JPH09210907A - 走査型蛍光検出装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 光検出器のパルスペア分解能および量子ノイ
ズの双方の問題を排除して、試料に含まれる蛍光物質か
ら発生する蛍光の分布を短時間に精度よく測定する。 【解決手段】 走査機構８４によって走査される試料８
６に励起光が照射されて発生した蛍光は、光検出器１０
に入射し、その光量に応じた光電子数分布に従った個数
の光電子が放出されて増倍された電流信号が出力され
る。その電流信号は積分器２０により一定時間積分され
て電圧信号に変換され、その電圧信号はＡＤ変換器５０
によりデジタル値に変換され、ヒストメモリ６０により
照射位置ごとに電圧信号の波高分布が生成される。照射
位置ごとの波高分布と単一光電子事象波高分布とk-光電
子事象波高分布とに基づいて、照射位置それぞれについ
て蛍光を光検出器１０が受光した場合の光電子数分布が
推定されて蛍光の光量が求められ、そして、試料８６に
おける蛍光の光量分布が求められる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、例えば生化学等の
分野において、励起光で励起された試料から発生する蛍
光の光量を、励起光または試料を走査しながら測定し
て、その試料中の蛍光分子数の分布を定量測定する走査
型蛍光検出装置に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】従来より、走査手段を利用して試料中の
蛍光物質（或いは、蛍光分子）の分布を定量測定する装
置として、レーザ顕微鏡、フローサイトメトリー、キャ
ピラリ電気泳動、光プローブ顕微鏡などが、様々な分野
で幅広く活用されている。このような走査型蛍光検出装
置は、走査手段を有しており、試料中の蛍光物質を励起
するための励起光を走査したり、励起光を出力する励起
光源を走査したり、あるいは、試料を走査したりしてい
る。このような走査手段と試料から発生した蛍光を検出
する手段とを組み合わせて、試料の蛍光発生分布、ある
いは、走査に対する時間的な蛍光光量変化を計測する。

【０００３】このような走査手段を有する蛍光検出装置
では、蛍光発生分布を求めようとする試料の走査範囲
と、その走査範囲全体について蛍光発生分布を測定する
に要する走査時間との兼ね合いが問題となる。すなわ
ち、広い走査範囲を短い走査時間で測定することが望ま
れるのであるが、両者は相反するものであるので、走査
範囲と走査時間とは適当な処で妥協する必要がある。

【０００４】例えば、レーザ顕微鏡の場合、レーザ光走
査により試料の各位置から発生した蛍光を測定して蛍光
発生分布を表す画像を構成する。その画像の１画素あた
りの蛍光測定時間は、１μ秒ないし１０μ秒程度であり
短い。このことは、走査範囲全体を走査する時間を考慮
すると、効率の悪い蛍光検出を行なっていることにな
る。

【０００５】特に、蛍光が微弱である場合には、１画素
あたりのＳ／Ｎ比が悪くなって大きな問題となる。光検
出器で蛍光を直流的に検出する場合には、Ｓ／Ｎ比が極
めて悪くなるので、蛍光の光量を測定することができな
い。そこで、Ｓ／Ｎ比を改善するために、入射する個々
の光子に対応して光検出器から出力されるパルスの個数
を計数する、いわゆる光子計数法によって蛍光を測定す
ることが行なわれている。この光子計数法による蛍光測
定であっても、１画素あたりの蛍光検出時間が短いこと
から、Ｓ／Ｎ比の改善の為に走査を多数回行なって蛍光
分布を測定する。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】しかし、このようにし
ても、試料から発生する蛍光が微弱である場合には依然
として以下のような問題点がある。

【０００７】光子計数法による光量測定においては、光
検出器の特性であるパルスペア分解能が問題となる。す
なわち、略同時刻に或いは短い時間間隔で連続して２個
以上の光子が光検出器に入射したにも拘らず、その光検
出器から１個のパルスしか出力されないことがある。こ
のことは、入射した２個以上の光子について１個としか
計数しないので数え落としが生じ、入射した光束の光量
を正確に測定することができないことを意味する。この
現象は、光量の大きい励起光が試料に照射されて光量の
大きい蛍光が発生した場合に発生し易い。

【０００８】このような入射した光子の数え落としが生
じないようにするには、励起光光量を小さくして蛍光光
量を小さくすればよい。しかし、蛍光光量が小さくなる
と、今度は、光検出器が蛍光を検出する確率が低くなっ
て、また、蛍光検出時間が短いことにも因って、光検出
器で得られる測定値は量子ノイズに埋もれて、Ｓ／Ｎ比
が悪くなる。そして、この量子ノイズの影響を低減して
Ｓ／Ｎ比を改善する為には、長時間かけて走査回数を増
やす必要がある。

