶液に添加した。攪拌しながら窒素を導入
し、８０℃で２時間重合した。室温まで冷却した後、ア
クリル酸４０ｇを添加して再び８０℃に加熱して２時間
重合した。得られた粒子を水およびアセトンで順次、洗
浄し、乾燥した後、空気分級機（日鉄鉱業社製）で分級
して６〜８μｍの粒子を集め、これを充填剤カチオン−
１とした。充填剤カチオン−１は、官能基として−ＣＯ
ＯＨを有する。
【００３９】充填剤 カチオン−２ 市販のカチオン交換充填剤（Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭ
Ｄ、メルク社製）。骨格の素材として、スチレン系ポリ
マーが使用され、官能基として−ＳＯ3 Ｈを有してい
る。
Ｄ、メルク社製）。骨格の素材として、スチレン系ポリ
マーが使用され、官能基として−ＳＯ3 Ｈを有してい
る。
【００４０】充填剤 アニオン−１ 市販のアニオン交換系充填剤（ＥＳ−５０２Ｎ、旭化成
社製）。骨格の素材として、ビニルアルコール系ポリマ
ーが使用され、官能基として−Ｎ（Ｃ2 Ｈ5 ） 2 を有し
ている。
社製）。骨格の素材として、ビニルアルコール系ポリマ
ーが使用され、官能基として−Ｎ（Ｃ2 Ｈ5 ） 2 を有し
ている。
【００４１】充填剤 逆相−１ 市販の逆相系充填剤（Ｍｉｃｒｏｎｅｘ ＲＰ−３０、
積水化学工業社製）。骨格の素材として、スチレン系ポ
リマーが使用され、官能基としてフェニル基を有してい
る。
積水化学工業社製）。骨格の素材として、スチレン系ポ
リマーが使用され、官能基としてフェニル基を有してい
る。
【００４２】充填剤 アパタイト−１ 市販のヒドロキシアパタイト系充填剤（ＨＣＡ−Ａ−４
００７、三井東圧化学社製）。
００７、三井東圧化学社製）。
【００４３】（実施例１〜４、比較例１） 液体クロマトグラフィー用カラムの製造 表１に示した充填剤（Ａ）と充填剤（Ｂ）又は充填剤
（Ｃ）とを、表１に示した使用量（ｇ）で３０ｍｌのリ
ン酸緩衝液（ｐＨ６）に分散した（比較例１は、充填剤
（Ａ）のみ使用）。内径６ｍｍ、長さ５０ｍｍのステン
レス製カラムを接続したパッカー（容量３０ｍｌ：梅谷
精機社製）に上記分散液を加え、送液ポンプ（島津製作
所社製、ＬＣ−６ＡＤ）をパッカーに接続して、定圧充
填を行ってカラムを製造した。
（Ｃ）とを、表１に示した使用量（ｇ）で３０ｍｌのリ
ン酸緩衝液（ｐＨ６）に分散した（比較例１は、充填剤
（Ａ）のみ使用）。内径６ｍｍ、長さ５０ｍｍのステン
レス製カラムを接続したパッカー（容量３０ｍｌ：梅谷
精機社製）に上記分散液を加え、送液ポンプ（島津製作
所社製、ＬＣ−６ＡＤ）をパッカーに接続して、定圧充
填を行ってカラムを製造した。
【００４４】
【表１】
【００４５】糖化ヘモグロビンの分離 健常人からフッ化ナトリウム採血後、界面活性剤及びポ
リリン酸を含む水溶液を添加して溶血及び不安定型ヘモ
グロビンの除去を行った。得られた試料を上記装置に上
記液体クロマトグラフィー用カラムを取りつけた装置に
導入して糖化ヘモグロビンの測定をした。溶出は、ｐＨ
５〜６のリン酸緩衝液を使用し、ｐＨ及びイオン強度を
調節して各実施例及び比較例で最良のクロマトグラムが
得られるようにした。また、ＨｂＡ1cより後の溶出物
は、移動相をｐＨ７、５００ｍＭのリン酸緩衝液に切り
替えて一度に溶出させた。実施例１で得られたクロマト
グラムを図２に、比較例１で得られたクロマトグラムを
図３に示した。なお、実施例２〜４のクロマトグラムも
実施例１のクロマトグラムとほぼ同様であった。なお、
図２及び３における各ピークは、１１ＨｂＡ1a及びＨｂ
Ａ1b、１２ＨｂＦ、１３ＨｂＡ1c、１４ＨｂＡ0 であ
る。
リリン酸を含む水溶液を添加して溶血及び不安定型ヘモ
グロビンの除去を行った。得られた試料を上記装置に上
記液体クロマトグラフィー用カラムを取りつけた装置に
導入して糖化ヘモグロビンの測定をした。溶出は、ｐＨ
５〜６のリン酸緩衝液を使用し、ｐＨ及びイオン強度を
調節して各実施例及び比較例で最良のクロマトグラムが
得られるようにした。また、ＨｂＡ1cより後の溶出物
は、移動相をｐＨ７、５００ｍＭのリン酸緩衝液に切り
替えて一度に溶出させた。実施例１で得られたクロマト
グラムを図２に、比較例１で得られたクロマトグラムを
図３に示した。なお、実施例２〜４のクロマトグラムも
実施例１のクロマトグラムとほぼ同様であった。なお、
図２及び３における各ピークは、１１ＨｂＡ1a及びＨｂ
