JPH09264889A

JPH09264889A - 液体クロマトグラフィーを用いた糖化ヘモグロビン測定装置のデータ処理方法

Info

Publication number: JPH09264889A
Application number: JP8073981A
Authority: JP
Inventors: Shingo Fukunaga; 信吾福永; Masanobu Kasai; 正信笠井
Original assignee: Tosoh Corp
Current assignee: Tosoh Corp
Priority date: 1996-03-28
Filing date: 1996-03-28
Publication date: 1997-10-07
Anticipated expiration: 2016-03-28
Also published as: JP3496390B2

Abstract

(57)【要約】【課題】データ処理のためのベースライン設定作業で、
同一のしきい値を用いているために生じる、異なる濃度
の試料について本来求められるべきピーク面積値とデー
タ処理後の計算上の面積値のずれを解消する。【解決手段】クロマトグラムを規格化してピーク検出処
理を行うステップ、クロマトグラムの最大吸光度値に従
って重み付けを持ったスムージング処理を行うステッ
プ、ピーク面積計算のベースラインを第1 ピークのベー
スラインスタート時の吸光度で定め、等吸光度の線を全
てのピーク面積計算においてベースラインとするステッ
プ、各ピーク間の区切り点をピーク間で吸光度が最低と
なる時間で定め、等時刻の線によりピークを分割してそ
れぞれのピーク面積計算を行うステップ、及び、最終ピ
ーク（Ａ０ピーク）の終了点を糖化ヘモグロビン成分の
溶出開始からの時間で定め、等時刻の線により最終ピー
クを分割してピーク面積計算を行うステップ、の各ステ
ップを含むデータ処理方法により前記課題を解決する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、液体クロマトグラ
フィーを用いた糖化ヘモグロビン測定装置のデータ処理
方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】従来、血液中の糖化ヘモグロビン濃度
は、図１に示したような液体クロマトグラフィー装置を
用いて測定されている。まず、サンプリング部１で収集
された血液試料２中の糖化ヘモグロビン成分は、陽イオ
ン交換樹脂を充填したカラムからなる液体クロマトグラ
フィーの分離系３にいったん吸着し、夾雑物と分離され
た後、溶離液により分離系外に溶出する。溶出した成分
については検出器４により吸光度変化として検出され
る。

【０００３】以上のような従来の測定方法により得られ
たクロマトグラム（溶出成分による、溶出時間に依存し
た吸光度の変化）の一例として、標準的な試料のクロマ
トグラムを図２に示す。図２に示したように、測定され
たクロマトグラム中には、血液中の糖化ヘモグロビンの
構成成分に応じた幾つかのピークが存在する。例えばＡ
１ｃピークは、ヘモグロビンのベータ鎖のＮ末端にグル
コースが付加した成分に対応したピークであり、Ａ０ピ
ークは、非糖化ヘモグロビンの成分に対応したピークで
ある。

【０００４】クロマトグラムデータは図１におけるＡ／
Ｄ変換器５によりデジタル信号に変換された後、ＣＰＵ
６によりデータ処理される。

【０００５】最終的にＣＰＵを含むデータ処理部６で
は、図３に示したようなピーク検出処理方法により各ピ
ークのピーク面積を求め、糖尿病に関する各種診断のた
めの情報を提供する。

【０００６】各ピークのピーク面積を求めるため、従来
は、図３に示したようにまず面積計算を行うためのベー
スラインを設定する。クロマトデータ各点の微分値、即
ち接線の傾きを計算し、微分値があらかじめ定めたしき
い値（正の値）より大きくなった点をベースラインスタ
ート点とし、同様に微分値があらかじめ定めたしきい値
（負の値）より小さくなった点をベースラインエンド点
とする。このベーラインスタート点とベースラインエン
ド点を結ぶ直線をピークのベースラインとし、クロマト
データ曲線とベースラインに囲まれた領域の面積をこの
ピークのピーク面積値とするのである。