【０００９】以上のように、試料の走査範囲全体の蛍光
発生分布を短時間に測定する為に１画素あたりの蛍光測
定を極めて短い時間に行なうことが望まれる走査型蛍光
検出装置にあっては、励起光光量が大きければ光検出器
のパルスペア分解能の問題が発生し、一方、励起光光量
が小さければ量子ノイズの問題が発生する。パルスペア
分解能および量子ノイズそれぞれの問題を考慮して、適
当な処で妥協して励起光光量を決定する必要がある。し
かし、その適切な励起光光量の決定は困難であり、ま
た、妥協して決定した励起光光量であってもパルスペア
分解能および量子ノイズそれぞれの問題は依然として存
在する。

【００１０】本発明は、上記問題点を解消する為になさ
れたものであり、光検出器のパルスペア分解能および量
子ノイズの双方の問題を排除して、試料に含まれる蛍光
物質から発生する蛍光の分布を短時間に精度よく測定す
ることができる走査型蛍光検出装置を提供することを目
的とする。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明に係る走査型蛍光
検出装置は、(1) 励起光を出力する励起光源と、(2)励
起光が照射される試料および励起光の少なくとも何れか
一方を、励起光の光軸に略垂直な方向に走査して、試料
上の照射位置それぞれに励起光を一定時間以上照射させ
るとともに、照射位置に応じた照射位置信号を出力する
走査手段と、(3) 照射位置それぞれから発生した蛍光を
受光し、蛍光の光量に応じた光電子数分布に従った個数
の光電子を放出し、光電子を増倍して電流信号を出力す
る光検出器と、(4) 照射位置それぞれにおいて、電流信
号を一定時間積分して電圧信号に変換する積分手段と、
(5) 照射位置それぞれにおいて、一定時間経過時の電圧
信号に応じたデジタル値を出力するＡＤ変換手段と、
(6) 照射位置信号およびデジタル値を入力し、照射位置
およびデジタル値に対応する番地に所定値を累積加算し
て、照射位置ごとに電圧信号の波高分布を生成する波高
分布生成手段と、(7)光検出器で放出される光電子が１
個の場合に波高分布生成手段で生成される波高分布を単
一光電子事象波高分布として獲得する単一光電子事象波
高分布生成手段と、(8) 光検出器で放出される光電子の
個数ｋが２以上かつ所定数以下のそれぞれの場合におけ
るk-光電子事象波高分布を、単一光電子事象波高分布に
基づいて漸化的にコンボリューション計算によって算出
するk-光電子事象波高分布生成手段と、(9) 照射位置そ
れぞれにおいて、蛍光が光検出器に入射して波高分布生
成手段で生成された波高分布と単一光電子事象波高分布
と光電子の個数ｋそれぞれの場合におけるk-光電子事象
波高分布とに基づいて、蛍光が光検出器に入射した場合
の光電子数分布を推定することによって蛍光の光量を求
める光電子数分布推定手段と、(10) 照射位置それぞれ
について光電子数分布推定手段で求められた蛍光の光量
に基づいて、試料における蛍光の光量分布を生成する蛍
光光量分布生成手段と、を備えることを特徴とする。

【００１２】本装置は以下のように作用する。励起光源
から出力された励起光は、走査手段により試料上の照射
位置それぞれに順次走査されて照射され、また、その照
射位置を示す照射位置信号が走査手段から出力される。
試料から発生した蛍光は、光検出器に入射し、その光量
に応じた光電子数分布に従った個数の光電子が放出され
増倍されて電流信号が出力される。その電流信号は積分
手段により一定時間積分されて電圧信号に変換され、そ
の電圧信号はＡＤ変換手段によりデジタル値に変換され
る。照射位置信号およびデジタル値は波高分布生成手段
に入力して、照射位置ごとに電圧信号の波高分布が生成
される。照射位置ごとの波高分布と、単一光電子事象波
高分布生成手段で獲得された単一光電子事象波高分布
と、k-光電子事象波高分布生成手段で生成されたk-光電
子事象波高分布とに基づいて、光電子数分布推定手段に
よって、照射位置それぞれで発生した蛍光を光検出器が
受光した場合の光電子数分布が推定され、その蛍光の光
量が求められる。そして、蛍光光量分布生成手段によっ
て、試料における蛍光の光量分布が求められる。

【００１３】光検出器として、(1) 受光した蛍光の光量
に応じた光電子数分布に従った個数の光電子を放出する
光電変換面と、(2) アノードとカソードとの間に逆バイ
アス電圧が印加され、且つ、光電変換面に対向する部位
が光電変換面の電位よりも高電位に設定されて、光電子
を入力して生成された電子・正孔対をアバランシェ増倍
し、アバランシェ増倍された電子・正孔対の数に応じた
電流信号を出力するアバランシェフォトダイオードと、
(3) 蛍光を透過させる入射窓を備えて光電変換面および
アバランシェフォトダイオードを内部に含む真空容器
と、を備えるものが好適に用いられる。

【００１４】光電子数分布推定手段は、最尤法により光
電子数分布を推定してもよい。また、光電子数分布とし
てポアソン分布を仮定してもよいし、任意の分布を仮定
することもできる。

【００１５】

【発明の実施の形態】以下、添付図面を参照して本発明
の実施の形態を詳細に説明する。尚、図面の説明におい
て同一の要素には同一の符号を付し、重複する説明を省
略する。

