JPH09234075A - コバルト輸送活性を有するポリペプチドおよびその遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明の課題は、コバルト輸送活性を有する
ポリペプチドをコードする遺伝子DNA、このDNAを含む組
換え体プラスミド等を提供することにある。 【解決手段】 特定のアミノ酸配列を有するコバルト輸
送活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子DNA。
特定のアミノ酸配列を有するコバルト輸送活性を有する
ポリペプチド。 【効果】 上記遺伝子を細菌内で高発現させることによ
り、コバルトの取り込みを促進させる。その結果、ニト
リルヒドラターゼの活性を向上させる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、コバルト輸送活性
を有するポリペプチドをコードする遺伝子DNA、このDNA
を含む組換え体プラスミド、このDNAおよびニトリルヒ
ドラターゼ遺伝子DNAを含む組換え体プラスミド、およ
び該組換え体プラスミドにより形質転換された形質転換
微生物に関する。

【０００２】

【従来の技術】ニトリル化合物を水和してアミド化合物
に変換する酵素はニトリルヒドラターゼ（NHase)として
知られており、鉄を含むものとコバルトを含むものが知
られている。後者に属するロドコッカス ロドクロウス
J1株のH型ニトリルヒドラターゼは、その能力の高さか
らアクリルアミドの工業生産に利用されている。コバル
ト型のニトリルヒドラターゼを産生する思われる微生物
は、ロドコッカス属細菌の他にもリゾビウム属（特開平
６-25296号公報）やクレブシエラ属（特開平5-30982号
公報）の微生物などが知られている。更に、これらの酵
素を含む微生物触媒を、遺伝子組換えの方法によりさら
に有用なものに改良していく試みがなされており（特開
平4-211379号公報、特開平6-25296号公報、特開平6-303
971号公報）、活性向上を含め触媒改良のための有用な
方法が望まれていた。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】発明者らは、コバルト
酵素であるJ1株L型ニトリルヒドラターゼ遺伝子（特開
平4-211379号公報、Biochim. Biophys. Acta 1129, 23-
33 (1991)）とその約1.9kb下流に存在するアミダーゼ遺
伝子との間に、既知のニッケル輸送ポリペプチドとホモ
ロジーを有するポリペプチドをコードする遺伝子を見い
だした。さらに、この遺伝子を組込み発現させた細菌は
高いコバルト取り込み活性を有することを見いだし、同
一菌体内で上記ニトリルヒドラターゼ遺伝子に加え該遺
伝子を発現させることで、ニトリルヒドラターゼ活性が
向上することを見いだした。

【０００４】そこで、本発明の課題はコバルト輸送活性
を有するポリペプチドをコードする遺伝子DNA、このDNA
を含む組換え体プラスミド等を提供することにある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】すなわち、実質的に配列
番号１のアミノ酸配列を有するコバルト輸送活性ポリペ
プチドの遺伝子DNAである。この遺伝子DNAとしては、ロ
ドコッカス属細菌由来のものが挙げられ、更にこの遺伝
子DNAとしては、例えば配列番号２の塩基配列を有する
ものが挙げられる。なお、ここで「実質的に配列番号１
のアミノ酸配列を有するコバルト輸送活性ポリペプチ
ド」における「実質的に」とは、配列番号１のアミノ酸
配列を有するコバルト輸送活性ポリペプチドの他にその
ポリペプチドがコバルト輸送活性を有する限り前記配列
番号１のアミノ酸配列のうちのいくつかのアミノ酸が欠
失、置換、挿入等の変化があってもよいことを意味する
ものである。また、本発明の遺伝子DNAは、縮重コドン
においてのみ異なる同一のボリペプチドをコードする縮
重異性体をも包含するものであることはいうまでもな
い。

【０００６】更に、本発明はさらに上記遺伝子DNAを含
む組換え体プラスミドである。更に、本発明はさらにニ
トリルヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコード
する遺伝子とコバルト輸送活性ポリペプチドのの遺伝子
DNAとを含む組換え体プラスミドである。

【０００７】更に、本発明は上記組換え体プラスミドに
より形質転換された形質転換微生物である。更に、本発
明は実質的に配列番号１のアミノ酸配列を有するコバル
ト輸送活性ポリペプチドである。以下に、本発明を詳細
に説明する。

【０００８】本発明は、下記の工程により実施されるも
のである。 １）ニトリルヒドラターゼ遺伝子とアミダーゼ遺伝子間
の塩基配列の決定：J1株L型ニトリルヒドラターゼ遺伝
子とその下流に存在するアミダーゼ遺伝子との間の塩基
配列を決定する。

【０００９】２） nhlFの発現ベクターへの挿入：両遺
伝子間に見いだされたオープンリーディングフレームを
コードする遺伝子nhlFを大腸菌発現ベクターpUC1及びpS
TV29に組込みそれぞれプラスミドpLCOexおよびプラスミ
ドpLCOexSTを作製する。なお、プラスミドpLCOexおよび
プラスミドpLCOexSTの制限酵素地図はそれぞれ図４およ
び図５に示す。

【００１０】３）大腸菌形質転換体のコバルト取り込み
活性：作製したプラスミドを大腸菌に導入しコバルト取
り込み活性を測定する。

【００１１】４）J1株染色体DNAの調製：ロドコッカス
ロドクロウスJ1株より染色体DNAを分離、調製する。

【００１２】５）DNAライブラリーの作製：J1株L型ニト
リルヒドラターゼ活性を有するポリペプチドの遺伝子を
有するプラスミドより、J1株由来の遺伝子部分を切り出
しこれを放射線同位元素でラベルしプローブとする。染
色体DNAを制限酵素で切断後、サザーンハイブリダイゼ
ーション法（Southern E. M. , J. Mol. Biol. 98 503
(1975)）により目的遺伝子を含有するDNA断片画分を上
記プロープを用いて検出しする。この画分をプラスミド
ベクターpUC18に挿入しライブラリーとする。

