JPH09234064A - Ｎ−アセチルグルコサミン６−リン酸デアセチラーゼ - Google Patents
Ｎ−アセチルグルコサミン６−リン酸デアセチラーゼInfo
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Abstract
(57)【要約】
【課題】４０℃以上の高温で高活性を有するＮ−アセチ
ルグルコサミン６−リン酸デアセチラーゼを提供する。
また、該酵素を加温の必要なく、室温で効率的に生産す
る技術を提供する。 【解決手段】低温細菌ビブリオ（Vibrio）属に属し、Ｎ
−アセチルグルコサミン６−リン酸のアセトアミド基に
作用するデアセチラーゼ生産菌を培養し、その培養物か
らＮ−アセチルグルコサミン６−リン酸デアセチラーゼ
を採取することを特徴とする、Ｎ−アセチルグルコサミ
ン６−リン酸デアセチラーゼの製造方法；Ｎ−アセチル
グルコサミン６−リン酸デアセチラーゼ；並びに低温細
菌ビブリオ（Vibrio）属に属する細菌。
ルグルコサミン６−リン酸デアセチラーゼを提供する。
また、該酵素を加温の必要なく、室温で効率的に生産す
る技術を提供する。 【解決手段】低温細菌ビブリオ（Vibrio）属に属し、Ｎ
−アセチルグルコサミン６−リン酸のアセトアミド基に
作用するデアセチラーゼ生産菌を培養し、その培養物か
らＮ−アセチルグルコサミン６−リン酸デアセチラーゼ
を採取することを特徴とする、Ｎ−アセチルグルコサミ
ン６−リン酸デアセチラーゼの製造方法；Ｎ−アセチル
グルコサミン６−リン酸デアセチラーゼ；並びに低温細
菌ビブリオ（Vibrio）属に属する細菌。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、Ｎ−アセチルグル
コサミン６−リン酸デアセチラーゼの製造方法に関する
ものである。本発明による酵素、Ｎ−アセチルグルコサ
ミン６−リン酸デアセチラーゼは、バイオテクノロジー
の分野で重要であり、本酵素によって生産されるＤ−グ
ルコサミン６−リン酸は、基質として生化学、医学の分
野で有用な物質である。
コサミン６−リン酸デアセチラーゼの製造方法に関する
ものである。本発明による酵素、Ｎ−アセチルグルコサ
ミン６−リン酸デアセチラーゼは、バイオテクノロジー
の分野で重要であり、本酵素によって生産されるＤ−グ
ルコサミン６−リン酸は、基質として生化学、医学の分
野で有用な物質である。
【０００２】
【従来の技術】Ｎ−アセチルグルコサミン６−リン酸デ
アセチラーゼは、Ｎ−アセチルグルコサミン６−リン酸
のアセトアミド基に作用して、Ｄ−グルコサミン６−リ
ン酸を生成する酵素である。従来、大腸菌による該酵素
の生産が知られているが、その活性は低く、工業的に利
用できるものではない。
アセチラーゼは、Ｎ−アセチルグルコサミン６−リン酸
のアセトアミド基に作用して、Ｄ−グルコサミン６−リ
ン酸を生成する酵素である。従来、大腸菌による該酵素
の生産が知られているが、その活性は低く、工業的に利
用できるものではない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、バイオテク
ノロジー分野での使用に供することができる、タンパク
質として均一かつ安定なＮ−アセチルグルコサミン６−
リン酸デアセチラーゼを提供するとともに、該酵素を工
業的に製造できる方法を提供することを目的とする。
ノロジー分野での使用に供することができる、タンパク
質として均一かつ安定なＮ−アセチルグルコサミン６−
リン酸デアセチラーゼを提供するとともに、該酵素を工
業的に製造できる方法を提供することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、海洋性低
温細菌ビブリオ（Vibrio）属について研究を重ねた結
果、該微生物がＮ−アセチルーＤ−グルコサミン６−リ