【００１６】まず、本発明に係る走査型蛍光検出装置の
構成について説明する。図１は、本発明に係る走査型蛍
光検出装置の構成図である。

【００１７】本実施形態に係る走査型蛍光検出装置は、
(1) 励起光を出力する励起光源８０とその励起光を集光
し試料８６に照射させるレンズ８２とを備える励起光学
系と、(2) 試料８６を励起光の光軸に直交する方向に走
査する走査機構８４とこれらを載置するＸＹステージ８
８とを備える走査系と、(3) 対物レンズ９０とバリアフ
ィルタ９２とを備え試料８６中の蛍光物質から発生した
蛍光を導く集光光学系と、(4) 光検出器１０、積分器２
０、増幅器３０、サンプルホールド回路４０、ＡＤ変換
器５０、ヒストメモリ６０および演算部７０を備え、集
光光学系から出力された蛍光を測定する蛍光検出系と、
(5) 走査機構８４を制御し、その走査に同期して、積分
器２０、サンプルホールド回路４０、ＡＤ変換器５０お
よびヒストメモリ６０それぞれを制御する信号を生成す
るとともに、走査回数Ｎを出力する制御部９４と、を備
える。

【００１８】励起光源８０から出力された励起光は、レ
ンズ８２で集光されて、蛍光物質を含む試料８６に照射
される。この励起光源として、例えば、キセノンランプ
やレーザ光源が用いられる。キセノンランプが用いられ
る場合には、励起光の所定の波長帯域のみを透過させる
帯域フィルタが、励起光源８０と試料８６との間の光路
上に挿入される。励起光は連続光であってもよいしパル
ス光であってもよい。以降では、励起光は連続光である
として説明する。また、レンズ８０は、励起光を集光し
て試料８６の表面の所定箇所に集光し、効率よく蛍光物
質を励起する為のものであるが、励起光源８０が充分に
径の小さい励起光を出力する場合には不要である。

【００１９】この励起光が照射される試料８６は、走査
機構８４を介してＸＹステージ８８の上に載置される。
この走査機構８４は、例えば、印加された電圧によって
歪が生じるピエゾ素子を利用したピエゾアクチュエータ
が用いられ、試料８６の側方より試料８６を移動させ
る。ＸＹ平面上で走査する場合には、ピエゾアクチュエ
ータはＸ方向およびＹ方向それぞれに設けられる。ま
た、ＸＹステージ８８は、走査機構８４および試料８６
を移動させるものであり、中央付近に孔部が設けられ
て、試料８６で発生して下方に向かう蛍光がその孔部を
通過する。

【００２０】これらＸＹステージ８８および走査機構８
４は、制御部９４によって制御されて、励起光の光軸に
直交する方向に移動することができる。ＸＹステージ８
８は、試料８６から発生する蛍光分布を観察する領域を
粗決めするものであり、走査機構８４は、その観察領域
を微調整するとともに、試料８６を走査して、その観察
領域中の各所に順次励起光を照射させるものである。試
料８６の走査は、１回だけに限られず、複数回行なわれ
てもよく、その走査回数Ｎは制御部９４で計数される。
なお、ＸＹステージ８８に加えて、試料８６を励起光の
光軸に沿った方向に移動させるＺステージ（図示せず）
を備えていてもよい。

【００２１】試料８６に励起光が照射されて試料８６に
含まれる蛍光物質から発生する蛍光は、対物レンズ９０
およびバリアフィルタ９２を経て、光検出器１０に入射
する。対物レンズ９０は、走査中の或時刻における試料
８６の視野領域で発生した蛍光のみを光検出器１０に導
くためのものであり、試料８６に照射される励起光のス
ポット径とともに本装置の測定分解能を決定するもので
ある。また、バリアフィルタ９２は、蛍光を透過させる
が、試料８６を透過した励起光や散乱光を遮断する。

【００２２】これら励起光源８０、レンズ８２、対物レ
ンズ９０、バリアフィルタ９２および光検出器１０は一
体化され相対的位置関係は固定されている。これら一体
化された各部に対して、ＸＹステージ８８はＸＹ方向に
移動可能であり、走査機構８４は、ＸＹステージ８８に
対して試料８６をＸＹ方向に走査することが可能であ
る。

【００２３】バリアフィルタ９２を透過した蛍光を受光
する光検出器１０は、その入射光束の光量に応じた光電
子数分布に従った個数の光電子を放出し、その光電子を
増倍して電流信号を出力するものである。例えば、光電
子増倍管や、アバランシェフォトダイオード（以下、Ａ
ＰＤ）を利用した光検出器（参考文献 ： Shawn J. Fag
en, "Vacuum avalanche photodiodes can count single
photons", Laser Focus World, Nov. (1993) pp.125-1
32）が用いられる。特に、ＡＰＤを利用した光検出器が
好適に用いられる。このＡＰＤを利用した光検出器の断
面図を図２に示す。