【００１３】６）形質転換体の作製および組換え体DNA
の選別：工程（５）で作製された組換え体DNAのライブ
ラリーによる形質転換体を作製し、その中から工程
（５）で作製したプローブを用いてコロニーハイブリダ
イゼーション法（R. Bruce Wallace. et al. Nuc. Acid
s Res. 9 879 (1981)）により目的の組換え体DNAを含む
形質転換体を選別する。更にサザーンハイブリダイゼー
ション法により目的の組換え体DNAの再確認を行う。

【００１４】７）組換え体プラスミドの精製と制限酵素
地図の作製：工程（６）で得られた組換え体よりプラス
ミドを精製する。こうして得られたプラスミドをpNLU10
と称する。これを種々の制限酵素を用いて切断したもの
について電気泳動で分析し、制限酵素地図を作成する。 ８）調節遺伝子およびNHase遺伝子を含む領域およびロ
ドコッカス属において複製可能なベクタープラスミドか
らなる組換え体プラスミドの作製：工程（７）で得られ
たプラスミドpNLU10、J1株L型ニトリルヒドラターゼ遺
伝子を含むプラスミドpNHJ20Lおよび複合プラスミドベ
クターpK4より、調節遺伝子およびNHase遺伝子を含む領
域およびロドコッカス属において複製可能なベクタープ
ラスミドからなる組換え体プラスミドpLJK10を作製す
る。

【００１５】９）ロドコッカス属細菌の形質転換：工程
（８）で得られたプラスミドpLJK10によりロドコッカス
属細菌を形質転換し、J1株由来のニトリルヒドラターゼ
が発現することを確認する。プラスミドpLJK10から種々
の領域を除いたプラスミドpLJK20〜pLJK60を作製する。

【００１６】10) ロドコッカス属細菌形質転換体のコバ
ルト取り込み活性：工程（９）で得られたプラスミドpL
JK50およびpLJK60を導入した形質転換体についてコバル
ト取り込み活性を測定する。

【００１７】なお、ロドコッカス ロドクロウスJ1株は
FERM BP-1478として生命工学工業技術研究所に寄託され
ている。また、ニトリルヒドラターゼ遺伝子を含むプラ
スミドpNHJ20Lはこれを含有する形質転換体TG1/pNHJ20L
（FERM BP-2778）として、複合プラスミドベクターpK4
はこれを含有する形質転換体ロドコッカス ロドクロウ
スATCC12674/pK4（FERM BP-3731）として、プラスミドp
NLU10はこれを含有する形質転換体JM109/pNLU10（FERM
P-14493）として寄託されている。

【００１８】

【発明の実施の形態】以下、実施例により詳細に説明す
る。ただし、本発明はこれらの実施例により限定される
ものではない。なお、実施例において下記の略語を用い
た。 TE: 10 mM Tris-HCl (pH7.8)-1 mM EDTA (pH8.0) TNE: 50 mM Tris-HCl (pH8.0)-1 mM EDTA (pH8.0)-50 m
M NaCl STE: 50 mM Tris-HCl (pH8.0)-1 mM EDTA (pH8.0)-35 m
M シュークロース LB培地: 1.0%トリプトン、0.5%酵母エキス、0.5% NaCl 2xYT培地: 1.6 % トリプトン、1 % 酵母エキス、0.5% N
aCl MY培地: 1%ポリペプトン、0.3%酵母エキス、0.3%麦芽エ
キス、1%グルコース 培地Ａ： Ｔｒｙｐｔｏｎｅ ５ｇ， Ｙｅａｓｔ
ｅｘｔｒａｃｔ ５ｇ， Ｇｌｕｃｏｓｅ １ｇ， Ｋ
２ＨＰＯ４ １ｇ／ｌ （ｐＨ ７．０）

【００１９】

【実施例】

〔実施例１〕 １）ニトリルヒドラターゼ遺伝子とアミダーゼ遺伝子間
の塩基配列の決定 Ｊ１株L型ニトリルヒドラターゼ遺伝子を含む9.4kbDNA
断片がpUC19ベクターに組み込まれたプラスミドpNHJ20L
（特開平4-211379号公報、Biochim. Biophys. Acta 112
9, 23-33 (1991)）に含まれ、ニトリルヒドラターゼ遺
伝子とアミダーゼ遺伝子（Eur. J. Biochem. 217, 327-
336 (1993)）の間の制限酵素EcoRIで挟まれる約1.5 kb
の領域の塩基配列については全く知られていなかった。
そこで、この領域の塩基配列の決定を行った。塩基配列
の決定はTth DNA polymeraseを用いたチェーンターミネ
ーション法（Sanger F. Science 214, 1205-1210 (198
0)）により行った。塩基配列が決定されていなかった制
限酵素EcoRIで挟まれる約1.5 kbの領域を決定した。こ
の前後の領域を含む2,040bpの長さの塩基配列を配列番
号３に示した。

【００２０】その結果、ニトリルヒドラターゼ遺伝子と
アミダーゼ遺伝子の間には二つのオープンリーディング
フレームが見いだされた。nhlFと名付けた２番目のオー
プンリーディングフレームにコードされるポリペプチド
についてポリペプチドデータベース(SWISS PROT)をホモ
ロジー検索したところ、ニッケル輸送ポリペプチドやウ
レアーゼのアクセサリーポリペプチドとホモロジーを有
することが見いだされた。