【０００７】さらに、図４に示すように２つ以上のピー
クが重なりあっている場合は、ピークとピークの間の最
下点がベースラインスタート点を通る、あらかじめ定め
られた傾きの直線（例えば図中、破線で示した直線）よ
り上に位置するか又は下に位置するかにより、ベースラ
インを変え、面積計算を行うのである。即ち、最下点が
上記直線より下に位置する場合（向かって左側の場合）
はこの最下点を第１ピーク（左側のピーク）のベースラ
インエンド点及び第２ピーク（右側のピーク）のベース
ラインスタート点とし、第２ピークのベースエンド点を
単一ピークの場合と同様に決定するのである。一方、最
下点が上記直線より上側に位置する場合（向かって右側
の場合）はベースラインを第１ピーク（左側のピーク）
と第２ピーク（右側のピーク）で共通とし、ベースライ
ンエンド点を第２ピークにおいて単一ピークの場合と同
様に決定して最下点からベースラインに垂直におろした
直線を第１ピークと第２ピークの境界線とするのである
（以下、本明細書において最下点が上記直線より上側に
位置する場合のデータ処理方法を谷切りピーク処理と記
載する）。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】上述のような従従来の
データ処理方法には種々課題があった。一般に、血液中
のヘモグロビン濃度には個人差があり、各成分の絶対濃
度は個人により異なるが、液体クロマトグラフィーを用
いた糖化ヘモグロビン測定装置による糖尿病診断におい
ては、血液中の全ヘモグロビン濃度に対するＡ１ｃ等の
成分の濃度比（ピーク面積比）用いて診断が行われてい
るために、成分比率が同一で濃度が異なる場合でも同一
の濃度比率を与えなければならない。

【０００９】しかし、従来のデータ処理のためのベース
ライン設定作業では、ベースラインスタート点及びベー
スラインエンド点を微分値から決定するためのしきい値
が異なる濃度の試料に対しても同一であったため、本来
求められるべきピーク面積値とのずれが発生することが
あったのである。

【００１０】例えば、理想的なガウス曲線のピークＹ＝
Ｃ・ｅｘｐ（−０．００１・Ｘ・Ｘ）を仮定し、ピーク
高さ１のピークＡ（つまりＣ＝１）とピーク高さ１０の
ピークＢ（つまりＣ＝１０）に対し、同一のしきい値
０．００１でベースラインスタート点を、同一のしきい
値−０．００１でベースラインエンド点を決定すると、
以下の表の様に本来求められるべき理論的面積比とのず
れが発生する。

【００１１】

【表１】

【００１２】また、先に示した図２に示されたように、
糖化ヘモグロビンのクロマトグラムにおいては、通常、
複数のピークが重なりあって測定されるため、多くのピ
ークで谷切りピークをするか否かを決定するためのあら
かじめ定めた直線が異なる濃度の試料に対しても同一で
あったため、本来求められるべきピーク面積値とのずれ
が発生することがあったのである。

【００１３】以上に説明した、データ処理結果の真の面
積とのずれは、理想的なガウス曲線であっても生じるも
のであるが、実際の測定データにはノイズ成分（ピー
ク）が含まれるため、糖化ヘモグロビン濃度が低い場合
には信号のＳ／Ｎ比が低くなり、ずれが生じる可能性が
高くなる。

【００１４】更に、実際の糖化ヘモグロビン測定におい
ては、例えば図５に示したように、クロマトグラムの最
後に出現する全ピーク面積の９０％を占めるＡ０と呼ば
れる成分由来のピークの最後の部分が、同一の試料であ
ってもカラムの劣化や溶離液濃度の微妙な変化などによ
って実線のようになったり、破線のようになったりす
る。図５のようにＡ０ピークを含んで谷切りピーク処理
を行う場合、Ａ０以外のピーク形状が変化ししていなく
とも、Ａ０ピーク最後の部分の変化によりベースライン
エンド点が大きく変化し、全体のベースラインが移動し
てしまう。この結果、ベースラインを共有しているＡ０
以外の他のピークに対する処理が影響され、ピーク形状
が変化していないのであるから面積値は変わらないはず
のピークの面積値が変化してしまうという課題が発生す
る。