【００２４】このＡＰＤを利用した光検出器１０は、内
部が真空に保たれている真空容器１１の一部に入射窓１
２が設けられており、入射光束Ａは、その入射窓１２を
透過して、光電変換面１３に到達する。光電変換面１３
には、ＡＰＤ１５のアノード１６に対して例えば−１０
ｋＶないし−１５ｋＶの高電圧が、高圧電源１９によっ
て印加されているので、入射光束Ａが光電変換面１３に
入射すると、その入射光束Ａの光量に応じた光電子数分
布に従った個数の光電子Ｂが放出される。そして、その
光電子Ｂは、光電変換面１３とＡＰＤ１５との間の電界
によって加速され、中央部に開口を有し所定電位に設定
された集束電極１４によって集束されて、ＡＰＤ１５に
入射する。

【００２５】このＡＰＤ１５は、アノード１６とカソー
ド１７との間に、逆バイアス電源１８によって逆バイア
ス電圧（例えば、＋２．５ｋＶ）が印加され、且つ、光
電変換面１３に対向するアノード１６の電位は光電変換
面１３の電位よりも高電位に設定されている。このＡＰ
Ｄ１５に光電子Ｂが衝突すると、電離作用により光電子
がＡＰＤ１５中で失ったエネルギ３．６ｅＶ当たり１対
の電子および正孔が生成され、そして、この電子・正孔
対はＡＰＤ１５内でアバランシェ増倍され、アノード端
子１６ａおよびカソード端子１７ａの間に電流信号とし
て出力される。但し、光電子がＡＰＤ１５内で失うエネ
ルギは一定値ではなく或る分布に従うため、また、ＡＰ
Ｄ１５の増倍率も一定値ではなく或る増倍率分布に従う
ため、１個の光電子の入射により出力される電流信号の
大きさも或る分布を有する。

【００２６】したがって、光検出器１０が一定光量の光
束を多数回測定すると、光電変換面１３で放出される光
電子の個数分布（光電子数分布）は、光量に応じた或る
平均値の周りに広がった分布となり、光検出器１０から
出力される電流信号は、光電子１個によりＡＰＤ１５か
ら出力される電子・正孔対の個数の分布に従って更に広
がりのある分布となる。

【００２７】このＡＰＤを利用した光検出器１０は、光
電子増倍管と比較して、低雑音、高感度であり、単一光
子をも計数することができる。更に、一定光量の光束を
多数回測定して得られる電流信号の波高分布において、
k-光電子事象すなわち光電変換面１３に光束が入射して
放出される光電子の個数がｋ個である事象（k=1,2,3,
…）それぞれに対応するピークを識別することができる
という優れた特徴を有する。このような特徴を有するこ
とから、本発明に係る走査型蛍光検出装置に用いられる
光検出器として好適なものである。

【００２８】この光検出器１０から出力された電流信号
を入力する積分器２０は、その電流信号を一定時間積分
して電圧信号に変換する。この積分器２０には、光検出
器１０のアノード端子１６ａと接地端子との間に、スイ
ッチ２１とコンデンサ２２とが並列に設けられている。
このスイッチ２１は、走査機構８４の走査に同期して制
御部９４から出力されるゲート信号に従って開閉する。
コンデンサ２２は、スイッチ２１が開いている期間だ
け、光検出器１０から出力された電流信号を積分し、そ
の積分結果である電位が一方の端子（図中の点Ｐ）に現
れる。スイッチ２１が閉じると、コンデンサ２２に蓄積
された電荷は放電され、点Ｐの電位は接地電位となる。

【００２９】積分器２０で電流信号が積分された結果で
ある点Ｐの電位は、増幅器３０によって、後段のサンプ
ルホールド回路４０やＡＤ変換器５０における動作に際
して適当な振幅となるよう増幅される。その増幅された
電圧信号は、サンプルホールド回路４０でサンプリング
されてホールドされ、更に、ＡＤ変換器５０で、その電
圧信号に応じたデジタル値である波高値に変換される。
サンプルホールド回路４０およびＡＤ変換器５０も、制
御部９４から出力される信号によって制御され動作す
る。また、このＡＤ変換器５０から出力されたデジタル
値をフレームメモリ（図示せず）に蓄えて、モニタテレ
ビ（図示せず）に表示させてもよく、この場合には、試
料８６の走査範囲における蛍光発生分布を実時間で観察
することができる。

【００３０】この波高値および制御部９４から出力され
る試料８６の励起光照射位置を表す照射位置信号を入力
するヒストメモリ（波高分布生成手段）６０は、試料８
６の各照射位置における蛍光測定が行われる度に、その
波高値および照射位置信号に応じた番地に所定値（例え
ば、１）を累積加算する。多数回の試料８６の走査につ
いてヒストメモリ６０に累積加算することによって、Ａ
Ｄ変換器５０から出力された電圧信号の波高値の分布
が、試料８６の各照射位置ごとに得られる。なお、走査
範囲が広くて照射位置の数が多く、また、波高分布が広
く広がっている場合には、ヒストメモリ６０は大きな番
地空間が必要となる。このような場合には、例えば、照
射位置ごとに対応するメモリを設けて照射位置が移動す
る度にメモリを切り替える構成としてもよい。