【００２１】２） nhlFの発現ベクターへの挿入 L型ニトリルヒドラターゼがコバルトポリペプチドであ
ることから、nhlFがコバルト輸送ポリペプチドをコード
する遺伝子ではないかと考えられた。そこで、PCR法に
よりnhlFを増幅し発現ベクターpUC19(宝酒造製) および
低コピーベクターpSTV29(宝酒造製) に挿入し、プラス
ミドpLCOex（pUC19由来）およびpLCOexST（pSTV29由
来）を作製した。

【００２２】プラスミドの作製は以下のようにして行っ
た。これらのベクターpUC19 またはpSTV2910μLに対
し、制限酵素用緩衝液（10倍濃度）3 μL、制限酵素Hin
dIIIとPstIをそれぞれ 2μL、滅菌水 13 μLを加え37℃
にて２時間反応させた。反応液に等量のTE飽和フェノー
ルを加え攪拌後遠心し上層（水層）と下層に分離させ
た。上層についてこの操作を2回繰り返した後、同量の
クロロホルムを加え同様の抽出操作を2回繰り返した。
上層に3μLの3M酢酸ナトリウムと90μLのエタノールを
加え、-80℃にて30分間放置後遠心し、乾燥してTEに溶
解した。一方、次の条件で増幅したPCR生成物を上記と
同様の条件でHindIIIとPstIで切断、精製断片を得た。

【００２３】反応液（100μL）： 67mM Tris-HCl (pH
8.3 )、6.7mM MgCl2、0.2mM dNTP、鋳型としてpNHJ20L
100ng 1μM プライマー1（センス）： 5'CTGCGAAGCTTAAGGAGGAAATAGGTATGACCAGCACCACC3' 1μM プライマー２（アンチセンス）： 5'GGGTATCTCGGTGGCTGCAGTGATCGTGGGC3' 反応温度： 94℃ 60秒、55℃ 60秒、75℃ 180秒、30サ
イクル

【００２４】こうして得られたベクター断片と挿入断片
をTAKARAライゲーションキットを用いて4℃で一晩反応
させることにより結合させた。これらの反応液を用いて
大腸菌を形質転換し、形質転換体より目的のプラスミド
を抽出した。大腸菌の形質転換は以下のように行った。
大腸菌JM109株を2xYT培地10mLに37℃で12時間培養後、
新規な同培地に前記培養菌を１%植菌し２時間培養し
た。遠心により集菌した後、冷50 mM CaCl2溶液を 5mL
加え、0℃で40分間放置後、再度遠心し、冷50 mMCaCl2
溶液0.25 mLに懸濁した。これに上記反応液60μLを加
え、０℃で40分間放置後、42℃で２分間ヒートショック
を与え、2xYT培地1 mLを加え37℃にて60分間振盪培養し
た。100 μLずつをアンピシリン50μg / mL含有2xYT寒
天培地にまき、37℃で培養した。寒天培地上に生育した
コロニーをアンピシリン50μg / mL含有2xYT培地1.5 mL
にて培養し、プラスミドを抽出し、目的の挿入断片が組
み込まれているかを確認した。

【００２５】３）大腸菌形質転換体のコバルト取り込み
活性 工程２）において作製したプラスミドが導入された形質
転換体のコバルト取り込み活性を調べた。大腸菌JM109/
pLCOexおよびJM109/pLCOexSTを1mM IPTGを含むLB培地で
培養後、集菌し、緩衝液50 mM Tris-HCl, 10mM MgCl2
(pH7.5)にて一回洗浄し、10 mLの同緩衝液に菌体濃度が
約0.1 mg dry cell / mLとなるように懸濁した。30℃で
5分間放置後、放射性57CoCl2を加えて反応を開始した。
5分おきに100μLずつサンプリングし、0.45μmのメンブ
レンフィルター上に捕集し、乾燥後γカウンターで放射
能を計測して、菌体内に取り込まれたコバルトの量を測
定した。図１に示すようにnhlFを含むプラスミドを導入
した大腸菌は高いコバルト取り込み活性を示し、nhlFは
コバルトの取り込みに関与していることが明らかとなっ
た。

【００２６】〔実施例２〕 １）染色体DNAの調製 ロドコッカス ロドクロウス J1株(FERM BP-1478)を100
mLの培地（グルコース、KH2PO4、K2HPO4、MgSO4・7H2
O、酵母エキス、ペプトン、CoCl2、尿素、水1L、pH7.
2）で培養後、集菌した。TENで洗浄後、10mLのTEに懸濁
し、0.25M EDTA4mL、リゾチーム10〜20 mg、アクロモプ
ロテアーゼ10〜20 mgおよび10%SDS 10 mLを加え、37℃
で3時間放置後、遠心し、上清を得た。2.5M酢酸ナトリ
ウム溶液0.7mL、ジエチルエーテルを加え遠心し、上層
を捨て下層に2倍溶のエタノールを加えガラス棒でDNAを
巻き取った。これをTE：エタノール（容積比）2:1、1:
9、0:10の各溶液に5分間ずつ浸した後、2〜4 mLのTEに
溶かし、RNase AとT1の混合物10μLを加え37℃で処理し
た。次に、TEで飽和されたフェノールを等量加え、遠心
後の上層に等量以上のエーテルを加え、下層を得た。こ
れをクロロホルムを少量添加した2LのTEで一晩透析し、
2回目の透析を3〜4時間行い、染色体DNA標品4mLを得
た。