Ａ1b、１２ＨｂＦ、１３ＨｂＡ1c、１４ＨｂＡ0 であ
る。
【００４６】
【発明の効果】本発明１の糖化ヘモグロビンの測定方法
の構成は上記の通りであり、糖化ヘモグロビンのクロマ
トグラムの改良がなされ得、糖化ヘモグロビンを一層分
離性良く短時間で測定し得る。また、本発明１の糖化ヘ
モグロビンの測定方法に使用される液体クロマトグラフ
ィー用カラムは、その製造が容易である。従って、本発
明１の糖化ヘモグロビンの測定方法は、簡便な方法でよ
り精度よく糖化ヘモグロビンを分析できる方法である。
の構成は上記の通りであり、糖化ヘモグロビンのクロマ
トグラムの改良がなされ得、糖化ヘモグロビンを一層分
離性良く短時間で測定し得る。また、本発明１の糖化ヘ
モグロビンの測定方法に使用される液体クロマトグラフ
ィー用カラムは、その製造が容易である。従って、本発
明１の糖化ヘモグロビンの測定方法は、簡便な方法でよ
り精度よく糖化ヘモグロビンを分析できる方法である。
【００４７】本発明２の糖化ヘモグロビンの測定方法の
構成は上記の通りであり、糖化ヘモグロビンのクロマト
グラムの改良がなされ得、糖化ヘモグロビンを一層分離
性良く短時間で測定し得る。また、本発明２の糖化ヘモ
グロビンの測定方法に使用される液体クロマトグラフィ
ー用カラムは、その製造が容易である。従って、本発明
２の糖化ヘモグロビンの測定方法は、簡便な方法でより
精度よく糖化ヘモグロビンを分析できる方法である。
構成は上記の通りであり、糖化ヘモグロビンのクロマト
グラムの改良がなされ得、糖化ヘモグロビンを一層分離
性良く短時間で測定し得る。また、本発明２の糖化ヘモ
グロビンの測定方法に使用される液体クロマトグラフィ
ー用カラムは、その製造が容易である。従って、本発明
２の糖化ヘモグロビンの測定方法は、簡便な方法でより
精度よく糖化ヘモグロビンを分析できる方法である。
【００４８】
【図１】本発明の糖化ヘモグロビンの測定を行う際の装
置の構成の一例である。
置の構成の一例である。
【図２】実施例１のクロマトグラムである。
【図３】比較例１のクロマトグラムである。
１ 液体クロマトグラフィー用カラム ２ 移動相 ３ 送液ポンプ ４ サンプラー ５ 検出器 ６ 記録計
Claims (2)
- 【請求項１】 糖化ヘモグロビンを含有する試料を、カ
チオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤（Ａ）と、
上記充填剤（Ａ）とは異なり、かつ上記充填剤（Ａ）の
上記糖化ヘモグロビンに対するクロマトグラムを改良し
得るカチオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤
（Ｂ）とが一本のカラムに充填されてなる液体クロマト
グラフィー用カラムに導入し、液体クロマトグラフィー
を行うことを特徴とする糖化ヘモグロビンの測定方法。 - 【請求項２】 糖化ヘモグロビンを含有する試料を、カ
チオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤（Ａ）と、
上記充填剤（Ａ）の上記糖化ヘモグロビンに対するクロ
マトグラムを改良し得る、アニオン交換液体クロマトグ
ラフィー用充填剤、逆相分配液体クロマトグラフィー用
充填剤、順相分配液体クロマトグラフィー用充填剤及び
ヒドロキシアパタイトからなる群より選ばれる少なくと
も一種である液体クロマトグラフィー用充填剤（Ｃ）と
が一本のカラムに充填されてなる液体クロマトグラフィ
ー用カラムに導入し、液体クロマトグラフィーを行うこ
とを特徴とする糖化ヘモグロビンの測定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP28596995A JP3561350B2 (ja) | 1995-11-02 | 1995-11-02 | 糖化ヘモグロビンの測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP28596995A JP3561350B2 (ja) | 1995-11-02 | 1995-11-02 | 糖化ヘモグロビンの測定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09127091A true JPH09127091A (ja) | 1997-05-16 |