【００３１】このヒストメモリ６０で生成された試料８
６の各照射位置の波高分布および試料８６の走査回数Ｎ
に基づいて、演算部７０は、光検出器１０の光電変換面
１３で放出された光電子の個数の分布（光電子数分布）
を推定し、この推定された光電子数分布に基づいて蛍光
の光量を求める。演算部７０として例えばコンピュータ
が用いられる。詳細は後述する。

【００３２】次に、以上に述べたスイッチ２１、サンプ
ルホールド回路４０、ＡＤ変換器５０、ヒストメモリ６
０および制御部９４それぞれの動作について詳細に説明
する。図３は、走査型蛍光検出装置の各部の動作を制御
する各信号の説明図である。光検出器１０の上記各部お
よび走査機構８４それぞれの動作を制御する各信号は、
制御部９４から出力される。

【００３３】走査機構８４を制御して試料８６を走査す
る為の走査制御信号（図３（ａ））は、その電圧値がス
テップ状に変化するものである。走査機構８４のピエゾ
アクチュエータには、この走査制御信号が印加されて電
圧値に応じた量の歪が発生する。これによって、試料８
６は、走査制御信号の電圧値に応じた照射位置それぞれ
に励起光が一定時間照射される。なお、走査機構８４
が、試料８６をＸおよびＹ方向の２方向に走査する場合
には、それぞれの方向について設けられたピエゾアクチ
ュエータそれぞれに対して走査制御信号が印加される。

【００３４】スイッチ２１の開閉動作を制御するゲート
信号（図３（ｂ））は、走査制御信号の値の変化タイミ
ングに同期して出力される一定幅Ｔｗのパルス形状であ
る。この信号の立ち上がり時刻は、走査制御信号の変化
時刻と同一タイミングでもよいし、あるいは、走査制御
信号の変化時刻から所定時間経過後でもよい。この信号
がハイレベルの期間（パルス幅Ｔｗの期間）は、スイッ
チ２１は開いて、光検出器１０から出力される電流信号
を積分し、点Ｐにはその積分結果である電位が現れる。
この信号がローレベルの期間は、スイッチ２１は閉じ
て、点Ｐの電位は接地電位になる。このようにして、試
料８６に励起光が照射される各点について、その点から
発生する蛍光の光量に応じて光検出器１０から出力され
た電流信号が積分される。

【００３５】サンプルホールド回路４０の動作を制御す
るサンプルホールド信号（図３（ｃ））は、ゲート信号
の立ち上がり時刻から一定時間Ｄｗ経過後に立ち上がり
を有するパルス信号である。この信号の立ち上がりの時
刻に、サンプルホールド回路４０は、点Ｐの電位が増幅
器３０で増幅されて出力された電圧値をサンプルしホー
ルドする。ここで重要なことは、ＤｗはＴｗ以下の一定
値であることである。すなわち、サンプルホールド回路
４０は、積分器２０がゲート信号に従って積分を開始し
て一定時間Ｄｗ経過時点における点Ｐの電位が増幅器３
０で増幅されて出力された電圧値を獲得する。そして、
サンプルホールド回路４０は、サンプルホールド信号が
ハイレベルである期間、サンプリング値をホールドす
る。したがって、サンプルホールド信号は、少なくとも
ＡＤ変換器５０によるデジタル変換動作が終了するまで
はハイレベルを維持し、サンプルホールド回路４０はサ
ンプリング値をホールドしておく必要がある。

【００３６】ＡＤ変換器５０におけるデジタル変換動作
を制御するＡＤスタート信号（図３（ｄ））は、サンプ
ルホールド信号の立ち上がり時刻からサンプルホールド
回路４０におけるセトリング時間（サンプルおよびホー
ルドの動作を開始して出力値が確定するまでに要する時
間）経過後に立ち上がりを有するパルス信号である。こ
の信号の立ち上がりの時刻に、ＡＤ変換器５０は、サン
プルホールド回路４０から出力された電圧値をデジタル
値である波高値（図３（ｅ））に変換する。

【００３７】また、制御部９４は、走査機構８４に印加
する走査制御信号に応じたデジタル値である照射位置信
号（図３（ｆ））を出力する。この信号は、例えば、Ａ
Ｄスタート信号の立ち上がり時刻における走査制御信号
をデジタル変換したものである。この場合には、ＡＤ変
換器５０から出力される波高値と制御信号９４から出力
される照射位置信号とは、同一のタイミングで更新され
る。

【００３８】そして、これら波高値と照射位置信号とを
入力するヒストメモリ６０は、波高値および照射位置信
号の双方に応じた番地に所定値を累積加算する。そし
て、試料８６を多数回走査することによって、ヒストメ
モリ６０には、試料８６の励起光照射の各位置に応じた
波高分布が得られる。

【００３９】次に、光検出器１０の光電変換面１３に入
射光束が入射して放出される光電子数分布の推定方法に
ついて詳細に説明する。この推定は、演算部７０におい
て行われるものである。