ン酸を脱アセチルする酵素を生産する事を見い出し、本
発明を完成した。
温細菌ビブリオ（Vibrio）属について研究を重ねた結
果、該微生物がＮ−アセチルーＤ−グルコサミン６−リ
ン酸を脱アセチルする酵素を生産する事を見い出し、本
発明を完成した。
【０００５】すなわち、本発明は、低温細菌ビブリオ
（Vibrio）属に属する菌株をＮ−アセチルグルコサミン
６−リン酸デアセチラーゼ誘導用培地中で培養し、Ｎ−
アセチルグルコサミン６−リン酸デアセチラーゼを生成
蓄積せしめ、次いで該酵素を単離することを特徴とする
Ｎ−アセチルグルコサミン６−リン酸デアセチラーゼの
製造方法に関する。また、本発明は、Ｎ−アセチルグル
コサミン６−リン酸デアセチラーゼ及びその生産菌にも
関する。
（Vibrio）属に属する菌株をＮ−アセチルグルコサミン
６−リン酸デアセチラーゼ誘導用培地中で培養し、Ｎ−
アセチルグルコサミン６−リン酸デアセチラーゼを生成
蓄積せしめ、次いで該酵素を単離することを特徴とする
Ｎ−アセチルグルコサミン６−リン酸デアセチラーゼの
製造方法に関する。また、本発明は、Ｎ−アセチルグル
コサミン６−リン酸デアセチラーゼ及びその生産菌にも
関する。
【０００６】
【発明の実施の形態】本発明に用いられる微生物は、低
温細菌ビブリオ属に属し、該Ｎ−アセチルグルコサミン
６−リン酸デアセチラーゼの生産能を有するものであれ
ば、いずれも使用することができる。例えば、本発明者
らが日本海溝の深層水から分離した海洋低温細菌P2K-5
菌株（FERM P-15480）を例示することができる。
温細菌ビブリオ属に属し、該Ｎ−アセチルグルコサミン
６−リン酸デアセチラーゼの生産能を有するものであれ
ば、いずれも使用することができる。例えば、本発明者
らが日本海溝の深層水から分離した海洋低温細菌P2K-5
菌株（FERM P-15480）を例示することができる。
【０００７】Ｎ−アセチルグルコサミン６−リン酸デア
セチラーゼ生産性海洋低温細菌P2K-5菌株（FERM P-154
80）の菌学的性質は、下記の通りである。
セチラーゼ生産性海洋低温細菌P2K-5菌株（FERM P-154
80）の菌学的性質は、下記の通りである。
【０００８】１．形態的性質 （１）細胞形態 ：稈状（rod） （２）鞭毛形態 ：極べん毛 （３）グラム染色：陰性 ２．生理的性質 （１）増殖温度 ４℃：＋ ２５℃：＋ ３０℃：＋ （２）Ｏ−Ｆテスト：Fermentative （３）塩類要求性 ：＋ （４）色素生産 ：− （５）オキシダーゼ：＋ （６）カタラーゼ ：＋ ３．分離源：日本海溝の水深６０００ｍの海水 上記菌学的性質の試験方法は、主として絵面良男：沿岸
環境調査マニュアルII〔水質・微生物篇〕、日本海洋学
会編、恒星社厚生閣、p.357-364(1990)に従った。ま
た、駒形和男：微生物の分類と同定（下）、（改訂版、
長谷川武治編著）、学会出版センター、p.99-161(1985)
を参考にした。
環境調査マニュアルII〔水質・微生物篇〕、日本海洋学
会編、恒星社厚生閣、p.357-364(1990)に従った。ま
た、駒形和男：微生物の分類と同定（下）、（改訂版、
長谷川武治編著）、学会出版センター、p.99-161(1985)
を参考にした。
【０００９】以上の菌学的性質を、絵面と清水の海洋細
菌の簡易同定図式（沿岸環境調査マニュアルII〔水質・
微生物篇〕、日本海洋学会編、恒星社厚生閣、p.357-36
4(1990)）に基づき、Bergey's Manual of Systematic B
acteriology, vol.1(N.R.Krieg、J.G.Holt編,Williams
& Wilkins, Baltimor, 1984)及びBergey's Manual ofDe
terminative Bacteriology(第９版、J.G.Holt, N.R.Kri