【００２７】２）DNAライブラリーの作製 J1株L型ニトリルヒドラターゼ遺伝子を含む9.4kbDNA断
片がpUC19ベクターに組み込まれたプラスミドpNHJ20L
（特開平4-211379号公報、Biochim. Biophys. Acta 112
9, 23-33 (1991)）を制限酵素SacIとEcoRIで切断後、1
kbのSacI-EcoRI断片を1%アガロースゲル電気泳動により
分離し、ゲルより切り出し回収した。制限酵素による切
断は以下のように行った。pNHJ20L 10μLに対し、制限
酵素用緩衝液（10倍濃度）3 μL、制限酵素SacIおよびE
coRIをそれぞれ２μL、滅菌水13μLを加え37℃にて２時
間反応させた。

【００２８】J1株染色体DNAをEcoRIにより切断した標品
についてアガロースゲル電気泳動を行った。上記1.35 k
b SacI-EcoRI断片を放射性同位元素P32でラベルし、こ
れをプローブとしてサザーンハイブリダイゼーション法
により上流域を含む約7.5 kbのDNA断片を検出した。プ
ローブによりハイブリダイズした7.5 kb断片を含むDNA
断片画分をアガロースゲルより切り出し、EcoRIで切断
したプラスミドベクターpUC18に挿入した。

【００２９】pUC18の切断は以下のように行った。pUC18
10μLに対し、制限酵素用緩衝液（10倍濃度）3 μL、
制限酵素EcoRIをそれぞれ ２μL、滅菌水 13 μLを加
え30℃にて２時間反応させた。反応液に等量のTE飽和フ
ェノールを加え攪拌後遠心し上層（水層）と下層に分離
させた。上層についてこの操作を２回繰り返した後、同
量のクロロホルムを加え同様の抽出操作を2回繰り返し
た。上層に３μLの3M酢酸ナトリウムと90μLのエタノー
ルを加え、-80℃にて30分間放置後遠心し、乾燥してTE
に溶解した。7.5 kb EcoRI断片を含むDNA断片画分３μL
を、上記のようにして調製したEcoRI切断pUC18 1μLと
TAKARAライゲーションキットを用いて4℃で一晩反応さ
せることによりpUC18への挿入を行い、DNAライブラリー
とした。

【００３０】３）形質転換体の作製および組換え体DNA
の選別 大腸菌JM109株を2xYT培地10mLに37℃で12時間培養後、
新規な同培地に1%植菌し2時間培養した。遠心により集
菌した後、冷50 mM CaCl2溶液を 5mL加え、0℃で40分間
放置後、再度遠心し、冷50 mM CaCl2溶液0.25 mLに懸濁
した。これに工程２）で作製した組換え体プラスミドを
含有する溶液（DNAライブラリー）を60μLを加え、0℃
で40分間放置後、42℃で2分間ヒートショックを与え、2
xYT培地1mLを加え37℃にて60分間振盪培養した。これを
100 μLずつアンピシリン50μg/ mL含有2xYT寒天培地に
まき、37℃で培養した。寒天培地上に生育した形質転換
体コロニーについてコロニーハイブリダイゼーションを
行い、ニトリルヒドラターゼ遺伝子上流域を含む形質転
換体を選別した。すなわち、寒天培地上に生育させたコ
ロニーをニトロセルロースフィルター上に移し、菌体を
溶かしてDNAを固定した後、これを工程２）で作製した
プローブ（1.35 kb断片）で処理し、オートラジオグラ
フ法で目的の組換え体DNAを含むコロニーを選択した。
更に、この選択したコロニーから組換え体プラスミドを
抽出し、サザンハイブリダイゼーション法によって上述
のプローブとハイブリダイズさせ、選抜したコロニーが
目的遺伝子を含む形質転換体であることを再確認した。

【００３１】４）組換え体プラスミドの精製と制限酵素
地図の作製 工程３）で選択した形質転換体を100 mLの2xYT培地にて
37℃一晩培養し、集菌後、TNEにより洗浄し、STEを8 m
L、リゾチームを10 mg加え、0℃で5分間放置した。0.25
M EDTA 4 mL加え、さらに室温で10 % SDS 2 mL, 5 M N
aCl 5 mLを加え、0〜4℃で3時間放置した。これを超遠
心し、その上澄みに30 % PEG6000を1/2当量加え、0〜4
℃で一晩放置し、遠心後TNEに溶解して7.5 mLとした。C
sClを加えた後遠心により除タンパクを行い、臭化エチ
ジウム溶液を300〜500 mg/mL加えシールチューブに移
し、熱シールし超遠心を行った。cccDNAを回収し、水飽
和イソプロピルアルコールを当量以上加えて臭化エチジ
ウムを除き、TEで透析し精製した組換え体プラスミド約
３mLを得た。これをpNLU10と命名した。この組換え体プ
ラスミドを数種の制限酵素を用いて切断し、図２に示さ
れる制限酵素地図を作製した。

【００３２】５）調節遺伝子およびNHase遺伝子を含む
領域およびロドコッカス属菌において複製可能なベクタ
ープラスミドからなる組換え体プラスミドの作製 工程４）で得られたプラスミドpNLU10は、ニトリルヒド
ラターゼ遺伝子を含むpNHJ20Lに含まれるJ1株由来のDNA
断片と1.35 kbオーバーラップし、更に6.15 kb上流まで
を含んでいる。pNLU10より6.15 kbのEcoRI-SacI断片を
切り出し、プラスミドpBluescript SK+に挿入してプラ
スミドpNLU20を作製した。次に、pNHJ20Lより9.4 kbのS
acI断片を切り出し、pNLU20に正しい向きになるように
挿入してプラスミドpNLUD30を作製した。更にpNLUD30よ
り14.55 kbのHindIII断片を切り出し、大腸菌-ロドコッ
カス属細菌用複合プラスミドベクターpK4に挿入し、プ
ラスミドpLJK10を作製した。pLJK10の作製過程を図３に
示す。