【００１５】しかも、通常Ａ０ピークは他のピークに比
べて面積が約１０〜５０倍大きいため、このベースライ
ン変動により変化する面積はＡ０ピークの場合無視でき
る程度のものであるが、微量成分であるＡ１ｃ等、糖尿
病診断に重要なピークの面積値の変化を無視することは
できない。

【００１６】

【課題を解決するための手段】本発明は、上記課題に鑑
みてなされたものであり、その目的は幅広い糖化ヘモグ
ロビン濃度分布を持った試料に対して正確で且つ再現性
のあるＡ１ｃ面積比などの成分面積比を与えるデータ処
理方法を提供することにある。

【００１７】即ち本発明は、血液試料を液体クロマトグ
ラフィーに供して吸光度クロマトグラフを得、当該クロ
マトグラム中の溶出ピークの全面積と目的成分である糖
化ヘモグロビンのピーク面積の比を求める液体クロマト
グラフィーを用いた糖化ヘモグロビン測定装置のデータ
処理方法であって、（Ａ）クロマトグラムを規格化して
ピーク検出処理を行うステップ、（Ｂ）クロマトグラム
の最大吸光度値に従って重み付けを持ったスムージング
処理を行うステップ、（Ｃ）ピーク面積計算のベースラ
インを第1 ピークのベースラインスタート時の吸光度で
定め、等吸光度の線を全てのピーク面積計算においてベ
ースラインとするステップ、（Ｄ）各ピーク間の区切り
点をピーク間で吸光度が最低となる時間で定め、等時刻
の線によりピークを分割してそれぞれのピーク面積計算
を行うステップ、及び（Ｅ）最終ピークの終了点を試料
注入からの時間で定め、等時刻の線により最終ピークを
分割してピーク面積計算を行うステップ、の各ステップ
を含むことを特徴とする方法である。以下本発明を詳細
に説明する。

【００１８】本発明の規格化のステップは、液体クロマ
トグラフィーによって得られたクロマトグラムデータの
最小値と最大値の差をＸとし、全体のクロマトグラムを
最小値が０、最大値がＡとなるように以下の式に従って
規格化する。

【００１９】

【数１】

【００２０】液体クロマトグラフィーを用いた糖化ヘモ
グロビン測定装置により得られるクロマトグラムは、通
常、図２に示すように、全面積の９０％程度を占めるＡ
０といわれる成分の前に、全面積の数％を占めるＡ１ｃ
等の微小ピークが観察される。このため通常は、式１の
ＸはほぼＡ０ピーク高さに等しく、全面積値にほぼ比例
した値となる。従って、この規格化により、血液中の糖
化ヘモグロビン全体の濃度により面積値に生じる誤差が
ほぼ完全に除去され、糖尿病診断において使用する全面
積に対するこれら微小ピークの比率（％）を正確かつ再
現性よく求めることが可能となる。

【００２１】規格化を行った後、この規格化データに対
し、Ｘの大きさによって重み付けを持ったスムージング
処理を行う。スムージング処理は、ノイズ削減を目的に
ローパスフィルタを用いて行うが、重み付けはＸが小さ
いほどローパスフィルタのカットオフ周波数を低く、ま
たはカットオフの減衰率を大きくして、元データのＳ／
Ｎが低い程Ｓ／Ｎを大きく改善し、Ｘの値によるＳ／Ｎ
比の違いを小さくするものである。

【００２２】重み付けの方法は、ローパスフィルタの種
類とＸの値のばらつきに応じて決定すれば良いが、好ま
しくは１段階、即ち重み付けを必要としない場合、さら
に好ましくは２段階以上の複数の段階を設けると良い。