eg,P.H.A.Sneath,J.T.Staley, S.T.Williams編、Willia
ms & Wilkins,Baltimor, 1984)を参考にして対比した結
果、本海洋低温細菌P2K-5菌株（FERM P-15480）は、低
温細菌ビブリオ（Vibrio）属に属する細菌と同定され
た。
菌の簡易同定図式（沿岸環境調査マニュアルII〔水質・
微生物篇〕、日本海洋学会編、恒星社厚生閣、p.357-36
4(1990)）に基づき、Bergey's Manual of Systematic B
acteriology, vol.1(N.R.Krieg、J.G.Holt編,Williams
& Wilkins, Baltimor, 1984)及びBergey's Manual ofDe
terminative Bacteriology(第９版、J.G.Holt, N.R.Kri
eg,P.H.A.Sneath,J.T.Staley, S.T.Williams編、Willia
ms & Wilkins,Baltimor, 1984)を参考にして対比した結
果、本海洋低温細菌P2K-5菌株（FERM P-15480）は、低
温細菌ビブリオ（Vibrio）属に属する細菌と同定され
た。
【００１０】この海洋低温細菌P2K-5菌株（FERM P-154
80）を用いて、Ｎ−アセチルグルコサミン６−リン酸デ
アセチラーゼを生産するには、当該菌体を適当な培地に
接種し、好ましくは誘導物質の存在下で常法に従って培
養すればよい。この誘導物質としては、キチン、キチン
分解物、Ｎ−アセチルグルコサミン６−リン酸、Ｎ−ア
セチルグルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミンオリゴ
マーを単独又はこれらのうち２種以上を組み合わせたも
のを使用できる。好ましい誘導物質は、Ｎ−アセチルグ
ルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミンオリゴマーが挙
げられ、最も好ましい誘導物質は、Ｎ−アセチルグルコ
サミンである。誘導物質は、0.1 g/リットル以上、好ましく
は1.0〜50 g/リットルの濃度で加える。培地は格別である必
要はなく、通常の培地が用いられる。例えば、炭素源と
してグルコース、マルトース、キシロース、スクロー
ス、ペプトン等が例示でき、窒素源としては、イースト
エキス、ペプトン、肉エキス、アミノ酸溶液等の有機窒
素、または硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム等の無
機窒素が例示できる。また誘導物質を炭素源、窒素源と
してもよい。無機塩としては、硫酸マグネシウム、塩化
マグネシウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、塩
化カリウム、塩化ナトリウム、塩化カルシウム等を適宜
組み合わせて使用できる。上記培地のpHは、適当な酸ま
たは塩基を加えることにより、6.5から8.5の範囲内に調
整され、オートクレーブにより殺菌される。培養温度
は、４〜３５℃、好ましくは１５から２８℃で２０〜４
８時間好気的に振とうまたは攪拌しながら培養を行う。
また上記の炭素源、窒素源、無機塩、及び寒天を適宜含
む平板培地を使用し、培養温度４〜３５℃、好ましくは
１５から２８℃で２０〜７２時間培養を行う。また、本
菌の培養は、静置でも行われる。
80）を用いて、Ｎ−アセチルグルコサミン６−リン酸デ
アセチラーゼを生産するには、当該菌体を適当な培地に
接種し、好ましくは誘導物質の存在下で常法に従って培
養すればよい。この誘導物質としては、キチン、キチン
分解物、Ｎ−アセチルグルコサミン６−リン酸、Ｎ−ア
セチルグルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミンオリゴ
マーを単独又はこれらのうち２種以上を組み合わせたも
のを使用できる。好ましい誘導物質は、Ｎ−アセチルグ
ルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミンオリゴマーが挙
げられ、最も好ましい誘導物質は、Ｎ−アセチルグルコ
サミンである。誘導物質は、0.1 g/リットル以上、好ましく
は1.0〜50 g/リットルの濃度で加える。培地は格別である必
要はなく、通常の培地が用いられる。例えば、炭素源と
してグルコース、マルトース、キシロース、スクロー
ス、ペプトン等が例示でき、窒素源としては、イースト
エキス、ペプトン、肉エキス、アミノ酸溶液等の有機窒
素、または硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム等の無
機窒素が例示できる。また誘導物質を炭素源、窒素源と
してもよい。無機塩としては、硫酸マグネシウム、塩化
マグネシウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、塩
化カリウム、塩化ナトリウム、塩化カルシウム等を適宜
組み合わせて使用できる。上記培地のpHは、適当な酸ま
たは塩基を加えることにより、6.5から8.5の範囲内に調
整され、オートクレーブにより殺菌される。培養温度
は、４〜３５℃、好ましくは１５から２８℃で２０〜４
８時間好気的に振とうまたは攪拌しながら培養を行う。
また上記の炭素源、窒素源、無機塩、及び寒天を適宜含
む平板培地を使用し、培養温度４〜３５℃、好ましくは
１５から２８℃で２０〜７２時間培養を行う。また、本
菌の培養は、静置でも行われる。
【００１１】培養によって得られた培養物から培養液と
菌体とを分離する方法としては、従来から行われている
遠心分離法やろ過等の方法が使用できるが、遠心分離法
が好適である。菌体内に蓄積された該酵素を菌体から抽
出する方法としては、従来から行われている超音波によ
る菌体破砕、あるいはガラス・ビーズと共に回転させる
ダイノミル細胞破砕機による菌体破砕、またはリゾチー
ム等の酵素やトルエン等の有機溶媒による細胞膜の破壊
等の方法が挙げられる。これらの中から適当な方法を選
択して菌体から酵素の抽出を行うことにより、酵素を採
取することができる。
菌体とを分離する方法としては、従来から行われている
遠心分離法やろ過等の方法が使用できるが、遠心分離法
が好適である。菌体内に蓄積された該酵素を菌体から抽
出する方法としては、従来から行われている超音波によ
る菌体破砕、あるいはガラス・ビーズと共に回転させる
ダイノミル細胞破砕機による菌体破砕、またはリゾチー
ム等の酵素やトルエン等の有機溶媒による細胞膜の破壊
等の方法が挙げられる。これらの中から適当な方法を選
択して菌体から酵素の抽出を行うことにより、酵素を採
取することができる。
【００１２】これらの方法で抽出された粗酵素液からＮ
−アセチルグルコサミン６−リン酸デアセチラーゼをさ
らに精製する必要がある場合には、通常実施されている
一般的な酵素の精製手段である硫酸アンモニウム沈澱
法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過法、吸着
クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ハイド
ロフォービック・クロマトグラフィー、調製用電気泳動
法等を適宜組み合わせることによって、精製を行うこと
ができる。
−アセチルグルコサミン６−リン酸デアセチラーゼをさ
らに精製する必要がある場合には、通常実施されている
一般的な酵素の精製手段である硫酸アンモニウム沈澱
法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過法、吸着
クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ハイド