【００３３】６）ロドコッカス属細菌の形質転換 ロドコッカス ロドクロウスATCC12674株の対数増殖期
の細胞を遠心分離により集菌し、氷冷した滅菌水にて３
回洗浄し、15%PEG6000（ポリエチレングリコール6000）
溶液に懸濁した（菌体濃度109 cell / mL以上）。工程
（５）で作製したプラスミド DNAまたはベクターDNA 1
μgと菌体懸濁液100μLを混合し、氷冷した。ジーンパ
ルサー用のチャンバーにDNAと菌体の混合液を入れ、氷
冷した後、静電容量 25 μF，抵抗 400オーム、電場強
度20 kV/cmで電気パルス処理を行った。

【００３４】電気パルス処理液を氷冷下１０分間静置
し、３７℃、５分間熱処理後、ＭＹ培地 1mlを加え、２
５℃、３時間振とうした。50μg/mlカナマイシン入りＭ
Ｙ寒天培地に塗布し28℃、2日間培養した。出現したコ
ロニーが明らかにカナマイシン耐性であることを別に作
成したカナマイシン入りＭＹ寒天培地に塗布することに
より確認した。

【００３５】こうして作製したロドコッカス属細菌組換
え体を、誘導物質としてクロトンアミド（2 g /L）を含
む培地（グリセロール 10 g、ポリペプトン 5 g、酵母
エキス 3 g、麦芽エキス 3 g、KH2PO4 1 g、K2HPO4 1
g、CoCl2・6H2O 0.01 g、(pH7.0) / L）にて28℃2日間培
養し、ニトリルヒドラターゼの活性測定を行った。培養
液より遠心分離により集菌し、150 mM NaClで洗浄後、
0.35 % n-酪酸を含む0.1 M HEPES-KOH(pH7.2)に菌体を
懸濁した。活性測定は以下のように行った。適当に水で
希釈した菌体懸濁液0.25 mLに100 mMリン酸カリウム緩
衝液(pH7.0)を0.25mL、12 mMのベンゾニトリルを0.5 mL
加え20℃にて10分間反応後、1N HClを0.1mL加えること
により反応を停止させた。生成するベンズアミドの定量
をHPLCにより行った。

【００３６】ロドコッカス ロドクロウスATCC12674/pL
JK10では、誘導物質を含まない培地で培養した場合には
ベンズアミドの生成が0.016 mMと低かったのに対して、
クロトンアミドを添加した場合には1.1 mMのベンズアミ
ドが生成していた。ロドコッカス ロドクロウスATCC12
674/pK4（FERM BP-3731) では、いずれの場合もベンズ
アミドの生成は認められなかった。

【００３７】pLJK10より欠失プラスミドpLJK20〜60を作
製した。プラスミドpLJK20からプラスミドpLJK60までの
作製にあたっては、図６に示したようにpNLUD30より8.3
kbのKpnI断片、11.8 kbのEcoRV-HindIII断片、5.45 kb
のPstI断片、3.2 kbのKpnI断片をそれぞれ切り出し、pK
4に挿入することにより作製した。ただし、pLJK10、pLJ
K20、pLJK30については、切断断片の末端をTAKARAのBla
nting Kitを用いて平滑化してからライゲーションを行
った。

【００３８】７）ロドコッカス属細菌形質転換体のコバ
ルト取り込み活性 ロドコッカス ロドクロウスATCC12674株の対数増殖期
の細胞を遠心分離により集菌し、氷冷した滅菌水にて３
回洗浄し、15%PEG6000（ポリエチレングリコール6000）
溶液に懸濁した（菌体濃度 10⁹cell/mL 以上）。工程
(7)で作製したプラスミド pLJK50、pLJK60またはベクタ
ーpK4 1μgと菌体懸濁液100μLを混合し、氷冷した。
ジーンパルサー用のチャンバーにDNAと菌体の混合液を
入れ、氷冷した後、静電容量 25 μF，抵抗 400オー
ム、電場強度20 kV/cmで電気パルス処理を行った。

【００３９】電気パルス処理液を氷冷下１０分間静置
し、３７℃、５分間熱処理後、ＭＹ培地 1mlを加え、２
５℃、３時間振とうした。50μg/mlカナマイシン入りＭ
Ｙ寒天培地に塗布し28℃、2日間培養した。出現したコ
ロニーが明らかにカナマイシン耐性であることを別に作
成したカナマイシン入りＭＹ寒天培地に塗布することに
より確認した。これらのコロニーを培地Aにて28℃、24
時間培養した。集菌後、氷冷した緩衝液[50 mM Tris-HC
l, 10 mM MgCl2 (pH 7.5)]で一回洗浄し、同緩衝液に再
懸濁し菌体懸濁液を得た。

【００４０】pK4, pLJK50およびpLJK60をそれぞれ含む
ロドコッカス ロドクロウス ATCC12674の形質転換体の
菌体懸濁液（菌体濃度が約0.1mg.dry cell/ml）10 mlを
30℃で5分間プリインキュベートした後、放射性57CoCl2
を加え反応を開始した。5分おきに100mlずつサンプリン
グし、0.45mmのメンブレンフィルター上に捕集し、乾燥
後、g-カウンターで放射能を計測して、菌体内に取り込
まれたコバルトの量を測定した。結果を図７に示した。
nhlFを含まないpLJK60やベクターpK4を導入したロドコ
ッカス ロドクロウス ATCC12674ではコバルトの取り込
みはほとんど認められなかったが、nhlFを含むpLJK50を
導入したものでは高いコバルト取り込み活性が認められ
た。

