JPH01502397A - Ｍ―ｃｓｆの生産方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｍ−Ｃ５Ｆの生産 本発明は、新規なりＮＡ配列および組換えＤＮＡ分子を用いてヒ）　Ｍ　−ＣＳ Ｆ糖タンパク質を生産する方法に関する。

発明の背景 −Ｖ　−ＣＳＦ　ｉたはＣ３Ｆ−１はマクロファージコロニーの生存、増殖およ び分化を促進する能力によって特徴づけられるタンパク質であシ、それ故にマク ロファージコロニー刺激因子［Ｍ　−ＣＳＦと略す〕と名づけられた。

Ｍ−Ｃ５Ｆは何年もの間ネズミＭよびヒト系でそれを検出するためのアッセイに 関する多数の論文の主題であった。同様に、天然源からこのタンパク質を精製す る方法も開示された。例えば、ｐｃｒ出願ＷＯ８６１０４５８７は、イムノアフ ィニティークロマトグラフィーおよび逆相高圧クロマトグラフィーな用いて天然 源からヒトおよびネズミＣ３Ｆ−１タンパク質を精製する方法を開示している。

例えばスタンレー（ｐ：、Ｒ，Ｓｔａｎｌｇｙ）ら、よびｐｃｒ出願ＷＯ３６１ ０４５８７に引用された文献を参照されたい。

ヒトＣ３Ｆ−１の一形態をコードするｃ　Ｄ　／Ｖ　Ａ配列が２９１−２９６（ １９８５）によって報告された。さらに、公開ＰＣＴ出願ＷＯ３６１０４６０７ は、そのｃＤＮＡ配列によりコードされるタンパク質を組換え法で生産する方法 を開示している。

当分野では、造血系疾患を治療するために天然に存在するヒト尿Ｍ　−ＣＳ　Ｆ に類似した他のヒトｃｓｐ−１−＝たはＭ−Ｃ５Ｆを生産する必要性が依然とし て残されて本発明の１つの面として、驚いたことに、他のヒトタンパク質と実質 的に会合しておらず、今までに同定されたことのない、ヒトＨ−Ｃ５Ｆタンパク 質を生産する新規方法が開発された。この方法は、従来技術において記載された 配列と有意に異なるＭ−Ｃ５Ｆタンパク質をコードする新規ｃ　Ｄ　Ａ’　Ａ配 列で形質転換された適当な細胞を培養することから成っている。この新規配列は 天然ヒ）　、ｉｉ−〇　Ｓ　Ｆの生物学的および生化学的特性を示し且つ表■に 示したアミノ酸＃１からアミノ酸＃２２３までのペプチド配列と同じであるか又 は実質的に同じペプチド−配列を含むことによシ特徴づけられるタンパク質をコ ードしている。

表Ｉは発現の際ＫＭ−Ｃ５Ｆタンパク質をコードする完全な４ＫｂのＤＮＡ配列 を示す。この配列は１６６２ヌクレオチドの長鎖翻訳オープン・リーディング・ フレームを含み、５５４個のアミノ酸から成るポリペプチドをコードしている。

３つの部分、すなわちヌクレオチド＃１〜＃４１５、ヌクレオチド＃４１９〜＃ ６８９、およびヌクレオチド＄１５８４〜＄１８２３はカワサキらの上記文献記 載の配列にも存在している。しかしながら、ヌクレオチド＃４１６〜＃４１８お よび＃６９０〜＃１５８３はコード配列のリーディング・フレームを乱さない新 規配列を表す。４Ｋｂ配列のタンパク質コード領域はヌクレオチド＃１４６（メ チオニンコドン中のアデニン）からヌクレオチド＃１８０７（この後にＴＡＧ停 止コドンが続り）マでの範囲である。Ａｓｎ−Ｘ−５ａｒまたはＡｍ％−Ｘ　− Ｔ　ｈ　ｒの特徴的配列によって示されるアスパラギン結合グリコジル化部位が ４個所存在しうる。

４Ｋｂ配列の残りの２２００ヌクレオチドの３′非コ一ド配列は天然宿主内での 転写において調節的役割を有している。この配列の３′末端はまた配列ＡＴＴＴ Ａの繰り返しを含むＡＴに富むセグメント（このセグメントはＲＮＡメツセージ の安定性に関係があると考えられている）を有する〔ショー（Ｇ、　Ｓｈａｗ　 ）およびカメン（Ｒ。

Ｋａｍａｎ）、Ｃｅ１１．４６（５１：６５９−６７７（１９８６）を参照され たい〕。

本発明方法で用いるｃ　Ｄ　ＮＡ配列は発現制御配列と操作可能な状態で結合し ている。このｃ　Ｄ　Ａ’　Ａ配列は以前に同定されたことのない新規配列−一 部Ｉに示すヌクレオチド＃２４２ないしヌクレオチド＃９１０Ｓまたはヌクレオ チド＃２４２ないしヌクレオチド＃１５８３と同じヌクレオチド配列、もしくは 実質的に同じヌクレオチド配列を含む。１つのこのような新規かつ好適なｃＤＮ Ａ配列は表Ｉの完全なヌクレオチド配列を含む。さらに、表Ｉのヌクレオチドお よび対応するペプチド配列の対立遺伝子変異型（またはアイソザイム）、並びに 遺伝暗号の同義性（ｄｇｇｇ％ｔｒｃＬｃν）によシ生ずるヌクレオチド配列の 変異型も、それらがＡｉ　−ＣＳ　Ｆ活性をもつポリペプチドをコードする限り 本発明に包含される。