ロフォービック・クロマトグラフィー、調製用電気泳動
法等を適宜組み合わせることによって、精製を行うこと
ができる。
【００１３】本発明により得られたＮ−アセチルグルコ
サミン６−リン酸デアセチラーゼは、以下の理化学的性
質を有する。
サミン６−リン酸デアセチラーゼは、以下の理化学的性
質を有する。
【００１４】（１）作用：Ｎ−アセチルグルコサミン６
−リン酸のアセトアミド基に作用し、グルコサミン６−
リン酸を生成する。
−リン酸のアセトアミド基に作用し、グルコサミン６−
リン酸を生成する。
【００１５】（２）至適pH：8.0〜9.0（図１に示され
る。） （３）安定pH：8.0〜10（２０℃、３０分間インキュベ
ート後、９０％以上の活性が保持される。） （４）至適温度：４０−４２℃（図２に示される。） （５）熱安定性：pH8.5、３０分間インキュベート後、
３０℃まで１００％の活性を保持。同じく４０℃まで
は、６０％以上の活性が保持される。
る。） （３）安定pH：8.0〜10（２０℃、３０分間インキュベ
ート後、９０％以上の活性が保持される。） （４）至適温度：４０−４２℃（図２に示される。） （５）熱安定性：pH8.5、３０分間インキュベート後、
３０℃まで１００％の活性を保持。同じく４０℃まで
は、６０％以上の活性が保持される。
【００１６】なお活性は、以下の方法により測定した。
【００１７】75mMリン酸緩衝液（pH8.5）0.3mlに基質と
して１％Ｎ−アセチルグルコサミン６−リン酸溶液0.1m
lを加え、さらに酵素液0.1mlを加え、４０℃で３０分間
インキュベートする。その後、生成したＤ−グルコサミ
ン６−リン酸をインドール・塩酸法で比色定量する。
して１％Ｎ−アセチルグルコサミン６−リン酸溶液0.1m
lを加え、さらに酵素液0.1mlを加え、４０℃で３０分間
インキュベートする。その後、生成したＤ−グルコサミ
ン６−リン酸をインドール・塩酸法で比色定量する。
【００１８】なお、酵素の１単位（ユニット）は、１分
間に１μmolのアミノ糖を生成する酵素量を表す。
間に１μmolのアミノ糖を生成する酵素量を表す。
【００１９】
【発明の効果】本発明による酵素Ｎ−アセチルグルコサ
ミン６−リン酸デアセチラーゼは、バイオテクノロジー
の分野で重要であり、本酵素によって生産されるＤ−グ
ルコサミン６−リン酸は、基質として生化学、医学の分
野で有用な物質である。
ミン６−リン酸デアセチラーゼは、バイオテクノロジー
の分野で重要であり、本酵素によって生産されるＤ−グ
ルコサミン６−リン酸は、基質として生化学、医学の分
野で有用な物質である。
【００２０】本発明によるＮ−アセチルグルコサミン６
−リン酸デアセチラーゼは、9.65units/mg-protein（３
０℃での活性）、14.5units/mg-protein（４０℃での活
性）、５０℃においても7.5units/mg-proteinの活性を
有する。本発明に係るＮ−アセチルグルコサミン６−リ
ン酸デアセチラーゼは、極めて高い活性を有するだけで
なく、４０℃以上でも高い活性を保持し、使用に際し冷
却装置を必要としない利点を持つ。さらに、本発明は、
Ｎ−アセチルグルコサミン６−リン酸デアセチラーゼを
工業的に、かつ通常加温することなく室温にて、従って
低コストで製造する技術をも提供するものである。
−リン酸デアセチラーゼは、9.65units/mg-protein（３
０℃での活性）、14.5units/mg-protein（４０℃での活
性）、５０℃においても7.5units/mg-proteinの活性を
有する。本発明に係るＮ−アセチルグルコサミン６−リ
ン酸デアセチラーゼは、極めて高い活性を有するだけで
なく、４０℃以上でも高い活性を保持し、使用に際し冷
却装置を必要としない利点を持つ。さらに、本発明は、
Ｎ−アセチルグルコサミン６−リン酸デアセチラーゼを