【００２３】一般にローパスフィルタは、データ中のカ
ットオフ周波数より高い周波数成分を減衰させることに
よりデータのＳ／Ｎ比を改善し、スムージングを行うた
めに使用される。即ち、一般の液体クロマトグラフィー
分析においては、ノイズに起因する周波数成分は、クロ
マトグラムピークに起因した周波数成分より高周波数側
にあるため、ローパスフィルタのカットオフ周波数とし
てこのクロマトグラムピークに起因した周波数成分のほ
とんどが入る周波数を選択することにより、クロマトグ
ラムのピークにほとんど影響を与えることなくノイズ成
分のみを減衰させることができるのである。また、高周
波数成分に対する減衰率はフィルタの特性によるため、
高い減衰率を持つフィルタを使用すればそれだけノイズ
除去効果を高くすることができる。

【００２４】前述のように規格化したデータに関して
は、同じノイズ幅を持った生データに対し、Ｘの値によ
り係数を掛けることになるので、Ｘの値が大きいほどノ
イズは小さくなり、Ｘの値が小さいほど大きくなる。従
って、異なる濃度試料の規格化データに対し同じＳ／Ｎ
比で面積計算を行うためには、Ｘの値が大きくノイズが
小さい時には減衰率の低いフィルタを、Ｘの値が小さく
ノイズが大きい時には減衰率の高いローパスフィルタと
いうように、Ｘの値によって異なる重み付けを行う。こ
の重みの段階は、Ｘの値のバラツキによって定めれば良
く、Ｘの値の範囲が狭いときは１段階、即ち重み付けを
行う必要はないが、Ｘの値の範囲が広ければ、２段階以
上の複数の減衰率を持ったローパスフィルタを使用する
ことが好ましい。

【００２５】規格化データにスムージングを施したデー
タに対して一次微分値を計算し、あらかじめ定めたしき
い値を越えた点を第１ピークのベースラインスタート点
とし、ベースラインはこのスタート点から水平に、即ち
当該ベースラインスタート点の吸光度を決定し、これと
等しい吸光度の線を全てのピーク面積計算においてベー
スラインとする。このしきい値は通常Ａ×０．０００３
（１／分）程度とすれば良いが、Ａ×１０^-5〜Ａ×１０
^-2（１／分）とすることでベースラインを最適化するこ
とが可能であり、好ましい。

【００２６】規格化したデータからベースラインスター
ト点を決定することにより、ベースラインスタート点は
Ｘの値によらず正確に決定される。更に、ベースライン
を等しい吸光度とする（水平に引く）ことにより、仮
に、Ａ０の最後のピーク形状が変化したとしてもベース
ラインは変化しなくなる。

【００２７】第２ピーク以降のピーク間は、ピークとピ
ークの間で吸光度が最小となる時間を定め、等時刻の線
でそれぞれを分割する。そして、この等時刻の線とベー
スラインで囲まれた各ピークの面積を計算する。得られ
た面積値は、規格化で使用したパラメータＸ、Ａを用
い、以下の式に従って規格化前の単位に換算する。ただ
し、このステップは面積値を得るためにのみ必要なステ
ップであり、各ピークの面積比のみ得られれば良いので
あれば不要である。

【００２８】

【数２】

【００２９】糖化ヘモグロビン測定により得られるクロ
マトグラムでは、Ａ０ピークが最後に出現する。このピ
ークは、前述の通り、微妙なカラム劣化や溶離液の変性
によりピークの最終点が変化する。このため本発明で
は、最終ピークの終了点を糖化ヘモグロビン成分がカラ
ムから溶出し始めて後一定の時間とし、等時刻の線によ
り最終ピークを分割してピーク面積計算を行う。該一定
の時間は、糖化ヘモグロビン測定を行う液体クロマトグ
ラフィー条件で標準試料を測定し、得られたクロマトグ
ラムにおいてＡ０ピークの溶出が完全に終了した段階と
なるように定めれば良く、カラムの容量、カラムから糖
化ヘモグロビン成分を溶出させるための溶離液の種類、
更には溶離液の送液スピード等により適宜決定する。例
えば、容量０．６ｍｌのカラムに陽イオン交換樹脂を充
填し、コハク酸等の緩衝液を１．５ｍｌ／分程度で送液
する場合には、カラムへの目的成分の溶離液の送液開始
から２．２分程度とすることが例示できる。