また、アミノ酸＃１５０ないしアミノ酸＃２２３の配列と同じ又は実質質に同じ ペプチド配列を含むことによシ特徴づけられる。４（−ＣＳ　Ｆタンパク質をコ ードするｅ　Ｄ　Ａ’　Ａ配列を用いて、培養すべき細胞を形質転換することを 含むＭ　−ＣＳ　Ｆの生産方法は本発明の一部を構成する。この方法で用いるｃ 　Ｄ　Ａ’　Ａ配列は、表Ｉに示したヌクレオチド＃６８９からヌクレオチド＋ ９ｘｏｔでのヌクレオチド配列と同じ又は実質的に同じヌクレオチド配列を含む 。本発明は、この新規ヌクレオチド配列によってコードされる同じ又は実質的に 同じ部分ペプチド配列により特徴づけられるＭ−Ｃ５Ｆ活住暑もつすべてのタン パク質の生産を包含する。

本発明方法で用いる形質転換細胞は、Ｍ　−Ｃ５ＦＤＮＡコ一ド配列と操作可能 な状態で連結された適当な発現制御配列を含む。適当な細胞または細胞株はチャ イニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞のような鴫乳動物細胞でありうる。適当 な１乳動物宿主細胞の選択、および形質転換、培養、増幅、スクリーニングおよ び生産物の製造・精製の諸方法は当分野で知られている。例えば、ゲツシング（ Ｇａｔｈｉｎｃｔ　）およびサムブロック（５ａｒＩＬｂｒ−レイ（Ｈｏｗｌｙ ）　ら、米国特許第４４１９４４６号を参照されたい。本実施例に記載されるそ の他の適当な哺乳動物細胞株はサルＣＯ５−１細胞株である。同じく有用な哺乳 動物細胞株はＣＶ−１細胞株である。

また、細菌細胞も本発明で用いるのに適している。例えば、種々の大腸菌株がバ イオテクノロジーの分野で宿主細胞としてよく知られている。枯草菌（Ｂ　、　 ５ｕｂｔｉｌｉｓ）のいろいろな菌株も本方法で用いられる。また、当業者に知 られた酵母細胞の多くの菌株も不発明ポリペプチドの発現用宿主細胞として利用 できる。さらに、所望の場合は、昆虫細胞も本発明方法で宿主細胞として使用で きおよびそこに引用された文献を参照されたい。

本発明の別の面は、辰ｉに示したヌクレオチド＃２４２ないしヌクレオチド＃９ １０、または＃６８９ないし＃９１０、または＃２４２ないし＃１５８３、もし くは＃６８９ないし＃１５８３の配列、あるいは全ヌクレオチド配列と同じ又は 実質的に同じヌクレオチド配列を含む、Ｍ−Ｃ５Ｆタンパク質の発現方法におい て用いるためのベクターを提供する。好ましくは、そのベクターは表■に記載の 全ＤＮＡ配列を含む。また、ベクターは制御配列を含む。さらに、本明細書に記 載されるような修飾された又は自然界に存在する対立遺伝子配列を組み込んだベ クターも本発明の実施態様であり、Ｍ　−ＣＳＦの生産に有用である。そのベク ターは細胞株の形質転換方法において使用され、そして所定の宿主細胞内でのそ の複製および発現を導き得る所定の調節配列（本発明のＤＮＡコード配列と操作 可能な状態で結合されている）を含有する。このようなベクターにとって有用な 調節配列は当分野で知られており、所定の宿主細胞に応じて選ばれる。このよう な選択は日常的な事であり、本発明の一部を構成するものではない。

本発明のさらに別の面は表１のＤＮＡ配列およびその対立遺伝子変異型である。

表Ｉの約４ＫｂのＤＮＡ配列は大腸菌ＢＢ１０１中のプラスミドｐ３ＡＣ５Ｆ− ６９に保持され、この大腸菌は１９８６年４月１６日にメＩＪ−ランド州ロック ビル、パークローンドライブ１２３０１、アメリカン・タイプ・カルチャー・コ レクションに寄託され、寄託番号ＡＴＣＣ６７０９２を与えられた。適当な宿主 細胞にトランスフェクションされたこの配列は、発現の際に、マウスおよびヒト ｉ％ｖｉｔｒｏ骨髄検定においてマクロファージコロニー刺激作用を示すＭ　− ＣＳＦタンパク質をコードする。