【００４０】推定に先立って、先ず、演算部７０の単一
光電子事象波高分布生成手段７１は、単一光電子事象の
場合にヒストメモリ６０で生成される単一光電子事象波
高分布を獲得する。ここで、単一光電子事象とは、光検
出器１０の光電変換面１３に光束が入射して１個の光電
子が放出される事象をいい、単一光電子事象波高分布と
は、その事象が発生した場合にヒストメモリ６０で生成
される波高分布である。すなわち、単一光電子事象波高
分布は、光電変換面１３で放出された１個の光電子がＡ
ＰＤ１５に入射したことによりＡＰＤ１５から出力され
る電子・正孔対の個数の分布を表すものである。この単
一光電子事象波高分布を、波高値ｈの関数としてｐ₁(h)
で表す。ｈは、ＡＤ変換器５０からの出力値である。な
お、この単一光電子事象波高分布は、単一光電子事象が
発生する確率が圧倒的に支配的となるような極めて微弱
な光束を光検出器１０に入射させることにより獲得す
る。

【００４１】なお、このｐ₁(h)の低波高部には増幅器系
のノイズが重畳しているので、実データを使用すること
ができない。そこで、低波高部では実データを用いるこ
となく、ノイズが重畳していない隣接した波高域のデー
タから外挿して求める。また、ｐ₁(h)は、

【数１】 で規格化しておく。ｈ_max は、波高値をデジタル値に変
換するＡＤ変換器５０のビット数で決まる最大波高値で
ある。

【００４２】続いて、演算部７０のk-光電子事象波高分
布生成手段７２は、k-光電子事象波高分布、すなわち、
光検出器１０の光電変換面１３に光束が入射してｋ個の
光電子が放出される場合にヒストメモリ６０で生成され
る波高分布ｐ_k(h)を、

【数２】 なるコンボリューション計算によって漸化的に算出する
（k=2,3,…,K）。Ｋは２以上である。光電子数分布を推
定する際に任意の分布を仮定する場合には、ｐ₁(h)のピ
ーク値を与える波高値をｈ_peak1 として、Ｋ＝ｈ_max ／
ｈ_peak1 とする。ｈ_max ＝４０９５、ｈ_peak1 ＝４００
であれば、Ｋは１０程度である。また、光電子数分布と
してポアソン分布を仮定する場合には、Ｋは、ｈ_max ／
ｈ_peak1 の２ないし３倍程度、すなわち、ｈ_max ＝４０
９５、ｈ_peak1 ＝４００であれば、Ｋは３０程度にす
る。なお、以上のようにして波高分布ｐ_k-1(h)とｐ₁(h)
とのコンボリューション計算から波高分布ｐ_k(h)を求め
ることができることの根拠は、波高分布ｐ_k(h)が、光電
変換面１３で放出されたｋ個の光電子がＡＰＤ１５に入
射してアバランシェ増倍された電子・正孔対の個数の分
布を表すものであることに基づく。

【００４３】なお、光検出器１０、積分器２０、増幅器
３０、サンプルホールド回路４０およびＡＤ変換器５０
において発生するノイズに起因する波高分布の広がりが
無視できない場合には、波高分布ｐ₁(h)からそのノイズ
の影響をデコンボリューション計算によって取り除いた
ものに基づいて、（１）式で波高分布ｐ_k(h)それぞれを
算出し、その後、波高分布ｐ_k(h)それぞれにノイズの影
響をコンボリューション計算によって重畳しておく（k=
2,3,…,K）。

【００４４】以上のようにして、測光装置が固有的に有
しているノイズの影響を考慮した波高分布ｐ_k(h)（k=1,
2,3,…,K）を、光電子数分布の推定に先立って用意して
おく。図４は、このようにして求められたk-光電子事象
の波高分布ｐ_k(h)それぞれを示す図である。

【００４５】そして、演算部７０の光電子数分布推定手
段７３は、測定対象である光束を光検出器１０で受光し
てヒストメモリ６０に生成された波高分布ｎ(h) を獲得
し、この波高分布ｎ(h) および上述した単一光電子事象
およびk-光電子事象それぞれ場合の波高分布ｐ_k(h)か
ら、被測定光束を受光して光電変換面１３から放出され
た光電子の個数の平均値すなわち光電子数分布を、以下
の要領で推定する。

【００４６】この波高分布ｎ(h) は、規格化する必要は
なく、ヒストメモリ６０に蓄積されたままの値でよい。
すなわち、波高分布ｎ(h) は、波高値ｈが得られた事象
の分布を表す。入射光束を受光して光検出器１０の光電
変換面１３で放出される光電子の個数の分布（光電子数
分布）の推定に際しては例えば最尤法を用いる。すなわ
ち、k-光電子事象それぞれが生起する確率をｑ_k （k=0,
1,2,…,K）として、

【数３】 なる式で表される対数尤度が最大になるｑ_k を求め、こ
れを推定光電子数分布とする。ここで、Ｎは測定回数で
あり、ｈ_min は解析に使用できる最小の波高値ｈであ
る。波高値ｈが小さい場合には、光検出器１０や増幅器
３０などに因るノイズが重畳されているので解析には使
用できないので、波高値ｈ_min 以上についてのみ解析す
る。また、ｐ(h) およびｐ_NDは、