工業的に、かつ通常加温することなく室温にて、従って
低コストで製造する技術をも提供するものである。
【００２１】以下、実施例により本発明をさらに詳細に
説明する。
説明する。
【００２２】
実施例１：3gのアガーを含む市販のＢＨＩ（商品名、Ｄ
ＩＦＣＯ製）平板培地に、低温細菌ビブリオ（Vibrio s
p．P2K-5、FERM P-15480）を接種し、２０℃で３６時
間培養した。その後、滅菌スパチュラを用いて集めた菌
体を、以下の液体培地に接種し、混和後、２０℃で３６
時間、好気的に振とう培養した。
ＩＦＣＯ製）平板培地に、低温細菌ビブリオ（Vibrio s
p．P2K-5、FERM P-15480）を接種し、２０℃で３６時
間培養した。その後、滅菌スパチュラを用いて集めた菌
体を、以下の液体培地に接種し、混和後、２０℃で３６
時間、好気的に振とう培養した。
【００２３】培地：800ml当たり、2.4gの硝酸アンモニ
ウム、0.8gのリン酸水素二カリウム、8gの塩化ナトリウ
ム、0.4gの硫酸マグネシウム、0.8gの塩化カルシウム、
当該酵素の誘導物質のＮ−アセチルグルコサミン40gを
含む。
ウム、0.8gのリン酸水素二カリウム、8gの塩化ナトリウ
ム、0.4gの硫酸マグネシウム、0.8gの塩化カルシウム、
当該酵素の誘導物質のＮ−アセチルグルコサミン40gを
含む。
【００２４】(1) 精製工程１ その後、培養液を8000×gで２０分間遠心分離にかけ湿
重量21gの菌体を得た。得られた菌体は、40mlの生理食
塩水にけん濁し、０℃で１０分間超音波処理（20秒間作
動、20秒間休止）を行った後、12000×gで１時間遠心分
離を行い、上清液を得た。この上清液中には、Ｎ−アセ
チルグルコサミン６−リン酸に対し総活性150units、比
活性0.188units／mg-proteinの酵素が含有された。
重量21gの菌体を得た。得られた菌体は、40mlの生理食
塩水にけん濁し、０℃で１０分間超音波処理（20秒間作
動、20秒間休止）を行った後、12000×gで１時間遠心分
離を行い、上清液を得た。この上清液中には、Ｎ−アセ
チルグルコサミン６−リン酸に対し総活性150units、比
活性0.188units／mg-proteinの酵素が含有された。
【００２５】(2) 精製工程２ 精製工程１で得られたこの上清液を、予め10mMのリン酸
緩衝液（pH7.0）で平衡化した30mlのDEAE Bio-GelA
（商品名、Bio-Rad製）カラムに通し、目的とする酵素
を吸着させた。カラムを同様のリン酸緩衝液で洗浄した
後、段階的に塩化ナトリウムの濃度を変化させて目的酵
素を溶出し、Ｎ−アセチルグルコサミン６−リン酸に対
し総活性102units、比活性0.657units／mg-proteinを有
する酵素画分を得た。
緩衝液（pH7.0）で平衡化した30mlのDEAE Bio-GelA
（商品名、Bio-Rad製）カラムに通し、目的とする酵素
を吸着させた。カラムを同様のリン酸緩衝液で洗浄した
後、段階的に塩化ナトリウムの濃度を変化させて目的酵
素を溶出し、Ｎ−アセチルグルコサミン６−リン酸に対
し総活性102units、比活性0.657units／mg-proteinを有
する酵素画分を得た。
【００２６】(3) 精製工程３ さらに上記の活性画分を、予め10mMのリン酸緩衝液（pH
7.0）で平衡化した10mMのハイドロキシアパタイト（商
品名、東亜合成化学製）カラムに通し、目的とする酵素
を吸着させた。カラムを同様のリン酸緩衝液で洗浄した
後、段階的にリン酸緩衝液の濃度を変化させて目的酵素
を溶出し、Ｎ−アセチルグルコサミン６−リン酸に対し
総活性21.2ユニット、比活性2.30units／mg-proteinを
有する酵素標品を得た。
7.0）で平衡化した10mMのハイドロキシアパタイト（商
品名、東亜合成化学製）カラムに通し、目的とする酵素