点突然変異などによって起こる表１の４Ｋｂ配列のわずかな変異は、その配列が コードする機能タンパク質を変化させないであろう。従って、このような小さい 配列変異は遺伝暗号の同義性によるものを含めて、本発明に包含される。また、 ヌクレオチドの修飾は本方法で用いるＤＮＡ配列に遺伝子工学的に故意に組み入 れることができ、その修飾は既知技法を用いて当業者により行われる。このよう な修飾はアミノ酸の欠失、挿入または置換をもたらす。例えば、コード配列中の システィン残基な１個以上取り換えると、対応するジスルフィド結合を排除する ことができる。また、１つ以上のトリペプチドアスパラギン結合グリコジル化認 識部位のアミノ酸を置換、挿入または欠失させると、その部位で非グリコジル化 が起こるであろう。このような置換または欠失のための突然変異誘発法は当分野 でよく知られている。〔米国特許第４５１８５８４号を参照されたい。〕これら の修飾配列を組み込んだベクターも本発明の実施態様であり、ここに記載のＭ− Ｃ５Ｆタンパク質の生産に有用である。

本発明方法によって生産されるＭ−Ｃ５Ｆは、非還元染件下でポリアクリルアミ ドＳＤＳゲル電気泳動により分析したとき、約７０〜９０ｆｄの見掛は分子量を もつことによって特徴づけられる。しかしながら、この分析−１９７６Ｍ　−Ｃ ＳＦの還元後に行うと、このタンパク質は３５〜４５Ｋｄの分子量を有し、この ことはＭ−Ｃ５Ｆが３５〜４５Ｋｄのサブユニットのジスルフィド結合ホモダイ マーであることを示唆している。

の除去によりアミン末端で、そして約２２９個の残基の除去によりカルボキシ末 端領域で処理されると、推定分子量２１Ｋｄの２２３個または２２４個のアミノ 酸から成るサブユニットを生ずる。従って、成熟Ｊｆ　−ＣＳＦモノマーはその アミノ末端にＧｈｂを有し、そして少なくともｆｉｔで示した２２３位のアミノ 酸Ａｒｇ４で伸長している。このタンパク質はまたそのカルボキシ末端に表１で 示した２２４位のアミノ酸Ｓｕｒ　ｆ含有し５る。このサブユニットは表Ｉの配 列中に存在する４つのアスパラギン結合炭水化物付加部位のうち２つを保有して いる。これらの２つの部位および多数のＯ−結合グリコシル化部位での２１ｆｄ ポリペプチドのグリコジル化は、３５〜４５ＫｄのＭ−Ｃ５Ｆサブユニツトの残 りの質量の大部分を占めている。

Ｖａｌ　Ｇｌｎ　Ａｓｐ　Ｉｒｅ　ＭＥＴ　ＧＬｘ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　ＭＥＴＡ ＴＣＧＣＣＡＴＴ　ＧＴＧ　ＣＡＧ　ＣＴＧ　ＣＡＧ　ＧＡＡ　ＣＴＣＩｒｅ　 Ａｌａ　Ｉｒｅ　ＶａＬ　Ｇｉｎ　ＬｅｒＬＧｌｎ　ＧＬｕ　ＬｅｘＡＡＧ　Ｇ ＡＴ　ＴＡＴ　ＧＡＡ　ＧＡＧ　ＣＡＴ　ＧＡＣＡＡＧ　ＧＣＣＬｙｓ　Ａｓｐ 　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ｇｌ′１Ｌｌｌｉｓ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　ＡｌａＣＴＣＣＡＧ 　ＴＴＧ　ＣＴＧ　ＧＡＧ　ＡＡＧ　ＧＴＣＡＡＧ　ＡＡＴＬｅｕ　Ｇｌｎ　Ｌ ｅｗ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　ＡｓｎＧＡＣＡＡＧ　ＧＡＣ ＴＧＧ　ＡＡＴ　ＡＴＴ　Ｔ７’ＣＡＧＣＩＡＧＡｓｐ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｔｒ ｐ　Ａｓｎ　ＩＬｅ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　ＬｙｓＴＣＣＡＧＣＣＡＡ　ＧＡＴ　Ｇ ＴＧ　ＧＴＧ　ＡＣＣＡＡＧ　ＣＣＴＳｅｒ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　Ａｓｐ　Ｖａｔ 　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｐｒ。

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Ｍ　−ＣＳＦは単球やマクロファージの生産ビ直接刺激するために使用され、ま た他の造血細胞系列を間接的に刺激することができる。本発明ポリペプチドを用 いて治療しやすい症状は、特に末梢血中の循環性白血球の数が減少する白血球減 少症である。白血球減少症はウィルスまたは放射線への暴露によって誘発され、 そして往々にして種々のかん治療および化学療法剤により起こる副作用である。

Ａｉ　−ＣＳＦによる白血球減少症の治療はこの種の副作用を避けることができ る。さらに、Ｍ　−ＣＳＦは重症の感染症の場合に成熟白血球を活性化すること ができ、しかも単球にＧ、Ｍ−Ｃ５Ｆを生産させることができる。、Ｖ　−ＣＳ Ｆはまた細胞内寄生虫感染症、細菌感染症などを治療するために用いられる。さ らに、Ｍ−Ｃ５Ｆ単独あるいはＩＬ−１，ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ −５、Ｂ細胞分化因子、Ｂｓｐ−２およびインターフェロンのような他の造血累 との組み合わせは、活性化マクロファージが腫瘍細胞を死滅させるマクロファー ジの愼能を増強させ、α−インターフェロンを放出させ、寄生虫を殺し、また他 のＣ３Ｆｆ放出および促進させることができる。