| JP3561350B2 JP3561350B2 (ja) | 2004-09-02 |
Family
ID=17698317
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP28596995A Expired - Lifetime JP3561350B2 (ja) | 1995-11-02 | 1995-11-02 | 糖化ヘモグロビンの測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3561350B2 (ja) |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH09264889A (ja) * | 1996-03-28 | 1997-10-07 | Tosoh Corp | 液体クロマトグラフィーを用いた糖化ヘモグロビン測定装置のデータ処理方法 |
| JPH11295286A (ja) * | 1998-04-10 | 1999-10-29 | Sekisui Chem Co Ltd | ヘモグロビン類の測定方法 |
| JP2000146934A (ja) * | 1998-11-09 | 2000-05-26 | Sekisui Chem Co Ltd | 液体クロマトグラフィー用充填剤 |
| JP2006223960A (ja) * | 2005-02-16 | 2006-08-31 | Ken Hosoya | 多孔性シリカ連続体カラム |
| JP2007205871A (ja) * | 2006-02-01 | 2007-08-16 | Shiseido Co Ltd | 高速液体クロマトグラフィー用カラム及びそれを用いた分析方法 |
| JP2010236907A (ja) * | 2009-03-30 | 2010-10-21 | Sekisui Medical Co Ltd | ヘモグロビン類分離用カラム充填剤、ヘモグロビンＡ１ｃ及び異常ヘモグロビン類の測定方法、並びに、ヘモグロビン類分離用カラム充填剤の製造方法 |
| CN110314664A (zh) * | 2019-06-05 | 2019-10-11 | 南京亘闪生物科技有限公司 | 一种粒径单分散HbA1C离子交换色谱填料合成方法及其应用 |
-
1995
- 1995-11-02 JP JP28596995A patent/JP3561350B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH09264889A (ja) * | 1996-03-28 | 1997-10-07 | Tosoh Corp | 液体クロマトグラフィーを用いた糖化ヘモグロビン測定装置のデータ処理方法 |
| JPH11295286A (ja) * | 1998-04-10 | 1999-10-29 | Sekisui Chem Co Ltd | ヘモグロビン類の測定方法 |
| JP2000146934A (ja) * | 1998-11-09 | 2000-05-26 | Sekisui Chem Co Ltd | 液体クロマトグラフィー用充填剤 |
| JP2006223960A (ja) * | 2005-02-16 | 2006-08-31 | Ken Hosoya | 多孔性シリカ連続体カラム |
| JP2007205871A (ja) * | 2006-02-01 | 2007-08-16 | Shiseido Co Ltd | 高速液体クロマトグラフィー用カラム及びそれを用いた分析方法 |
| JP2010236907A (ja) * | 2009-03-30 | 2010-10-21 | Sekisui Medical Co Ltd | ヘモグロビン類分離用カラム充填剤、ヘモグロビンＡ１ｃ及び異常ヘモグロビン類の測定方法、並びに、ヘモグロビン類分離用カラム充填剤の製造方法 |
| CN110314664A (zh) * | 2019-06-05 | 2019-10-11 | 南京亘闪生物科技有限公司 | 一种粒径单分散HbA1C离子交换色谱填料合成方法及其应用 |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3561350B2 (ja) | 2004-09-02 |
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