【００４１】〔実施例３〕実施例２において作製した組
換え体ロドコッカス ロドクロウス ATCC12674/pLJK5
0、ATCC12674/pLJK60およびATCC12674/pK4 を、CoCl2を
含む培地Aにて28℃2日間培養し、実施例2と同様の方法
によりニトリルヒドラターゼの活性測定を行った。CoCl
₂の最終濃度は0,1,2,3,4,5μMの6種で行った。

【００４２】その結果、図８に示すように、nhlFを含む
pLJK50を導入したものではnhlFを含まないpLJK60やベク
ターを導入したものよりも高いニトリルヒドラターゼ活
性を示した。図中、黒色の棒グラフはロドコッカス ロ
ドクロウス ATCC12674/pLJK50を、網かけの棒グラフは
ロドコッカス ロドクロウスATCC12674/pLJK60をそれぞ
れ示す。

【００４３】

【配列表】

配列番号１： 配列の長さ： 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ポリペプチド 起源 生物名：ロドコッカス ロドクロウス（Rhodococcus rh
odochrous） 株名：J1配列： MetThrSerThrThrIleThrProHisHisIleGlyGlyAlaTrp 15 ThrArgThrGluArgArgArgLeuAlaSerValValGlyAlaIle 30 ValIleLeuHisValLeuGlyValAlaLeuTyrLeuGlyTyrSer 45 GlyAsnProAlaAlaAlaGlyGlyLeuAlaGlySerGlyValLeu 60 AlaTyrValLeuGlyValArgHisAlaPheAspAlaAspHisIle 75 AlaAlaIleAspAspThrThrArgLeuMetLeuLeuArgGlyArg 90 ArgProValGlyValGlyPhePhePheAlaMetGlyHisSerThr 105 ValValValValLeuAlaLeuValValAlaLeuGlyAlaSerAla 120 LeuThrThrThrGluLeuGluGlyValGlnGluIleGlyGlyLeu 135 ValAlaThrValValAlaValThrPheLeuSerIleValAlaGly 150 LeuAsnSerValValLeuArgAsnLeuLeuCysLeuSerArgGln 165 ValArgAlaGlySerAspIleThrGlyAspLeuGluSerArgLeu 180 SerGluArgGlyLeuPheThrArgLeuLeuGlyAsnArgTrpArg 195 GlyLeuValArgSerSerTrpHisMetTyrProValGlyLeuLeu 210 MetGlyLeuGlyLeuGluThrAlaSerGluValThrLeuLeuThr 225 LeuThrAlaSerAlaAlaThrGlyGlyThrLeuSerIleAlaAla 240 ValLeuSerLeuProLeuLeuPheAlaAlaGlyMetSerThrPhe 255 AspThrAlaAspSerLeuPheMetThrArgAlaTyrSerTrpSer 270 TyrGlnAspProGlnArgArgLeuAsnPheAsnIleAlaThrThr 285 GlyAlaThrValValIleGlyLeuPheValAlaGlyIleTyrVal 300 CysAlaLeuLeuAlaHisLeuProMetPheAlaAlaLeuSerPro 315 IleGlyAspIleSerGluAsnPheGluPheLeuGlyTyrAlaVal 330 AlaAlaAlaPheIleLeuThrTrpThrGlyAlaLeuLeuPheAsn 345 HisLeuLysProGlnArgAsn 352

【００４４】配列番号２： 配列の長さ：1059 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 起源 生物名：ロドコッカス ロドクロウス（Rhodococcus rh
odochrous） 株名：J1 配列： TTG ACC AGC ACC ACC ATT ACA CCG CAC CAC ATA GGT GGT GCC TGG 45 ACT CGA ACC GAG CGT CGA CGG TTG GCG TCC GTT GTC GGT GCC ATC 90 GTG ATC CTG CAC GTC TTG GGC GTG GCG CTG TAC TTG GGA TAC TCG 135 GGC AAC CCG GCA GCG GCC GGG GGC CTC GCC GGA TCC GGT GTG CTC 180 GCC TAC GTG CTC GGC GTT CGT CAC GCA TTC GAC GCC GAC CAC ATC 225 GCG GCA ATC GAC GAC ACG ACA CGC CTG ATG CTG CTA CGG GGA CGC 270 CGT CCC GTC GGA GTC GGA TTC TTC TTC GCG ATG GGA CAC TCG ACC 315 GTC GTC GTT GTC CTT GCC CTC GTC GTG GCA CTG GGC GCG AGC GCC 360 CTA ACC ACG ACC GAA CTC GAA GGA GTA CAG GAA ATC GGC GGG TTG 405 GTC GCC ACC GTC GTC GCC GTC ACC TTC CTG TCG ATC GTT GCA GGA 450 CTC AAC AGT GTG GTC CTG CGC AAT CTG CTT TGC CTG TCC CGA CAG 495 GTA CGC GCC GGA TCG GAC ATC ACC GGC GAC CTC GAG AGC AGA CTC 540 AGT GAG CGC GGG CTG TTC ACC CGC CTA CTG GGC AAC CGC TGG CGC 585 GGA CTG GTT CGA TCG TCC TGG CAC ATG TAC CCC GTC GGC CTG TTG 630 ATG GGA CTG GGG CTC GAG ACC GCC TCC GAG GTC ACC TTG CTC ACC 675 CTC ACC GCC TCG GCA GCC ACC GGG GGC ACG TTG TCG ATA GCC GCT 720 GTG CTC AGC CTC CCG TTG CTC TTC GCC GCG GGG ATG AGC ACG TTC 765 GAC ACA GCG GAC TCC TTG TTC ATG ACC CGC GCA TAC TCG TGG TCG 810 TAC CAG GAC CCC CAG CGT CGA CTG AAC TTC AAC ATT GCG ACG ACC 855 GGC GCC ACC GTG GTC ATC GGC CTC TTC GTA GCC GGC ATC TAC GTA 900 TGT GCA CTA CTG GCA CAC CTG CCC ATG TTC GCT GCG CTG TCC CCG 945 ATC GGT GAC ATC TCC GAA AAC TTC GAA TTC CTC GGC TAC GCC GTC 990 GCA GCC GCC TTC ATC CTC ACC TGG ACA GGC GCG TTG CTG TTC AAT 1035 CAC CTG AAA CCT CAA CGG AAC TGA 1059