Ｍ−Ｃ５Ｆはまた皿小板慮少症や貧血を含めた他の血球欠損症の治療；骨髄移植 から回復しつつある患者の治療；および外科手術中および熱Ｓ患者における生体 防御の促進に使用することができる。ＪＳｆ　−ＣＳＦは、抗体と共に〔例えば 、抗体依存江細胞障害法；ロペツ（Ａ、Ｆ。

Ｌｏｐｅｔ　）ら、Ｊ、　ＩｍｍｗｎｏＬ、、１３１（６１：２９８３　２９８ ８（１９８３）を参照〕、ヒト単球による腫瘍細胞の撲滅を活性化することがで き、それによｐある種のがんにとって有効な処置である。

本発明の治療用組成物および方法は、治療上有効な量のＭ　−ＣＳＦタンパク質 を製剤上許容されるキャリヤーと共に投与することを含む。この組成物は非経口 的、静脈内あるいは皮下に、全身的に投与される。全身的に投与する場合、本発 明で用いる治療用組成物は、もちろん発熱物’Ｘｋ含まない、非経口的に許容さ れる水溶液の形である。、Ｅに関連して等優性および安定性等を有するこの種の 非経口的に許容されるタンパク質浴漱の調製は、当分野の技術の範囲内である。

投与量は薬物の作用を変更する種々の要因、例えば患者の健康状態、体ｌ、性別 および食事療法、感染症の程度、投与回数ならびに他の臨床的要因を考慮しつつ 主治医によって決定されるであろう。一般に、−８分の投与量は体重１＃当たり １〜１０００μ２のタンパク質、あるいは５０〜５０００単位のタンパク質（１ 単位は標準ネズミ骨髄検足において最大刺激の％へ導くポリペプチドの濃度）で ある。経過は圧液学的形態の定期的な評価（例えば白血球の計数など）により監 視することができ治療用組成物および方法はまたＭ−Ｃ５Ｆと一緒に他のヒト因 子を同時投与することを含む。本発明のＡｉ　−Ｃ５Ｆと相互作用する他の適当 な造血素、Ｃ５Ｆおよびインターロイキンの非限定的な例には、先に挙げた諸因 子、ＧＭ−Ｃ５Ｆ、Ｇ−Ｃ５Ｆ、Ｊｉｇｇ−Ｃ５Ｆ、エリトロポイエチンおよび 好酸球分化因子が含まれる。上記の投与量は治療用組成物または方法においてこ の種の追加成分を補償すべく調整されるであろう。Ｊｉ　−ＣＳＦはまたモノク ローナル抗体を用いる療法においても投与することができる。

発明の詳細な説明 以下の実施例は、ｆｉｌのＤ　ＮＡ配列を用いてＪ（−ＣＳ　Ｆまたはその自然 界［ｉ在する対立遺伝子変異型（アイソザイム）、もしくは故意に修飾されたｋ ｉ　−ＣＳ　Ｆタンパク質を生産する本発明方法を例示するものである。

ＳＶ４０形質転換した栄養膜紀胞株ＴＰ、４−３０−１± ＣＡＴＣＣ＃ＣＲＬ　−１５８３）のポリス。情ＲＮ　Ａから表Ｉの完全ＤＮＡ 　配列を分瓶した。Ａｉ　ＣＳＦ発現用の鴫乳動物ベクターを構築するために、 上記のＷｌに示した完全ｃ　Ｄ　Ａ’　Ａ配列は制限エンドヌクレアーゼ酵素Ｘ ｈ。

ｌリンカ−（ＮａｗＥ％ｇｌａｎｄ　Ｈｉｏｌａｂａ社製）で改作し、そしてＸ んｏＩで消化後ホスファターゼ処理したＣＯ５細胞発現ベクターｐＸＭに連結さ せた。ｐＸ　、４ｆはＳＶ４０エンハンサ−、メジャーアデノウィルス後期プロ モーター、ＤＥＦＲコード配列、ＳＶ４０後期メツセージポリーＡ付加部位およ びＶａｌ遺伝子を含む。ｐＸＭはさらにＫｐ％■、ｐｓｔｌおよびＸにＯｌの制 限エンドヌクレアーゼ部位をもつリンカ−配列を含有する。ｐＸＭのＸｈｏｌ消 化および、４ｉ−ＣＳＦ　？：コードする表Ｉのリンカ−／Ｘ＆ｏｌ処Ｗ　Ｄ　 Ｎ　Ａ配列の挿入により生じたプラスミドはｐ３ＡｃｓＦ−６９と名づけられた 。ｐ３ＡＣ５Ｆ−６９（ＡＴＣＣ＃６７０９２）は配置−Ｃ５Ｆタンパク質の発 現のために適した哨乳動物宿主細胞へ慣用技術により形質転換しうる。代辰的な 宿主細胞は哨乳動物細胞および細胞株であり、と９わけ霊長目や　歯口などの細 胞株である。