【数４】

【数５】 である。このｐ(h) は、k-光電子事象（k=1,2,3,…,K）
それぞれの生起確率（光電子数分布）をも考慮した波高
値ｈの発生確率分布を表す。（３）式の対数尤度を最大
とするｑ_k を求めるには、例えば最適化問題に対して使
われる準ニュートン法等の数値計算法を適用する。

【００４７】光電子数分布としてポアソン分布を仮定す
る場合には、k-光電子事象それぞれが生起する確率ｑ_k
は、

【数６】 で表される。ここで、λは、光電変換面１３から放出さ
れる光電子の個数の平均値である。この場合、対数尤度
を最大とする光電子数分布を求めることは、対数尤度を
最大とするλ値を求めることであり、例えば黄金分割法
等の数値計算により求めることができる。以下では、光
電子数分布としてポアソン分布を仮定する。図５は、被
測定光束を光検出器１０で受光してヒストメモリ６０に
生成された波高分布（破線）と、最尤法で推定されたλ
値に基づいて計算された波高分布（実線）との１例を示
す。両者は、波高値ｈ_min （＝１５０）以上の範囲で良
い一致を示している。なお、このとき推定された光電子
数の平均値λは、１．０３であった。

【００４８】そして、演算部７０の蛍光光量分布生成手
段７４は、以上のようにして求められた試料８６の励起
光照射位置ごとの光電子数の平均値λすなわち蛍光光量
に基づいて、試料８６の走査範囲における蛍光発生分布
を求め、蛍光光量を例えば輝度に対応させて蛍光物質分
布画像を構成し、その画像を画像表示部（図示せず）に
表示させる。

【００４９】本発明は、上記実施形態に限定されるもの
ではなく種々の変形が可能である。例えば、上記実施形
態においては、励起光源から出力される励起光は連続光
として説明したが、励起光はパルス光であってもよい。
励起光がパルス光である場合には、図３における各信号
のタイミングは例えば励起パルス光発生タイミングと同
期したものとなる。すなわち、走査制御信号が変化する
時刻の一定時間経過後に励起光源は励起パルスを１パル
ス発生させる。そして、ゲート信号の立ち上がり時刻か
らサンプルホールド信号の立ち上がり時刻までの時間Ｄ
ｗすなわち積分器の積分時間は、蛍光寿命の例えば４な
いし５倍程度とする。あるいは、時間Ｄｗ内に、２以上
の一定パルス数の励起光を発生して走査回数を減らすこ
ともできる。

【００５０】また、試料を走査するのではなく、励起光
を走査してもよい。この場合には、試料は、ＸＹステー
ジに固定載置され、励起光源と試料との間に励起光走査
手段が設けられる。

【００５１】また、励起光を試料の上方から照射して、
試料の下方に向かって発生した蛍光を検出するのではな
く、試料の上方に向かって発生した蛍光を検出してもよ
い。この場合、光学系にダイクロイックミラーが備えら
れ、励起光源から出力された励起光はダイクロイックミ
ラーで反射された後に試料に照射され、試料から発生し
た蛍光はダイクロイックミラーを透過して光検出器で検
出される。

【００５２】また、光電子数分布の推定は、最尤法によ
るのが最も好適であるが、他の方法、例えば、最小二乗
法を用いることもできる。

【００５３】

【発明の効果】以上、詳細に説明したとおり本発明に係
る走査型蛍光検出装置では、励起光源から出力された励
起光は、走査手段により試料上の照射位置それぞれに順
次走査されて照射され、また、その照射位置を示す照射
位置信号が走査手段から出力される。試料から発生した
蛍光は、光検出器に入射し、その光量に応じた光電子数
分布に従った個数の光電子が放出され、その光電子は増
倍されて電流信号が出力される。その電流信号は積分手
段により一定時間積分されて電圧信号に変換され、その
電圧信号はＡＤ変換手段によりデジタル値に変換され
る。照射位置信号とデジタル値とは波高分布生成手段に
入力して、照射位置ごとに電圧信号の波高分布が生成さ
れる。この照射位置ごとの波高分布と、単一光電子事象
波高分布生成手段で獲得された単一光電子事象波高分布
と、k-光電子事象波高分布生成手段で生成されたk-光電
子事象波高分布とに基づいて、光電子数分布推定手段に
よって、照射位置それぞれで発生した蛍光を光検出器が
受光した場合の光電子数分布が推定され、その蛍光の光
量が求められる。そして、蛍光光量分布生成手段によっ
て、試料における蛍光の光量分布が求められる。ここ
で、光検出器として、アバランシェフォトダイオードを
利用したものが好適に用いられ、また、光電子数分布推
定手段は、光電子数分布がポアソン分布であると仮定し
て最尤法により光電子数分布を推定する。