【００４５】配列番号３： 配列の長さ：2040 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 起源 生物名：ロドコッカス ロドクロウス（Rhodococcus rh
odochrous） 株名：J1 配列： GCCGGCACCGAGAACTTCACCGAAGAACAACTCGCCGACCTCGTCACCCGCGACTCGCTC AlaGlyThrGluAsnPheThrGluGluGlnLeuAlaAspLeuValThrArgAspSerLeu nhlE ATCGGCGTATCCGTCCCCACCACACCCAGCAAGGCCTGACATGCCCCGACTCAACGAACA IleGlyValSerValProThrThrProSerLysAla*** MetProArgLeuAsnGluGln ACCCCACCCGGGTCTCGAAGCCAACCTCGGCGACCTGGTACAGAATCTGCCGTTCAACGA ProHisProGlyLeuGluAlaAsnLeuGlyAspLeuValGlnAsnLeuProPheAsnGlu ACGAATCCCCCGCCGCTCCGGCGAGGTCGCCTTCGATCAGGCCTGGGAGATCCGCGCCTT ArgIleProArgArgSerGlyGluValAlaPheAspGlnAlaTrpGluIleArgAlaPhe EcoRI CAGCATTGCCACCGCATTGCATGGCCAGGGCCGATTCGAATGGGACGAATTCCAGTCCCG SerIleAlaThrAlaLeuHisGlyGlnGlyArgPheGluTrpAspGluPheGlnSerArg CCTGATCGAGTCGATCAAACAGTGGGAAGCCGAACACGCCACCACCGAGCAGTGGAGTTA LeuIleGluSerIleLysGlnTrpGluAlaGluHisAlaThrThrGluGlnTrpSerTyr CTACGAGCGTTGGATGCTCGCACTCGAAGAGCTGCTGCACGACAAGGGATTTGTCGCAGG TyrGluArgTrpMetLeuAlaLeuGluGluLeuLeuHisAspLysGlyPheValAlaGly CGAGGAACTCGCGCACCGTACCGAGCAGGTGCTGGCAACGCCCGCCGGCGCCCATCACCA GluGluLeuAlaHisArgThrGluGlnValLeuAlaThrProAlaGlyAlaHisHisGln GCACGCCGTGCGTGATCCCATCGCCGTGCACGCCATCGGCACACGCACCACTGACTCCGA HisAlaValArgAspProIleAlaValHisAlaIleGlyThrArgThrThrAspSerAsp CGGGTAGCCGGAACCTCGTCGCCGCGAACCCAGCGGGTTCACCAACGTCGAGTCGCTCCC Gly*** GGAAGCGCGCCCCGTGTAACGACGACTGTTGGTGCGAACCCCGAACGCCGCGACATCAGT ATCTTCCCGGTCTTCAGACCCGGCTCCACCGCGGACCTACGGAGCGTCACCGGTACCGCG GCTCGAATCGGGCCGGATCATCCCCGCACCGCACCCGCGGCACCCCGAACATTTCAGTCT nhlF CAGGCGTATCCGAAAAACGCTGCGAATCATCTGAAGGACAAGCGTTTGACCAGCACCACC MetThrSerThrThr ATTACACCGCACCACATAGGTGGTGCCTGGACTCGAACCGAGCGTCGACGGTTGGCGTCC IleThrProHisHisIleGlyGlyAlaTrpThrArgThrGluArgArgArgLeuAlaSer GTTGTCGGTGCCATCGTGATCCTGCACGTCTTGGGCGTGGCGCTGTACTTGGGATACTCG ValValGlyAlaIleValIleLeuHisValLeuGlyValAlaLeuTyrLeuGlyTyrSer GGCAACCCGGCAGCGGCCGGGGGCCTCGCCGGATCCGGTGTGCTCGCCTACGTGCTCGGC GlyAsnProAlaAlaAlaGlyGlyLeuAlaGlySerGlyValLeuAlaTyrValLeuGly GTTCGTCACGCATTCGACGCCGACCACATCGCGGCAATCGACGACACGACACGCCTGATG ValArgHisAlaPheAspAlaAspHisIleAlaAlaIleAspAspThrThrArgLeuMet CTGCTACGGGGACGCCGTCCCGTCGGAGTCGGATTCTTCTTCGCGATGGGACACTCGACC LeuLeuArgGlyArgArgProValGlyValGlyPhePhePheAlaMetGlyHisSerThr GTCGTCGTTGTCCTTGCCCTCGTCGTGGCACTGGGCGCGAGCGCCCTAACCACGACCGAA ValValValValLeuAlaLeuValValAlaLeuGlyAlaSerAlaLeuThrThrThrGlu CTCGAAGGAGTACAGGAAATCGGCGGGTTGGTCGCCACCGTCGTCGCCGTCACCTTCCTG LeuGluGlyValGlnGluIleGlyGlyLeuValAlaThrValValAlaValThrPheLeu TCGATCGTTGCAGGACTCAACAGTGTGGTCCTGCGCAATCTGCTTTGCCTGTCCCGACAG SerIleValAlaGlyLeuAsnSerValValLeuArgAsnLeuLeuCysLeuSerArgGln GTACGCGCCGGATCGGACATCACCGGCGACCTCGAGAGCAGACTCAGTGAGCGCGGGCTG ValArgAlaGlySerAspIleThrGlyAspLeuGluSerArgLeuSerGluArgGlyLeu TTCACCCGCCTACTGGGCAACCGCTGGCGCGGACTGGTTCGATCGTCCTGGCACATGTAC PheThrArgLeuLeuGlyAsnArgTrpArgGlyLeuValArgSerSerTrpHisMetTyr CCCGTCGGCCTGTTGATGGGACTGGGGCTCGAGACCGCCTCCGAGGTCACCTTGCTCACC ProValGlyLeuLeuMetGlyLeuGlyLeuGluThrAlaSerGluValThrLeuLeuThr CTCACCGCCTCGGCAGCCACCGGGGGCACGTTGTCGATAGCCGCTGTGCTCAGCCTCCCG LeuThrAlaSerAlaAlaThrGlyGlyThrLeuSerIleAlaAlaValLeuSerLeuPro TTGCTCTTCGCCGCGGGGATGAGCACGTTCGACACAGCGGACTCCTTGTTCATGACCCGC LeuLeuPheAlaAlaGlyMetSerThrPheAspThrAlaAspSerLeuPheMetThrArg GCATACTCGTGGTCGTACCAGGACCCCCAGCGTCGACTGAACTTCAACATTGCGACGACC AlaTyrSerTrpSerTyrGlnAspProGlnArgArgLeuAsnPheAsnIleAlaThrThr GGCGCCACCGTGGTCATCGGCCTCTTCGTAGCCGGCATCTACGTATGTGCACTACTGGCA GlyAlaThrValValIleGlyLeuPheValAlaGlyIleTyrValCysAlaLeuLeuAla EcoRI CACCTGCCCATGTTCGCTGCGCTGTCCCCGATCGGTGACATCTCCGAAAACTTCGAATTC HisLeuProMetPheAlaAlaLeuSerProIleGlyAspIleSerGluAsnPheGluPhe CTCGGCTACGCCGTCGCAGCCGCCTTCATCCTCACCTGGACAGGCGCGTTGCTGTTCAAT LeuGlyTyrAlaValAlaAlaAlaPheIleLeuThrTrpThrGlyAlaLeuLeuPheAsn CACCTGAAACCTCAACGGAACTGAAGGCGCCCACGATCACATCAGCCACCGAGATACCCA HisLeuLysProGlnArgAsn*** TAACGCTGACGGACACTTACGACACAGCGCACCGAGCGATCCCTCCCTCCCCCACTCGAT amdA GATGCTGTTCACATATTCGAAGGGAACCTCATGTCTTCGTTGACTCCCCCCAATTCCAAC MetSerSerLeuThrProProAsnSerAsn