当業者はまた。３ＡＣ５Ｆ−６９に類似しているが表１の完全ＤＮＡ配列よりも 短い配列を含む他の嘩乳動物発現ベクターを構築することができる。例えば、５ ′および３′フランキング（ｆ　ｒａｎｋｉｎｇ　）配列を所望によ９表１の配 列から切断することができ、また表Ｉの配列を操作することによ９表１の修飾変 異型あるいは対立遺伝子変異型を使用することができる。表ＩのＤＮＡ配列はＸ ｈｏＩを用いて上記プラスミドから切断され、そしてその配列を修飾して、それ を弛の既知ベクター、例えばｐＣＤ〔オカヤＷ　（ＯｋｃＬｙａｒｎａ　）　ら 、３ノｏｔ、ｃａＬｌ、ＢｉｏＬ。

２：１６１−１７０（１９８２）を参照〕、およびｐＪＬ３、ｐＪ　Ｌ　４　Ｃ ’：ｌ”つ（Ｇｏｘｇｈ　）ら、ＥＭＢＯ／、、４　：６４５−６５３（１９８ ５）を参照〕へ挿入するために公知の組換え遺伝子工学的手法が用いられる。適 当な宿主細胞へのこれらのベクターの形質転換は−Ａｆ　−ＣＳＦタンパク質の 発現をもたらす。

同様に、当業者はコード配列の両側に位置する哨乳動物調節配列を除去するか、 あるいは哩乳動物以外のベクターを作製すべくその調節配列を酵母、細菌または 昆虫の配列と取り換えることにより、その配列を操作することができるであろう 。従って、この配列はその後酵母、細菌または昆虫の宿主細胞円で発現可能であ るだろう。

例えば、表Ｉのコード配列はＸｈｏＩを用いてｐ３ＡｃｓＦ−６９から切断した 後さらに操作されるであろう（例えば他の既知リンカ−へ連結されるか、あるい はその配列から非コード配列を欠失させたり、既知技法によりその配列中のヌク レオチドを改変したりすることによって修飾される）。修飾された。Ｍ　−ＣＳ Ｆコード配列はその後記載されるような方法を用いて、例えば既知の細菌ベクタ ーへ挿入することができる。この細菌ベクターはその後細菌宿主細胞へ形質転換 され、これによりＭ−Ｃ５Ｆが発現されるであろう。

昆虫または酵母細胞によるＭ−Ｃ５Ｆタンパク質の発現のために、同様の操作を 行って昆虫ベクター〔公開された欧州特許出願第１５５４７６号に記載の方法を 参照〕または酵母ベクター〔公開されたＰＣＴ出願ＷＯ８６００６３９号に記載 の方法を参照〕を講築することができる。

実施例■ Ｍ　−Ｃ５Ｆタンパク質の発現 ＬａｂｏｒｃＬｔｏｒｙ　（１９８２）に記載されるようにしてｐ３ＡＣ５Ｆ− ６９を含む大腸菌ＢＢ１０１から調整したフリスミドＤ　ＮＡは、エチジウムプ ロミドを含む塩化セシウム勾配中での平衡遠心を伴う慣用方法により精製した。

ＣＯＳ細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ１６５ｏ）は１０’個のＣＯ５細胞あたクズラスミ ドＤＮＡ約５μりの濃度で精製ＤＮＡによりトランスフェクションを行い、ウオ ン（１９８５）およびカウフマン（Ｒ、／　、　Ｋａｕｆｍａｎ　）ら、Ａｌｏ ｌ、Ｃｔｌｌ、Ｂｉｏｌ、、　２　：１３０４　（１９８２）に記載の方法に従 ってクロロキンで処理した。トランスフェクションの７２時間後、以下の実施例 ■で説明する標準骨髄検定においてＡ１−Ｃ３Ｆｒ５性を示すタンパク質を含む ｐ３ＡｃｓＦ−６９含有ＣＯＳ細胞からの調整培地（ｃｏ％ｄｉｔｉｏｎｅｄ　 ｒｎｇｄｉｓｍ）ｆ回収することができた。

Ａ、マウス検定 Ｅｌｓｇｖｉｇｒ　Ｐｒｅｓｓ＋　Ｎｇｗ　Ｙｏｒｋ　（１９８４）に記載の方 法を次のように変更して実施した： （ａ）　この検定では２Ｘ１０５骨髄細胞／ｍｔを用いた；（ｈ）　最終検定容 量は１００μｔであった；および（ｃｌ　検定は標準的な９６ウエルマイクロタ イタープレートで行った。

骨髄は６〜２５週目の雌ＢｃＬｌｂ／ｃマウス（Ｊａｃｋ−８０％）の大腿骨か ら得た。標準対照としてマウスＬ細胞調整培地を含むＷＥＩＩＩ　３％調整培地 リー（Ｊ、Ｃ，Ｌｅｅ）ら、Ｊ−１ｍｍｕｎｏ１．、１２８　：　２３９３−２ ３９８（１９８２）：］を用いて、活性の１希釈単位はこの骨髄検定において最 大応答（すなわち、２Ｘ１０４マウス骨髄細胞あたり約１５〜２０コロニー）を もたらすタンパク質の濃度と定められた。