【００３０】なお、以上に述べたように（Ａ）規格化の
ためのステップ、（Ｂ）スムージングのためのステッ
プ、（Ｃ）ベースライン設定のためのステップ、（Ｄ）
各ピークの境界線を設定するためのステップ、（Ｅ）最
終ピーク（Ａ０ピーク）分割のためのステップを含む
が、これらのステップは必ずしもその順序に従って実施
する必要はなく、（Ａ）及び（Ｂ）のステップが、
（Ｃ）及び（Ｄ）のステップに先立って実施されれば特
別の制限はない。

【００３１】

【発明の効果】本発明によれば、濃度が異なる試料につ
いて常に同じ条件でクロマトグラムのデータ処理を行う
ことができるため、幅広い糖化ヘモグロビン濃度分布を
持っている人血試料に対して正確かつ再現性のあるピー
ク面積計算が可能である。この結果、糖尿病診断に用い
られるＡ１ｃ等の面積比を用いた診断パラメータについ
ても、正確かつ再現性のある結果を提供することが可能
である。

【００３２】また、微妙なカラム劣化や溶離液の変性が
あった場合でも、糖尿病診断の際に重要なＡ１ｃなどの
微小ピークの面積値に与える影響を最小限に抑えること
が可能であり、結果として糖尿病診断に用いるＡ１ｃピ
ークの面積比を正確かつ再現性をもって提供することが
可能である。

【００３３】

【発明の実施の形態】以下、本発明を図面に基づき更に
詳細に説明するが、本発明はこれら図面に記載された発
明に限定されるものではない。

【００３４】図１は糖化ヘモグロビン測定装置の構成を
示す図である。本発明は、図１中のＣＰＵ６（データ処
理部）でのデータ処理方法に関するものであり、装置は
従来のものを使用することが可能である。図１に示した
ように、サンプリング部１で収集された血液試料２中の
糖化ヘモグロビン成分は、陽イオン交換樹脂を充填した
カラムからなる液体クロマトグラフィーの分離系３にい
ったん吸着し、夾雑物と分離された後、溶離液により分
離系外に溶出する。溶出した成分については検出器４に
より吸光度変化として検出される。そして、得られたク
ロマトグラムデータはＡ／Ｄ変換器５によりデジタル信
号に変換された後、ＣＰＵ６によりデータ処理される。

【００３５】本発明のデータ処理方法を実施するため
の、ＣＰＵ６（データ処理部）におけるフローチャート
を図６に示す。ＣＰＵ６（データ処理部）では、まず、
データ中の最大値及び最小値を求め、Ｘ、即ち最大値と
最小値の差を計算し、続いて先に説明した式１を用いて
規格化を行う。規格化のパラメータＡは、例えばＡ＝１
００等であるが、面積計算を整数演算で行う場合にはＡ
＝１００００００等、ＣＰＵの演算能力等に応じて変更
する。

【００３６】次に、デジタルフィルタ（ローパスフィル
タ）を用いて、カットオフ周波数約０．０１４［Ｈｚ］
でノイズ除去を行い、スムージング処理を行う。カット
オフ周波数は、例えば着目するピークの時間幅が２倍の
場合には半分程度とする等、クロマトグラム中の着目す
るピークの周波数成分に応じて変更すれば良い。

【００３７】次に、データの微分値があらかじめ定めら
れた値を越えた点をベースラインスタート点とし、この
点の吸光度値と等しい吸光度線を引いて全てのピークの
ベースラインとする。図２等を参照すれば明瞭である
が、等しい吸光度の線を引くことは、水平な線を引くこ
とに他ならない。なお、このステップにおけるしきい値
は任意に決定することができるが、通常Ａ×０．０００
３（１／分）程度とすれば良く、Ａ×１０^-5〜Ａ×１０
^-2（１／分）とすることでベースラインを最適化するこ
とが可能である。