を吸着させた。カラムを同様のリン酸緩衝液で洗浄した
後、段階的にリン酸緩衝液の濃度を変化させて目的酵素
を溶出し、Ｎ−アセチルグルコサミン６−リン酸に対し
総活性21.2ユニット、比活性2.30units／mg-proteinを
有する酵素標品を得た。
【００２７】(4) 精製工程４ 次いで、上記の活性画分を、予め100mMのリン酸２水素
カリウム溶液で平衡化したHiTrapTM Q（商品名、ファル
マシア製）カラムに通し、目的とする酵素を吸着させ
た。カラムを同様のリン酸２水素カリウム溶液で洗浄し
た後、段階的に塩化ナトリウム濃度を変化させて目的酵
素を溶出し、Ｎ−アセチルグルコサミン６−リン酸に対
し総活性10.4units、比活性1.61units／mg-proteinを有
する酵素標品を得た。
カリウム溶液で平衡化したHiTrapTM Q（商品名、ファル
マシア製）カラムに通し、目的とする酵素を吸着させ
た。カラムを同様のリン酸２水素カリウム溶液で洗浄し
た後、段階的に塩化ナトリウム濃度を変化させて目的酵
素を溶出し、Ｎ−アセチルグルコサミン６−リン酸に対
し総活性10.4units、比活性1.61units／mg-proteinを有
する酵素標品を得た。
【００２８】(5) 精製工程５ さらに上記の活性画分を、予め10mMのリン酸緩衝液(pH
7.0)で平衡化した2mlのQAE Sephadex A-50（商品名、フ
ァルマシア製）カラムに通し、目的とする酵素を吸着さ
せた。カラムを同様のリン酸緩衝液で洗浄した後、段階
的に塩化ナトリウム濃度を変化させて目的酵素を溶出
し、Ｎ−アセチルグルコサミン６−リン酸に対し総活性
3.58units、比活性9.65units／mg-proteinを有する酵素
標品を得た。
7.0)で平衡化した2mlのQAE Sephadex A-50（商品名、フ
ァルマシア製）カラムに通し、目的とする酵素を吸着さ
せた。カラムを同様のリン酸緩衝液で洗浄した後、段階
的に塩化ナトリウム濃度を変化させて目的酵素を溶出
し、Ｎ−アセチルグルコサミン６−リン酸に対し総活性
3.58units、比活性9.65units／mg-proteinを有する酵素
標品を得た。
【００２９】この酵素標品をＳＤＳポリアクリルアミド
電気泳動によって測定した結果、１本のバンドが得ら
れ、タンパクとして均一であることを確認した。
電気泳動によって測定した結果、１本のバンドが得ら
れ、タンパクとして均一であることを確認した。
【００３０】また、該酵素はＮ−アセチルガラクトサミ
ンには全く作用しなかった。
ンには全く作用しなかった。
【００３１】実施例２ 上記実施例１の精製工程１〜３で得られた各精製段階の
酵素のＮ−アセチルグルコサミンに対するデアセチラー
ゼ作用の総活性及び比活性を測定した。結果を表１に示
す。
酵素のＮ−アセチルグルコサミンに対するデアセチラー
ゼ作用の総活性及び比活性を測定した。結果を表１に示
す。
【００３２】
【表１】 上記のように、本願発明の酵素は、Ｎ−アセチルグルコ
サミンに対してもデアセチラーゼ作用を有するが、その
作用は、Ｎ−アセチルグルコサミン６−リン酸を基質と
した場合よりも、弱いものであった。
サミンに対してもデアセチラーゼ作用を有するが、その
作用は、Ｎ−アセチルグルコサミン６−リン酸を基質と
した場合よりも、弱いものであった。
【図面の簡単な説明】
【図１】ビブリオ（Vibrio SP．P2K-5、FERM P-1548
0）由来デアセチラーゼのＮ−アセチルグルコサミン６
−リン酸に対する活性の至適pH曲線を示す。
0）由来デアセチラーゼのＮ−アセチルグルコサミン６
−リン酸に対する活性の至適pH曲線を示す。
【図２】同酵素の温度活性曲線を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 東原 孝規 茨城県つくば市東１丁目１番３ 工業技術 院生命工学工業技術研究所内