ｐ３ΔＣ３Ｆ−６９含有ＣＯ５細胞からの調整培地は、マウス骨髄検定において 少な（とも１Ｏ−４希釈まで活性であることが判明し、主として単球系列のコロ ニーを生じた。最大応答における細胞の数および型は、マウス供与体の種類や年 令により変化するであろう。

Ｂ、ヒト検定 非付着性骨髄細胞を用いるヒト骨髄検定はウォン（Ｇ、Ｇ、Ｗｏｎｇ）ら、上記 文献に記載されるように行った。

ｐ３ＡＣ５Ｆ−６９含有ＣＯ５細胞からの調整培地はヒト骨髄検定において１： ５０希釈まで活性であり、主としカウフマン（Ｒ、Ｊ　、　Ｋａｓｃ　ｆｍａｎ 　）およびシャープ（Ｐ、Ａ。

Ｓんａｒｐ　）　、　Ｊｌ、１ノｏ１．ＢｉｏＬ、１５９：６０　１　６２９（ １９８２）の方法に従って、ｐ３ＡｃｓＦ−６９ＤＮＡでのＣＯ５細胞トランス フェクションにより生産されるＭ−Ｃ５Ｆタンパク質中に、３５Ｓメチオニンを 代謝的に組み入れることができる。３５５メチオニンで標識したｐ３ＡｃｓＦ− ６９含有ＣＯ５細胞由来の調整培地をポリアクリルアミドゲル電気泳動により非 還元東件下で分析すると〔レムリ（Ｕ　、　Ｋ　、　Ｌａ　ｅｒｎｍｌ　ｉ　） 、Ｎａｔｓｒｇ　２２７　：６８０−６８５（１９７０））、グリコジル化を表 す幅広バンドが約７０Ｋｄの見掛分子量のところに検出される。ｐ　Ｘ　ｉｓＩ ベクターＤ　Ａ’　Ａの対応するトランスフェクションでは同様の３５５タンパ ク質バンドが現れない。

！５Ｓメチオニンで標識したｐ３ＡｃｓＦ−６９調整培地は１００　ｍＡｉβ− メルカプトエタノールで還元し、その後ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動 により分析した。７０Ｋｄのバンドは消失し、約３５Ｋｄの幅広バンド（グリコ ジル化を示す）が検出される。還元されたｐ３ＡｃｓＦ−６９含有ＣＯ５細胞論 整培地はマウスとヒトの両骨髄検定において不活性である。従って、ＣＯ５細胞 調整培地中のＭ−Ｃ５Ｆタンパク質はダイマーとして活性であるが、その構成モ ノマーに還元されると不活であると思われる。

３５Ｓメチオニンで標識し、還元したｐ３ＡｃｓＦ−６９含有ＣＯ５細胞調整培 地は、ブラッドフォードＣＭ。

Ｂｒａｄｆｏｒｄ　）　、　Ａｎ　ｃＬｌ　、Ｈｉｏｃｈｅｍ　７２　二　２４ ８（１９７６）の方法に従ってノイラミニダーゼ（Ｓ　ｉ　ｇｒｎＧ社）で処理 してシアル酸を除き、さらにペプチドＮ−グリコシダーゼＦ〔Ｎ−グリカナーゼ （Ｇ酵素）としても知られている〕で処理してＮ−結合炭水化物を除去したｃＳ ＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析は、ノイラミニダーゼとＮ−グ リコシダーゼＦで処理した。３ＡＣ５Ｆ−６９含有ＣＯ５細胞調整培地中に約１ ８Ｋｄの分離したバンドを明らかにし、このバンドは未処理の還元ｓｓＳ　メチ オニン標識調整培地には見られなかった。Ｎ−グリカナーゼのみで処理した還元 ３５Ｓ標識ｐ３ＡＣ５Ｆ−６９含有ＣＯ５細胞論整培地は、５ＤＳ−ポリアクリ ルアミドゲル電気泳動分析において約１８１”ｄのバンドを示した。

Ｎ−グリコシダーゼおよびノイラミニダーゼの実験から、ｐ３ＡＣ５Ｆ−６９で トランスフェクションしたＣＯＳ細胞により生産された３１−　ＣＳＦタンパク 質は、それぞれＡ’　−Ｍ合グリコジル化により十分に修飾された約１８Ｋｄの ポリペプチドから成る２つの約３５Ｋｄグリコジル化モノマーのダイマーである と考えられる。

Ｍ　−Ｃ５Ｆを高レベルで発現するＣｌｌ０細胞株の構築鴫乳動物細胞から高レ ベルで、ＩＩ　−ＣＳＦを生産するための１つの方法は、多コピー数の異種ＡＩ −Ｃ５Ｆ遺伝子を含む細胞の構築を伴う。異種遺伝子は増幅可能なマーカー〔例 えばジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子〕に結合され、そのために増加し た遺伝子コピーを含む細胞はＫａｗｆｍａｎ　＆　５ｈａｒｐ、　Ｊ、Ｍｏ１． 　Ｂｉｏｌ、、　同上の方法に従って、次第に増加する濃度のメトトレキセート （ＭＴＸ）中で増殖させることにより選択できる。この手法は多数の別の細胞型 においても利用しつる。