【００３８】次に、各ピーク間で吸光度が最低となる時
間を定め、等時刻の線によりピークを分割する。図２等
を参照すれば明瞭であるが、等しい時刻の線を引くこと
は、垂直な線を引くことに他ならない。この結果、先に
引いたベースラインとこのステップで引く各ピークの境
界線は垂直に交わることになる。

【００３９】図６には示していないが、最終ピーク（Ａ
０ピーク）の終了点は糖化ヘモグロビン成分の溶出開始
からの時間で定め、等時刻の線により最終ピークを分割
する。

【００４０】以上のようにして分割された各ピークにつ
いてその面積を計算し、比を求める。必要に応じて面積
値を計算する場合には、前記式２に各パラメータを代入
すれば良い。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、全自動糖化ヘモグロビン測定装置の構
成を図示したものである。

【図２】図２は、標準試料について適切な糖化ヘモグロ
ビン測定が行われた場合に得られるクロマトグラムを示
す図である。

【図３】図３は、従来のピーク検出データ処理方法を示
す図である。

【図４】図４は、従来の、２つ以上ピークが重なった場
合のピーク検出データ処理方法を示す図である。

【図５】図５は、従来の、Ａ０ピークの形状が変化した
場合に発生する課題を説明するための図である。

【図６】図６は、本発明のデータ処理方法のフローチャ
ートを示す図である。

【符号の説明】

１サンプリング部２血液試料３陽イオン交換樹脂を充填したカラムからなる液体ク
ロマトグラフィーの分離系４検出器５Ａ／Ｄ変換器６ＣＰＵ（データ処理部）

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｇ０１Ｎ 30/86 Ｇ０１Ｎ 30/86 Ｆ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】血液試料を液体クロマトグラフィーに供し
て吸光度クロマトグラフを得、当該クロマトグラム中の
溶出ピークの全面積と目的成分である糖化ヘモグロビン
のピーク面積の比を求める液体クロマトグラフィーを用
いた糖化ヘモグロビン測定装置のデータ処理方法であっ
て、（Ａ）クロマトグラムを規格化してピーク検出処理
を行うステップ、（Ｂ）クロマトグラムの最大吸光度値
に従って重み付けを持ったスムージング処理を行うステ
ップ、（Ｃ）ピーク面積計算のベースラインを第1 ピー
クのベースラインスタート時の吸光度で定め、等吸光度
の線を全てのピーク面積計算においてベースラインとす
るステップ、（Ｄ）各ピーク間の区切り点をピーク間で
吸光度が最低となる時間で定め、等時刻の線によりピー
クを分割してそれぞれのピーク面積計算を行うステッ
プ、及び、（Ｅ）最終ピーク（Ａ０ピーク）の終了点を
糖化ヘモグロビン成分の溶出開始からの時間で定め、等
時刻の線により最終ピークを分割してピーク面積計算を
行うステップ、の各ステップを含むことを特徴とする方
法。
【請求項２】液体クロマトグラフィーが陽イオン交換体
を充填したカラムを用いるものであることを特徴とする
請求項１のデータ処理方法。
【請求項３】カラム容量が約０．６ｍｌであり、カラム
に対する送液が１．５ｍｌ／分の液体クロマトグラフィ
ーであることを特徴とする請求項２のデータ処理方法。
【請求項４】血液試料中の糖化ヘモグロビンを陽イオン
交換樹脂が充填されたカラムに吸着させるための緩衝液
が５０ｍＭ以下のコハク酸であり、カラムに吸着した糖
化ヘモグロビンを溶出させるための緩衝液が０．１〜
０．５Ｍのコハク酸であることを特徴とする請求項２の
データ処理方法。