【００５４】以上のような構成としたので、光検出器の
パルスペア分解能および量子ノイズの双方の問題を排除
することができ、試料に含まれる蛍光物質から発生する
蛍光の分布を短時間に精度よく測定することができる。
また、これらの問題を考慮する必要がないので、励起光
の光量設定が容易となる。したがって、例えば生化学等
の分野において、励起光で励起された試料から発生する
蛍光の光量を測定してその試料中の蛍光分子数の分布を
定量測定する装置として好適に用いることができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明に係る走査型蛍光検出装置の構成図であ
る。

【図２】アバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）を利
用した光検出器の断面図である。

【図３】光検出器の各部の動作を制御する各信号の説明
図である。

【図４】k-光電子事象の波高分布ｐ_k(h)を示す図であ
る。

【図５】測定対象である光束を実際に測定して得られた
波高分布（破線）と、最尤法で推定されたλ値に基づい
て計算された波高分布（実線）とを示す図である。

【符号の説明】

１０…光検出器、１１…真空容器、１２…入射窓、１３
…光電変換面、１４…集束電極、１５…アバランシェフ
ォトダイオード（ＡＰＤ）、１６…アノード、１７…カ
ソード、１８…逆バイアス電源、１９…高圧電源、２０
…積分器、２１…スイッチ、２２…コンデンサ、３０…
増幅器、４０…サンプルホールド回路、５０…ＡＤ変換
器、６０…ヒストメモリ、７０…演算部、７１…単一光
電子事象波高分布生成手段、７２…k-光電子事象波高分
布生成手段、７３…光電子数分布推定手段、７４…蛍光
光量分布生成手段、８０…励起光源、８２…レンズ、８
４…走査機構、８６…試料、８８…ＸＹステージ、９０
…対物レンズ、９２…バリアフィルタ、９４…制御部。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 励起光を出力する励起光源と、 前記励起光が照射される試料および前記励起光の少なく
   とも何れか一方を、前記励起光の光軸に略垂直な方向に
   走査して、前記試料上の照射位置それぞれに前記励起光
   を一定時間以上照射させるとともに、前記照射位置に応
   じた照射位置信号を出力する走査手段と、 前記照射位置それぞれから発生した蛍光を受光し、前記
   蛍光の光量に応じた光電子数分布に従った個数の光電子
   を放出し、前記光電子を増倍して電流信号を出力する光
   検出器と、 前記照射位置それぞれにおいて、前記電流信号を前記一
   定時間積分して電圧信号に変換する積分手段と、 前記照射位置それぞれにおいて、前記一定時間経過時の
   前記電圧信号に応じたデジタル値を出力するＡＤ変換手
   段と、 前記照射位置信号および前記デジタル値を入力し、前記
   照射位置および前記デジタル値に対応する番地に所定値
   を累積加算して、前記照射位置ごとに前記電圧信号の波
   高分布を生成する波高分布生成手段と、 前記光検出器で放出される光電子が１個の場合に前記波
   高分布生成手段で生成される波高分布を単一光電子事象
   波高分布として獲得する単一光電子事象波高分布生成手
   段と、 前記光検出器で放出される光電子の個数ｋが２以上かつ
   所定数以下のそれぞれの場合におけるk-光電子事象波高
   分布を、前記単一光電子事象波高分布に基づいて漸化的
   にコンボリューション計算によって算出するk-光電子事
   象波高分布生成手段と、 前記照射位置それぞれにおいて、前記蛍光が前記光検出
   器に入射して前記波高分布生成手段で生成された波高分
   布と前記単一光電子事象波高分布と前記光電子の個数ｋ
   それぞれの場合における前記k-光電子事象波高分布とに
   基づいて、前記蛍光が前記光検出器に入射した場合の前
   記光電子数分布を推定することによって前記蛍光の光量
   を求める光電子数分布推定手段と、 前記照射位置それぞれについて前記光電子数分布推定手
   段で求められた前記蛍光の光量に基づいて、前記試料に
   おける前記蛍光の光量分布を生成する蛍光光量分布生成
   手段と、 を備えることを特徴とする走査型蛍光検出装置。
2. 【請求項２】 前記光検出器は、 受光した前記蛍光の光量に応じた光電子数分布に従った
   個数の光電子を放出する光電変換面と、 アノードとカソードとの間に逆バイアス電圧が印加さ
   れ、且つ、前記光電変換面に対向する部位が前記光電変
   換面の電位よりも高電位に設定されて、前記光電子を入
   力して生成された電子・正孔対をアバランシェ増倍し、
   アバランシェ増倍された電子・正孔対の数に応じた前記
   電流信号を出力するアバランシェフォトダイオードと、 前記蛍光を透過させる入射窓を備えて前記光電変換面お
   よび前記アバランシェフォトダイオードを内部に含む真
   空容器と、 を備えることを特徴とする請求項１記載の走査型蛍光検
   出装置。
3. 【請求項３】 前記光電子数分布推定手段は、最尤法に
   より前記光電子数分布を推定する、ことを特徴とする請
   求項１記載の走査型蛍光検出装置。
4. 【請求項４】 前記光電子数分布推定手段は、前記光電
   子数分布がポアソン分布であると仮定して前記光電子数
   分布を推定する、ことを特徴とする請求項１記載の走査
   型蛍光検出装置。