ｐ３ＡｃｓＦ−６ｇおよびＤＢＦＲ発現プラスミド、ンスフエクションによりＤ ＨＦＲ欠損ＣＥＯｆ５胞、ＤＵＫＸ−Ｂ１１へ同時トランスフェクションを行う 。初期のＤｌｉＦＲ発現形質転換体は透析したウシ胎児血清を含むアルファ培地 中での生育について選択され、その後次第に増加する濃度のＡｉＴＸ（０，０２ ，０，２，１，０および５　ｍＪｆ　Ｍ　Ｔ　Ｘの段階的濃度）中での生育によ る増幅にる。

０．２５μＭＡｉＴＸでの生育について選択された、ＣＨＯ−３ＡＣ５Ｆ−６９ と名づけられた１つのクローンは生理活性Ｊｉ−Ｃ５Ｆｙ、２ミーＣ５Ｆｙ、２ 高レベル分かつた。この細胞株は１：６０．ＯＯＯ最終希釈でネズミマクロファ ージコロニー形成を促進しつる調整培地を終始一貫して生成する。これらの細胞 （１つの１０ｃｍ培養皿）ならびに親ＣＥＯ細胞は、最少必須培地（ＭＥＮ）４ ｍｔ中３７℃で４時間３５５−常ａｔ（ＭＥＮ社）１悔Ｃｔにより標識する。得 られた調整培地試料は精製した尿Ｍ−Ｃ５Ｆを用いてウサギ中で誘導された抗血 清と共にインキュベートする。抗原−抗体複合体は黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈ ｙ−１ｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｓｃｓ　）細胞（Ｃａｒ　Ｈｉｏｃｈｅｍ社） への吸着により沈殿させる。この複合体はレムリ（Ｕ、に、Ｌａｅ□−ｍｌｉ） 、Ｎａｔ％ｒｅ、２２７：６８０　６８５（１９７０）に従って還元剤を含まな い泳動用緩衝液に可溶化する。試料を還元するために、それらに２−メルカプト エタノールを加えて１００　ｍＭとなし、３７℃で３０分インキュに、標識タン パク質のパターンがＫｏｄｃＬｋ　ＭＡＲフィルムを用いたフルオログラフィー （エンハンス、ＭＥＮ社）によシ可視化される。非還元条件下での５ＤＳ−ポリ アクリルアミドゲル電気泳動によるこれらの免疫沈殿物の分析は、Ｍ−Ｃ５Ｆタ ンパク質産生ＣＥＯ細抱からの調整培地が７０〜９０Ｋｄの親サイズと１５０Ｋ ｄよりも大きいサイズの２種類の異９Ｍ−ＣＳＦタンパク質を含むことｔＢＡら かにした。観察されたこれらのタンパク質のサイズ不均一性は多くの糖タンパク 質に特徴的である。

還元後に同一試料を分析すると、Ｍ−Ｃ５Ｆタンパク質の７０〜９０Ｋｄ物質の 移動度は３５〜４０Ｋｄの分子量と一致する位ｔにずれるが、より大きい物質（ １５０Ｋｄ以上）の相対移動度はこの処理により影響を受けないことが判明した 。従って、少なくとも２種類の異なるＭ−Ｃ５Ｆタンパク質がＣ１１Ｏ−３ＡＣ ５Ｆ−６９細胞により発現されるニす、なわち、３５〜４５Ｋｄサブユニツトの ジスルフィド結合ダイマーから成る７０〜９０Ｋｄタンパク質、および比較的大 きいサイズの物質。上記細胞株は血清を含まない完全規定培地に適応させた。

実施例■ Ｍ−Ｃ５Ｆの精製 ０．５％ウシ胎児血清およびＤｆｉｉＥ）ｄ　−Ｆ　１２を含ビ１１０細胞調整 培地は水で１：１に希釈する。その後、希釈した培地は４０７７Ｌ、Ｍ　）リス （ｐＨ７，４）で平滑化したＱＡＥ″Ｚｇｔα−Ｐｒｏｐ″カートリッジ（ＬＫ Ｂ社）に加える。

未顆合タンパクｆＸ乞含む流出液は捨てた。結合タンパク質は４０ｍＭ）リスＣ ｐＨ７，４）で洗い、４０　ｔｎＭ　）リス（ｐＨ７，４）および０．７５　Ｍ 　ＮａＣ１で溶出した。この溶出液をその抜水で希釈してＱ、　５　Ｍ　ＮａＣ Ｌの濃度とした。

ツイーン２０１ｆ！：加えて０．０５％となし、この混合ＰＭヲ２０　ｍＭ　） リス（ｐＨ７，４）、０．５ＭＮａＣ４および０．０５％ツイーン２０中で平衡 化したヒラマメレクチン−セファロース４Ｂカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）に 大体１力ラム容量／時で加えた。カラムは２〜５カラム容量の２０？ＰＬＭトリ ス（ｐＨ７，４）および０．５　Ｍ　ＮａＣＬで洗った。特異的に結合したタン ノぐり質は２０　ｍ、Ｍ　）　＋）ス、０．２　Ｍα−メチルマンノピラノシド 、０．５　Ｍ　ＮａＣＬおよび０．０５％ツイー７２０で溶出し、その後１０％ トリフルオロ酢酸（ＴＥＡ）で酸性化した。この溶出液を３０％アセトニトリル および０．１％ＴＥＡで平衡化したカラムを用いて逆相液体クロマトグラフィー にかけた。タンパク質は０１％ＴＦＡ中のアセトニトリル上昇勾配により溶出し た。