Claims (15)
- 【請求項１】低温細菌ビブリオ（Vibrio）属に属し、Ｎ
−アセチルグルコサミン６−リン酸のアセトアミド基に
作用するデアセチラーゼ生産菌を培養し、その培養物か
らＮ−アセチルグルコサミン６−リン酸デアセチラーゼ
を採取することを特徴とする、Ｎ−アセチルグルコサミ
ン６−リン酸デアセチラーゼの製造方法。 - 【請求項２】前記微生物が海洋低温細菌ビブリオ属細菌
P2K-5菌株（Vibriosp. P2K-5菌株、FERM P-15480）で
ある請求項１記載のＮ−アセチルグルコサミン６−リン
酸デアセチラーゼの製造方法。 - 【請求項３】前記Ｎ−アセチルグルコサミン６−リン酸
デアセチラーゼが、５℃から６０℃の範囲で活性を有す
る請求項１または２記載のＮ−アセチルグルコサミン６
−リン酸デアセチラーゼの製造方法。 - 【請求項４】前記Ｎ−アセチルグルコサミン６−リン酸
デアセチラーゼの至適温度が４０−４２℃である請求項
１〜３のいずれかに記載のＮ−アセチルグルコサミン６
−リン酸デアセチラーゼの製造方法。 - 【請求項５】前記Ｎ−アセチルグルコサミン６−リン酸
デアセチラーゼが３０℃までの温度でpH8.5、３０分間
インキュベート後、１００％の活性を保持するＮ−アセ
チルグルコサミン６−リン酸デアセチラーゼの製造方
法。 - 【請求項６】前記Ｎ−アセチルグルコサミン６−リン酸
デアセチラーゼが４０℃までの温度でpH8.5、３０分間
インキュベート後、６０％以上の活性を保持するＮ−ア
セチルグルコサミン６−リン酸デアセチラーゼの製造方
法。 - 【請求項７】請求項１〜６のいずれかの方法により得る
ことができるＮ−アセチルグルコサミン６−リン酸デア
セチラーゼ。 - 【請求項８】５℃から６０℃の範囲で活性を有するＮ−
アセチルグルコサミン６−リン酸デアセチラーゼ。 - 【請求項９】至適温度が４０−４２℃であるＮ−アセチ
ルグルコサミン６−リン酸デアセチラーゼ。 - 【請求項１０】３０℃までの温度でpH8.5、３０分間イ
ンキュベート後、１００％の活性を保持するＮ−アセチ
ルグルコサミン６−リン酸デアセチラーゼ。 - 【請求項１１】４０℃までの温度でpH8.5、３０分間イ
ンキュベート後、６０％以上の活性を保持するＮ−アセ
チルグルコサミン６−リン酸デアセチラーゼ。 - 【請求項１２】Ｎ−アセチルグルコサミン６−リン酸デ
アセチラーゼの生産能を有する低温細菌ビブリオ属に属
する細菌。 - 【請求項１３】前記細菌がP2K-5菌株（Vibrio sp. P2K-
5菌株、FERM P-15480）である請求項１２に記載の細
菌。 - 【請求項１４】低温細菌ビブリオ属に属するＮ−アセチ
ルグルコサミン６−リン酸デアセチラーゼ生産菌。 - 【請求項１５】前記細菌がP2K-5菌株（Vibrio sp. P2K-
5菌株、FERM P-15480）である請求項１４に記載の生産
菌。
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|---|---|---|---|
| JP8075250A JP2824508B2 (ja) | 1996-03-04 | 1996-03-04 | Ｎ−アセチルグルコサミン６−リン酸デアセチラーゼ |
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| JP8075250A JP2824508B2 (ja) | 1996-03-04 | 1996-03-04 | Ｎ−アセチルグルコサミン６−リン酸デアセチラーゼ |
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Cited By (1)
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