【図面の簡単な説明】

【図１】大腸菌JM109/pLCOexおよびJM109/pLCOexSTのコ
バルト取り込み活性を示す図。

【図２】組換え体プラスミドpNLU10の制限酵素地図を示
す図。

【図３】組換え体プラスミドpLJK10の作製方法を示す
図。

【図４】プラスミドpLCOexの制限酵素地図を示す図。

【図５】プラスミドpLCOexSTの制限酵素地図を示す図。

【図６】組換え体プラスミドpLJK10〜pLJK60にに挿入さ
れているDNA断片を示す図。白抜き四角は本発明におい
て塩基配列を決定した領域を示す。太い矢印は調節遺伝
子を示す。

【図７】ロドコッカス ロドクロウス ATCC12674/pLJK5
0、ATCC12674/pLJK60およびATCC12674/pK4 のコバルト
取り込み活性を示す図。

【図８】ロドコッカス ロドクロウス ATCC12674/pLJK5
0およびATCC12674/pLJK60のニトリルヒドラターゼ活性
を示す図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/88 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 実質的に配列番号１のアミノ酸配列を有
   するコバルト輸送活性ポリペプチドの遺伝子DNA
2. 【請求項２】 コバルト輸送活性ポリペプチドの遺伝子
   DNAが配列番号２の塩基配列を有するものである、請求
   項１記載の遺伝子DNA
3. 【請求項３】 コバルト輸送活性ポリペプチドの遺伝子
   DNAがロドコッカス属細菌由来のものである、請求項1ま
   たは請求項２に記載の遺伝子DNA
4. 【請求項４】 請求項１または２に記載の遺伝子DNAを
   含む組換え体プラスミド
5. 【請求項５】 ニトリルヒドラターゼ活性を有するポリ
   ペプチドをコードする遺伝子と請求項１または２に記載
   の遺伝子DNAとを含む組換え体プラスミド
6. 【請求項６】 請求項４または５に記載の組換え体プラ
   スミドにより形質転換された形質転換微生物
7. 【請求項７】 実質的に配列番号１のアミノ酸配列を有
   するコバルト輸送活性ポリペプチド