４５％アセトニトリルと５０％アセトニトリルの間で集めたタンパク質は試験管 中にてトリス（ＰＨ１，５）で中和し、分析した。

精製方法はまた高分子量凝集物を除くためのサイズ排除段階を伴う。Ｍ−Ｃ５Ｆ の予備分析は約１０’骨髄単位／ｍ９の比活性を示す（実施例ｍの骨髄検定を参 照されたい）。

不発明乞実施する際には、その好適な実施態様の前記説明を考慮することにより 、当業者には多くの修飾および変更が予測できる。このような修飾および変更は 添付の請求の範囲に包含されるものである。

補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の７第１項） 昭和６３年１１月　η刀 特許庁長官　吉　１）文　毅　殿 １、特許出願の表示 ＰＣＴ／ＵＳ８７１００８３５ ２、発明の名称 Ｍ−Ｃ５Ｆの生産 ３、特許出願人 住　所　アメリカ合衆国マサチューセッツ州０２１４０．ケンブリッジ。

ケンブリッジパーク・ドライブ　８７／名　称　ジニネティックス・インスチチ ュート・インコーホレーテッド４、代理人 住　所　東京都千代田区大手町二丁目２番１号−新大手町ビル　２０６区 ５、補正書の提出日 ８、請求項１に従って生産された有効量のタンパク質を含有する治療用組成物。

９、有効量の少なくとも１種の造血累、インターロイキン、成長因子または抗体 をさらに含む、請求項８記載の組成物。

１０、表■のアミノ酸配列から成るタンパク質をコードし、発現制御配列に操作 可能な状態で結合されているｃ　Ｄ　Ａ’　Ａ配列を含む形質転換用ベクター。

１１、ｐ３ＡＣ５Ｆ−６９である、請求項１０記載のベクタ１２、請求項１記載 の方法により生産された有効量のタンパク質を思考に投与することから成る治療 方法。

１３、表■のアミノ酸＃１からアミノ酸＃２２３までのアミノ酸配列ρ・ら成る 精製したＭ−Ｃ５Ｆタンパク質。

１４、請求項１３記載の有効量のタンパク質を製剤上許容されるキャリアーと共 に含有してなる治療用組成物。

１５、表■のヌクレオチド配列から成る、Ｍ−Ｃ５Ｆタンパク質をコードするｃ 　Ｄ　Ａ’　Ａ配列。

国際調査報告

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. １．表Ｉのアミノ酸＃１からアミノ酸＃２２３までの配列と実質的に同じ配列か ら成るペプチド配列を含むことにより特徴づけられるタンパク質をコードし、発 現制御配列に作動可能な状態で結合されているｃＤＮＡ配列で形質転換された適 当左細胞を培養することから成るＭ−ＣＳＦの生産方法。
2. ２．前記ｃＤＮＡ配列は表Ｉのヌクレオチド＃２４２からヌクレオチド＃９１０ までのヌクレオチド配列から成る、請求項１記載の方法。
3. ３．前記ｃＤＮＡ配列は表Ｉのヌクレオチド＃１４６からヌクレオチド＃１５８ ３までのヌクレオチド配列から成る、請求項１記載の方法。
4. ４．ｃＤＮＡ配列は表Ｉの完全左ヌクレオチド配列から成る、請求項１記載の方 法。
5. ５．前記細胞は哺乳動物細胞株である、請求項１記載の方法。
6. ６．表Ｉのアミノ酸＃１５０からアミノ酸＃２２３までの配列と実質的に同じ配 列から成るペプチド配列を含むことによク特徴づけられるタンパク質をコードし 、発現制御配列に操作可能左状態で結合されているｃＤＮＡ配列で形質転換され た適当な細胞を培養することから成るＭ−ＣＳＦの生産方法。
7. ７．前記ｃＤＮＡ配列は表Ｉのヌクレオチド＃６８９からヌクレオチド＃９１０ までのヌクレオチド配列から成る、請求項１記載の方法。
8. ８．請求項１に従つて生産された有効量のタンパク質を含有する治療用組成物。
9. ９．有効量の少なくとも１種の造血素、インターロイキン、成長因子または抗体 をさらに含む、請求項８記載の組成物。
10. １０．天然ヒトＭ−ＣＳＦの生物学的および生化学的特性を示すタンパク質をコ ードするｃＤＮＡ配列であつて、表Ｉのヌクレオチド＃６８９からヌクレオチド ＃９１０までのヌクレオチド配列から成り且つ発現制御配列に操作可能な状態で 結合されている該ｃＤＮＡ配列を含む形質転換用ベクター。
11. １１．ｐ３ＡＣＳＦ−６９である、請求項１０記載のベクタ１２．請求項１に従 つて生産された有効量のタンパク質を患者に投与することから成る治療方法。